Summary
Vi præsenterer her, en protokol til syntese af placenta chondroitin sulfat A bindende peptid (plCSA-BP)-konjugeret lipid-polymer nanopartikler via trinvis ultralydbehandling og bioconjugate teknikker. Disse partikler udgør en roman redskab til målrettet levering af therapeutics til mest humane tumorer og placenta trophoblasts til behandling af kræft og placenta lidelser.
Abstract
En effektiv kræft terapeutiske metode reducerer og eliminerer tumorer med minimal systemisk toksicitet. Aktivt målretning nanopartikler tilbyder en lovende tilgang til kræftbehandling. Glykosaminoglykan placenta Chondroitinsulfat en (plCSA) er udtrykt på en bred vifte af kræftceller og placenta trophoblasts og malaria protein VAR2CSA kan specifikt binder sig til plCSA. En rapporteret placenta chondroitin sulfat A bindende peptid (plCSA-BP), afledt af malaria protein VAR2CSA, kan også specifikt binder sig til plCSA på kræftceller og placenta trophoblasts. Derfor kunne plCSA-BP-konjugeret nanopartikler bruges som et redskab til målrettet medicinafgivelse menneskelige kræftformer og placenta trophoblasts. I denne protokol beskriver vi en metode til at syntetisere plCSA-BP-konjugeret lipid-polymer nanopartikler fyldt med doxorubicin (plCSA-DNPs); Metoden består af en enkelt sonikering trin og bioconjugate teknikker. Derudover er flere metoder til at karakterisere plCSA-DNPs, herunder fastsættelsen af fysisk-kemiske egenskaber og cellulære optagelse af placenta choriocarcinoma (JEG3) celler, beskrevet.
Introduction
En effektiv kræft terapeutiske metode reducerer og eliminerer tumorer med minimal systemisk toksicitet. Dermed er selektiv tumor målretning nøglen til at udforske vellykket terapeutiske metoder. Nanopartikler giver en lovende mulighed for kræftbehandling, og molekylære enheder med forskellige funktionelle grupper vil forbedre drug effektivitet og reducere forbundet bivirkninger1,2. Derudover udnytter nanopartikel systemer hovedsagelig passive og aktive målretning til at nå målet tumorer3.
Passiv målretning udnytter de medfødte egenskaber af nanopartikler og øget permeabilitet og opbevaring (EPR) effekter at nå tumorceller. Kationiske Liposomer har held været anvendt til at levere forskellige anticancermedicin til tumorer i kliniske anvendelser4,5,6. Trods den potentielle effektive kræft terapeutiske effekt, en lav drug koncentration i regionen tumor og manglende evne til at skelne mellem tumorceller fra normalt væv er to store begrænsninger i passiv-targeting nanopartikler7.
Aktive målretning strategier drage fordel af antigen-antistof, ligand-receptor og andre Molekylær anerkendelse interaktioner specifikt levere lægemidler til tumorer8. Glykosaminoglykan placenta Chondroitinsulfat en (plCSA) udtrykkes bredt på de fleste kræftceller og placenta trophoblasts. Derudover malaria proteinet VAR2CSA kan specifikt binder til plCSA9,10. Derfor kan VAR2CSA være et redskab til at målrette menneskelige kræftceller. Men når VAR2CSA er konjugeret med nanopartikler, fuldlængde protein kan begrænse indtrængen af nanopartikler i tumorceller. For nylig opdagede vi en plCSA bindende peptid (plCSA-BP), afledt af malaria proteinet VAR2CSA. plCSA-BP-konjugeret lipid-polymer nanopartikler hurtigt bundet til choriocarcinoma celler og signifikant øget doxorubicin (DOX) anticancer aktivitet i vivo11; disse partikler også specifikt bundet til placenta trophoblasts og kunne tjene som et redskab til målrettet levering af lægemidler til moderkagen12.
Lipid-polymer nanopartikler består af en lipid éncellelag shell og en hydrofobe polymere kerne og repræsenterer en ny transportør for drug delivery. Disse nanopartikler kombinere fordelene ved Liposomer og polymere nanocarriers, kontrollerbar nanopartikel størrelse, høj biokompatibilitet, vedvarende drug frigivelse, høj drug lastning effektivitet (LE) og fremragende stabilitet13. I dette arbejde brugte vi en trinvis sonikering metode til at syntetisere lipid-polymer nanopartikler. Denne metode er hurtig, bekvem og egnet til opskalering og har været meget anvendt til at forberede lipid-polymer nanopartikler af vores gruppe11,14 og andre15,16,17,18 .
