Article de méthode

Haut débit mesure de Membrane plasmique réapposition de sceau sur l’efficacité des cellules de mammifères

DOI :

10.3791/58351

⸱

7 janvier 2019

 ,  , 
1Department of Microbial Infection and Immunity, The Ohio State University, 2Department of Microbiology, The Ohio State University, 3Infectious Diseases Institute, The Ohio State University, 4Division of Biostatistics, College of Public Health, The Ohio State University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons ici un test haut débit fluorescence qui mesure la membrane plasmique rescellage d’efficacité grâce à des analyses fluorimétrique et imageries de cellules vivantes. Ce test peut être utilisé pour le dépistage des drogues ou des gènes de cible qui régulent la membrane plasmique réapposition de sceau sur des cellules mammaliennes.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans leur environnement physiologique, les cellules de mammifères souvent soumises à des contraintes mécaniques et biochimiques qui donnent lieu à des dommages de la membrane plasmique. En réponse à ces dommages-intérêts, les mécanismes moléculaires complexes refermer rapidement la membrane plasmique pour rétablir sa fonction de barrière et de maintenir la survie des cellules. Malgré les 60 ans de recherche dans ce domaine, il nous manque encore une compréhension approfondie de la cellule réapposition de sceau sur machines. Dans le but d’identifier les composants cellulaires que contrôle rescellement de membrane plasmique ou des médicaments qui peuvent améliorer la réapposition de sceau, nous avons développé un test haut débit basés sur la fluorescence qui mesure la membrane plasmique réapposition de sceau sur l’efficacité des cellules de mammifères cultivé en microplaques. Comme système modèle pour les dommages de la membrane plasmique, les cellules sont exposées à la listériolysine toxine bactérienne formant des pores O (LLO), qui forme la grande 30-50 nm de diamètre protéique pores en cholestérol contenant les membranes. L’utilisation d’un lecteur de microplaques de multimode thermorégulées permettant la spectrofluorométrie rapide et sensible des mesures en combinaison avec fond clair et imagerie de la microscopie de fluorescence des cellules vivantes. L’analyse cinétique de l’intensité de la fluorescence émise par un fluorochrome de l’acide nucléique-liaison imperméants membrane reflète l’étendue de la membrane blessant et refermer au niveau de la population des cellules, permettant le calcul de la cellule réapposition de sceau sur l’efficacité . Imagerie de la microscopie de fluorescence permet pour le dénombrement des cellules, qui constitutivement expriment une chimère fluorescente de la protéine nucléaire histone 2 b, dans chaque puits de la microplaque pour tenir compte des variations potentielles de leur nombre et permet éventuellement identification des populations cellulaires distincts. Ce test haut débit est un outil puissant devrait s’accroître notre compréhension des mécanismes de réparation de membrane par l’intermédiaire de dépistage des gènes hôtes ou exogène ajouté des rescellement de membrane plasmique ce contrôle.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cellules de mammifères sont soumis à un stress mécanique, osmotique et biochimique, entraînant la perte d’intégrité de la membrane plasmique. Sans rescellement de rapide et efficace, les cellules endommagées succomberait rapidement à mort programmée ou nécrotique. Depuis les années 1960, les efforts pour comprendre la membrane plasmique rescellage processus ont été motivées par les conséquences dévastatrices, associés à ses dysfonctionnements. En effet, des maladies telles que la branche-Girdle Muscular Dystrophy, le diabète et le Syndrome de Chediak-Higashi ont été liés à déficient membrane plasmique réparation due à des mutations dans le gène codant dysferline, la production de produits de glycation avancée ainsi que les anomalies dans le régulateur de trafic lysosomal CHS1, respectivement1,2,3,4,5,6. Toutefois, à ce jour, notre compréhension de la membrane rescellage est encore limitée7. Les premières études ont démontré que la membrane rescellage est initiée par l’influx d’extracellulaire Ca2 + par le biais de la plasmalemme endommagés8,9,10. Depuis lors, plusieurs ne s’excluent Ca2 +-mécanismes dépendants ont été proposées pour refermer les cellules. L’hypothèse de patch propose que, à proximité de la plaie, vésicules intracellulaires fusionnent entre eux et la membrane plasmique endommagée d’agir comme un patch11,12,13,14. Un second modèle propose cette exocytose calcium-dépendante des lysosomes à la plaie site libère la Sphingomyélinase acide enzyme lysosomale, qui convertit la sphingomyéline en céramide dans le feuillet externe de la membrane plasmique. Ce changement soudain dans la composition lipidique entraîne axée sur le céramide endocytose de la région endommagée15,16,17. Enfin, le troisième mécanisme proposé implique un rôle pour l’endosomale tri complexes nécessaires au transport (ESCRT) promouvoir la formation de vésicules donnant sur l’extérieur qui bourgeonnent hors de la membrane plasmique18. Uniquement un ensemble limité de protéines a été identifié dans ces modèles, et leurs machines doit être davantage élucidé.

