Summary
Nous présentons ici un protocole pour la synthèse de peptide de liaison placentaire chondroïtine sulfate A (plCSA-BP)-conjugués de lipide-polymère nanoparticules via seule étape sonication et bioconjugate techniques. Ces particules constituent un nouvel outil pour l’administration ciblée d’agents thérapeutiques tumeurs plus humaines et les trophoblastes placentaires pour traiter des cancers et des troubles placentaires.
Abstract
Une méthode thérapeutique efficace cancer réduit et élimine les tumeurs avec une toxicité systémique minimale. NANOPARTICULES activement ciblage offrent une approche prometteuse pour le traitement du cancer. Le sulfate de chondroïtine placentaire glycosaminoglycan un (plCSA) s’exprime sur une large gamme de cellules cancéreuses trophoblastes placentaires et protéine malarique VAR2CSA peut se lier spécifiquement à plCSA. Un peptide de liaison déclarés placentaire chondroïtine sulfate A (plCSA-BP), dérivé de protéine malarique VAR2CSA, pouvez également spécifiquement lier à plCSA sur les cellules cancéreuses et les trophoblastes placentaires. C’est pourquoi, plCSA-BP-conjugués de nanoparticules pourraient servir un outil pour la livraison de médicaments ciblés aux cancers humains et trophoblastes placentaires. Dans le présent protocole, on décrit une méthode pour faire la synthèse des nanoparticules de plCSA-BP-conjugué lipide-polymère chargés avec la doxorubicine (plCSA-DNPs) ; la méthode consiste à une sonication seule étape et bioconjugate techniques. En outre, plusieurs méthodes pour caractériser plCSA-DNPs, y compris la détermination de leurs propriétés physico-chimiques et la capture cellulaire de cellules de choriocarcinome placentaire (JEG3), sont décrites.
Introduction
Une méthode thérapeutique efficace cancer réduit et élimine les tumeurs avec une toxicité systémique minimale. Par conséquent, ciblage tumoral sélective est la clé à l’exploration de méthodes thérapeutiques efficaces. NANOPARTICULES offrent une opportunité prometteuse pour le traitement du cancer et des assemblages moléculaires avec différents groupes fonctionnels améliorera l’efficacité du médicament et réduire des effets secondaires associés1,2. En outre, des systèmes de nanoparticules utilisent principalement passives et actives visant à atteindre la cible des tumeurs3.
Ciblage passive exploite les caractéristiques innées des nanoparticules et perméabilité améliorée et des effets de rétention (EPR) pour atteindre les cellules tumorales. Les liposomes cationiques ont été utilisés avec succès pour libérer des médicaments anticancéreux diverses tumeurs dans des applications cliniques4,5,6. Malgré l’effet thérapeutique potentiel de cancer efficace, une concentration faible de drogue dans la région de la tumeur et une incapacité à distinguer les cellules tumorales des tissus normaux sont les deux principales limites de nanoparticules de ciblage passif7.
Les stratégies de ciblage actifs Profitez d’antigène-anticorps, ligand-récepteur et autres interactions de reconnaissance moléculaire à libérer spécifiquement des médicaments tumeurs8. Le sulfate de chondroïtine placentaire glycosaminoglycan un (plCSA) est largement exprimé sur la plupart des cellules cancéreuses et des trophoblastes placentaires. En outre, la protéine malarique VAR2CSA pouvez spécifiquement lier à plCSA9,10. Par conséquent, VAR2CSA peut être un outil pour cibler les cellules cancéreuses humaines. Cependant, lorsque VAR2CSA est conjugué aux nanoparticules, la protéine pleine longueur peut-être limiter la pénétration des nanoparticules dans les cellules tumorales. Récemment, nous avons découvert un peptide de la liaison plCSA (plCSA-BP), dérivé de la protéine malarique VAR2CSA. plCSA-BP-conjugué lipide-polymère nanoparticules rapidement collé sur choriocarcinome cellules et une augmentation significative de doxorubicine (DOX) activité anticancéreuse in vivo11; ces particules aussi spécifiquement lié à trophoblastes placentaires et pourraient servir d’outil pour l’administration ciblée des médicaments au placenta12.
NANOPARTICULES lipidiques-polymère sont constitués d’une enveloppe de monocouche de lipides et un noyau de polymère hydrophobe et représentent un nouveau transporteur pour la livraison de drogue. Ces nanoparticules combinent les avantages des liposomes et nanocarriers polymères, tels que les nanoparticules contrôlables taille haute biocompatibilité, libération du médicament soutenue, drogue haute chargement (LE) et l’efficacité excellente stabilité13. Dans ce travail, nous avons utilisé une méthode seule étape sonication à synthétiser des nanoparticules lipidiques-polymère. Cette méthode est rapide, pratique et adapté pour l’intensification et a été largement utilisée pour préparer des nanoparticules lipidiques-polymère par notre groupe de11,14 et d’autres15,16,17,18 .
