Immunology and Infection

哺乳动物细胞血浆膜检测效率的高通量测量

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58351

Jonathan G.T. Lam^1,2,3, Chi Song⁴, Stephanie Seveau^1,2,3

¹Department of Microbial Infection and Immunity, The Ohio State University, ²Department of Microbiology, The Ohio State University, ³Infectious Diseases Institute, The Ohio State University, ⁴Division of Biostatistics, College of Public Health, The Ohio State University

Summary

在这里, 我们描述了一种高通量荧光检测, 通过在活细胞中的荧光和成像分析测量质膜的重接受效率。该检测方法可用于筛选调节哺乳动物细胞质膜重密封的药物或靶向基因。

Abstract

在其生理环境中, 哺乳动物细胞经常受到机械和生化压力, 导致质膜损伤。为了应对这些损伤, 复杂的分子机械迅速重新密封质膜, 以恢复其屏障功能, 并保持细胞存活。尽管在这一领域进行了60年的研究, 但我们仍然缺乏对细胞重闭机械的透彻了解。为了识别控制质膜再密封的细胞成分或可以改善再密封的药物, 我们开发了一种基于荧光的高通量检测方法, 用于测量哺乳动物细胞中的质膜再密封效率在微板中培养。作为细胞膜损伤的模型系统, 细胞暴露在细菌形成毒素李斯特菌素 o (l低铁) 中, 在含胆固醇的膜中形成直径30-50 纳米的大型蛋白质孔。使用温度控制的多模微板读取器, 可以结合明亮场和荧光显微镜成像活细胞进行快速和灵敏的光谱测量。对膜不含核酸结合荧光铬发出的荧光强度进行动力学分析, 反映了细胞膜在细胞群体中的损伤和再密封程度, 从而可以计算细胞的保存效率.荧光显微镜成像允许细胞的计数, 这在宪法上表达了核蛋白组蛋白 2 b 的荧光嵌合体, 在微板的每口井, 以考虑其数量的潜在变化, 并允许最终识别不同的细胞群。这种高通量检测是一个强大的工具, 有望通过筛选宿主基因或控制质膜重新密封的外源添加化合物来扩大我们对膜修复机制的了解。

Introduction

哺乳动物细胞受到机械、渗透和生化胁迫, 导致细胞膜完整性的丧失。如果没有快速有效的重新密封, 受损的细胞很快就会死于有程序或坏死的死亡。自20世纪60年代以来, 了解质膜重密封过程的努力的动机是其功能障碍带来的破坏性后果。事实上, 像肢体腰带肌肉营养不良症、糖尿病和 chediak-higashi 综合征这样的疾病与由于基因编码异常的突变、先进的糖基化终产物的生产以及缺陷而导致的质膜修复不足有关。溶酶体贩运调节剂 chs1,分别^{为 1}^、²^、³^、4、⁵^、⁶.然而, 到目前为止, 我们对膜重封的理解仍然有限。初步研究表明, 膜复位是由细胞外 ca2⁺通过受损的质膜 8^,⁹^,¹⁰的流入^而引发的。自那时以来, 几个非相互排斥的 ca^{2 +}依赖机制已被提出重新体细胞。贴片假说提出, 在接近伤口的细胞内囊泡融合在一起, 并将受损的质膜作为^{贴片 11}^,¹²^,¹³^,¹⁴。第二个模型提出, 钙依赖性的溶酶体在伤口部位的渗出释放溶酶酸 sphingomyelinase, 它将 sphingomyelin 转化为质膜外单中的神经酰胺。脂质组成的这种突然变化导致受损区域¹⁵^、¹⁶^、¹⁷的神经酰胺驱动的内吞。最后, 第三个拟议的机制涉及运输所需的子宫内膜分枝复合体 (escrt) 的作用, 以促进从质膜¹⁸中脱落的向外的囊泡的形成。在这些模型中只发现了一组有限的蛋白质, 必须进一步阐明它们的机制。

在这里, 我们描述了一种高通量的测定膜重组李斯特菌蛋白 o (l库)¹⁹介导的损伤的粘附哺乳动物细胞的膜重组效率。llo 是一种成孔毒素 (pft), 由细胞内的兼发性病原菌单^核细胞增生李斯特菌 20^、²¹、²²分泌, 属于 macpf按 cdc (膜攻击复合体, 穿孔,胆固醇依赖性细胞分裂素) 超家族。macpf 是参与免疫防御的哺乳动物成孔蛋白, 而 cdc 是细菌毒素, 主要由革兰氏阳性病原体产生, 损害宿主细胞, 促进其致病性生活方式²³。cdc 被合成为水溶性单体或二聚体, 结合质膜中的胆固醇, 并将寡聚结合成最多50个亚基的前孢子复合体。然后, 前孔复合物重新排列, 在脂质双层层上插入β链, 形成直径^{为 24}^、²⁵^、²⁶^、²⁷的β桶孔。这些大毛孔允许离子和小细胞成分进出细胞;不过, 一些研究提出, 较小尺寸的毛孔也会形成 2⁸^、^{2 9}^、^{3 0.}在 cdc 中, llo 显示出独特的特性, 包括不可逆的 ph 和温度相关的聚合, 这有利于高吞吐量分析³¹^,³²。llo 可以在4°c 时添加到细胞培养培养基中, 温度允许其与细胞结合, 但不能添加到孔隙复合体的形成中。然后, 可以通过将温度提高到37°c 来同步孔隙形成的启动, 从而使毒素分子在膜平面上有效扩散, 形成低聚物, 并进行与孔隙生成有关的构象重塑。因此, 随着温度的变化, 细胞损伤的动力学将取决于与质膜结合的毒素量。重要的是, 当温度达到37°c 时, 可溶性 llo (不与质膜结合) 会迅速且不可逆转地聚集在一起, 从而缓解了冲洗未结合毒素分子的需要, 并随着时间的推移限制了膜的损伤程度。最后, 由于 llo 与胆固醇结合, 并在富含胆固醇的膜中形成毛孔, 这种检测方法适用于多种哺乳动物细胞。重要的是要记住, llo 主要通过孔隙形成影响宿主细胞信号, 除了少数例外, 在这些情况下, 与孔隙无关的细胞信号转导可能会发生³³^、³⁴^、³⁵^、³⁶ ^,³⁷^,³⁸^,³⁹。因此, 不能排除 llo 信号活动可能会影响膜修复过程。

