Summary
Ribonucleotides behoren tot de meest voorkomende niet-canonieke nucleotiden in het genoom opgenomen tijdens de eukaryote nucleair DNA-replicatie. Als het niet correct is verwijderd, kan ribonucleotides DNA-beschadiging en mutagenese veroorzaken. Hier presenteren we twee experimentele benaderingen die worden gebruikt voor het beoordelen van de overvloed van ribonucleotide opneming in DNA en zijn mutagene effecten.
Abstract
De aanwezigheid van ribonucleotides in nucleaire DNA heeft aangetoond dat een bron van instabiliteit van het genoom. De omvang van ribonucleotide opneming kan worden geëvalueerd door de alkalische hydrolyse en gel elektroforese zoals RNA zeer gevoelig voor hydrolyse onder alkalische omstandigheden is. Dit, kan in combinatie met zuidelijke vlekkenanalyse worden gebruikt om te bepalen van de locatie en strand in die het ribonucleotides hebben overgenomen. Echter kan deze procedure is alleen semi-kwantitatieve en niet gevoelig genoeg voor het detecteren van kleine veranderingen in ribonucleotide inhoud, hoewel strand-specifieke zuidelijke vlek indringende de gevoeligheid verbetert. Als een maatregel van een van de meest opvallende biologische gevolgen van ribonucleotides in DNA, kan spontane mutagenese worden geanalyseerd met behulp van een voorwaartse mutatie test. Met behulp van passende reporter genen, kunnen zeldzame mutaties die resulteert in het verlies van functie geselecteerd en algemene en specifieke mutatie kan worden gemeten door het combineren van gegevens uit schommelingen experimenten met het rangschikken van DNA van het gen verslaggever. De fluctuatie-bepaling is van toepassing op een breed scala aan mutagene processen in specifieke genetische achtergrond of groei voorwaarden onderzoeken.
Introduction
Tijdens de eukaryote nucleair DNA replicatie, zijn ribonucleotides ingelijfd bij het genoom van alle drie belangrijke replicases van DNA, DNA polymerase (Pols) α, ε en δ1,2. RNase H2-afhankelijke ribonucleotide excisie reparatie (RER3) verwijdert de meerderheid van deze ingesloten ribonucleotides.
Een ribonucleotide in DNA is gevoelig voor hydrolyse, aangezien de hydroxylgroep 2' van de suiker-groep de aangrenzende phosphodiester band, het vrijgeven van één eind met een cyclische fosfaat 2' - 3' en de andere met een 5'-OH4kan aantasten. Alkalische omstandigheden kunnen deze reactie aanzienlijk versnellen. Dus, de hydrolyse van ingesloten ribonucleotides tijdens de incubatie in een basisoplossing veroorzaakt fragmentatie van genomic DNA, die kan worden gevisualiseerd door alkalische-agarose de Elektroforese van5. Dit DNA kan worden overgebracht naar een membraan en peilden door vlekkenanalyse van de zuidelijke met behulp van strand-specifieke sondes waarmee de inventarisatie van alkali-gevoelige locaties veroorzaakt door ribonucleotides opgenomen in de ontluikende toonaangevende - of achterblijvende-streng DNA, respectievelijk.
In gistcellen ontbreekt RNase H2-activiteit, kan verwijdering van ribonucleotides worden gestart wanneer topoisomerase nicks ik (Top1) DNA op de ingesloten ribonucleotide6,7. Echter wanneer Top1 cleaves aan de 3'-kant van de ribonucleotide, genereert dit 5'-OH en 2' - 3' cyclische fosfaat DNA einden die vuurvaste aan de regeling. Reparatie, of afwijkende verwerking van deze 'vuile einden' niet kan leiden tot instabiliteit van het genoom. Bovendien, als de incisie binnen een herhaalde DNA-sequentie optreedt, kan het herstelproces leiden tot verwijdering mutaties. Dit is met name problematisch voor tandem herhaalt, waar korte verwijderingen (van tussen twee en vijf basenparen) worden vaak waargenomen bij RNase H2-deficiënte cellen. De schadelijke effecten van de Top1-afhankelijke bij gebrek aan gist RNase H2 activiteit worden verergerd in een polymerase van DNA ε mutant (pol2-M644G) promiscue voor ribonucleotide opneming tijdens ontluikende toonaangevende onderdeel synthese.