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) chlorhydrate de carbodiimide (EDC) est un populaire carbodiimide, utilisé comme un agent de réticulation pour la conjugaison des biomolécules contenant des amines et carboxylates19. En plus de l’EDC, N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) est le plus commun réactif de conjugaison en surface et nanoparticules conjugaison réactions20,21. NHS peut réduire le nombre de réactions secondaires et améliorer la stabilité et le rendement d’ester INTERMEDIAIRES22,23.
Nous décrivons ici un protocole pour la synthèse de nanoparticules lipidiques-polymère plCSA ciblées. Tout d’abord, la synthèse de la seule étape sonication de nanoparticules lipidiques-polymère DOX-chargé (DNPs) est décrite. Ensuite, une technique de bioconjugate EDC/NHS pour générer des nanoparticules de polymère lipidique plCSA-BP-conjugué est introduite. Cette technique de bioconjugate permet aussi de conjuguer les autres anticorps et les peptides aux nanoparticules. Enfin, nous décrivons le dosage physico-chimiques, propriétés et in vitro , utilisé pour caractériser des nanoparticules lipidiques-polymère plCSA ciblées. Nous croyons que ces nanoparticules lipidiques-polymère plCSA ciblées pourraient constituer un système efficace pour l’administration ciblée des médicaments à des cancers plus humains et de l’administration ciblée de charges utiles pour le placenta pour traiter les troubles placentaires.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. préparation des Solutions mères
- Préparer une solution aqueuse d’éthanol de 4 % en diluant avec 4 mL d’éthanol absolu avec 100 mL d’eau ultrapure. Conserver la solution à 4 ° C.
NOTE : L’eau Ultrapure est définie comme l’eau sans contaminants tels que des bactéries, des particules, des ions ou des nucléases. Eau ultrapure provient d’un système de purification de l’eau avec une résistivité de cible de jusqu'à 18,2 mΩ·cm, qui signifie faible contamination anionique. - Préparer un 1 mg/mL de solution mère de lécithine de soja en dissolvant 20 mg de lécithine de soja dans 20 mL de la solution aqueuse d’éthanol de 4 %. Stocker la solution mère de lécithine de soja à 4 ° C.
- Préparer un 25 mg/mL DSPE-PEG (2000)-COOH solution en dissolvant 100 mg de DSPE-PEG-COOH dans 4 mL de la solution aqueuse d’éthanol de 4 %. Conserver la solution stock à-20 ° C.
- Préparer un 10 mg/mL solution DOX en dissolvant 50 mg de DOX dans 5 mL d’eau ultrapure. Stocker la solution mère de DOX à 4 ° C dans l’obscurité.
- Préparer un 2 mg/mL solution PLGA dissoudre 20 mg de PLGA dans 10 mL d’acétonitrile. Stocker la solution mère de PLGA à 4 ° C.
ATTENTION : L’acétonitrile est inflammable et toxique. Fonctionnent avec soin dans une hotte de laboratoire et porter un vêtement approprié, tels que sarraus de laboratoire, des lunettes de sécurité et des gants en latex. - Préparer une solution 0,1 M 2-(morpholino) ethanesulfonic acide (MES, pH 6,0) mère en dissolvant 2,17 g de MES dans 100 mL d’eau ultrapure. Stocker la solution-mère à 4 ° C.
2. synthèse du DNPs
Remarque : Pour éviter une dégradation photochimique DOX, toutes les opérations ont été effectuées dans l’obscurité.
NANOPARTICULES ont été synthétisés par une seule étape a déjà été indiqué la sonication méthode11,13,14.
- Ajouter 3 mL de la solution aqueuse d’éthanol de 4 % dans un tube à centrifuger stérile de 10 mL. Puis, ajoutez 90 µg de la solution mère de lécithine de soja, 210 µg de la solution mère DSPE-PEG-COOH et 750 µg de la solution mère de DOX à 3 mL de la solution aqueuse d’éthanol de 4 %.
- Placer le tube à centrifuger dans un bain de glace et placez le bain de glace sur un processeur à ultrasons.
- Avec une seringue de 1 mL, pipette 2 mg de la solution mère de PLGA goutte à goutte (1 goutte/4-6 s) dans le tube à centrifuger. Pendant ce temps, laisser agir le tube à l’aide d’un processeur à ultrasons à une fréquence de 20 kHz et une amplitude de sortie de 30 % pendant 5 min pour synthétiser le DNPs.
