Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Hög genomströmning mätning av plasmamembranet återförslutning effektivitet i däggdjursceller

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58351
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1,2,3
1Department of Microbial Infection and Immunity, The Ohio State University, 2Department of Microbiology, The Ohio State University, 3Infectious Diseases Institute, The Ohio State University, 4Division of Biostatistics, College of Public Health, The Ohio State University

Summary

Här beskriver vi en hög genomströmning fluorescens-baserad analys som mäter plasmamembranet återförslutning effektivitet genom fluorometric och imaging analyser i levande celler. Denna analys kan användas för screening droger eller målgener som reglerar plasmamembranet återförslutning i däggdjursceller.

Abstract

I deras fysiologiska miljön utsätts däggdjursceller ofta för mekaniska och biokemiska betonar att plasmamembranet skadas. Svar på dessa skador återförslut komplexa molekylära maskinerier snabbt plasmamembranet för att återställa dess barriärfunktion och upprätthålla cellöverlevnad. Trots 60 års forskning på detta område saknar vi fortfarande en grundlig förståelse av cellen återförslutning maskiner. Med målet att identifiera cellulära komponenter att kontroll plasmamembranet återförslutning eller läkemedel som kan förbättra återförslutning, har vi utvecklat en fluorescens-baserade högt dataflöde test som mäter plasmamembranet återförslutning effektivitet i däggdjursceller odlade i mikroplattor. Som modellsystem för plasmamembranet skada, celler utsätts för den bakteriella pore-bilda toxin listeriolysin O (LLO), som bildar stora 30-50 nm diameter proteinhaltiga porer i kolesterol-innehållande membran. Användning av en temperatur-kontrollerad multi-mode microplate reader möjliggör snabb och känslig spectrofluorometric mätningar i kombination med brightfield och fluorescence mikroskopi avbildning av levande celler. Kinetic analys av fluorescensintensiteten som avges av en membran impermeant nukleinsyra-bindande fluorokrom avspeglar i vilken utsträckning av membran såra och återförslutning på cell befolkningen nivå, vilket möjliggör beräkning av cellen återförslutning effektivitet . Fluorescence mikroskopi imaging tillåter för uppräkning av celler, som konstitutivt express en fluorescerande chimär av den nukleära protein Histon 2B, i varje brunn mikroplattan att ta hänsyn till eventuella variationer i antalet och möjliggör eventuell identifiering av olika cellpopulationer. Denna hög genomströmning-analysen är ett kraftfullt verktyg förväntas expandera vår förståelse av membran reparationsmekanismer via screening för värd gener eller exogent läggas föreningar att kontroll plasmamembranet återförslutning.

Introduction

Däggdjursceller är föremål för mekanisk, osmotisk och biokemisk stress, vilket resulterar i förlust av plasmamembranet integritet. Utan snabb och effektiv återförslutning, skulle skadade celler snabbt duka under programmerad eller nekrotiska ihjäl. Sedan 1960-talet, har ansträngningar att förstå plasmamembranet återförslutning processen motiverats av de förödande konsekvenser i samband med dess dysfunktioner. Nämligen har sjukdomar såsom lem-gördel muskeldystrofi, diabetes och Chediak-Higashi syndromet varit kopplade till bristfällig plasmamembranet reparation på grund av mutationer i genen kodning dysferlin, produktion av avancerad glykation end produkter och defekter i de lysosomala människohandel regulatorn CHS1, respektive1,2,3,4,5,6. Hittills har vår förståelse av membran är återförslutning dock fortfarande begränsad7. Inledande studier har visat att membranet återförslutning initieras av tillströmningen av extracellulära Ca2 + genom den skadada plasmamembranet8,9,10. Sedan dess har flera icke-ömsesidigt uteslutande Ca2 +-beroende mekanismer har föreslagits att återförsluta celler. Patch hypotesen föreslår att intracellulära blåsor i närhet till såret, säkring med varandra och skadade plasmamembranet att agera som en patch11,12,13,14. En andra modell föreslår att kalcium-beroende exocytos av lysosomer på såret webbplats släpper det lysosomala enzymet syra sphingomyelinase, som omvandlar ceramidas till ceramide i den yttre bipacksedeln av plasmamembranet. Denna plötsliga förändring i lipid sammansättningen resulterar i ceramide-driven endocytos av skadade region15,16,17. Slutligen involverar den tredje föreslagna mekanismen en roll för endosomal sorteringen komplex krävs för transport (ESCRT) att främja bildandet av vetter utåt blåsor som knoppas av från plasmamembranet18. Endast en begränsad uppsättning proteiner identifierades i dessa modeller, och deras maskiner måste belysas ytterligare.