Verwerking van ribonucleotides in DNA leidt tot spontane mutaties en deze mutagenese kan worden opgespoord met behulp van passende reporter genen en selecteren voor de begeleidende fenotypische verandering. Een schommeling test of Luria en Delbrück experiment is een van de meest gebruikte methoden voor het meten van de spontane mutatie tarieven met selecteerbare reporter genen8,9. In gist, kunnen de genen URA3 en CAN1 worden gebruikt als verslaggevers in een voorwaartse mutatie assay, die het mogelijk maakt voor de detectie van alle soorten van de mutaties die leiden het verlies van de genfunctie tot. De spontane mutaties wordt geschat als de mediaan van die waargenomen voor meerdere parallelle culturen gestart vanuit één kolonies zonder mutaties in het doel verslaggever gen. Een gist RNase H2-deficiënte stam zoals rnh201Δ heeft een matig verhoogde totale spontane mutatie tarief dat grotendeels door een verhoogde incidentie van 2-5 bp verwijderingen in tandem veroorzaakt wordt herhalen sequenties. Aldus, volledig karakteriseren de mutagene effecten van ribonucleotides in het genoom, specifieke mutatie tarieven moeten worden bepaald. In dit geval de URA3 of CAN1 verslaggever genen kunnen worden versterkt en sequenced om te bepalen van de soorten en locaties van de mutaties en specifieke mutatie tarieven kunnen worden berekend. Opstellen van mutaties geïdentificeerd in meerdere onafhankelijke URA3 of CAN1 mutanten kan vervolgens worden gebruikt voor het genereren van een mutatie spectrum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. alkalische hydrolyse en Strand-specifieke zuidelijke vlek (Figuur 1)
- Celgroei en genomic DNA isolatie
- Isoleer genomic DNA gist met behulp van een gist DNA zuivering kit na instructies van de fabrikant. Gebruik de culturen die in de exponentiële fase van groei tussen (optische dichtheid van 0,5) en 1. Resuspendeer de laatste DNA-pellet in 35 mL 1 x TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA)).
- 1 mL van 5 mg/mL RNase A toevoegen aan het DNA en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
- Neerslaan van het DNA 0.1 volumes van 3 M Natriumacetaat (pH 5.2) gebruiken en 2.5 volumes van 100% ethanol voor 20 min op ijs.
- Centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. Verwijder de bovendrijvende vloeistof met behulp van een precisiepipet.
- Wassen van de pellet tweemaal met 500 mL 70% ethanol. Verwijder de bovendrijvende vloeistof met behulp van een precisiepipet.
- Droog de pellet op bankje en resuspendeer in 35 ml 1 x TE buffer.
- Kwantificeren van de DNA een fluorimeter (Tabel of Materials) met de dsDNA BR Assay kit.
- Neerslag van 5 mg van DNA van elk monster met behulp van 0.1 volumes van 3 M Natriumacetaat, pH 5.2 en 2.5 volumes van 100% EtOH voor een totaal volume van 200 mL (Voeg H2O indien nodig, extra 5 mg van DNA is nodig als de neutrale gel controle nodig is). Incubeer op ijs gedurende 20 minuten.
- Centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. Verwijder de bovendrijvende vloeistof met behulp van een precisiepipet.
- Droog de pellet op Bank. Resuspendeer de DNA in 14 mL H2O.
- Alkalische hydrolyse en gel elektroforese
- Voeg 6 mL 1 M KOH en Incubeer bij 55 ° C gedurende 2 uur.
- Incubeer de monsters op ijs gedurende 5 minuten.
- Voeg 4 mL 6 x alkaline DNA laden buffer: 300 mM KOH, 6 mM EDTA, pH 8,0 18% polysucrose (Tabel of Materials), 0,15% broomkresolpurper groen, en 0,25% xyleen cyanol FF.
- Een alkalisch gel die uit 1% agarose, 50 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 8,0 bestaat gegoten. Gebruik een kam dat voorziet in 24 mL van DNA-monster worden geladen per rijstrook.
- De gel worden uitgevoerd bij kamertemperatuur in 1 x de Elektroforese van de alkalische buffer: 50 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 8,0. Omvatten een passende DNA grootte markering.
- Spin down de buizen kort en laadt de gehele 24 mL monster in de alkalische agarose gel. Electrophorese gedurende 30 minuten bij 30 V, gevolgd door 18-20 h op 10 V.
- Neutraliseer de gel voor 2 incubations van 45 min bij kamertemperatuur met zachte agitatie in neutralisatie Buffer I: 1 M Tris-HCl, NaCl van 1,5 M.
- Vlek het DNA door inweken de geneutraliseerde gel in 200 mL water met een verdunning van 1/10.000 van de SYBR gouden vlek gedurende 2 uur bij kamertemperatuur met zacht schudden.
- Visualiseer het DNA met behulp van een UV-transilluminator. Verhoogde alkali-gevoeligheid zorgt ervoor dat het uiterlijk van kleinere DNA-fragmenten, die een hogere dichtheid van herstelde ribonucleotides in DNA5aangeeft.
- Zuidelijke overdracht
- Het DNA van de alkalische gel overbrengen naar de positief geladen nylon membraan door capillaire actie10. Een voorbeeld van hoe deze overdracht kan worden ingesteld is beschikbaar in Sambrook en Russells handmatige10.