Remarque : Pour faire la synthèse des particules uniformes avec petites tailles, la vitesse à laquelle la solution PLGA est coulait dans le tube doit être lent et bulle génération devrait être évitée. - Purifier le DNPs en lavant la solution ci-dessus dans un tampon MES 0,1 M (pH 6.0) 3 fois en utilisant un filtre de la centrifugeuse (MWCO, 10 kDa). Centrifuger à 4 ° C et 1000 × g pendant 3 minutes chaque fois. Enfin, environ 1 mL de nanoparticules-résolu MES doit rester.
NOTE : Ceci est un point d’arrêt acceptable dans la procédure. Dans le cas contraire permettant de conjuguer les peptides, les nanoparticules peuvent être épurées par tampon PBS (pH 7,4), et le DNPs purifié peuvent être stocké à 4° C dans l’obscurité.
3. conjugaison des Peptides à DNPs
-
Activation de l’ester
- Ajouter 0,4 mg d’EDC (concentration finale de 2 mM) à 1 mL de DNPs.
- Ajouter 0,24 mg de NHS à la réaction (concentration finale de 2 mM).
Remarque : Pour ajouter facilement de la quantité correcte d’EDC et le NHS, une solution peut être préparée si les réactifs sont dissous et utilisés immédiatement. - Bien mélanger les composants de la réaction et placer la réaction sur un agitateur ; laisser la réaction pour 30 min - 1 h à température ambiante dans l’obscurité.
-
Réaction amine
- Augmenter le tampon pH de 7,2 à 7,5 en utilisant PBS (20 ×, pH 7,4).
- Ajouter 0,5 mg du peptide ciblage plCSA (plCSA-BP, EDVKDINFDTKEKFLAGCLIVSFHEGKC) à la solution de la réaction.
Remarque : Avant d’ajouter, dissoudre les peptides dans 20 % d’acétonitrile. Si les peptides ne sont pas solubles, sonication dans un sonicateur bain peut utile. - Bien mélanger la solution et puis placer sur un agitateur ; permettre la réaction de procéder à 4 ° C durant la nuit dans l’obscurité.
- Placer la solution de conjugué dans des sacs de dialyse (MWCO, 3 500 Da) pour dialyser et purifier le plCSA-DNPs à l’aide de la solution tampon PBS (pH 7,4) à température ambiante pendant 24 h dans l’obscurité.
Remarque : Vous pouvez également purification peut être effectuée qu’à l’étape 2.4 pour obtenir plCSA-DNPs. - Pour les applications de culture cellulaire, filtrer la solution reconstituée à travers un filtre de seringue stérile de 0,22 µm pour éliminer les éventuelles précipités.
4. caractérisation des lipides plCSA ciblées-nanoparticules polymériques
-
Mesure de la taille de la NANOPARTICULE hydrodynamique à l’aide de diffusion dynamique de la lumière (DLS)
- NANOPARTICULES diluées avec de l’eau ultrapure (dilution 50 fois). Charger 500 µL de l’échantillon dans une cuvette conformément aux instructions de l’instrument potentiel DLS ou zeta.
NOTE : Potentiel zêta et cuvettes de listes de distribution peuvent différer selon les spécifications de l’instrument. - Une fois la mesure terminée, enregistrez le diamètre des particules, l’indice de polydispersité (PDI) et la potentiel zêta. Moyenne des résultats obtenus à partir de 4 répètent lectures et calculent l’écart.
- NANOPARTICULES diluées avec de l’eau ultrapure (dilution 50 fois). Charger 500 µL de l’échantillon dans une cuvette conformément aux instructions de l’instrument potentiel DLS ou zeta.
-
Microscopie électronique à transmission (TEM)
Remarque : La morphologie des nanoparticules a été observée par TEM avec la méthode de coloration négative. 24- NANOPARTICULES diluées avec de l’eau ultrapure (400-fold dilution). Ajouter 20 µL de l’échantillon sur une grille TEM et laisser pour reposer pendant 5 min.
- Ajouter 100 µL de 2 % (p/v) d’acide phosphotungstique et laisser pour reposer pendant 2 min. mèche à la goutte.
- Sécher la grille TEM à température ambiante.
- Régler la tension d’accélération de TEM à 80 kV et agrandir l’image à 100 000 × pour visualiser les nanoparticules.
-
Détermination de l’efficacité de l’encapsulation (EE) et LE
- Génération de la courbe d’étalonnage. Dissoudre DOX dans eau ultrapure pour préparer une DOX cinq concentrations différentes : 1 µg/mL, 5 µg/mL, 10 µg/mL, 50 µg/mL et 100 µg/mL. Mesurer l’absorption des solutions DOX à 480 nm avec un spectromètre UV-visible. Générer une courbe standard basée sur les concentrations de DOX.