该检测方法通过测量被动进入损伤细胞并与核酸连接后成为高荧光细胞的小不含氟铬细胞 (例如碘化钠) 的含量, 直接评估细胞损伤的程度.因此, 在整个实验过程中, 荧光铬可以保存在细胞培养介质中, 从而能够实时分析细胞损伤。核酸结合染料的荧光强度会随着毒素的浓度而增加, 对于一定浓度的毒素, 随着时间的推移, 会随着时间的推移而增加, 直到所有毛孔形成, 细胞完全修复或达到饱和度。细胞外 ca2⁺通过膜孔的涌入是重新密封的必要条件。因此, 通过比较含有 ca^{2 +} (修复允许条件) 的培养基中的细胞损伤与 ca²+ 无损伤 (修复限制性条件) 的损伤, 可以间接地证明细胞损伤的恢复效率。由于核酸结合染料的荧光强度与每口井的细胞浓度成正比, 因此所有油井中相同浓度的种子细胞都很重要。同样重要的是, 在检测前后的每口井中列举细胞, 以确保细胞分离不会发生, 因为漂浮的聚集细胞可能会掩盖荧光读数, 从而使数据解释复杂化。为了列举细胞, 本试验中使用了表达核局部组蛋白 2b-gfp (h2b-gfp) 的细胞。温度控制的多模微板读取器将荧光强度的快速、高吞吐量测量 (使用96或384个孔板格式) 与37°c 下活细胞的显微镜成像相结合。后者可用于列举细胞数量和观察不同细胞群的最终形成。

最终, 这种检测方法通过筛选宿主分子或可能控制膜修复的外源添加化合物, 为用户提供了扩大其对膜修复机制复杂性的了解的能力。下面的协议描述了测量暴露于 llo 的细胞的重密封效率的实验步骤, 并评估特定药物或细胞治疗对重密封效率的影响。