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochlorid (EDC) er en populær carbodiimide anvendes som en crosslinking agent for de tråddannende biomolekyler indeholdende aminer og carboxylates19. Ud over EDC er N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) den mest almindelige konjugation reagens i overfladen og nanopartikel konjugation reaktioner20,21. NHS kan reducere antallet af side reaktioner og øge stabiliteten og udbytte af ester mellemprodukter22,23.
Her, beskriver vi en protokol for syntese af plCSA-målrettet lipid-polymer nanopartikler. Først, trinvis sonikering syntesen af DOX-loaded lipid-polymer nanopartikler (DNPs) er beskrevet. Derefter, en EDC/NHS bioconjugate teknik til at generere plCSA-BP-konjugeret lipid-polymer nanopartikler er indført. Denne bioconjugate teknik kan også bruges til konjugat andre antistoffer og peptider for nanopartikler. Endelig vil beskrive vi fysisk-kemiske egenskaber og in vitro- analysen bruges til at karakterisere plCSA-målrettet lipid-polymer nanopartikler. Vi mener, at disse plCSA-målrettet lipid-polymer nanopartikler kunne udgøre et effektivt system for målrettet levering af lægemidler til de fleste menneskelige kræftformer og målrettet levering af lasterne til moderkagen til behandling af placenta lidelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fremstilling af stamopløsninger
- Forberede en vandig opløsning af 4% ethanol ved fortynding af 4 mL af absolut ethanol med 100 mL i ultrarent vand. Butik løsning ved 4 ° C.
Bemærk: Ultrarent vand er defineret som vand uden forurenende stoffer såsom bakterier, partikler, ioner eller nukleaser. Ultrarent vand blev indhentet fra et vandrensningssystem med en target resistivitet af op til 18.2 mΩ·cm, hvilket betyder lav anioniske forurening. - Forberede en 1 mg/mL soja lecithin stamopløsning ved at opløse 20 mg soja lecithin i 20 mL af den vandige opløsning 4% ethanol. Butik soja lecithin stamopløsningen ved 4 ° C.
- Forberede en 25 mg/mL DSPE-PEG (2000)-COOH stamopløsning ved at opløse 100 mg af DSPE-PIND-COOH i 4 mL af den vandige opløsning 4% ethanol. Butik stamopløsning ved-20 ° C.
- Forberede en 10 mg/mL DOX stamopløsning ved at opløse 50 mg af DOX i 5 mL i ultrarent vand. Gemme DOX stamopløsning ved 4 ° C i mørke.
- Forbered en 2 mg/mL stamopløsning, hvis PLGA ved at opløse 20 mg af PLGA i 10 mL acetonitril. Butik PLGA stamopløsning ved 4 ° C.
Forsigtig: Acetonitril er brandfarlige og giftige. Operere med forsigtighed i et stinkskab, og bære passende personlige udstyr, såsom lab frakker, sikkerhedsbriller og latex handsker. - Forberede en 0,1 M 2-(morpholino) ethanesulfonic syre (MES, pH 6.0) bestand løsning ved at opløse 2.17 g af MES i 100 mL i ultrarent vand. Butik stamopløsning ved 4 ° C.
2. Sammenfatning af DNPs
Bemærk: For at undgå DOX fotokemisk nedbrydning, alle operationer blev udført i mørke.
Nanopartikler blev syntetiseret af en tidligere rapporteret trinvis sonikering metode11,13,14.
- Tilføj 3 mL af den vandige opløsning 4% ethanol til en steril 10 mL centrifugeglas. Tilføj derefter 90 µg soja lecithin stamopløsning, 210 µg DSPE-PIND-COOH stamopløsning og 750 µg DOX stamopløsningens til 3 mL af den vandige opløsning 4% ethanol.
- Centrifuge røret anbringes i isbad, og placere iskarret på en ultralyd processor.
- Med en 1 mL sprøjte, der afpipetteres 2 mg PLGA stamopløsningens dråbevis (1 dråbe/4-6 s) i centrifugeglasset. I mellemtiden, sonikeres røret ved hjælp af en ultralyds processor på en frekvens på 20 kHz og en output amplitude på 30% for 5 min for at syntetisere DNPs.