- Geniet van de alkalische gel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in alkalische Buffer voor Transfer: 0.4 M NaOH, 1 M NaCl.
- De nylon membraan (ontneemt aan de grootte van de gel) kort nat met water, en vervolgens geniet gedurende 5 min. in alkalische Transfer Buffer.
- De overdracht-platform door het omkeren van 3 glazen bekers (100 mL) opgericht in een glazen bakken schotel. Dit gerecht moet iets groter dan de grootte van het agarose gel. Stel een glasplaat over bovenkant van hen.
- 2 grote stukken van 3 MM CHR chromatografie papier (ontneemt aan de grootte van de breedte van de gel plus langer zijden die over de randen in de buffer reservoir draperen kunnen) draperen over de glasplaat.
- Alkaline Transfer Buffer giet de chromatografie papier en de helft vullen de glazen schotel. De bubbels met behulp van een precisiepipet 5 mL glas glad.
- Plaats de agarose gel op bovenkant, weer gladstrijken van de bubbels. Alle randen van de gel met parafilm omringen. Giet een kleine hoeveelheid van de alkalische Transfer Buffer op de gel.
- Plaats het vooraf doorweekt nylon membraan op de top van de gel. De bubbels glad.
- Natte 2 stukjes papier knippen en naar de grootte van het agarose gel. Plaats ze op de top van het membraan, en bubbels gladstrijken.
- Plaats een grote stapel papieren handdoeken (knippen tot een formaat iets groter dan de agarose gel) op de top van de overdracht sandwich. Zorgvuldig plaatst een glasplaat bovenop het keukenpapier. Een gewogen object toevoegen aan de bovenkant (een boek met een massa van 400 g werkt goed).
- Laat de overdracht gaan 's nachts bij kamertemperatuur.
- Zorgvuldig de transfer-stack uit elkaar te halen en geniet van het membraan gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in neutralisatie Buffer II: 0,5 M Tris-HCl, pH 7,2, 1 M NaCl.
- Dwarslijn het DNA aan de geladen nylon membraan met behulp van een UV-crosslinker. Plaats het membraan in de cross-linker en de autocrosslink instelling gebruiken.
- Zuidelijke sonde voorbereiding
Opmerking: De hier beschreven voor het detecteren van alkali-gevoelige sites in de ontluikende toonaangevende-versus achterblijvende-onderdeel van de bundel van DNA is gebaseerd op een protocol aanpak publiceerde eerder11. Voor onze experiment, wordt indringende uitgevoerd met het URA3 verslaggever gen die is ingevoegd in een van de twee oriëntaties (OR1 of en2) grenzend aan de oorsprong van de replicatie ARS306 op chromosoom III (figuur 3A). De aanwezigheid van alkali-gevoelige locaties in genomic DNA van gist is een indicator van ribonucleotide opneming, waardoor het gebruik van ribonucleotides als de biomarkers van DNA-polymerase activiteit12,13,14. Deze aanpak, met behulp van een streefcijfer DNA-sequentie grenzend aan de efficiënte ARS306 oorsprong van replicatie, moet vatbaar voor andere genomic locaties en organisatieonderdelen doelgenen.- PCR-versterken een 520-base paar segment van de URA3 verslaggever gen met behulp van de volgende paar van de primer: URA3-F1 (5´-GCTACATATAAGGAACGTGCTGC) en URA3-R1 (5´-CTTTGTCGCTCTTCGCAATGTC).
- Uitvoeren van de PCR-reactie met behulp van 10-20 ng van de genomic DNA van de gist als een sjabloon, 4 μL van elke primer (10 μM stock), 10 μL van 10 x Ex Taq Buffer (Mg2 + plus), 8 μL van dNTP mengsel (elke 2.5 mM), 0,5 μL van Ex Taq Polymerase van DNA (5 U/μl) , en het uiteindelijke volume aan 100 μl met H2O.
- Voer het volgende programma van PCR: 95 ° C gedurende 5 minuten; 30 cycli van 95 ° C gedurende 1 min., 55 ° C gedurende 1 min, 72 ° C gedurende 2 minuten; 72 ° C gedurende 10 minuten en houd bij 4 ° C.
- Zuiveren van het PCR-product met behulp van een PCR zuivering kit en elueer de DNA met behulp van 50 mL H2O. Dit kan nu worden gebruikt als de sjabloon in de radiolabeling reactie.
- Gebruik de volgende inleidingen voor strand-specifieke radiolabeling: gebruik URA3-A (5´-CTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCC) voor het visualiseren van DNA die anneals sonde A. Dit komt overeen met het ontluikende toonaangevende streng DNA wanneer URA3 in en2 en de lagging strand DNA is als URA3 in OR1 tnascent. URA3-B (5´-CAGTACCCTTAGTATATTCTCCAG) gebruiken voor het visualiseren van ontluikende DNA die anneals sonde B. Dit komt overeen met het ontluikende toonaangevende streng DNA wanneer URA3 is OR1 en ontluikende lagging strand DNA wanneer URA3 in en2 is (Figuur 3).