- Diluer 25 µL de nanoparticules avec 500 µL d’eau ultrapure. Mesurer l’absorption à 480 nm avec un spectromètre UV-visible. Calculer les concentrations du médicament par la courbe d’étalonnage.
- Calculer le lé à l’aide de l’équation suivante :
LE = ((quantité de drogues dans les nanoparticules) / (poids total des matériaux)) × 100 %. - Calculer la EE selon l’équation suivante :
EE = ((quantité de drogues dans les nanoparticules) / (quantité de drogue a ajouté)) × 100 %.
-
Mesure de l’efficacité de conjugaison bicinchoninic acide (BCA) essai sur 25 , 26 , 27
- Pipetter 25 µL des solutions de peptide standard (tableau 1) ou plCSA-DNPs dans les puits en double exemplaire. Ajouter 200 µL de réactif au travail à chaque puits et mélanger la plaque bien sur un agitateur de plaque pendant 30 s.
- La plaque de recouvrement et incuber à 37 ° C pendant 30 min.
- Mesurer l’absorbance à 562 nm sur un lecteur de plaque. Utiliser la courbe d’étalonnage générée pour calculer les concentrations de plCSA de plCSA-DNPs.
- Calculer l’efficacité de la conjugaison à l’aide de l’équation suivante :
Efficacité de conjugaison = ((quantité de peptide à nanoparticules) / (quantité d’ajouté peptide)) × 100 %.
| Flacon | Volume de diluant (μL) | Volume et source de peptide (μL) | Concentration finale de peptide (μg/mL) |
| A | 0 | 300 sur Stock | 1000 |
| B | 250 | 250 du flacon une dilution | 500 |
| C | 250 | 250 de dilution du flacon B | 250 |
| D | 250 | 250 de dilution flacon C | 125 |
| E | 300 | 200 de dilution flacon D | 50 |
| F | 250 | 250 de dilution flacon E | 25 |
| G | 400 | 100 de dilution flacon F | 5 |
| H | 500 | 0 | 0 |
Le tableau 1. Préparation de peptides Standard
5. fluorescence Microscopy évaluation d’absorption de nanoparticules plCSA ciblées dans les cellules de choriocarcinome (JEG3)
- Graines de cellules sur des plaques de 12 puits stériles à 1,0 × 104 cellules/puits avec DMEM complet/F12 (cDMEM/F12, contenant de le 1 % pénicilline/streptomycine et 10 % de sérum foetal de bovin (FBS)). Laissez les cellules à confluence de 60 % à 37 ° C et 5 % de CO2 dans des conditions humides.
- Retirez le support et ajouter 1 mL de froids supports neufs avec une teneur sérique (5 % FBS) et DNPs ou plCSA-DNPs (5 µg d’équivalent-DOX).
- Incuber le mélange des cellules et des nanoparticules à 4 ° C pendant 1 h.
- Après incubation, retirez le support et laver les cellules trois fois avec du PBS. Ensuite, ajouter 1 mL de frais cDMEM/F12 et incuber les cellules à 37 ° C pendant 30 min.
- Enlever le cDMEM/F12 et laver les cellules trois fois avec du PBS.
- Ajouter 2 mL de paraformaldéhyde froide de 4 % (PFA) et incuber à température ambiante pendant 15 min fixer les cellules.
- Retirez la PFA. Laver les cellules avec 2 mL de PBS une fois. Ajouter 1 mL de PBS contenant DAPI (1 µg/mL) pour la coloration, les noyaux et incuber à température ambiante pendant 10 min.
- Aspirer le PBS et laver les cellules trois fois avec du PBS.
- Ajouter le milieu de montage et l’image de la fluorescence avec une microscopie de fluorescence, utilisant des canaux vert et bleu pour visualiser les DOX et les noyaux, respectivement.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dans ce protocole, PLGA, DSPE-PEG-COOH et soja lécithine sont un polymère représentatif, conjugué de lipide-PEG-COOH et de lipides, respectivement. La synthèse de nanoparticules par une seule étape méthode sonication de polymère lipidique plCSA ciblées et une technique d’EDC/NHS est illustrée à la Figure 1. Tout d’abord, dans des conditions de la sonication, lécithine de soya, PLGA et DSPE-PEG-COOH s’auto-assembler à forme coeur-écorce structuré DNPs. Le noyau est constitué de PLGA et DOX encapsulée, la coque se compose de DSPE-PEG-COOH et la monocouche de lécithine de soja se trouve au carrefour de la coque et le noyau. Ensuite, les groupes COOH - exposés à la surface DNP ont été conjugués avec les groupes de2 -NH de la peptide via la technique EDC/NHS à synthétiser plCSA-DNPs.