Bemærk: For at syntetisere ensartede partikler med små størrelser, den hastighed, hvormed PLGA løsningen er dryppede ind i røret skal være langsom og boble generation bør undgås. - Rense DNPs ved at vaske ovenstående løsning i 0,1 M MES buffer (pH 6.0) 3 gange ved hjælp af en centrifuge filter (MWCO, 10 kDa). Der centrifugeres ved 4 ° C og 1000 × g i 3 min. hver gang. Endelig, ca. 1 mL af MES-løst nanopartikler bør forblive.
Bemærk: Dette er en acceptabel standsested i proceduren. Hvis ikke anvendes til konjugat peptider, af nanopartikler kan renses af PBS buffer (pH 7,4), og de renset DNPs kan opbevares ved 4° C i mørke.
3. konjugation af peptider til DNPs
-
Ester aktivering
- Tilføje 0,4 mg af EDC (slutkoncentration 2 mM) til 1 mL af DNPs.
- Tilføje 0,24 mg af NHS til reaktionen (slutkoncentration 2 mM).
Bemærk: For nem tilføjelse af det korrekte antal EDC og NHS, en stamopløsning kan være forberedt, hvis reagenserne er opløst og bruges straks. - Bland reaktion komponenter godt, og Placer reaktionen på en shaker; Tillad reaktion for 30 min - 1 time ved stuetemperatur i mørke.
-
Amin reaktion
- Øge buffer pH til 7,2-7,5 ved hjælp af PBS (20 ×, pH 7,4).
- Tilføje 0,5 mg af målretning af plCSA peptid (plCSA-BP, EDVKDINFDTKEKFLAGCLIVSFHEGKC) til reaktion løsning.
Bemærk: Før tilsætning, opløse peptider i 20% acetonitril. Hvis peptider ikke er opløselige, kan sonikering i et badekar sonikator hjælpsom. - Bland opløsningen godt, og derefter placere på en shaker; Tillad reaktion at fortsætte ved 4 ° C natten over i mørke.
- Placere konjugat løsning i dialyse poser (MWCO, 3.500 Da) til dialyze og rense plCSA-DNPs ved hjælp af PBS (pH 7,4) buffer ved stuetemperatur i 24 timer i mørke.
Bemærk: Alternativt rensning kan udføres som i trin 2.4 at opnå plCSA-DNPs. - For celle kultur applikationer, rekonstitueret Opløsningen filtreres gennem et 0,22 µm steril sprøjte filter til at fjerne potentielle bundfald.
4. karakterisering af plCSA-målrettet Lipid-Polymer nanopartikler
-
Måling af den hydrodynamiske nanopartikel størrelse ved hjælp af dynamisk lysspredning (DLS)
- Fortyndet nanopartikler med ultrarent vand (50-fold fortynding). Indlæse 500 µL af prøven i en kuvette efter anvisninger af DLS eller zeta potentielle instrument.
Bemærk: Zeta potentiale og DLS kuvetter kan variere baseret på instrumentets specifikationer. - Efter målingen er afsluttet, registrere partikel diameter, polydispersity index (PDI) og zeta potentiale. Gennemsnitlige resultaterne fra 4 gentagne behandlinger, og beregne standardafvigelsen.
- Fortyndet nanopartikler med ultrarent vand (50-fold fortynding). Indlæse 500 µL af prøven i en kuvette efter anvisninger af DLS eller zeta potentielle instrument.
-
Transmissions elektronmikroskopi (TEM)
Bemærk: Morfologi af nanopartikler blev observeret af TEM med metoden negative pletten. 24- Fortyndet nanopartikler med ultrarent vand (400-fold fortynding). Tilføje 20 µL af prøven til et TEM gitter, og lad sidde i 5 min.
- Tilsæt 100 µL af 2% (w/v) phosphorwolfram syre og lad sidde i 2 min. vægen væk slipværktøjet.
- Tørre TEM gitteret ved stuetemperatur.
- Indstille TEM acceleration spænding på 80 kV, og forstørre billedet til 100.000 × at visualisere nanopartikler.
-
Bestemmelse af indkapsling effektivitet (EE) og LE
- Standardkurven generation. Opløse DOX i ultrarent vand for at forberede DOX løsninger i fem forskellige koncentrationer: 1 µg/mL, 5 µg/mL, 10 µg/mL, 50 µg/mL og 100 µg/mL. Måle absorptionen af DOX løsninger på 480 nm med en UV-VIS spektrometer. Generere en standardkurve, der er baseret på DOX koncentrationer.
- Fortyndet 25 µL af nanopartikler med 500 µL ultrarent vand. Måle absorption på 480 nm med en UV-VIS spektrometer. Beregne stof koncentrationer af standardkurven.