- Uitvoeren van de radiolabeling reactie met behulp van 10-20 ng versterkt URA3 fragment als sjabloon DNA, 2 μL van de primer (10 μM stock), 5 μl van 10 x Ex Taq Buffer (Mg2 + plus), 4 μL van 2.5 mM dNTPs (min dCTP), 5 μl (50 aanbevolen) voor een -32P-dCTP , 0,5 μL van de Polymerase van het DNA van de ExTaq (5 U/μl) en het uiteindelijke volume naar 50 μl met H2O. Run het volgende programma voor radiolabeling: 94 ° C gedurende 5 minuten; 25 cycli van 94 ° C voor 1 min, 55 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 1 min; 72 ° C gedurende 5 minuten en houd bij 4 ° C.
- Gebruik een G-25 spin kolom te verwijderen designated radioactieve label. Centrifugeer voorafgaand aan toe te voegen het radiolabeled monster, de kolom voor 1 min op 720 x g en removethe buffer door pipetteren. De radiolabeled reactieproduct en Centrifugeer gedurende 2 min op 720 x g tot elueer de gelabelde sonde laden.
- Incubeer bij 95 ° C gedurende 5 min te denatureren van de sonde onmiddellijk voorafgaand aan de hybridisatie. Cool kort op ijs.
- Zuidelijke hybridisatie
- Het wordt bevochtigd membraan rollen in een kruising buis en voeg 25 mL vers bereide hybridisatie buffer: 0,5 M natriumhydroxide fosfaatbuffer, pH 7,2, 7% natrium dodecyl sulfaat (SDS), 1% bovien serumalbumine (BSA). Incubeer bij 65 ° C gedurende 1-2 h met rotatie in een oven van hybridisatie.
- Zorgvuldig giet af de oplossing en voeg 25 mL hybridisatie buffer plus de hoeveelheid radioactief gemerkte sonde. Incubeer bij 65 ° C gedurende 16-18 h met rotatie.
- Giet af de oplossing in een radioactieve afval container. Uitvoeren van 5 wasbeurten van 5 minuten bij kamertemperatuur met fosfaat-SDS wassen oplossing I: 40 mM natrium fosfaatbuffer, pH 7,2, 5% SDS, 0,5% BSA, 1 mM EDTA, pH 8,0.
- Uitvoeren van 2 wasbeurten van 15 min bij 65 ° C met fosfaat-SDS wassen oplossing II: 40 mM natrium fosfaatbuffer, pH 7,2, 1% SDS, 1 mM EDTA, pH 8,0.
- Verwijder het membraan van de buis van de kruising met pincet en plaats in een geopende plastic hoes beschermer. Cover en bloot te stellen aan een imaging plaat. Probeer een aantal verschillende blootstellingstijden variërend van 4 h tot en met 4 d.
- Indien nodig, strippen en opnieuw sonde de vlek met een verschillende sonde ongeveer 3 - 4 keer. Incubeer het membraan gedurende 2 uur bij 65 ° C in 25 mL van een 50% formamide, 2 x SSPE oplossing om te strippen.
Opmerking: 20 x SSPE stockoplossing: 3 M NaCl, 0,2 M NaH2PO4, 0,02 M EDTA, pH 7.4. - Giet af de oplossing in een radioactieve afval container. 2 wasbeurten van 15 min bij 65 ° C in fosfaat-SDS wassen oplossing II uitvoeren.
- Controleer het membraan met een geigerteller en herhaal het strippen protocol als signaal blijft.
- Pre kruising en kruising uitvoeren zoals hierboven beschreven.
2. meten van mutaties en specificiteit bij S. cerevisiae stammen
- Voorbereiden van de cultuur van de cel
- Inoculeer een één kolonie (gezonde gist cellen neemt 2-3 dagen bij 30 ° C tot vorm juiste formaat kolonies) geteeld op YPD agar aangevuld met 100 mg/mL adenine in 5 mL van YPDA Bouillon aangevuld met 250 mg/mL adenine (de suppletie van adenine is alleen nodig als de stam is een adenine-auxotroph). Groeien in een shaker incubator of op een rotator bij 30 ° C tot de cultuur verzadiging (36-48 h voor een stam zonder een ernstige groei defect bereikt).
- Spin down de cellen bij ~ 2000 x g gedurende 5 min.
- Verwijder het supernatant en wassen van de cellen met 5 mL steriel water.
- Resuspendeer de cellen in 500 mL steriel water.
- Verdunning van de celcultuur en beplating
- Verdun de cellen in een 96-wells-plaat met een factor van 1.600.000 en plaat 100 mL elke cultuur op een volledige (COM)-bord voor niet-selectie besturingselementen.