Nous décrivons ici un test haut débit qui la membrane plasmique réapposition de sceau sur l’efficacité des cellules de mammifères adhérentes soumise à endommager des mesures médiées par recombinaison listériolysine O (LLO)19. LLO est une toxine en formant des pores (PFT) sécrétée par le pathogène intracellulaire facultatif Listeria monocytogenes20,21,22 et appartient à la MACPF/CDC (complexe d’attaque membranaire, la perforine, et super-famille cytolysine cholestérol-dépendante). MACPF sont formant des pores mammifères protéines impliquées dans les défenses immunitaires, tandis que les CDC est des toxines bactériennes principalement produites par des agents pathogènes Gram-positifs qui endommagent les cellules de l’hôte pour promouvoir leurs modes de vie pathogènes23. CDCs sont synthétisées sous forme de monomères solubles dans l’eau ou les dimères qui se lient au cholestérol présent dans la membrane plasmique et oligomerize en un complexe prepore des sous-unités jusqu'à 50. Le complexe prepore réarrange ensuite pour insérer les brins β à travers la bicouche lipidique, formant un pore de β-canon qui s’étend sur 30-50 nm de diamètre24,25,26,27.  Ces grands pores permettent un flux d’ions et de petites composantes cellulaires dans et hors de la cellule ; Cependant, certaines études ont proposé que les pores de plus petites tailles sont également formé28,29,30. Entre les CDC, LLO affiche des propriétés uniques, y compris l’agrégation irréversible et température-dépendante du pH, qui est propice à des analyses de haut débit31,32. LLO peut être ajouté au milieu de culture cellulaire à 4 ° c, une température permissive à sa liaison à des cellules, mais pas à la formation du pore complexe. Ouverture de la formation de pores est synchronisable puis en augmentant la température à 37 ° c, permettant la diffusion efficace des molécules de la toxine dans le plan de la membrane d’oligomères de forme et pour le remodelage conformationnelle impliqués dans la génération de pore. C’est pourquoi, suite à l’interrupteur de température, la cinétique des dommages cellulaires dépendra de la quantité de toxine liée à la membrane plasmique. Ce qui est important, LLO soluble (non lié à la membrane plasmique) rapidement et irréversiblement agrégats lorsque la température atteint 37 ° c, ce qui diminue le besoin d’évacuer les molécules de la toxine non lié et limite l’étendue des dégâts de la membrane au fil du temps. Enfin, parce que LLO se lie au cholestérol et forme des pores dans les membranes riches en cholestérol, ce dosage est favorable à une large gamme de cellules de mammifères. Il est important de garder à l’esprit que LLO affecte la cellule hôte signalisation principalement via la formation de pores, à quelques exceptions près dans quelle cellule indépendante du pore de signalisation peut se produire33,34,35,36 ,37,38,,39. Par conséquent, il ne peut pas être exclu que LLO activités peuvent influer sur le processus de réparation de membrane de signalisation.