- Beregne LE ved hjælp af følgende ligning:
LE = ((mængden af narkotika i nanopartikler) / (samlet vægt af materialer)) × 100%. - Beregne EE ved hjælp af følgende ligning:
EE = ((mængden af narkotika i nanopartikler) / (mængden af tilsat stof)) × 100%.
-
Måling af konjugation effektivitet ved hjælp af bicinchoninic syre (BCA) analysen 25 , 26 , 27
- Der afpipetteres 25 µL af standard peptid løsninger (tabel 1) eller plCSA-DNPs i mikrotiterplade brønde i to eksemplarer. Tilføje 200 µL af den arbejdende reagens til hver brønd, og bland pladen godt på en plade shaker til 30 s.
- Dække nummerpladen, og der inkuberes ved 37 ° C i 30 min.
- Absorbansen måles på 562 nm på en pladelæseren. Bruge den genererede standardkurve til at beregne plCSA koncentrationer af plCSA-DNPs.
- Beregne konjugation effektivitet ved hjælp af følgende ligning:
Konjugation effektivitet = ((mængden af peptid i nanopartikler) / (antal tilføjet peptid)) × 100%.
| Hætteglas | Mængde fortyndingsmiddel (μL) | Volumen og kilde af peptid (μL) | Endelige peptid koncentration (μg/mL) |
| A | 0 | 300 af materiel | 1000 |
| B | 250 | 250 af hætteglasset en fortynding | 500 |
| C | 250 | 250 af hætteglasset B fortynding | 250 |
| D | 250 | 250 af hætteglasset C fortynding | 125 |
| E | 300 | 200 af hætteglasset D fortynding | 50 |
| F | 250 | 250 af hætteglasset E fortynding | 25 |
| G | 400 | 100 af hætteglasset F fortynding | 5 |
| H | 500 | 0 | 0 |
Tabel 1. Forberedelse af Standard peptider
5. Fluorescens mikroskopi vurdering af plCSA-målrettet nanopartikel optagelse i Choriocarcinoma (JEG3) celler
- Seed celler på sterile 12-godt plader på 1,0 × 104 celler/brønd med komplet DMEM/F12 (cDMEM/F12, indeholdende 1% penicillin/streptomycin og 10% føtal bovint serum (FBS)). Tillad celler til at vokse til 60% sammenløbet på 37 ° C og 5% CO2 under fugtige tilstand.
- Fjerne medierne, og der tilsættes 1 mL af kold frisk medier med et lavt serum indhold (5% FBS) og DNPs eller plCSA-DNPs (5 µg DOX ækvivalent).
- Inkuber blanding af celler og nanopartikler ved 4 ° C i 1 time.
- Efter inkubationen, fjerne medier, og cellerne vaskes tre gange med PBS. Derefter tilsættes 1 mL af friske cDMEM/F12, og Inkuber celler ved 37 ° C i 30 min.
- Fjerne cDMEM/F12, og cellerne vaskes tre gange med PBS.
- Der tilsættes 2 mL koldt 4% PARAFORMALDEHYD (PFA), og der inkuberes ved stuetemperatur i 15 min. at lave cellerne.
- Fjerne PFA. Cellerne vaskes med 2 mL PBS én gang. Der tilsættes 1 mL PBS, som indeholder DAPI (1 µg/mL) for kerner farvning, og der inkuberes ved stuetemperatur i 10 min.
- Opsug PBS, og cellerne vaskes tre gange med PBS.
- Tilføje montering medium, og billed fluorescens med et Fluorescens mikroskopi, ved hjælp af grønne og blå kanaler til at visualisere DOX og kerner, henholdsvis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne protokol, PLGA, DSPE-PIND-COOH og soja lecithin er et repræsentativt polymer, lipid-PIND-COOH konjugat og lipid, henholdsvis. Syntesen af plCSA-målrettet lipid-polymer nanopartikler via en enkelt-trins sonikering metode og EDC/NHS-teknik er illustreret i figur 1. Først under sonikering betingelser, soja lecithin, PLGA og DSPE-PIND-COOH selv samle til form core-shell struktureret DNPs. Kernen består af PLGA og indkapslet DOX og skallen består af DSPE-PIND-COOH soja lecithin éncellelag er placeret på grænsefladen af shell og kernen. Derefter var - COOH grupper udsat på DNP overfladen konjugeret med -NH2 grupper af peptid via EDC/NHS teknik til at syntetisere plCSA-DNPs.