- Schakel voor ura3 mutanten, plaat 100 mL onverdund cellen op een bord van 5-FOA voor een spanning van wild-type (WT). Verdun de cellen dienovereenkomstig als de mutatie van de stam van belang naar verwachting hoger zijn dan bij een WT-stam.
- Schakel voor can1 mutanten, Verdun de cellen 5-voudig en plaat 100 mL op een plaat canavanine-bevattende (CAN) voor een WT-stam. De verdunningsfactor is 0,5.
- Incubeer de platen bij 30 ° C tot gist kolonies vormen. Voor stammen zonder een groei defect, 2-3 dagen is meestal voldoende voor COM en kan platen en 3-5 dagen voor 5-FOA platen. Om te vergelijken de mutatie tarieven tussen verschillende stammen, is het het beste om te kiezen van dezelfde dag van groei te tellen kolonies. Bewaar de platen klaar om te worden geteld in de koude kamer (~ 4 ° C).
- Berekening van spontane mutaties
- Zichtbare kolonies op elke plaat tellen en neem daar nota van kolonie getallen
- Bereken het percentage van de mutatie met behulp van Drake's formule: μ = f ÷ ln (μNt). f is de mutatiefrequentie berekend door het aantal mutanten gedeeld door het aantal cellen in de laatste cultuur. NT is het aantal cellen in de laatste cultuur en μ is de mutaties. Deze vergelijking kan worden opgelost door een iteratieve methode zoals de Newton-Raphson methode. Er zijn andere methoden van de schatter, inclusief de Lea en Coulson test, voor de berekening van de mutatie tarief15.
- Bereken de betrouwbaarheidsinterval uitgaande logboek normaalverdeling van de utation tarieven van individuele isolaten. De 95%-betrouwbaarheidsinterval wordt meestal gebruikt.
- Analyse van mutatie spectrum
- Kies een één kolonie van elke 5-FOA of kunt plaat en vernieuw op een plaat van YPDA.
- Uitvoeren van PCR te versterken van de URA3 of CAN1 gen en de volgorde om op te sporen met behulp van de volgende inleidingen mutaties van de kolonie: URA3-F (5'-CGCATATGTGGTGTTGAAGAA-3') en URA3-R (5'-TGTGAGTTTAGTATACATGCA-3') voor beide PCR versterking en rangschikking van de 800 bp URA3 gen; CAN1-F (5'-CTTCTACTCCGTCTGCTTTC-3') en CAN1-R (5'-CAGAGTTCTTCAGACTTC-3') voor versterking en CAN1-AR (5'-TGAAATGTGAAGGCAGCGTT-3'), CAN1-9R (5'-CCTGCAACACCAGTGATA-3'), CAN1-10R (5'-GAGGATGTAACAGGGATGAAT-3') en CAN1-BR ( 5'-CGGTGTATGACTTATGAGGG-3') voor het rangschikken van de 1800 bp CAN1 verslaggever gen.
- Voor het uitvoeren van PCR van de kolonie, resuspendeer een één kolonie in 5 μL van H2O en 1 μL gebruiken als sjabloon. Voeg 1 μl van elk van de inleidingen (5 μM stock), 2 μL van 5 x KAPA2G Buffer (Mg2 + plus), 0,5 μL van dNTP (2,5 mM), 0,5 μL van KAPA2G snel Polymerase van DNA, 12 μL van H2O.
- Voor de versterking van URA3 gen, voer het volgende programma van de PCR: 95 ° C gedurende 5 minuten; 5 cycli van 95 ° C voor 10 s, 61 ° C gedurende 15 s, 72 ° C gedurende 30 s; 35 cycli van 95 ° C voor 10 s, 61 ° C gedurende 15 s, 72 ° C gedurende 30 s; 72 ° C gedurende 2 min en houd bij 4 ° C. Voor de versterking van CAN1 gen, voer het volgende programma van de PCR: 95 ° C gedurende 5 minuten; 5 cycli van 95 ° C voor 10 s, 61 ° C gedurende 15 s, 72 ° C gedurende 45 s; 35 cycli van 95 ° C voor 10 s, 61 ° C gedurende 15 s, 72 ° C gedurende 45 s; 72 ° C gedurende 2 min en houd bij 4 ° C.
- Hiermee lijnt u de reeksnummers resultaten in een referentie-reeks met een programma zoals DNASTAR Seqman Pro of Sequencher te identificeren van mutaties.