Ce test évalue directement l’étendue de la cellule blessant en mesurant l’incorporation d’un fluorochrome imperméants cellulaire (p. ex., l’iodure de propidium) qui pénètre les cellules blessées passivement et qui devient très fluorescent une fois qu’il associe à des acides nucléiques . Par conséquent, le fluorochrome peut être maintenu dans le milieu de culture cellulaire pendant toute l’expérience, ce qui permet des analyses en temps réel des cellules blessant. L’intensité de la fluorescence du colorant acide nucléique-liaison augmente avec la concentration de la toxine et, pour une concentration donnée de toxine, augmentera au fil du temps jusqu'à ce que tous les pores sont formés, et les cellules sont entièrement réparés ou jusqu'à ce que la saturation est atteinte. L’afflux d’extracellulaire Ca2 + à travers les pores de la membrane est un événement de la condition sine qua non pour refermer. Par conséquent, l’efficacité de fermeture peut être indirectement attestée en comparant la cellule blessant dans le milieu de culture contenant du Ca2 + (condition permissive de réparation) à blessant d’un Ca2 +-milieu dépourvu (condition restrictive de réparation). Parce que l’intensité de la fluorescence de la teinture de liaison de l’acide nucléique est directement proportionnelle à la concentration cellulaire dans chaque puits, il est important de cellules des graines à la même concentration dans tous les puits. Il est également important d’énumérer des cellules dans chaque puits avant et après le test pour s’assurer que le détachement de cellules ne se produit pas, comme flottant, cellules agrégées peuvent masquer des lectures de fluorescence qui peuvent compliquer l’interprétation des données. Pour énumérer des cellules, les cellules exprimant l’histone nucléaire localisé 2 b-GFP (H2B-GFP) ont été utilisées dans ce test. Température contrôlée, multimode, lecteurs de microplaques allient des mesures rapides et à haut débit (à l’aide d’un format de plaque 96 ou 384 puits) d’intensités de fluorescence avec imagerie microscopie des cellules vivantes à 37 ° C. Ce dernier peut être utilisé pour énumérer le nombre de cellules et observer la formation éventuelle de populations cellulaires distincts.

En fin de compte, ce test offre aux utilisateurs la possibilité d’approfondir leur connaissance de la complexité des mécanismes de réparation de membrane de dépistage pour les molécules de l’hôte ou réparer des composés exogène qui peuvent contrôler la membrane. Le protocole suivant décrit les étapes expérimentales afin de mesurer l’efficacité de fermeture des cellules exposées à la LLO et évaluer les effets d’un médicament ou un traitement cellulaire sur l’efficacité de fermeture.