DNPs udarbejdet i denne protokol var 82.3 ± 4.7 nm i diameter, og efter konjugering til plCSA-BP, diameteren af de primære DNPs steg til 109.3 ± 5.9 nm (figur 2). PDI af DNPs og plCSA-DNPs var 0.127±0.005 og 0.134 ± 0,065, henholdsvis. TEM billeder af DNPs og plCSA-DNPs viste også, at partikler var godt spredt og generelt havde sfæriske morfologier (figur 3). Zeta potentielle DNPs og plCSA-DNPs var-20.1 ± 1,32 mV og-29.9 ± 3,56 mV, henholdsvis (tabel 2). Derfor, disse nanopartikler er forudsagt til at være meget stabil.
| Nanopartikler | Diameter(nm) | PDI | Zeta potentiale (mV) |
| DNPs | 82.3±4.7 | 0.127±0.005 | -20.1±1.32 |
| plCSA-DNPs | 109.3±5.9 | 0.134±0.065 | -29.9±3.56 |
| PDI:polydispersity indeks. Data præsenteres gennemsnit ± SD (n = 3). | |||
Tabel 2. Karakterisering af nanopartikler
EE og LE af nanopartikler er vigtige for kliniske applikationer. EE DOX af DNPs og plCSA-DNPs var 40.3 ± 1,67% og 39,5 ± 1,94%, henholdsvis. LE af DOX i DNPs og plCSA-DNPs var 6,2 ± 0,74% og 5,1 ± 0,42%, henholdsvis. Disse data viste, at omfanget af narkotika lastning og narkotika indkapsling blev opretholdt efter plCSA-BP dekoration. Dekoration var af plCSA-BP på overfladen af DNPs bestemt af BCA assay (figur 4). PlCSA-BP konjugation effektivitet blev fundet for at være 45.5 ± 3,7%.
JEG3 cellulære optagelse assay anført, at plCSA-DNPs hurtigt bundet til JEG3 celler inden for 30 min (figur 5). Derfor var plCSA-BP effektivt konjugeret til DNP overfladen i denne protokol. Desuden kunne plCSA-BP hurtigt binder til JEG3 celler og øge den cellulære optagelse af nanopartikler.
Figur 1. Skematisk illustration af metoden bruges til at syntetisere plCSA-målrettet lipid-polymer nanopartikler. Først, en enkelt-trins sonikering metode blev brugt til at syntetisere lipid-polymer nanopartikler (DNPs), og derefter EDC/NHS teknikken blev brugt til konjugat peptider til nanopartikel overflader (plCSA-DNPs). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Størrelse fordeling af de forskellige nanopartikler. Hydrodynamisk størrelse af DNPs (A) og plCSA-DNPs (B) målt af DLS. Repræsentative tal er præsenteret for at demonstrere partikelstørrelse og størrelse distribution. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Nanopartikel morfologi karakteriseret ved TEM. Typiske TEM billede af DNPs (A) og plCSA-DNPs (B) observeret med 2% phosphorwolfram syre farvning. Skalalinjen = 100 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Måling af konjugation effektivitet ved hjælp af BCA assay. Standardkurven for peptider på 562 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Nanopartikel optagelsen af JEG3 celler. JEG3 celler blev analyseret af Fluorescens mikroskopi efter 30 min inkubation med 5 µg/mL forskellige nanopartikler. Rød: DOX, blå: DAPI-mærket kerner. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol giver en effektiv og reproducerbar metode til syntese af plCSA-BP-konjugeret lipid-polymer nanopartikler. Trinvis sonikering metode at forberede lipid-polymer nanopartikler er hurtig, reproducerbare og adskiller sig fra typiske nanoprecipitation metoder, der involverer varme, vortexing eller fordampning. Derfor reducerer udviklede metoden syntese tid. Derudover er EDC/NHS bioconjugate anvendes i denne protokol et almindeligt anvendte og praktisk teknik til konjugat peptider og antistoffer for nanopartikler. Derfor, kombinationen af metoden trinvis sonikering med EDC/NHS bioconjugate teknik til at syntetisere plCSA-targeting lipid-polymer nanopartikler kan skaleres til kliniske applikationer.