Le DNPs établi dans le présent protocole ont été 82.3 ± 4,7 nm de diamètre, et après conjugaison à la plCSA-BP, le diamètre de la DNPs primaire a augmenté à 109,3 ± 5,9 nm (Figure 2). La préparation de la DNPs et plCSA-DNPs était 0.127±0.005 et 0,134 ± 0,065, respectivement. Images TEM du DNPs et plCSA-DNPs a également montrent que les particules sont bien dispersées et avaient généralement des morphologies sphériques (Figure 3). Le potentiel zêta des DNPs et plCSA-DNPs était -20,1 ± 1,32 mV et-29.9 mV ± 3.56, respectivement (tableau 2). Par conséquent, ces nanoparticules sont prévus pour être très stable.
| Nanoparticules | Diameter(nm) | PDI | Potentiel zêta (mV) |
| DNPs | 82.3±4.7 | 0.127±0.005 | -20.1±1.32 |
| plCSA-DNPs | 109.3±5.9 | 0.134±0.065 | -29.9±3.56 |
| Indice de PDI:polydispersity. Les données sont présentées moyenne ± écart type (n = 3). | |||
Le tableau 2. Caractérisation des nanoparticules
Les EE et LE des nanoparticules sont importants pour des applications cliniques. La EE de DOX DNPs et plCSA-DNPs était de 40,3 ± 1,67 % et 39,5 ± 1,94 %, respectivement. Le LE de DOX dans le DNPs et plCSA-DNPs était de 6,2 ± 0,74 % et 5,1 ± 0,42 %, respectivement. Ces données ont montré que l’ampleur du chargement de la drogue et l’encapsulation de la drogue a été maintenue après la décoration plCSA-BP. L’efficacité de la décoration du plCSA-BP sur la surface de DNPs a été déterminée par l’essai de la BCA (Figure 4). L’efficacité de conjugaison plCSA-BP s’est avérée pour être 45,5 ± 3,7 %.
L’essai d’absorption cellulaire JEG3 a indiqué que le plCSA-DNPs rapidement lié à des cellules JEG3 30 min (Figure 5). C’est pourquoi, plCSA-BP a été efficacement conjugué à la surface DNP dans le présent protocole. En outre, plCSA-BP pourrait rapidement se lient aux cellules JEG3 et augmenter l’assimilation des nanoparticules.
Figure 1. Illustration schématique de la méthode utilisée pour synthétiser des nanoparticules lipidiques-polymériques ciblée plCSA. Tout d’abord, une méthode de sonication seule étape a été utilisée pour synthétiser des nanoparticules lipidiques-polymère (DNPs), et puis la technique EDC/NHS servait de conjuguer des peptides sur les surfaces de nanoparticules (plCSA-DNPs). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. Taille de distribution des nanoparticules différents. Taille hydrodynamique de DNPs (A) et plCSA-DNPs b mesurées par DLS. Chiffres représentatifs sont présentés pour illustrer la taille des particules et la distribution granulométrique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3. Nanoparticules de morphologie caractérisée par TEM. Image typique de TEM de DNPs (A) et plCSA-DNPs (B) a observé avec 2 % acide phosphotungstique. Echelle = 100 nm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4. Mesure de l’efficacité de la conjugaison à l’aide du test BCA. Courbe d’étalonnage des peptides à 562 nm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5. Absorption de nanoparticules par les cellules JEG3. JEG3 cellules ont été analysés par microscopie de fluorescence après 30 min d’incubation avec des nanoparticules différents de 5 µg/mL. Rouge : DOX, bleu : noyaux marquées au DAPI. Echelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ce protocole fournit une méthode efficace et reproductible pour la synthèse de nanoparticules de polymère lipidique plCSA-BP-conjugués. La méthode de sonication seule étape pour préparer les nanoparticules lipidiques-polymère est rapide, reproductible et différente des méthodes nanoprécipitation typique qui impliquent chauffage, Vortex ou évaporation. Par conséquent, la méthode développée réduit considérablement le temps de la synthèse. En outre, l’EDC/NHS bioconjugate utilisé dans le présent protocole est une technique fréquemment utilisée et commode de conjuguer des peptides et des anticorps aux nanoparticules. Par conséquent, la combinaison de la méthode de sonication seule étape avec la technique de bioconjugate EDC/NHS pour synthétiser le ciblage plCSA lipides-polymère nanoparticules peuvent être transposés pour des applications cliniques.