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Protocole

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1. préparation

  1. Placage de cellule
    Remarque : Donner naissance à des cellules épithéliales humaines du col utérin, HeLa et HeLa exprimant Histone 2 b-GFP (H2B-GFP), ont été utilisés dans le présent protocole, mais ce test peut être adapté aux autres cellules mammaliennes19.
    1. Détacher les cellules adhérentes d’un flacon de culture cellulaire 75 cm2 de laver les cellules avec 2 mL de trypsine-EDTA 0,25 %. Remplacez la trypsine utilisée par 2 mL de 0,25 % de trypsine-EDTA fraîches.
    2. Incuber les cellules à 37 ° c pendant 5 min jusqu'à ce que les cellules ont arrondi et détaché de la fiole.
    3. Remettre en suspension les cellules de 8 mL de milieu de culture (DMEM contenant 10 % sérum de veau fœtal inactivés par la chaleur, 100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine).
    4. Déterminer la concentration de cellules à l’aide d’un hémocytomètre et 10 µL de suspension cellulaire.
    5. Diluer les cellules dans un milieu de croissance à une concentration de 2, 5 x 105 cellules/mL.
    6. Versez la suspension cellulaire dans un bassin de pipette stérile et mélanger soigneusement la suspension à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL.
    7. À l’aide d’une micropipette multicanaux-12 avec embouts 200 µL, distribuer les cellules HeLa (2,5 x 104 cellules/100 µL/puits) en trois exemplaires (ou quatre exemplaires) dans une plaque de culture de tissus traités en polystyrène fond plat de 96 puits, clair, noir.
      Remarque : Un arrangement de placage est présenté comme un exemple à la Figure 1.
    8. La culture des cellules pendant 24 h dans un incubateur de culture cellulaire humidifiée à 37 ° c et 5 % de CO2.
  2. Préparation de la Solution mère
    1. Préparer 1 L d’un stock de 10 x de tampon M (utilisé pour préparer des M1 et M2) en ajoutant 95 g de Hanks Solution saline équilibrée, 0,476 g de MgCl2 (5 mM) et g 23,83 de HEPES (100 mM) à 900 mL d’eau. Ajuster le pH à 7,4 et augmenter le volume à 1 L. filtre stériliser.
    2. Préparer 50 mL de 50 x (1,25 M) stock de glucose en ajoutant 11,26 g de D-(+)-Glucose à un total de 50 mL d’eau. Filtre de stériliser la solution.
    3. Préparer 50 mL d’un 100 x stock (120 mM) de calcium en ajoutant 0,666 g de CaCl2 pour un total de 50 mL d’eau. Filtre de stériliser la solution.
    4. Préparer 50 mL d’un 10 x stock (50 mM) de l’éthylène glycol-bis(2-aminoethylether)-N, N, N', N', acide tétraacétique (EGTA) en ajoutant 0,951 g de EGTA à 40 mL d’eau. Augmenter le pH à 8 à l’aide de NaOH pour dissoudre l’EGTA, puis augmentez le volume à 50 mL. Filtre de stériliser la solution.
    5. Pour une seule plaque 96 puits, préparer 50 mL de milieu 1 (M1, contient Ca2 +), 50 mL de milieu 2 (M2, Ca2 +-libre) et 15 mL de moyen 2 additionné de EGTA, en conséquence :
      1. Pour M1, ajouter 5 mL de 10 x M de tampon, 0,5 mL de 100 x CaCl2et 1 mL de glucose de x 50 à 43,5 mL d’eau.
      2. Pour M2, ajouter 5 mL de 10 x M de tampon et 1 mL de glucose x 50 à 44 mL d’eau.
      3. Pour M2/EGTA, ajouter 1,5 mL de 10 x M de tampon et 1,5 mL de 10 x EGTA à 12 mL d’eau.
        Remarque : Toutes les solutions contenant de l’iodure de propidium (PI) doivent être préparées directement avant de les ajouter aux cellules.
  3. Plaque Reader/imagerie cytomètre en paramètres
    Remarque : Utilisez un lecteur de plaque multimodes équipé de deux unités de détection : un spectrofluorimètre et un cytomètre en imagerie. Limiter l’exposition de fluorescence pour éviter le Photoblanchiment les fluorophores.
    1. Réchauffez le lecteur de plaque à 37 ° C avant d’effectuer le test.