Visse procedurer er kritisk for vellykket syntese og kendetegner plCSA-DNPs. Først, de relative koncentrationer af lecithin, PLGA og DSPE-PIND-COOH bestemme lipid-polymer nanopartikel størrelse og polydispersity. Når koncentrationen af lecithin er fast, en højere koncentration af DSPE-PIND-COOH resultater i lavere polydispersity og en mindre nanopartikel størrelse,13,15 , hvilket derfor mindsker drug LE. Når koncentrationen af PLGA er faste, er mere DSPE-PIND-COOH erstattet af lecithin, fører til højere nanopartikel polydispersity og større nanopartikel størrelse15. I denne situation, at nanopartikler er mere ustabilt og samlede nemt. I denne protokol, DSPE-PIND-COOH/PLGA vægtforhold er 0,11 og lecithin/DSPE-PIND-COOH masse forholdet er 0,43. Lipid-polymer nanopartikel størrelse er ca 82 nm med en PDI af ca 0.127.
Andet, pH af løsningen under konjugation af peptider for nanopartikler er af allerstørste betydning. Den optimale pH af ester aktivering er 5,0-6,0, og Amin reaktion er mest effektiv på pH 7,2-7,519,28,29. For de bedste resultater, skal reaktionen udføres i to trin. Først, ester Aktivering sker i MES (eller en anden noncarboxylate, nonamine buffer) ved pH 5,0-6,0. Derefter er pH justeret til 7,2-7,5 benytter PBS (eller en anden nonamine buffer) umiddelbart før reaktionen med Amin-holdige molekyle19. I betragtning af at halveringstiden for NHS estere er 4-5 h på pH 7,019, overstiger varigheden af amin reaktion 10 h ved 4 ° C.
Den endelige kritiske faktor er nanopartikel optagelse. Disse optagelsen af DNPs af JGE3 celler blev elimineret i en funktion analyse af målrettede optagelsen ved at kontrollere kultur tid og temperatur og koncentration af FBS i medium. I denne protokol, JEG3 celler blev inkuberet med 5% FBS ved 4 ° C i 1 h, og derefter kulturperler ved 37 ° C i 30 min at minimere DNP cellulære optagelse.
Hvis der opstår problemer under proceduren, der er tre store fejlfindingstrin relateret til syntese og karakterisering af plCSA-DNPs. Først, lipid-polymer nanopartikler blev udarbejdet af den samlesæt af PLGA og lecithin sonikering betingelser. PLGA kun opløses i organisk opløsningsmiddel. Derfor, efter tilføjelse til en hydrofil opløsningsmiddel, PLGA udfældes hurtigt i små nanopartikler. For at minimere effekten af hastigheden af dråbevis tilsætning og undgå at generere større partikler, er ultralydbehandling af blandingen i 1-2 min før du tilføjer PLGA nødvendigt. For det andet, selv om kvantitativ analyse af plCSA-BP konjugation effektivitet ved hjælp af metoden BCA er hurtig og bekvem, en high-performance væskekromatografi (HPLC) assay er mere præcis. HPLC eksperimentelle detaljer har været beskrevet af vores gruppe,11 og30,31,32. Endelig, de optimale betingelser for plCSA-DNP cellulære optagelse kan variere for andre kræftceller. Gradvist faldende FBS koncentration og øge inkubationstiden ved 37 ° C kan hjælpe med at bestemme de optimale betingelser.
En begrænsning i protokollen er, at hydrophobicity af narkotika bestemmer EE af narkotika. Sammenlignet med hydrofile narkotika, har hydrofobe narkotika en stærkere affinitet til PLGA, hvilket resulterer i en øget drug EE. I disse tilfælde er skal procedurerne for syntesen af plCSA-målrettet lipid-polymer nanopartikler undersøges eksperimentelt for at fastslå den mest effektive syntese metode, der resulterer i den ideelle drug LE og EE.
Som nævnt ovenfor, udtrykt glykosaminoglykan plCSA specifikt på de fleste kræftceller og placenta trophoblasts. Derfor er det vigtigt at bemærke, at plCSA-NPs bør anvendes til målrettet levering af therapeutics til tumorceller kun nonpregnant dyr og mennesker, og at disse narkotika-loaded partikler ville føre til bivirkninger i placenta hos drægtige dyr og mennesker.