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Protocol

1. 准备工作

电池电镀
注: 本协议中使用了人宫颈上皮细胞、hela 和 hela 表达组蛋白 2b-gfp (h2b-gfp), 但该检测方法可适用于其他哺乳动物细胞¹⁹。
1. 用2毫升^的胰蛋白酶-edta 0.25% 清洗细胞, 从75厘米2细胞培养瓶中分离粘附细胞。将使用过的胰蛋白酶替换为2毫升的新鲜胰蛋白酶 edta 0.25%。
2. 在37°c 下将细胞加氢 5分钟, 直到细胞圆形并与烧瓶分离。
3. 在生长培养基中复制8毫升的细胞 (dmem 含有10% 热灭活的胎儿牛血清、100 u/ml 青霉素和100μgml 链霉素)。
4. 使用血细胞计和10μl 细胞悬浮液确定细胞浓度。
5. 将生长介质中的细胞稀释至 2.5 x^{10 5}细胞的浓度。
6. 将细胞悬浮液倒进无菌的移液器盆中, 并使用10毫升血清学移液器将悬浮液彻底混合。
7. 使用12多通道微移液器和200μl 尖端, 将 hela 细胞 (2.5 x^{10 4} cellsless件) 三分之一 (或四裂) 分布在96井平底、黑色聚苯乙烯组织培养板中。
  注意:在图 1中, 电镀布置以示例形式显示。
8. 在37°c 和 5% co 2 的加湿细胞培养孵化器中培养细胞 24小时.
库存解决方案准备
1. 通过添加95克 hanks 平衡盐溶液、0.476 克 mgl 2 (5 mm) 和23.83 克 hepes (100 mm) 至900毫升的水, 制备 10x缓冲液 m (用于制备 mM 和 m2) 的1升。将 ph 值调整到 7.4, 并将体积提高到 1 l. 过滤灭菌。
2. 在总共50毫升的水中加入11.26 克 d-(+)-葡萄糖, 制备 50x (1.25 m) 葡萄糖库存的50毫升。滤清器对溶液进行消毒。
3. 在总共50毫升的水中加入 0.66 g 的 ccl 2, 制备 100x (120 毫米) 钙库存的50毫升。滤清器对溶液进行消毒。
4. 在40毫升的水中加入0.951 克的 egta, 制备出 10倍 (50 mm) 的乙二醇-bis(2 氨基乙叶)-n、n、n、n '、n '、四乙酸 (egta)。使用 naoh 将 ph 值提高到 8, 以溶解 egta, 然后将体积提高到50毫升。滤清器对溶液进行消毒。
5. 对于单个96孔板, 请制备 50 ml 的中等 1 (mL, 包含 ca^{2 +})、50 ml 的中等 2 (m2, ca^{2 +}无) 和 15 ml 的中等 2, 并以 egta 为补充, 因此:
  1. 对于 mL, 加入5毫升的10倍缓冲液 m, 0.5 ml 的 100x ccl₂, 1 毫升的50x 葡萄糖到43.5 毫升的水。
  2. 对于 m2, 在水中加入5毫升的10倍缓冲 m 和1毫升的50x 葡萄糖。
  3. 对于 mL/egta, 在12毫升的水中加入 1.5 ml 的10倍缓冲 m 和 1.5 ml 的10倍的 egta。
    注: 在添加到细胞中之前, 应直接准备含有碘化物 (pi) 的所有溶液。
板读/成像细胞仪设置
注: 使用配备两种检测单元的多模板式读取器: 光谱仪和成像细胞仪。限制荧光暴露, 以避免光漂白的氟。
1. 在进行测试之前, 将读卡器预热至37°c。
2. 在"设置"模式下相应地设置动力学检测的参数:
  1. 分别为光学配置、读取模式和读取类型选择单色仪、fl (荧光)和动力学。
  2. 在 "波长设置"下, 分别选择9和15纳米激励和发射带通。对于使用碘化丙酸 (pi) 进行的检测, 将激发和发射波长分别设置为535纳米和617纳米。
  3. 在"板类型"下, 选择96 井作为板格式和与黑墙透明底板相对应的预置板配置。
  4. 在"读取区域" 下, 突出显示将在整个动力学过程中分析的井。
  5. 在pmt 和光学下, 将每次读取的闪光灯预设为6 , 然后选中 "从底部读取" 复选框。
  6. 在"时间"下, 在"总运行时间" 框中插入00:30:00以进行30分钟的动态分析, 并插入00:05:00进行间隔。
    注意: 对于每个时间点和一个波长, 一个完整的96孔板的读取时间为30秒。
  7. 在右侧的 "设置信息"中确认指定的设置, 然后选择"确定"。按"读取"启动动能运行。
3. 在 "设置" 模式下相应地设置映像参数:
  1. 分别为光学配置、读取模式和读取类型选择 "最小值"、"成像" 和 "终结点"。
  2. 在波长下, 选择透射光, 并选择与456/541 纳米 (gfp) 和 625/713 nm (pi) 的激发和发射波长相对应的荧光框中的一个或两个。
  3. 对"板类型" 和"读取区域" 使用与步骤1.3.2.3 和1.3.2.4 中定义的相同选项。
  4. 在"井区设置" 下, 选择要映像的井内的地点数。
    注意: 12个站点对应于完整的图像。
  5. 在"图像采集设置"下, 选择传输光、541 (gfp) 和 713 (pi) 的曝光时间。对于 gfp, 以 20 ms/图像的曝光时间对整个油井进行成像。对于透射光 (tl) 和 pi 荧光, 获取每个井的中心的单一图像, 曝光时间分别为8毫秒和20毫秒。
  6. 在右侧的 "设置信息"中确认指定的设置, 然后选择"确定"。对96孔板的每口井 (12 张成像井) 的整个表面进行成像的采集时间为 ~ 15分钟, 按读数启动成像。
    注:96 孔板的单个图像/井的采集时间需要一个波长的 ~ 2.5 分钟板。上述参数与我们实验室的特定设备相对应。光谱测量: 显示 1.0 nm 增量激发波长 (250-850 nm) 的氙气闪光灯, 带有可调9或 15 nm 带通, 光电倍增管检测器具有 > 6个测井动态范围和可调节的15或 25 nm 发射通。成像细胞仪: 一种能够提供白光、460纳米和 625 nm 激发波长的照明光源, 具有20纳米带通, 发射滤波器分别以 541 nm (108 nm 带通) 和 713 nm (123 nm 带通) 为中心, 4x 目标耦合到1.2512位电荷耦合设备摄像头。

2. 检测

注意: 在检测时, 细胞必须是70-90% 的融合。在清洗步骤中, 应将介质从井壁中取出并应用于井壁 (而不是直接位于细胞上方)。将 llo 的温度保持在 < 4°c, 以防止其聚合, 直至3.1.5 步骤。