- Het compileren van de gegevens van de mutaties door mutatie type (Figuur 4) of mutatie locatie (Figuur 5). Bereken de specifieke mutatie tarieven door de frequentie van een mutatie (het aantal gebeurtenissen waargenomen gedeeld door aantal mutanten sequenced) vermenigvuldigd met de algehele mutaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Behandeling van genomic DNA met alkali gevolgd door alkalische gelelektroforese zorgt voor semi-kwantitatieve opsporing van de fragmentatie van DNA wegens de overvloed van stabiel opgenomen ribonucleotides. Figuur 2 toont de beelden van de gel van gist genomic DNA behandeld met of zonder KOH5. De M644L variant van de Pol2, de katalytische subeenheid van Polε, heeft de mogelijkheid om op te nemen ribonucleotides terwijl de mutant M644G meer ribonucleotides dan de WT polymerase bevat verminderd. Zoals beschreven in het protocol, kan de alkalische gel verder worden peilden door strand-specifieke zuidelijke vlekkenanalyse. Met de kennis van de locatie van de peilden genomic site ten opzichte van de aangrenzende oorsprong ervan, kunnen we selectief sonde ribonucleotides opgenomen in de ontluikende voorloop- of achtergebleven strengen. Figuur 3 toont de resultaten van de zuidelijke vlek indringende het URA3 verslaggever gen ingevoegd in twee tegenovergestelde richtingen dicht bij een vroege-vuren replicatie oorsprong, ARS30616. Met behulp van toonaangevende strand-specifieke sondes, observeren wij het DNA fragmentatie patroon veroorzaakt door alkali-decollete op ribonucleotides in de ontluikende toonaangevende streng DNA in een WT-stam en in stammen uitdrukken van de varianten van polymerase α, δ en ε die promiscue voor ribonucleotide inwerken.
Met behulp van een schommeling experiment, kunnen we meten de mutatie tarieven van giststammen die verslaggever genen bevatten. Figuur 4 toont de mutatie tarieven van de URA3 en CAN1 loci van stammen uiting WT polymerase of de pol2-M644G -mutant met of zonder functionele RNase H2. Het gebrek aan RNase H2 veroorzaakt een matige toename totale mutatie tarieven in de beide achtergronden. Echter nader onderzoek van de specificiteit van de mutatie blijkt dat bij stammen RNase H2 ontbreekt (Figuur 5), is er een sterke stijging in de mutaties voor korte deleties, met name in tandem herhalen sequenties. Figuur 5A vergelijkt de specificiteit van de mutatie in WT en rnh201Δ -stammen en figuur 5B geeft het vogelgriepvirus effect van verdere verhoogde ribonucleotide opneming in de ontluikende toonaangevende bundel van DNA door Pol ε.
Figuur 1: stappen betrokken bij het strand-specifieke detectie van alkali-gevoelige sites veroorzaakt door ribonucleotide opneming in genomic DNA van de gist Protocol. Een overzicht van de verschillende grote stappen in deze procedure, beginnend met gist genomic DNA isolatie en verloopt via de laatste zuidelijke vlekkenanalyse. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: een representatief beeld van de resultaten verkregen door de Elektroforese van het gel van de alkalische-agarose. Dit percentage is aangepast van Nick McElhinny, S. A. et al. 5. de genomic DNA van de gist van stammen van verschillende genotypen werd behandeld met KCl (neutraal) of KOH (alkalisch) en klik vervolgens op een neutrale of alkalische agarose gel gescheiden. "WT" en "M644G" geven de status van Pol ε. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Strand-specifieke sonderen van een alkalische-agarose gel door Southern blot. Dit percentage is aangepast van Williams, J. S. et al. 13. (A) de radiolabeled sondes aan de ontluikende toonaangevende bundel van DNA binnen het URA3 verslaggever gen die dicht bij de ARS306 in twee tegenovergestelde richtingen (OR1 en en2 ontharden) is ingevoegd. (B) representatieve resultaten van het Zuidelijke bevlekken met behulp van de ontluikende toonaangevende strand-specifieke sondes. Weergegeven zijn de indringende resultaten voor de ontluikende toonaangevende strand in een stam met WT DNA-polymerase, of de pol1-L868M, pol2-M644G of de pol3-L612M variant stammen met of zonder RNase H2. De POL1, POL2, en POL3 genen coderen katalytische subeenheden van Pols α, ε en δ, respectievelijk. De varianten zijn meer promiscue voor ribonucleotide opneming5,12,17. (C) kwantificering van het radioactieve signaal door de Fractie van de totale in elke rijstrook van (B). Waarden worden uitgedrukt als een percentage van het totaal. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: spontane mutatie tarieven in giststammen. Dit percentage is aangepast van Nick McElhinny, S. A. et al. 5. de URA3 en CAN1 verslaggever genen werden gebruikt in de voorwaartse mutatie test voor het meten van de tarieven van de mutatie van de aangegeven stammen. URA3 verslaggever is in "oriëntatie 2" (en2, figuur 3A). Het 95% betrouwbaarheidsinterval (CI) is opgenomen voor elke meting. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: mutatie spectra voor het URA3-en2 verslaggever gen. Dit percentage is aangepast van eerdere publicaties5,18,19,20. Het type van het standpunt en mutatie waargenomen in elke onafhankelijke 5-FOA-resistant kolonie in de voorwaartse mutatie assay geselecteerd worden afgebeeld in de 804 bp URA3 codering volgorde. Brieven geven base vervangingen, open driehoeken geven enkele basis verwijderingen, gesloten driehoeken geven enkele basis invoegingen, en ononderbroken lijnen geven korte verwijderingen. (A) mutatie spectra in WT en rnh201Δ stammen. Rode labels boven de volgorde zijn mutaties waargenomen in WT terwijl blauwe etiketten onder de volgorde waargenomen in een rnh201Δ stam zijn. (B) de spectra van de mutatie in pol2-M644G en pol2-M644G-rnh201Δ stammen. Rode labels boven de volgorde zijn mutaties waargenomen in pol2-M644G terwijl het blauw hieronder de volgorde voor de pol2-M644G-rnh201Δ stammen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we de protocollen voor twee sets van experimenten die vaak gebruikt worden voor het analyseren van semi-kwantitatief ribonucleotides tijdens de replicatie van DNA en de mutagene effecten van herstelde ribonucleotides opgenomen. Hoewel deze benaderingen de eukaryote model S. cerevisiae betrekken, kunnen deze technieken gemakkelijk worden aangepast aan andere microben en zelfs hogere eukaryoten.