I sammendrag, har vi beskrevet en enkel og bekvem metode til at syntetisere plCSA-målrettet lipid-polymer nanopartikler. Betydningen af denne protokol er, at det øger drug tilgængelighed på tumorer og moderkagen, samtidig minimere ledsagende giftigheden. Denne tilgang bør være nyttige for målrettet levering af lægemidler til tumorer og moderkagen og kan skaleres til at forberede plCSA-målrettet lipid-polymer nanopartikler til kliniske applikationer i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
X.F. og B.Z. er opfindere om patent PCT/CN2017/108646 og 201710906587.6 indsendt af SIAT, der dækker en plCSA-målrettet nanopartikel syntese metode og anvendelse. Ingen potentielle interessekonflikter blev oplyst af de andre forfattere.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den nationale nøgle-forskning og udvikling Program i Kina (2016YFC1000402), National Natural Sciences Foundation (81571445 og 81771617) og Natural Science Foundation of Guangdong provins (2016A030313178) til X.F. og Shenzhen Basic Research Fund (JCYJ20170413165233512) til X.F.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plCSA peptide | Shanghai GL Biochem | 573518 | for peptide synthesis |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| Doxorubicin | JKChemical | 113424 | for nanoparticles synthesis |
| Acetonitrile | Shanghai Lingfeng | 1008621 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Centrifuge filter (MWCO 10 kDa) | Millipore | UFC801024 | for nanoparticles purification |
| centrifuge | Sigma | 3-18KS | for nanoparticles purification |
| 2-[morpholino]ethanesulfonic acid(MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | for peptide conjugation |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 3450 | for peptide conjugation |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 56480 | for peptide conjugation |
| Dialysis bags | Spectrum | 132592T | for nanoparticles purification |
| PBS | Hyclone | SH30028.01 | for cell culture |
| 10 mL centrifuge tubes, polypropylene | Aladdin | S-025 | for nanoparticles synthesis |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430791 | for various applications |
| 0.22 μm sterile syringe filter | Millipore | SLGV033RB | for nanoparticles purification |
| 1 ml syringe, polypropylene | BD | 328421 | for nanoparticles synthesis |
| Malvern Zetasizer | Malvern | Nano ZS | for particle size analyer |
| Phosphotungstic acid | for TEM | ||
| TEM grid | EMCN | BZ10024a | for TEM |
| UV-VIS spectrometer | Leagene | DZ0035 | for TEM |
| Transmission electron microscope |
JEOL | JEM-100CXII | for particle size analyer |
| BCA reagent A | Thermo Fisher Scientific | 23228 | for BCA assay |
| BCA reagent B | Thermo Fisher Scientific | 23224 | for BCA assay |
| 96-Well Plates | Corning | 3599 | for BCA assay |
| Plate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan™ GO | for BCA assay |
| 12-well plates | Corning | 3513 | for cell culture |
| JEG3 cell | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | TCHu195 | Human placenta |
| DMEM/F12 | Hyclone | SH30272.01 | phenol red-free |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10100 | for cell culture |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15070063 | for cell culture |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | CKK53 | for celluar uptake |
| Paraformaldehyde | Shanghai Lingfeng | 1372021 | for celluar uptake |
| DAPI | Sangon Biotech | A606584 | for celluar uptake |
| Mounting medium | Life | P36961 | for celluar uptake |
References
- Davis, M. E., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (9), 771 (2008).
- Nie, S., Xing, Y., Kim, G. J., Simons, J. W. Nanotechnology applications in cancer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 257-288 (2007).
- Jabir, N. R., et al. An overview on the current status of cancer nanomedicines. Current Medical Research and Opinion. 34 (5), 911-921 (2018).
- Pillai, G. Nanomedicines for Cancer Therapy: An Update of FDA Approved and Those under Various Stages of Development. SOJ Pharmacy & Pharmaceutical Sciences. 1 (2), 1-13 (2014).
- Marta, T., Luca, S., Serena, M., Luisa, F., Fabio, C. What is the role of nanotechnology in diagnosis and treatment of metastatic breast cancer? Promising Scenarios for the Near Future. Journal of Nanomaterials. 2016, e5436458 (2016).
- Dasari, S., Tchounwou, P. B. Cisplatin in cancer therapy: molecular mechanisms of action. European journal of Pharmacology. 740, 364-378 (2014).
- Brigger, I., Dubernet, C., Couvreur, P. Nanoparticles in cancer therapy and diagnosis. Advanced Drug Delivery Reviews. 64, 24-36 (2012).
- Steichen, S. D., Caldorera-Moore, M., Peppas, N. A. A review of current nanoparticle and targeting moieties for the delivery of cancer therapeutics. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 48 (3), 416-427 (2013).
- Salanti, A., et al. Targeting human cancer by a glycosaminoglycan binding malaria protein. Cancer Cell. 28 (4), 500-514 (2015).
- Seiler, R., et al. An Oncofetal Glycosaminoglycan Modification Provides Therapeutic Access to Cisplatin-resistant Bladder Cancer. European Urology. 72 (1), 142-150 (2017).