    2. Définir les paramètres pour l’analyse de la cinétique en conséquence dans le mode de réglage :
      1. Choisir le monochromateur, FL (fluorescence)et cinétique pour la configuration optique, modes de lire et lire type, respectivement.
      2. Sous Paramètres de longueur d’onde, sélectionnez un 9 et 15 nm d’excitation et d’émission passe-bande, respectivement. Pour les tests à l’aide de l’iodure de propidium (PI), définissez la longueur d’onde d’excitation et d’émission à 535 et 617 nm, respectivement.
      3. Sous Type de plaque, sélectionnez 96 puits pour le format de la plaque et une configuration préréglée plaque correspondant à une plaque de fond clair noir-mur.
      4. Sous la Zone de lecture, mettez en surbrillance les puits qui seront analysés tout au long de la cinétique.
      5. PMT et optique, présélection les clignotements à la lecture à 6 et cochez la case lecture du fond.
      6. Sous calendrier, ajouter 00:30:00 dans la zone de Temps d’exécution Total pour un dosage de cinétique de 30 min et 00:05:00 pour l' intervalle.
        Attention : À chaque fois d’orienter et d’une longueur d’onde, le temps de lecture d’une plaque 96 puits complet est de 30 s.
      7. Confirmer les paramètres spécifiés dans les Paramètres d’informations vers la droite, puis sélectionnez OK. Appuyez sur lecture pour initier la cinétique exécuter.
    3. Définir les paramètres d’imagerie en conséquence dans le mode de réglage :
      1. Choisissez Minimax, d’imagerieet des manifestations pour la configuration optique, modes de lire et lire type, respectivement.
      2. En vertu de longueurs d’onde, sélectionnez diascopieet une ou les deux les cases de fluorescence correspondant aux longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 456/541 nm (GFP) et 625/713 nm (PI).
      3. Utilisez les mêmes options pour le Type de plaque et de la Zone de lecture tel que défini aux étapes 1.3.2.3 et 1.3.2.4.
      4. Sous Bien des paramètre de zone, sélectionnez le nombre de sites dans un puits à être photographié.
        Remarque : 12 sites correspondent à une image plein-puits.
      5. Avec les Réglages d’Acquisition Image, sélectionner les temps d’exposition par lumière transmise, 541 (GFP) et 713 (PI). Pour GFP, image de l’ensemble du bien avec un temps de pose de 20 ms/image. Pour transmettre lumière (TL) et la fluorescence de la PI, acquérir une image unique du centre de chaque puits avec des temps d’exposition de 8 à 20 ms, respectivement.
      6. Confirmer les paramètres spécifiés dans les informations de paramètres à droite, puis sélectionnez OK. Le temps d’acquisition des images de la totalité de la surface de chaque puits (12 images/puits) d’une plaque 96 puits et d’une longueur d’onde est environ 15 min. Appuyez sur lire pour initier l’imagerie.
        Remarque : Le temps d’acquisition d’un seul image/puits d’une plaque 96 puits nécessite ~2.5 min/plaque pour une longueur d’onde. Les paramètres décrits ci-dessus correspondent à l’équipement spécifique dans notre laboratoire. Spectrofluorométrie mesures : une lampe flash xénon affichant 1,0 nm incrément excitation longueurs d’onde (250 à 850 nm) avec un passe-bande réglable de nm 9 ou 15, un détecteur de tube photomultiplicateur avec un > 6 log gamme dynamique et une émission réglable à 15 ou 25 nm passe-bande. Cytomètre d’imagerie : une source de lumière éclairage capable de lumière blanche, 460 nm et 625 longueurs d’onde excitation nm avec un 20 nm passe-bande, filtres d’émission centrées à 541 nm (108 nm bandpass) et 713 nm (passe-bande de 123 nm), respectivement, et un objectif 4 X couplé à un 1,25 dispositif à couplage de charge 12-bit mégapixels.