Indringende voor herstelde ribonucleotides in DNA met behulp van alkalische-agarose de elektroforese in combinatie met de Southern blotting bevat belangrijke informatie met betrekking tot het aantal ribonucleotides aanwezig en het onderdeel waarin ze zijn opgenomen. Het is echter belangrijk op te merken dat alkali-gevoeligheid kan ook worden veroorzaakt door andere DNA-beschadigingen, zoals een abasic site. Een ander middel voor het opsporen van ribonucleotides in DNA is door de behandeling met gezuiverde RNase H2 enzym, zoals is gebeurd in zoogdiercellen21. Hoewel onze benadering indringende voor alkali-gevoelige sites in de ontluikende leiding houdt versus achtergebleven strengen in het URA3 verslaggever gen in onze experimenten vogelgriepvirus analyse gebruikt, is het mogelijk om te ontwerpen de sondes die op andere locaties in volgorde gloeien belangrijk om informatie te verkrijgen over ribonucleotide dichtheid bij andere genomic sites. De zuidelijke vlek-gedeelte van de procedure kan ook worden gebruikt als referentie voor andere generieke indringende experimenten van DNA.
Meten van mutatie tarieven met behulp van een test van de schommeling is wijd verbeid gebruikt voor de analyse van verschillende mutagene gebeurtenissen in micro-organismen, en dus is niet beperkt tot de analyse van de mutagene gevolgen van ribonucleotides in DNA. Voor dit experiment, kan verhoging van het aantal onafhankelijke culturen sterk verbeteren de nauwkeurigheid van de meting. Onafhankelijke kolonies kunnen worden verkregen door een stam van belang op YPDA medium strepen of door de analyse van onafhankelijke spore kolonies verkregen door tetrad dissectie van een diploïde gist vlek. In het ideale geval het gebruik van meerdere onafhankelijke haploïde giststammen (bv., van tetrad dissectie) wordt aangemoedigd om te minimaliseren van de gevolgen van spanning-naar-spanning variatie. Dit is met name belangrijk wanneer de spontane mutaties hoog is of wanneer de stam een groei-defect heeft. Een aanvullende methode die kan worden ingezet voor het meten van spontane de mutaties is een mutatie accumulatie experimenteren22. In deze analyse, mutatiefrequentie voor de cellen wordt bepaald, na uitgebreide groei en kan worden gebruikt om te berekenen voor de mutaties. Koppeling van een mutatie accumulatie experiment met diepe sequencing technologie heeft aangetoond dat een krachtig hulpmiddel om de mutaties en specificiteit over het genoom te analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken alle huidige en voormalige Kunkel Lab-leden voor hun werk en discussies met betrekking tot protocol en hergebruikt van de hier gepresenteerde gegevens. Dit werk werd ondersteund door Project Z01 ES065070 tot T.A.K. van de divisie van de intramurale onderzoek van de National Institutes of Health (NIH), National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| YPD media | 20 g dextrose, 20 g peptone, 10g yeast extract, in deionized H2O up to 1 L, add 20 g Bacto agar for solid media, autoclave. | ||
| COM plates | 1.3 g SC dropout mix, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar deionized H2O up to 1 L. Adjust pH to 5.8. Autoclave and 30 – 35 ml per plate. | ||
| CAN plates | 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 1 L. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 56 °C. Add 6 mL of filter-sterilized 1% canavanine sulfate solution. | ||
| 5-FOA plates | 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 800 mL. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 60 °C. Add 200 mL of filter-sterilized 0.5% 5-FOA solution. | ||
| L-Canavanine sulfate | US Biological | C1050 | |
| 5-FOA | US Biological | F5050 | |
| 20 mL glass culture tube | Any brand | ||
| Culture rotator in 30 °C incubator | Shaker incubator can be used instead | ||
| 96 well round bottom plates | Sterile, any brand | ||
| 3 mm glass beads | Fisher Scientific | 11-312A | Autoclave before use |
| 12-channel pipettes | Any brand | ||
| Ex Taq DNA Polymerase | TaKaRa | RR001 | |
| Epicentre MasterPure Yeast DNA Purification Kit | Epicenter | MPY80200 | |
| 3 M sodium acetate | Sigma-Aldrich | S7899 | |
| 100% ethanol | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | Newer model available |