Certaines procédures sont critiques pour synthétiser et caractériser plCSA-DNPs avec succès. Les concentrations relatives de la lécithine, PLGA et DSPE-PEG-COOH d’abord déterminent la taille des nanoparticules lipidiques-polymère et la polydispersité. Quand la concentration de la lécithine est fixe, une concentration plus élevée des résultats DSPE-PEG-COOH dans polydispersité inférieure et une plus petite taille de la NANOPARTICULE,13,15 , ce qui réduit par conséquent la drogue LE. Lorsque la concentration de PLGA est fixe, plus DSPE-PEG-COOH est remplacé par lécithine, conduisant à la polydispersité de nanoparticules plus élevée et plus grande NANOPARTICULE taille15. Dans cette situation, les nanoparticules sont plus instables et regrouper facilement. Dans ce protocole, le rapport de poids DSPE-PEG-COOH/PLGA est 0,11 et le rapport de masse de lécithine/DSPE-PEG-COOH est de 0,43. La taille de nanoparticules lipidiques-polymère est environ 82 nm avec une préparation de 0,127 environ.
Deuxièmement, le pH de la solution au cours de la conjugaison des peptides à des nanoparticules est d’une importance capitale. Le pH optimal de l’activation de l’ester est 5.0 ou 6.0, et la réaction des amines est plus efficace à pH 7,2 à 7,519,28,29. Pour de meilleurs résultats, la réaction doit être effectuée en deux étapes. Tout d’abord, activation ester apparaît dans MES (ou un autre noncarboxylate, tampon de nonamine) à pH 5.0 ou 6.0. Ensuite, le pH est ajusté à 7,2 à 7,5 à l’aide de PBS (ou un autre tampon nonamine) immédiatement avant la réaction avec la molécule de contenant des amines19. Considérant que la demi-vie des esters de NHS est 4-5 h à pH 7,019, la durée de la réaction des amines est supérieure à 10 h à 4 ° C.
Le dernier facteur critique est absorption de nanoparticules. Absorption non ciblée de DNPs par les cellules de JGE3 a été éliminée dans une analyse de fonction de l’absorption ciblée en contrôlant le temps de la culture et de température et de la concentration de FBS dans le milieu. Dans ce protocole, JEG3 cellules ont été incubées avec 5 % FBS à 4 ° C pendant 1 h et ensuite mis en culture à 37 ° C pendant 30 min pour réduire au minimum la capture cellulaire de DNP.
Si des problèmes surviennent lors de la procédure, il y a trois grandes étapes de dépannage associés à la synthèse et la caractérisation des plCSA-DNPs. Tout d’abord, les nanoparticules lipidiques-polymère ont été préparés par l’auto-assemblage de PLGA et lécithine dans des conditions de sonication. PLGA seulement se dissout dans un solvant organique. Par conséquent, lors de l’addition d’un solvant hydrophile, PLGA précipite rapidement en petites nanoparticules. Pour minimiser l’effet de la vitesse de l’addition de goutte à goutte et éviter de générer des particules plus grosses, sonication du mélange pour 1-2 min avant d’ajouter PLGA est nécessaire. Deuxièmement, bien que l’analyse quantitative de l’efficacité de conjugaison plCSA-BP à l’aide de la méthode BCA est rapide et pratique, un dosage de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) est plus précis. Les détails expérimentaux HPLC ont été décrits par notre groupe11 et d’autres30,31,32. Enfin, les conditions optimales pour l’absorption cellulaire plCSA-DNP peuvent différer des autres cellules cancéreuses. Peu à peu, diminution de la concentration de FBS et augmenter le temps d’incubation à 37 ° C peuvent aider à déterminer les conditions optimales.
Une des limitations du protocole sont que l’hydrophobie de drogues détermine la EE des médicaments. Par rapport aux médicaments hydrophiles, médicaments hydrophobes ont une forte affinité pour PLGA, qui se traduit par une augmentation drogue EE. Dans ces cas, les procédures pour la synthèse des nanoparticules lipidiques-polymère plCSA ciblées devront être examiné expérimentalement pour déterminer la méthode de synthèse plus efficace qui se traduit par le médicament idéal LE et EE.
Comme mentionné ci-dessus, le plCSA de glycosaminoglycane est exprimé spécifiquement sur la plupart des cellules cancéreuses et des trophoblastes placentaires. Par conséquent, il est important de noter que les plCSA-NPs doivent être utilisés pour la prestation ciblée d’agents thérapeutiques aux cellules tumorales chez les animaux seulement non-gestantes et les humains, et que ces particules chargées médicaments entraînerait des effets secondaires dans le placenta des animaux gravides et êtres humains.