2. Mode operatoire

Remarque : Au moment du test, les cellules doivent être confluente de 70 à 90 %. Au cours des étapes de lavage, le support doit être retiré et appliqué à la paroi latérale du puits (pas directement au-dessus des cellules). Maintenir la température de LLO à < 4 ° c pour empêcher son agrégation jusqu'à l’étape 3.1.5.

  1. Préparation d’un stock de 30 µM PI en M1 et un stock de 30 µM PI en M2 préchauffée à 37 ° c.
  2. Laver délicatement les cellules de la plaque 1 à une micropipette multicanaux-12 avec embouts 200 µL, comme suit :
    1. Conditions de réparation-permissive, enlevez le milieu de croissance et laver que les cellules deux fois avec 200 µL/puits M1 préchauffées à 37 ° c. Remplacez le support par 100 µL/puits de M1 chaud contenant 30 µM PI.
    2. Pour réparer des conditions restrictives, enlevez le milieu de croissance et laver les cellules une fois avec 200 µL/puits chaud M2 contenant 5 mM EGTA de chélater Ca2 +, suivie d’un lavage avec 200 µL/puits M2. Remplacer le support avec 100 µL/puits chaud M2 contenant 30 µM PI.
    3. Après que le milieu de culture a été lavé et remplacé avec un milieu contenant de l’iodure de propidium, passer directement à l’étape 2.1.3.
  3. Plaque image 1 sous lumière transmise, GFP et PI comme indiqué sous 1.3.3 (pré cinétique). Cette étape prend 15-20 min.
  4. Pendant la période de 15 min à l’étape 2.1.3, préparer la plaque 2 à l’aide une micropipette multicanaux-12 et 200 µL conseils comme suit :
    1. Placer une microplaque en polypropylène fond rond 96 puits sur la glace. Configurer la plaque à l’aide d’un dispositif expérimental correspondant à la plaque 1 (Figure 1).
    2. Conditions de réparation-permissive, ajouter 100 µL/puits de M1 glacée contenant 60 µM PI, suivie de l’addition de 100 µL/puits de M1 glacée contenant 4 x LLO ou pas pour le contrôle.
    3. Pour des conditions restrictives pour réparation, ajouter 100 µL/puits de M2 glacée contenant 60 µM PI, suivie de l’addition de 100 µL/puits de M2 glacée contenant 4 x LLO ou pas pour le contrôle.
  5. Après immédiatement l’imagerie plaque 1 (étape 2.1.3), placez-le sur la glace, à l’aide de papier d’aluminium pour séparer la plaque de contact direct avec la glace. Laissez la plaque 1 se refroidir pendant 5 min.
  6. À l’aide d’une micropipette multicanaux-12 avec embouts 200 µL, transférer 100 µL de chaque puits dans plaque 2 (étape 2.1.4) aux puits correspondants à la plaque 1. Afin de répartir correctement la toxine dans les médias de la plaque 1, insérer les pointes sous le ménisque et le volume d’éjection doucement sans introduire des bulles.
    Remarque : Ne pas pipeter haut et en bas, comme cela peut détacher par inadvertance les cellules.
  7. Laisser la plaque pour une 1 min supplémentaire permettre à la toxine de lier aux cellules et immédiatement transférer plaque 1 dans le lecteur de plaque pour le test cinétique utilisant le mode spectrofluorimètre (étape 1.3.2).
  8. À la fin de l’essai cinétique, immédiatement image plaque 1 (études cinétiques) à l’aide étape 1.3.3.

3. analyse : Numération des lymphocytes

  1. Déterminer le nombre d’éléments basé sur la fluorescence nucléaire en utilisant le logiciel d’énumération cellule microplaque.
    1. Dans paramètres, sélectionnez Re-analyseet sous la section de catégorie dans les Paramètres de l’analyse d’Image , sélectionnez L’analyse objet discret en utilisant 541 comme la longueur d’onde pour trouver des objets.
    2. Au sein de l’option de trouver des objets, en utilisant le s’inspirent d’Images recherche méthode, sélectionnez noyaux sous l’onglet paramètres, puis appuyez sur appliquer.
    3. Appuyez sur OK et lecture pour lancer la cellule algorithme de comptage.
  2. Si aucun de ce outils n’est disponible, utiliser un logiciel d’analyse image comme ImageJ pour énumérer les cellules.
    1. Dans ImageJ, ouvrez le fichier de l’image comme une pile.
    2. Convertir la pile d’images niveaux de gris 8 bits en cliquant sur Image dans la barre de menu, survolez de Type, puis sur 8 bits.
    3. Soustraire le fond : cliquez sur l' Image dans la barre de menu, survolez Adjustet sélectionnez Luminosité/contraste. Ajuster la valeur minimale pour supprimer le bruit de fond et sélectionnez appliquer.
    4. Seuil pour créer des images binaires : cliquez sur l' Image dans la barre de menu, survolez Adjust, puis sélectionnez le seuil. Sélectionnez arrière-plan sombre, ajuster les seuils minimum et maximum et cliquez sur appliquer.
    5. En cas de cumul des noyaux, un outil de bassin hydrographique peut servir aux noyaux de segment. Cliquez sur processus dans le menu, survolez binaire et sélectionnez des bassins versants.
      Remarque : Cela se détachera automatiquement connectés noyaux.
    6. Analyser les images masqués par l’application des critères spécifiés par l’utilisateur (taille et circularité) pour affiner l’identification des noyaux et exclure les débris cellulaires.
      1. Cliquez sur analyser dans le menu, puis sur analyser les particules. Définir la taille désirée (pixel ^ 2) et circularité (une valeur de 1 est un cercle parfait) cuisinières qui sont suffisantes pour inclure les cellules/noyaux individuels.
      2. Dans la zone de liste déroulante Afficher, sélectionnez les ou les options désirées, vérifier les résumeret cliquez sur OK pour obtenir le nombre de cellules.