在 m1 中准备 30μm pi 的库存, 在37°c 预热的 m2 中制备 30μm pi 的库存。
使用12通道微移液器和200μl 吸头轻轻清洗第1版中的细胞, 如下所示:
1. 对于可修复的条件, 请取出生长介质, 用 200μl/well m1 在37°c 预热的情况下两次清洗细胞。将含有 30μm pi 的温暖 m1 介质替换为 100μl/井。
2. 为在限制性条件下, 取出生长介质, 用含有 5mm egta 的200μl 井温 m2 清洗细胞一次, 将其螯合 ca 2⁺, 然后用 200μl/well m2 清洗一次。将介质替换为含有 30μm pi 的100μl 井温 m2。
3. 在对培养基进行洗涤后, 用含碘化物的培养基代替, 直接移动到步骤2.1.3。
图像板1在透射光、gfp 和 pi 下, 在1.3.3 下详细 (前动)。此步骤需要15-20。
在2.1.3 步骤的15分钟内, 使用 12-多通道微移液器和200μl 吸头准备2板, 如下所示:
1. 将96孔圆形底部聚丙烯微板放在冰上。使用与板材1相对应的实验设计配置板 (图 1)。
2. 对于允许的修复条件, 添加含有 60μm pi 的冰凉 m1 的 100μl/well, 然后添加 100μl/well, 其中包含 4倍 llo 或不用于控制。
3. 对于限制维修的情况, 添加含有 60μm pi 的冰凉 m2 100μl 井, 然后添加 100μlswell, 其中包含 4倍 llo 或不用于控制。
成像板 1 (步骤 2.1.3) 后, 立即将其放置在冰上, 使用铝箔将板与冰直接接触分离。让1号板块冷却5分钟。
使用12多通道微移液器和200μl 吸头, 将每口井100μl 转移到2板 (步骤 2.1.4) 中, 转移到板1中的相应井。要在第1片介质中正确分配毒素, 请将小脚尖下方的尖端插入, 然后在不引入气泡的情况下轻轻弹出体积。
注意: 不要上下移液器, 因为这可能会无意中分离单元格。
离开板额外 1分钟, 让毒素绑定到细胞, 并立即转移板1到板读取器的动力学分析使用光谱仪荧光模式 (步骤 1.3.2)。
在动力学分析结束时, 立即使用步骤1.3.3 成像板 1 (后动力学)。

3. 分析: 细胞枚举

使用微板细胞枚举软件确定基于核荧光的细胞计数。
1. 在"设置" 中,选择 "重新分析", 然后在"图像分析设置"中的 "类别" 部分下, 使用541选择"离散对象分析" 作为查找对象的波长.
2. 在 "查找对象" 选项中, 使用"在图像上绘制"方法, 在 "设置" 选项卡下选择"核酸" , 然后按"应用"。
3. 按"确定"和"读取"启动单元计数算法。
或者, 如果没有此类工具, 请使用图像分析软件 (如 imagej) 枚举单元格。
1. 在 imagej 中, 以堆栈的身份打开图像文件。
2. 通过单击菜单栏中的"图像", 将堆栈转换为8位灰度图像, 将鼠标悬停在"类型"上, 然后选择8位。
3. 减去背景: 单击菜单栏中的"图像", 将鼠标悬停在"调整"上, 然后选择 "亮度/对比度"。调整最小值以消除背景噪音, 然后选择"应用"。
4. 创建二进制图像的阈值: 单击菜单栏中的"图像", 将鼠标悬停在"调整" 上, 然后选择 "阈值"。选择"深色背景", 调整最小值和最大阈值, 然后单击 "应用"。
5. 在重叠原子核的情况下, 可以使用流域工具对原子核进行分割。单击菜单中的"处理" , 将鼠标悬停在二进制系统上, 然后选择 "流域"。
  注意: 这将自动分离连接的原子核。
6. 通过应用用户指定的标准 (大小和循环) 分析蒙版图像, 以细化细胞核的识别和排除细胞碎片。
  1. 单击菜单中的"分析" , 然后单击 "分析粒子"。设置所需的大小 (pixel^2) 和循环 (值为1是一个完美的圆) 范围, 这足以包括单个细胞/原子核。
  2. 在 "显示" 下拉框中, 选择所需的选项, 选中"汇总", 然后单击"确定"以获取单元格计数。

4. 分析: 动力学曲线

将动力学数据从板式读取器软件传输到分析数据软件。
对于每个实验条件, 平均复制的荧光强度在每个时间点, 以及相应的标准偏差和标准误差的平均值为每个实验条件。
对于每个实验条件, 跟踪相应的动力学曲线: pi 强度 (y 轴) 与时间 (x 轴)。
要计算给定处理条件的重密封效率, 请计算 m2 (AUC(M1) 中 + llo 和 m2 (AUC(M2) 中 + llo) 的曲线 (auc) 下的面积。使用下面建议的方法来评估重新密封的效率 (e):
通过确定以下所示的效率比 (r_抵消), 对控制和测试处理进行比较:

r_eff = 1, 试验处理对修复没有影响
r_eff < 1, 试验治疗抑制修复
r_eff > 1, 测试处理改善修复
使用以下公式计算曲线下的面积:
, 其中 k 是后续行动的总数。

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Representative Results

细胞计数的准确性: hela 细胞经常被用作哺乳动物细胞系的模型, 以探索膜修复机制。在评估细胞群体水平的膜修复时, 重要的是将所有油井中浓度相同的细胞进行平板, 以进行适当的数据解释。在检测时, 验证细胞数量在井间是否相等也很重要。本试验引入了本构表达组蛋白2b 融合到 gfp (h2b-gfp) 的平列细胞, 以便在检测其荧光核的基础上自动列举细胞。为了确定细胞计数的准确性, 将 hela h2b-gfp 细胞的双重连续稀释一次, 将其镀成一式三份, 放在96孔板中, 培养4小时。这个时间量足以用于细胞附着, 并提供有限的细胞分裂。在透射光 (tl) 下对全井进行了成像, 并利用平板阅读器分析软件 (图 2 a 和2A), 在 gfp 荧光的基础上对 gfp 荧光照明和细胞计数进行了评估。根据细胞播种浓度绘制了平均细胞计数±标准偏差, 最适合的一行表明细胞计数与细胞播种的比例为 1.8:1, 表明计数的准确性 (图 2c)。通过在动力学试验之前对所有油井进行成像, 可以确保所有井的细胞数量是一致的。此外, 通过动力学分析后的井成像, 可以确定暴露于毒素是否引起细胞分离。