En résumé, nous avons décrit une méthode simple et pratique pour faire la synthèse des nanoparticules lipidiques-polymère plCSA ciblées. La signification du présent protocole est d’augmenter la disponibilité de drogues à des tumeurs et le placenta, tout en réduisant la toxicité concomitante. Cette approche devrait être utile pour l’administration ciblée des médicaments aux tumeurs et le placenta et peut-être être transposée pour préparer des nanoparticules lipidiques-polymère plCSA ciblées pour des applications cliniques dans le futur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
X.F. et B.Z. sont les inventeurs sur le brevet PCT/CN2017/108646 et 201710906587.6 présenté par SIAT qui couvre une méthode de synthèse de nanoparticules plCSA ciblée et de la demande. Aucun conflit d’intérêts potentiel ont été divulgués par les autres auteurs.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu grâce à des subventions de la clé National de recherche et programme de développement de Chine (2016YFC1000402), la Fondation nationale des Sciences naturelles (81571445 et 81771617) et la Fondation sciences naturelles de la Province de Guangdong (2016A030313178) à X.F. et le Fonds de recherche de Shenzhen Basic (JCYJ20170413165233512) à X.F.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plCSA peptide | Shanghai GL Biochem | 573518 | for peptide synthesis |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| Doxorubicin | JKChemical | 113424 | for nanoparticles synthesis |
| Acetonitrile | Shanghai Lingfeng | 1008621 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Centrifuge filter (MWCO 10 kDa) | Millipore | UFC801024 | for nanoparticles purification |
| centrifuge | Sigma | 3-18KS | for nanoparticles purification |
| 2-[morpholino]ethanesulfonic acid(MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | for peptide conjugation |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 3450 | for peptide conjugation |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 56480 | for peptide conjugation |
| Dialysis bags | Spectrum | 132592T | for nanoparticles purification |
| PBS | Hyclone | SH30028.01 | for cell culture |
| 10 mL centrifuge tubes, polypropylene | Aladdin | S-025 | for nanoparticles synthesis |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430791 | for various applications |
| 0.22 μm sterile syringe filter | Millipore | SLGV033RB | for nanoparticles purification |
| 1 ml syringe, polypropylene | BD | 328421 | for nanoparticles synthesis |
| Malvern Zetasizer | Malvern | Nano ZS | for particle size analyer |
| Phosphotungstic acid | for TEM | ||
| TEM grid | EMCN | BZ10024a | for TEM |
| UV-VIS spectrometer | Leagene | DZ0035 | for TEM |
| Transmission electron microscope |
JEOL | JEM-100CXII | for particle size analyer |
| BCA reagent A | Thermo Fisher Scientific | 23228 | for BCA assay |
| BCA reagent B | Thermo Fisher Scientific | 23224 | for BCA assay |
| 96-Well Plates | Corning | 3599 | for BCA assay |
| Plate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan™ GO | for BCA assay |
| 12-well plates | Corning | 3513 | for cell culture |
| JEG3 cell | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | TCHu195 | Human placenta |
| DMEM/F12 | Hyclone | SH30272.01 | phenol red-free |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10100 | for cell culture |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15070063 | for cell culture |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | CKK53 | for celluar uptake |
| Paraformaldehyde | Shanghai Lingfeng | 1372021 | for celluar uptake |
| DAPI | Sangon Biotech | A606584 | for celluar uptake |
| Mounting medium | Life | P36961 | for celluar uptake |
References
- Davis, M. E., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (9), 771 (2008).
- Nie, S., Xing, Y., Kim, G. J., Simons, J. W. Nanotechnology applications in cancer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 257-288 (2007).
- Jabir, N. R., et al. An overview on the current status of cancer nanomedicines. Current Medical Research and Opinion. 34 (5), 911-921 (2018).
- Pillai, G. Nanomedicines for Cancer Therapy: An Update of FDA Approved and Those under Various Stages of Development. SOJ Pharmacy & Pharmaceutical Sciences. 1 (2), 1-13 (2014).
- Marta, T., Luca, S., Serena, M., Luisa, F., Fabio, C. What is the role of nanotechnology in diagnosis and treatment of metastatic breast cancer? Promising Scenarios for the Near Future. Journal of Nanomaterials. 2016, e5436458 (2016).
- Dasari, S., Tchounwou, P. B. Cisplatin in cancer therapy: molecular mechanisms of action. European journal of Pharmacology. 740, 364-378 (2014).
- Brigger, I., Dubernet, C., Couvreur, P. Nanoparticles in cancer therapy and diagnosis. Advanced Drug Delivery Reviews. 64, 24-36 (2012).
- Steichen, S. D., Caldorera-Moore, M., Peppas, N. A. A review of current nanoparticle and targeting moieties for the delivery of cancer therapeutics. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 48 (3), 416-427 (2013).