Här beskriver vi en hög genomströmning analysmetod som åtgärder plasmamembranet återförslutning effektivitet i vidhäftande däggdjursceller utsätts för skada medieras av rekombinant listeriolysin O (LLO)19. LLO är ett por-bilda toxin (PFT) utsöndras av fakultativt intracellulär patogenen Listeria monocytogenes20,21,22 och tillhör MACPF/CDC (membran attack complex, perforin, och kolesterol-beroende cytolysin) superfamiljen. MACPF är däggdjur pore-bilda proteiner involverade i immunförsvar, CDCs är bakteriella toxiner främst produceras av grampositiva patogener som skada värdceller att främja deras sjukdomsframkallande livsstil23. CDCs syntetiseras som vattenlösliga monomerer eller dimerer som binder till kolesterol presentera i plasmamembranet och oligomerize i ett prepore komplex av upp till 50 subenheter. Den komplexa prepore sorterar sedan om du vill infoga β-slingor över de lipid lipidens, bildar en β-fat por som sträcker sig över 30-50 nm i diameter24,25,26,27.  Dessa stora porer tillåta flöden av joner och små cellulära komponenter och ut ur cellen; vissa studier har dock föreslagit att porerna i mindre storlekar är också bildade28,29,30. Bland CDCs visar LLO unika egenskaper inklusive irreversibel pH - och temperatur-anhörigen aggregering, som bidrar till hög genomströmning analyser31,32. LLO kan läggas till i cellodlingsmedium vid 4 ° c, en temperatur som är tillåtande till dess bindning till celler, men inte till bildandet av pore komplexa. Inledande av pore bildandet kan sedan synkroniseras genom att höja temperaturen till 37 ° c, möjliggör för effektiv spridning av toxin molekyler i planet av membranet att bilda oligomerer och för den konfirmerande remodeling inblandade i pore generation. Därför, efter växeln i temperatur, den kinetiska av cellskador beror på mängden av toxin bundet till plasmamembranet. Allt lösligt LLO (inte bundet till plasmamembranet) snabbt och oåterkalleligt aggregerar när temperaturen når 37 ˚C, vilket minskar behovet av att tvätta bort obundna toxin molekyler och begränsar omfattningen av membran skador över tid. Slutligen, eftersom LLO binder till kolesterol och bildar porer i kolesterol-rika membran, denna analys är mottagliga för ett brett utbud av däggdjursceller. Det är viktigt att Tänk på att LLO påverkar värdcell signalering huvudsakligen via pore formation, med några få undantag i vilken pore-oberoende cell signalering kan uppstå33,34,35,36 ,37,38,39. Därför, det kan inte vara uteslutet att LLO signalering verksamhet kan påverka processen för membran reparation.

Denna analys bedömer direkt omfattningen av cell såra genom att mäta införlivandet av en cell impermeant fluorokrom (t.ex., propidium jodid) som passivt kommer in skadade celler och blir starkt fluorescerande när kopplas nukleinsyror . Därför kan fluorokrom bibehållas i cellodlingsmedium hela experimentet, så att realtid analyser av cell såra. Fluorescensintensiteten hos nukleinsyra-bindande färgämnet kommer att öka koncentrationen av toxin och, för en given koncentration av toxin, ökar med tiden tills alla porerna bildas och cellerna fullt repareras eller mättnad uppnåtts. Inflödet av extracellulära Ca2 + genom membran porer är ett oeftergivligt villkor evenemang för återförslutning. Därför resealing effektivitet kan bevisas indirekt genom att jämföra cell såra i odlingsmedium som innehåller Ca2 + (reparation tillåtande tillstånd) att såra i en Ca2 +-gratis medium (reparation restriktiva villkor). Eftersom fluorescensintensiteten hos nukleinsyra-bindande färgämnet är direkt proportionell mot cellkoncentrationen av i varje brunn, är det viktigt att utsäde celler i samma koncentration i alla brunnar. Det är också viktigt att räkna upp celler i varje brunn före och efter analysen till att cellen avlossning ska inte uppstå, som flytande, aggregerade celler kan skymma fluorescens avläsningar som kan komplicera tolkning av data. För att räkna upp celler, användes celler som uttrycker kärn-lokaliserad Histon 2B-GFP (H2B-GFP) i denna analys. Temperatur-kontrollerad, multi-mode, mikroplattan läsare kombinera snabb, hög genomströmning mätningar (med ett 96 eller 384-well platta format) av fluorescens stödnivåer med mikroskopi avbildning av levande celler vid 37 ° C. Den senare kan användas för att räkna upp antalet celler och observera eventuella bildandet av olika cellpopulationer.