gfp 的表达不会干扰碘化物 (pi) 强度测量 (i_pi): 确保 h2b-gfp 核关联不会干扰 pi 整合或 pi 荧光强度测量 (pi), i_pi 在 hela 和 hela h2b-gfp 细胞中进行了比较, 这些细胞暴露或不暴露在 1 nm llo 中 (图 3)。在没有 pi 的情况下, hela 和 hela h2b-gfp 中的背景荧光水平同样较低, 表明 gfp 不会通过 pi 荧光发射过滤器出血。在 pi 存在的情况下, 但没有 llo, 在 hela 和 hela h2b-gfp 中都有类似的基部 pi 荧光发射, 且不会随着时间的推移而改变。这证实了 gfp 的表达并不影响 pi 荧光的测量, 并表明 pi 在实验时间内不会穿透非受损细胞。随着时间的推移, lll 的加入导致 pi 荧光的增加在 hela 和 hela h2b-gfp 中都是相似的。这一增加是由于 lro 与 pi 与核酸的联系引起的细胞损伤。这些结果共同证明, 组蛋白-2b-gfp 的表达不影响 pi 合并或其荧光的测量。

荧光不会干扰基于 gfp 的细胞计数: 相互验证, 重要的是要验证在受伤细胞中加入 pi 核不会干扰基于 gfp 的细胞计数。在 pi 存在的情况下暴露于 1 nm llo 的 hela 和 hela h22-gfp 的代表性荧光图像显示, 如预期的那样, 在运动后受伤细胞中存在 pi 明显积累 (图 4 a)。成像还显示, pi 可通过 gfp 荧光检测出血 (图 4 a 和表 1)。这种荧光交叉是最好的欣赏后动能细胞的动能图像, 不表达 gfp, 但仍然显示绿色荧光原子核 (图 4 a)。这种交叉也可以通过在 hela h2b-gfp 细胞中测量 gfp 荧光强度 (i_gfp) 来证明, 与前动能相比, 后动力学显著增加 (图 4b)。重要的是, pi 荧光交叉不会影响细胞计数, 因为细胞核枚举所涉及的分割过程不受 gfp 荧光增加的影响 (图 4c)。

测量质膜重密封效率: 在本节中, 我们提出了测量膜重密封效率的基本方法。为了证明膜重密封的过程, helah2b-gfp 细胞在细胞外 ca 2 + 存在 (m1) 或不存在 (m2) 的情况下暴露在 1 nm^{llo 中}或不暴露于 1 nm llo (图 5)。不出所料, 在 llo 缺席的情况下, i_{pi 在}m1 和 m2 中保持不变。在 ca^{2 +}-含介质中添加 llo 会导致 pi 荧光强度 (i_pi) 的稳步增加, 而在没有细胞外 ca^{2 +}的情况下, pi 荧光的增加明显更大, 反映出没有膜复位。为了评估重新密封效率, 即相对于 m2 (步骤 1.5.4.1) 的 m1 中细胞的修复能力, 确定了 m1 和 m2 曲线下的区域, 并计算出修复效率 (e) 为0.287。

pi 的另一种选择: pi 被广泛用作质膜损伤的标记。然而, 还有其他核酸结合染料, 也适用于此检测。例如, 膜不适合卡宾宁核酸结合染料 (cnabd) 表现出的发射光谱延伸到远红色, 并具有高度特异性的双链 dna。另一方面 pi 束缚脱氧核糖核酸和 rna⁴⁰^,⁴¹。与 pi 不同的是, cnabd 的激发和发射光谱与 gfp 的激发和发射光谱并不重叠, 因此可以在两个荧光素之间实现更好的光谱分辨率。此外, 本协议中使用的 cnabd 的消光系数几乎是 pi 的两倍, 这意味着对于它们各自的激发波长, 这种染料比 pi 更能吸收能量, 从而产生更强的荧光发射。cnabd 和 gfp 图像的定量荧光分析表明, 该染料具有较大的荧光动态范围, 在 gfp 荧光波长下不会显著发射, 并且不会影响细胞计数 (图 6a-d)。事实上, hela h2b-gfp 细胞在含有 cabd 的 m1 或 m2 介质中培养, 并被 1 nm llo 损坏, 与非损坏对照相比,_cnabd的含量分别增加了4倍和 5.5倍 (图 7a)。为便于比较, 在 pi 存在的情况下暴露于 1 nm llo 的细胞在 m1 和 m2 中的 pi 荧光强度分别增加了2.5倍和 3倍 (图 5)。与 pi 一样, cabd 在 m1 中的 lo 浓度也在增加 (图 7a), 结果的修复效率也随之增加 (图 7A)。我们报告说, 细胞的重插效率随着 llo 浓度的增加而降低。这种现象反映了这样一个事实, 即当造成过度损害时, 细胞会降低其重新恢复的能力。