4. analyse : Courbes cinétiques

  1. Transférer les données cinétiques du logiciel de lecteur de plaque à un logiciel d’analyse de données.
  2. Pour chaque condition expérimentale, en moyenne les intensités de fluorescence des répliques à chaque validant, ainsi que l’écart-type correspondant et l’écart-type de la moyenne pour chaque condition expérimentale.
  3. Pour chaque condition expérimentale, tracer la courbe cinétique correspondante : intensité de PI (axe y) par rapport au temps (axe des x).
  4. Pour calculer l’efficacité de fermeture d’une condition de traitement donnée, calculer l’aire sous la courbe (ASC) de la + LLO en M1 (AUC(M1)) et + LLO en M2 (AUC(M2)). Utiliser l’approche suggérée ci-dessous afin d’évaluer l’efficacité (E) d’étanchement :
    figure-protocol-1
  5. Effectuez une comparaison entre contrôle et essai de traitement en déterminant le coefficient d’efficacité (REff) indiqués ci-après :
    figure-protocol-2
    REFF = 1, test traitement n’a aucun effet sur la réparation
    REFF < 1, test traitement inhibe la réparation
    REFF > 1, test traitement améliore la réparation
  6. Calculer l’aire sous la courbe à l’aide de l’équation suivante :
    figure-protocol-3, où k est le nombre total des suivis.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Précision de comptage de cellules : les cellules HeLa sont fréquemment utilisés comme une ligne de cellules de mammifère modèle explorer les mécanismes de réparation de membrane. Lors de l’évaluation de réparation de la membrane au niveau de la population des cellules, il est important de cellules de la plaque à la même concentration dans tous les puits pour l’interprétation des données appropriées. Il est également important de vérifier au moment de l’essai que nombre de cellules est équ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce test mesure l’efficacité de la membrane rescellage au niveau des populations de cellules avec une capacité de haut débit. Il peut être utilisé pour dépister les composants cellulaires ou des bibliothèques de drogues qui pourraient affecter la réparation de la membrane. Le test décrit utilisée un format de plaque à 96 puits, mais il peut être adapté pour les plaques 384 puits pour un débit plus élevé. Un avantage de ce test est sa capacité à obtenir des mesures de fluorescence des cellules vivantes adhérentes en temps ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous reconnaissons le Dr Jesse Kwiek (The Ohio State University) pour bien vouloir ce qui nous permet d’utiliser sa plate-forme de détection multimode pour quelques expériences préliminaires. Recherche rapporté dans cet article a été financée par le National Institute of Allergy et des maladies infectieuses de la National Institutes of Health, sous le numéro de prix RO1AI107250 à Stephanie Seveau. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Lecteur de microplaques multimode SpectraMax i3xDispositifs moléculairesi3x
MiniMax 300Dispositifs moléculaires5024062
TO-PRO-3ThermoFisher ScientificT3605
Iodure de propidiumThermoFisher ScientificP3566
HeLaATCCCCL2
HeLa H2B-GFPMilliporeSCC117
Trypsine-EDTA 0,25 %ThermoFisher Scientific25200056
Plaque de culture tissulaire en polystyrène noir à fond plat de 96 puits Corning3603
Sels équilibrés de HanksSigma-AldrichH4891
EGTAISC BioExpress0732-100G
HEPESFisher ScientificBP310-500
D-(+)-glucose, HybriMaxSigma-AldrichG5146-1KG
Cytomètre d’imagerie

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Demonbreun, A. R., McNally, E. M. Plasma Membrane Repair in Health and Disease. Current Topics in Membranes. 77, 67-96 (2016).
  2. Howard, A. C., McNeil, A. K., McNeil, P. L. Promotion of plasma membrane repair by vitamin E. Nature Communications. 2, 597(2011).
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