- Zhang, B., et al. Targeted delivery of doxorubicin by CSA-binding nanoparticles for choriocarcinoma treatment. Drug Delivery. 25 (1), 461-471 (2018).
- Zhang, B., et al. Placenta-specific drug delivery by trophoblast-targeted nanoparticles in mice. Theranostics. 26 (2), 130-137 (2018).
- Zhang, L., et al. Self-assembled lipid--polymer hybrid nanoparticles: a robust drug delivery platform. ACS Nano. 2 (8), 1696-1702 (2008).
- Zheng, M., et al. Single-step assembly of DOX/ICG loaded lipid-polymer nanoparticles for highly effective chemo-photothermal combination therapy. ACS. 7 (3), 2056-2067 (2013).
- Fang, R. H., Aryal, S., Hu, C. -M. J., Zhang, L. Quick synthesis of lipid− polymer hybrid nanoparticles with low polydispersity using a single-step sonication method. Langmuir. 26 (22), 16958-16962 (2010).
- Gu, L., et al. Folate-modified, indocyanine green-loaded lipid-polymer hybrid nanoparticles for targeted delivery of cisplatin. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 28 (7), 690-702 (2017).
- Mandal, B., Mittal, N. K., Balabathula, P., Thoma, L. A., Wood, G. C. Development and in vitro evaluation of core-shell type lipid-polymer hybrid nanoparticles for the delivery of erlotinib in non-small cell lung cancer. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 81, 162-171 (2016).
- Shi, T., et al. Enhanced legumain-recognition and NIR controlled released of cisplatin-indocyanine nanosphere against gastric carcinoma. European Journal of Pharmacology. 794, 184-192 (2017).
- Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Analytical Biochemistry. 185 (1), 131-135 (1990).
- Hadjipanayis, C. G., et al. EGFRvIII Antibody-Conjugated Iron Oxide Nanoparticles for Magnetic Resonance Imaging-Guided Convection-Enhanced Delivery and Targeted Therapy of Glioblastoma. Cancer Research. 70 (15), 6303-6312 (2010).
- Sadhukha, T., Wiedmann, T. S., Panyam, J. Inhalable magnetic nanoparticles for targeted hyperthermia in lung cancer therapy. Biomaterials. 34 (21), 5163-5171 (2013).
- Jennings, M., Nicknish, J. Localization of a site of intermolecular cross-linking in human red blood cell band 3 protein. Journal of Biological Chemistry. 260 (9), 5472-5479 (1985).
- Staros, J. V. N-hydroxysulfosuccinimide active esters: bis(N-hydroxysulfosuccinimide) esters of two dicarboxylic acids are hydrophilic, membrane-impermeant, protein cross-linkers. Biochemistry. 21 (17), 3950-3955 (1982).
- Valencia, P. M., et al. Single-step assembly of homogenous lipid− polymeric and lipid− quantum dot nanoparticles enabled by microfluidic rapid mixing. ACS. 4 (3), 1671-1679 (2010).
- Altintas, I., et al. Nanobody-albumin nanoparticles (NANAPs) for the delivery of a multikinase inhibitor 17864 to EGFR overexpressing tumor cells. Journal of Controlled Release. 165 (2), 110-118 (2013).
- Maya, S., et al. Cetuximab conjugated O-carboxymethyl chitosan nanoparticles for targeting EGFR overexpressing cancer cells. Carbohydrate Polymers. 93 (2), 661-669 (2013).
- Deepagan, V. G., et al. In vitro targeted imaging and delivery of camptothecin using cetuximab-conjugated multifunctional PLGA-ZnS nanoparticles. Nanomedicine. 7 (4), 507-519 (2012).
- Totaro, K. A., et al. Systematic investigation of EDC/sNHS-mediated bioconjugation reactions for carboxylated peptide substrates. Bioconjugate Chemistry. 27 (4), 994-1004 (2016).
- Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25 (4), 663-682 (2006).
- Zhang, B., et al. LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma. Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).
- Koren, E., Apte, A., Sawant, R. R., Grunwald, J., Torchilin, V. P. Cell-penetrating TAT peptide in drug delivery systems: proteolytic stability requirements. Drug Delivery. 18 (5), 377-384 (2011).
- Chu, Y., et al. Topical ocular delivery to laser-induced choroidal neovascularization by dual internalizing RGD and TAT peptide-modified nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 12, 1353-1368 (2017).