膜修复检测的质量评估: 任何检测的一个关键方面是其稳定性或检测和解决阴性对照和阳性对照之间差异的能力。正负控制之间的信号变化必须显示足够的动态范围和重现性。在这种膜修复试验中, 阳性和阴性对照分别是暴露于 llo 的细胞, 分别处于允许修复 (m1) 和限制修复 (m2) 的条件下。采用了两种方法来评估该检测方法在高通量分析中的稳健性。首先, z 因子 (z 因子) 或筛选窗口系数确定给定的一组条件是否提供了足够大的动态范围, 同时考虑到信号的可变性。z 因子在 0 < z≤0.5 和 0.5 < z≤1范围内对应于可接受的和非常好的检测, 分别^{为 42}^,⁴³。使用 z 因子进行质量评估的一个限制是, 与极端的正反控制相比, 测试条件通常表现出更温和的值。因此, 作为第二种方法, 我们计算了严格标准化的均值差 (ssmd, β), 它可以确定实验条件之间的差异, 否则这些条件将被归类为基于限定 z 因子44的负结果 ^,⁴⁵。ssmd 值可分为从无效应 (β= 0) 到极强 (β-5) 的效应强度。利用图 7a和 auc 中的数据对 m1 和 m2 条件进行比较, 暴露于 0.25 nm llo 和 0.5 nm llo 产生的 z 因子值分别为0.3100813 和 0.137313, β= 6.0672 和 4.803308, 表明 llo 浓度的窗口是适用于该检测。由于 llo 的浓度增加到 1 nm 以上, m1 和 m2 条件之间的 i_cnabd动力学曲线中的间隙缩小, 导致 z 因子和 ssmd 值大幅降低 (图 7b)。如此高浓度的 llo 对应于修复潜力被损伤超过的条件, 从而否定了该检测方法在识别膜修复中涉及的因素方面的使用。随着 llo 浓度的增加, 修复效率 (e) 的下降进一步说明了这一点 (图 7b)。所有数据 (z 因子、ssmd 和 e) 均为3个生物复制和3个技术复制, 用于每个实验条件进行检测验证。这些数据表明, 该检测具有预期的鲁棒性, 用于高通量检测, 其 lo 浓度低于 hia 细胞的 1 nm。

原理证明: 一旦确定了检测的鲁棒性, 我们就进行了额外的实验, 以证明该检测具有识别修复过程中缺陷的灵敏度和分辨率。另外, 我们认为高通量检测被用作筛选过程, 以识别大屏幕内的 "命中", 这可能涉及不到3个生物复制。因此, 实验设计提供了在单个检测中识别 "命中" 的检测能力是相关的。因此, 在高通量屏幕下, 可以调整分析布局以适应4个技术复制, 从而在一次实验中提高统计能力。细胞被镀成四式三份, 并在检测前1小时用去甲胺进行预处理, 地西那胺是溶酶体蛋白酸注入肌素酶 (asm) 的药理抑制剂, 在质膜修复中起作用 15^,¹⁷ ^,⁴⁶。重要的是, 在整个检测过程中, 对地苯丙胺的处理不会影响细胞计数, 因此可以对去甲胺处理的细胞和未经处理的细胞进行适当的比较 (图 8a)。在接受环境的细胞中抑制 asm 会导致接触 llo 后膜的膜重接受效率出现缺陷, 如 e 和 r 抵消的减少 (图 8b和8B₎所示。使用混合效应模型, 对 m1 中暴露在0.25 和 0.5 nm llo 中的未经处理的细胞进行了对的对二甲胺处理的比较显示, p 值分别为0.0010 和 1 x^10-10。总之, 数据表明, 0.25 和 0.5 nm llo 是适当的浓度, 以确定在高通量实验环境中的修复缺陷, 一旦技术复制增加到4种, 可能会对单个实验进行统计分析。.请注意, 四式混合效应模型之间的统计方法不会考虑多个生物复制之间的潜在变化。使用一种生物复制的任何重要发现都应在其他实验环境中进行验证。

图 1: 实验设计.流程图描述了一个具有代表性的板材设计, 该设计被配置为测试七个测试条件的效果, 而不是对照未经处理的细胞。应酌情列入更多的管制措施, 例如药品车辆。在实验前24小时镀膜细胞 (第1版)。实验当天, 第1板中的细胞在37°c 时使用 m1 或 m2 介质预热, 并对板 (tl、gfp 和 pi 荧光) 进行预动力学成像。在15分钟的成像过程中, 试剂被添加到冰上的圆盘2。成像后, 将1板立即放置在冰上 5分钟, 100μl/井从2板转移到1板。在板读取器中放置 1, 在37°c 下进行30分钟的动力学分析, 然后进行成像 (tl、gfp 和 pi 荧光)。然后对数据进行分析, 以计算细胞数量, 并评估所有实验条件下的修复效率。在大型数据集中, 分析可以自动化。此外, 在高通量屏幕中, 技术复制的数量可以增加到4。请点击这里查看此图的较大版本.

图 2: 单元格计数精度.在指示浓度下, 以三元类的形式播种了表达 gfp 标记组蛋白的 hela 细胞。(a) 在透射光 (tl) 和 gfp 荧光 (12个 imageswell) 下, 在37°c 时对细胞进行成像, 并使用细胞检测算法来描述单个细胞核 (紫色)。刻度条 = 1 毫米 (b) tl、gfp 和细胞检测 (紫色) 图像的放大倍率较高 (缩放 2x)。刻度杆 = 100μm。(c) 利用图像分析软件对细胞数量进行计数, 并根据初始细胞播种浓度绘制细胞计数。请点击这里查看此图的较大版本.

图 3: 碘化物荧光检测不受组蛋白2b-gfp 表达的影响.组蛋白2b-gfp 表达和不表达的 hela 细胞在 ca^{2 +}-a (m1) 中存在 (实线) 或不存在 30μm pi (虚线) 的情况下暴露给 1 nm llo。动力学测定法在37°c 下每5分钟用分光光度法测量一次 pi 荧光强度, 时间为30分钟。数据是以相对荧光单位 (rfu) ± sem (n₌3个独立实验, 每个实验以三元制进行) 表示的平均 pi 荧光强度 (i pi)。请点击这里查看此图的较大版本.