| dsDNA BR Assay kit | Invitrogen | Q32850 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Ficoll 400 | Dot Scientific Inc. | DSF10400 | |
| Bromocresol green | Eastman | 6356 | |
| Xylene cyanol FF | International Technologies Inc. | 72120 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 1 M Tris-HCl (pH 8.0) | Teknova | T5080 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S11494 | |
| UV transilluminator | |||
| Amersham Nylon membrane Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN303B | |
| 3 MM CHR Chromotography paper | Whatman | 3030-392 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| Stratalinker 1800 | Stratagene | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| G-25 spin column | GE Healthcare | 27-5325-01 | |
| 1 M Sodium phosphate buffer (pH 7.2) | Sigma-Aldrich | NaH2PO4 (S9638); Na2HPO4 (S9390) |
|
| SDS | Sigma-Aldrich | L4522 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671 | |
| Geiger counter |
References
- Joyce, C. M. Choosing the right sugar: how polymerases select a nucleotide substrate. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 94 (5), 1619-1622 (1997).
- Nick McElhinny, S. A., et al. Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (11), 4949-4954 (2010).
- Sparks, J. L., et al. RNase H2-initiated ribonucleotide excision repair. Molecular Cell. 47 (6), 980-986 (2012).
- Li, Y., Breaker, R. R. Kinetics of RNA Degradation by Specific Base Catalysis of Transesterification Involving the 2'-Hydroxyl Group. Journal of the American Chemical Society. 121 (23), 5364-5372 (1999).
- Nick McElhinny, S. A., et al. Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA. Nature Chemical Biology. 6 (10), 774-781 (2010).
- Williams, J. S., Kunkel, T. A. Ribonucleotides in DNA: origins, repair and consequences. DNA Repair (Amst). 19, 27-37 (2014).
- Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (6), 350-363 (2016).
- Jones, M. E., Thomas, S. M., Rogers, A. Luria-Delbruck fluctuation experiments: design and analysis. Genetics. 136 (3), 1209-1216 (1994).
- Zheng, Q. A new practical guide to the Luria-Delbruck protocol. Mutat Research. 781, 7-13 (2015).
- Sambrook, J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
- Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. The major roles of DNA polymerases epsilon and delta at the eukaryotic replication fork are evolutionarily conserved. PLoS Genetics. 7 (12), e1002407 (2011).
- Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. Ribonucleotides are signals for mismatch repair of leading-strand replication errors. Molecular Cell. 50 (3), 437-443 (2013).
- Williams, J. S., et al. Topoisomerase 1-mediated removal of ribonucleotides from nascent leading-strand DNA. Molecular Cell. 49 (5), 1010-1015 (2013).
- Clausen, A. R., et al. Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 185-191 (2015).
- Foster, P. L. Methods for determining spontaneous mutation rates. Methods Enzymology. 409, 195-213 (2006).
- Williams, J. S., et al. Evidence that processing of ribonucleotides in DNA by topoisomerase 1 is leading-strand specific. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (4), 291-297 (2015).
- Pavlov, Y. I., Shcherbakova, P. V., Kunkel, T. A. In vivo consequences of putative active site mutations in yeast DNA polymerases alpha, epsilon, delta, and zeta. Genetics. 159 (1), 47-64 (2001).
- Nick McElhinny, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. Differential correction of lagging-strand replication errors made by DNA polymerases {alpha} and {delta}. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (49), 21070-21075 (2010).
- Clark, A. B., Lujan, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. Mismatch repair-independent tandem repeat sequence instability resulting from ribonucleotide incorporation by DNA polymerase epsilon. DNA Repair (Amst). 10 (5), 476-482 (2011).
- Lujan, S. A., et al. Mismatch repair balances leading and lagging strand DNA replication fidelity. PLoS Genetics. 8 (10), e1003016 (2012).
- Reijns, M. A., et al. Enzymatic removal of ribonucleotides from DNA is essential for mammalian genome integrity and development. Cell. 149 (5), 1008-1022 (2012).
- Lujan, S. A., et al. Heterogeneous polymerase fidelity and mismatch repair bias genome variation and composition. Genome Research. 24 (11), 1751-1764 (2014).