- Salanti, A., et al. Targeting human cancer by a glycosaminoglycan binding malaria protein. Cancer Cell. 28 (4), 500-514 (2015).
- Seiler, R., et al. An Oncofetal Glycosaminoglycan Modification Provides Therapeutic Access to Cisplatin-resistant Bladder Cancer. European Urology. 72 (1), 142-150 (2017).
- Zhang, B., et al. Targeted delivery of doxorubicin by CSA-binding nanoparticles for choriocarcinoma treatment. Drug Delivery. 25 (1), 461-471 (2018).
- Zhang, B., et al. Placenta-specific drug delivery by trophoblast-targeted nanoparticles in mice. Theranostics. 26 (2), 130-137 (2018).
- Zhang, L., et al. Self-assembled lipid--polymer hybrid nanoparticles: a robust drug delivery platform. ACS Nano. 2 (8), 1696-1702 (2008).
- Zheng, M., et al. Single-step assembly of DOX/ICG loaded lipid-polymer nanoparticles for highly effective chemo-photothermal combination therapy. ACS. 7 (3), 2056-2067 (2013).
- Fang, R. H., Aryal, S., Hu, C. -M. J., Zhang, L. Quick synthesis of lipid− polymer hybrid nanoparticles with low polydispersity using a single-step sonication method. Langmuir. 26 (22), 16958-16962 (2010).
- Gu, L., et al. Folate-modified, indocyanine green-loaded lipid-polymer hybrid nanoparticles for targeted delivery of cisplatin. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 28 (7), 690-702 (2017).
- Mandal, B., Mittal, N. K., Balabathula, P., Thoma, L. A., Wood, G. C. Development and in vitro evaluation of core-shell type lipid-polymer hybrid nanoparticles for the delivery of erlotinib in non-small cell lung cancer. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 81, 162-171 (2016).
- Shi, T., et al. Enhanced legumain-recognition and NIR controlled released of cisplatin-indocyanine nanosphere against gastric carcinoma. European Journal of Pharmacology. 794, 184-192 (2017).
- Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Analytical Biochemistry. 185 (1), 131-135 (1990).
- Hadjipanayis, C. G., et al. EGFRvIII Antibody-Conjugated Iron Oxide Nanoparticles for Magnetic Resonance Imaging-Guided Convection-Enhanced Delivery and Targeted Therapy of Glioblastoma. Cancer Research. 70 (15), 6303-6312 (2010).
- Sadhukha, T., Wiedmann, T. S., Panyam, J. Inhalable magnetic nanoparticles for targeted hyperthermia in lung cancer therapy. Biomaterials. 34 (21), 5163-5171 (2013).
- Jennings, M., Nicknish, J. Localization of a site of intermolecular cross-linking in human red blood cell band 3 protein. Journal of Biological Chemistry. 260 (9), 5472-5479 (1985).
- Staros, J. V. N-hydroxysulfosuccinimide active esters: bis(N-hydroxysulfosuccinimide) esters of two dicarboxylic acids are hydrophilic, membrane-impermeant, protein cross-linkers. Biochemistry. 21 (17), 3950-3955 (1982).
- Valencia, P. M., et al. Single-step assembly of homogenous lipid− polymeric and lipid− quantum dot nanoparticles enabled by microfluidic rapid mixing. ACS. 4 (3), 1671-1679 (2010).
- Altintas, I., et al. Nanobody-albumin nanoparticles (NANAPs) for the delivery of a multikinase inhibitor 17864 to EGFR overexpressing tumor cells. Journal of Controlled Release. 165 (2), 110-118 (2013).
- Maya, S., et al. Cetuximab conjugated O-carboxymethyl chitosan nanoparticles for targeting EGFR overexpressing cancer cells. Carbohydrate Polymers. 93 (2), 661-669 (2013).
- Deepagan, V. G., et al. In vitro targeted imaging and delivery of camptothecin using cetuximab-conjugated multifunctional PLGA-ZnS nanoparticles. Nanomedicine. 7 (4), 507-519 (2012).
- Totaro, K. A., et al. Systematic investigation of EDC/sNHS-mediated bioconjugation reactions for carboxylated peptide substrates. Bioconjugate Chemistry. 27 (4), 994-1004 (2016).
- Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25 (4), 663-682 (2006).
- Zhang, B., et al. LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma. Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).
- Koren, E., Apte, A., Sawant, R. R., Grunwald, J., Torchilin, V. P. Cell-penetrating TAT peptide in drug delivery systems: proteolytic stability requirements. Drug Delivery. 18 (5), 377-384 (2011).
- Chu, Y., et al. Topical ocular delivery to laser-induced choroidal neovascularization by dual internalizing RGD and TAT peptide-modified nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 12, 1353-1368 (2017).