图 4: 单元格枚举不受 pi 荧光的影响.(a) 在 m1 中暴露或不暴露于 1 nm llo 的细胞的前和运动后图像 (tl、pi 和 gfp) 的代表性。刻度杆 = 100μm。(b) 定量荧光显微镜分析 (i_gfp±sem) 显示, 由于 pi 与 lli 损伤时的核结合, llo (后动力学) 的 pf 核结合, gfp 荧光测量量增加。(c) 基于 gfp 的细胞计数不受 gfp 强度增加的影响。每口井的细胞计数表示为平均±sem (在 b 和 c 中: 黑条 = 动力学前数据; 红条 = 动力学后数据; n = 3个独立实验, 每个实验以三元进行; 使用双尾学生的 t 测试来分析定量荧光从获得的图像中获得的强度和细胞计数, * * p < 0.01)。请点击这里查看此图的较大版本.

图 5: 测量质膜重密封效率.在含有 ca + 的 (m1) 或含有 30μm pi 的 ca 2⁺无 (m2) 介质中, 表达 hela 细胞的组蛋白2b-gfp 暴露于或不暴露于 1 nm^llo.动力学数据表示相对荧光单位 (rfu) ± sem 中的 pi 荧光强度 (i_pi), 在37°c 下测量30分钟。n = 3个独立的实验, 每个实验都是以三元为例进行的。测量了协议步骤1.5.4 中指出的复位效率。请点击这里查看此图的较大版本.

图 6: 卡宾素核酸结合染料作为一种替代染料, 用于评估膜重密封.hela h2b-gfp 细胞在37°c 时暴露在 0.5 nm llo 中 30分钟, 在包含 ca^{2 +}(m1) 或 ca^{2 +}无 (m2) 介质中存在1微米 cabd。(a) 在含有染料的 m1 中, 获得了 hearh2b-gfp 细胞的图像。刻度杆 = 100μm。(b和c) 利用成像细胞仪测量了集成 cabd 和 gfp 荧光强度, 并以相对荧光单位 (rfu) ± sem 表示. (d) gfp 荧光图像进行了记录, 以列举 hela h2b-gfp单元格 (黑条 = 前动能数据, 红条 = 后动力学数据, n = 3个独立实验, 每个实验都以三重奏的形式进行)。双尾学生的 t 测试被用来分析定量荧光强度和细胞计数从获得的图像, * * p < 0.01, * * * p < 0.001)请点击这里查看这个数字的更大版本.

图 7: llo 浓度对重密封效率、z 因子和 ssmd 的影响.(a) 在含有1微米 cabd 的 m1 或 m2 中培养的 helah2b-gfp 细胞暴露在不断增加的 llo 浓度下, 并在37°c 下进行30分钟的动力学试验。数据以 cabd 强度 (i_cabd) 表示为相对荧光单位 (rfu) ± sem. (b) z 因子和严格标准化均值差 (ssmd) 作为膜修复鲁棒性的质量评估测定, 以曲线下的面积 (auc) 作为动力学曲线⁴²^、⁴³^、⁴⁴^、^{45 的}度量。如协议和结果部分所述, 计算了重新密封效率 (n = 3个独立实验, 每个实验都以三重奏的形式进行)。请点击这里查看此图的较大版本.

图 8: 细胞暴露于异丙胺会导致重新密封缺陷.hella h2b-gfp 细胞 (镀成四式) 在37°c 下用30μm 去甲胺 (或不) 预处理 1小时, 然后暴露于在包含 ca^{2 +}--的介质 (m1) 或 ca^{2 +}无 (m2) 介质中, 存在1微 mm cabd 的0.25 或 0.5 nm llo。对细胞进行成像 (动力学前和动力学后), 并在37°c 下进行动力学分析 30分钟 (a) 细胞;数据以平均细胞计数± sem 表示. (b) cabd 荧光强度 (i_cnabd) 以相对荧光单位 (rfu) ± sem 表示. (c) 在存在和不存在的情况下计算了恢复效率。德西普拉明。在假设每个技术复制都有随机截距的情况下, 对日志转换强度值使用了混合效应模型。为了捕捉动力学曲线形状的变化, 对处理条件的主要影响以及处理条件与时间的相互作用作用进行了统计意义的联合测试。一个双尾学生的 t 测试被用来分析细胞计数从获得的图像。利用混合效应模型计算了 p 值。(4个技术复制, 1个实验)。请点击这里查看此图的较大版本.

		成像细胞仪发射通道规范
荧光	氟荧光灯 (nm)	绿色通道 (前部±带通, nm)	红色通道 (前部±带通, nm)
Gfp	488/510	460/544±20108	625/713±20123
Pi	533/617
cnabd	642/661

表1:gfp、pi 和 cabd 激发和发射峰以及成像细胞仪的绿色和红色通道激励和发射带。

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Discussion

该方法测量了具有高通量的细胞群体水平上的膜再密封效率。它可用于筛选可能影响膜修复的细胞成分或药物库。所述检测采用了96孔板格式, 但可适用于384孔板, 以获得更高的吞吐量。该方法的优点是能够实时获得粘附活细胞的荧光测量, 而无需进行过多的细胞处理, 如细胞分离、固定或荧光标记固定后。多模板读取器 (如本协议中使用的读取器) 具有足够的灵敏度, 可在96孔板的时间间隔低至30秒的情况下进行快速光谱测量。荧光图像的获取提供了更多的信息, 包括细胞枚举、细胞形态的最终变化以及不同细胞群的潜在识别。本试验不确定单细胞水平的质膜重密封动力学, 但确定了可能对其过程产生正面或负面影响的实验条件 (药理化合物或细胞成分)。细胞群体水平的膜重新密封。

还开发了其他几种实验方法来评估膜的重密封机制。例如, 微针穿刺、珠磨损和激光烧蚀的机械破坏已被用来模拟机械膜损伤。通过量化荧光探针 (fm 1-43、碘化物、荧光结合糊精) 或跟踪荧光蛋白嵌合体 47, 测量伤口修复涉及荧光显微镜或流式细胞^仪. ^,⁴⁸^,⁴⁹^,⁵⁰。每一种方法都有其自身的优势;然而, 它们并不像本试验中所介绍的那样, 适合在活细胞中进行高通量筛选。

本方法对成孔蛋白 llo 损伤的细胞的再密封效率进行了优化, 该蛋白 llo 形成大毛孔, 导致质膜机械破裂引起的大量 ca^{2 +}流入。虽然成孔毒素是质膜损伤的一种形式, 但建议修复大的毒素毛孔和机械伤口, 以共享常见的 ca^{2 +}依赖途径¹⁷^,⁵¹。需要注意的是, 与机械伤口相比, lno 与细胞膜成分 (如胆固醇) 的相互作用可能会影响细胞信号转导, 从而可能影响细胞膜的重毛机制。我们对膜修复的了解仍然有限, 需要进一步研究, 以确定机械伤口的重新密封是否不同于毒素毛孔形成后的重新密封。使用 llo 有几个优点。首先, 通过将温度从4°c 提高到 37°c, 可以同步膜损伤的启动。其次, llo 的可溶性形式 (不与细胞膜结合) 在中性 ph 值和37°c 下不可逆转地聚集在一起, 从而限制了细胞毒性效应, 消除了清洗细胞的需要。最后, 通过改变毒素的浓度, 可以调整损伤程度。然而, 这种检测的一个局限性是37至4°c 之间的温度开关, 这可能会影响修复机制, 如水泡运输, 内吞, 膜流动性等过程, 受^{温度 52}^的影响, ⁵³^,⁵⁴。重要的是要验证, 该检测中包含的任何药理抑制剂不会干扰 llo 毛孔的形成, 方法是在药物55存在 (相对于不存在) 的情况^下进行溶血试验。由于 llo 活动中可能存在批处理差异, 因此准备一份足够大的 llo 库存非常重要, 该库存可用于整个高通量屏幕⁵⁵。

我们包括使用表达核局部组内-2b-gp 嵌合体的细胞, 作为一种手段, 通过显微成像检查膜修复分析前后的细胞。重要的是, 在动力学分析之前和之后, 各条件下的等效细胞计数和不变的细胞计数至关重要, 因为 pi 或 cabd 荧光强度不容易归一化。事实上, 细胞计数的差异将导致给定的 llo 浓度的损伤程度的差异, 由于重密封效率的变化, 不能通过荧光归一化来纠正这种差异 (图 7)。我们表明, 组内2b-gfp 表达不干扰 pi 或 cnabd 的结合或荧光发射。相反, pi 或 cabd 合并不会影响基于 gfp 的单元枚举。如果要使用荧光的其他组合, 就有必要像在这项工作中所做的那样, 评估荧光色之间潜在的光谱重叠。虽然 pi 已被广泛用于测量膜损伤, 但我们表明 cabd 是一种很好的替代品, 具有较高的荧光量子产率, 从而产生了更大的动态范围, 适合于表征树脂密封效率。

z 因子和 ssmd 证实, 该检测具有执行高通量分析所需的鲁棒性。重新密封效率的计算是识别潜在命中的关键和可靠的工具。此外, 混合效应模型可作为统计工具, 用于评估单个检测中的命中情况。如果屏幕可以重复多次, 实验计划必须至少包括三个技术复制。如果要将混合效应模型等统计工具纳入单一实验, 无论是否重复, 都应使用四元体。但是, 建议多次执行屏幕, 并通过执行互补实验来验证结果。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们感谢 jesse kwiek 博士 (俄亥俄州立大学) 善意地允许我们使用他的多模式检测平台进行一些初步实验。本文报告的研究得到了国家卫生研究院国家过敏和传染病研究所的支持, 该研究所的编号为 ro1ai107250, 授予 stephanie seveau。内容完全由作者负责, 不一定代表国家卫生研究院的官方观点。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader	Molecular Devices	i3x
MiniMax 300 Imaging cytometer	Molecular Devices	5024062
TO-PRO-3	ThermoFisher Scientific	T3605
Propidium Iodide	ThermoFisher Scientific	P3566
HeLa	ATCC	CCL2
HeLa H2B-GFP	Millipore	SCC117
Trypsin-EDTA 0.25%	ThermoFisher Scientific	25200056
96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate	Corning	3603
Hanks' balanced Salts	Sigma-Aldrich	H4891
EGTA	ISC BioExpress	0732-100G
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
D-(+)-Glucose, HybriMax	Sigma-Aldrich	G5146-1KG

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Immunology and Infection

哺乳动物细胞血浆膜检测效率的高通量测量

Summary

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Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

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