Slutligen, denna analys ger användare möjlighet att utöka sina kunskaper om komplexiteten i membran reparationsmekanismer genom screening för värd molekyler eller exogent extra föreningar som kan styra membranet reparera. Följande protokoll beskriver de experimentella steg för att mäta celler utsätts för LLO resealing effektivitet och utvärdera effekterna av ett visst läkemedel eller cellulära behandling på återförslutning effektivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. beredning

  1. Cell plätering
    Obs: Human cervical epitelceller, HeLa och HeLa uttrycker Histon 2B-GFP (H2B-GFP), användes i detta protokoll, men denna analys kan anpassas till andra däggdjursceller19.
    1. Lossa fastsittande celler från en 75 cm2 cell kultur mätkolv genom att tvätta cellerna med 2 mL av Trypsin-EDTA 0,25%. Byt ut den använda trypsin med 2 mL färsk trypsin-EDTA 0,25%.
    2. Inkubera cellerna vid 37 ˚C för 5 min tills cellerna har rundade och lossnat från kolven.
    3. Att resuspendera cellerna i 8 mL odlingsmedium (DMEM innehållande 10% Värmeinaktiverade fetalt bovint serum, 100 U/mL penicillin och 100 µg/mL streptomycin).
    4. Bestämma cell koncentration med hjälp av en hemocytometer och 10 µL cellsuspension.
    5. Späd cellerna i odlingsmedium till en koncentration av 2,5 x 105 celler/mL.
    6. Häll cellsuspensionen i en steril pipett bassäng och grundligt blanda suspensionen med serologiska pipett 10 mL.
    7. Med hjälp av en 12-flerkanals mikropipett och 200 µL tips, distribuera HeLa cells (2,5 x 104 celler/100 µL per brunn) i tre exemplar (eller fyra exemplar) i en 96-well platta, tydliga, svarta polystyren vävnadsodling-behandlade bottenplatta.
      Observera: En plätering arrangemang presenteras som ett exempel i figur 1.
    8. Odla cellerna för 24 h i en befuktade cell kultur inkubator vid 37 ° c och 5% CO2.
  2. Stamlösning förberedelse
    1. Förbereda 1 L ett 10 x lager av buffert M (används för att förbereda M1 och M2) genom att lägga till 95 g Hanks balanserad saltlösning, 0.476 g MgCl2 (5 mM), och 23.83 g HEPES (100 mM) till 900 mL vatten. Justera pH till 7,4 och höja volymen till 1 L. Filter sterilisera.
    2. Förbereda 50 mL 50 x (1,25 M) lager av glukos genom att lägga till 11.26 g D-(+)-glukos till totalt 50 mL vatten. Filter sterilisera lösningen.
    3. Förbereda 50 mL en 100 x (120 mM) lager av kalcium genom att lägga till 0.666 g CaCl2 sammanlagt 50 mL vatten. Filter sterilisera lösningen.
    4. Förbereda 50 mL i en 10 x (50 mM) lager av etylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N, N, N', N', tetraacetic acid (EGTA) genom att lägga till 0.951 g EGTA 40 mL vatten. Öka pH till 8 med NaOH för att upplösa EGTA, sedan höja volymen till 50 mL. Filter sterilisera lösningen.
    5. För en enda plattan med 96 brunnar, förbereda 50 mL Medium 1 (M1, innehåller Ca2 +), 50 mL Medium 2 (M2, Ca2 +-gratis), och 15 mL Medium 2 kompletteras med EGTA, således:
      1. För M1, tillsätt 5 mL 10 x buffert M, 0,5 mL 100 x CaCl2och 1 mL 50 x glukos till 43,5 mL vatten.
      2. För M2, tillsätt 5 mL 10 x buffert M och 1 mL 50 x glukos till 44 mL vatten.
      3. För M2/EGTA, tillsätt 1,5 mL 10 x buffert M och 1,5 mL 10 x EGTA till 12 mL vatten.
        Obs: Alla lösningar som innehåller propidium jodid (PI) bör beredas direkt innan du lägger till cellerna.
  3. Plate Reader/Imaging Cytometer inställningar
    Obs: Använd en multi-mode Plattläsare utrustad med två upptäckt enheter: en spectrofluorometer och en tänkbar cytometer. Begränsa fluorescens exponering för att undvika fotoblekning fluorophores.
    1. Pre varm tallrik läsaren till 37 ° C innan du utför analysen.
    2. Ställa in parametrar för kinetiska analysen med detta inom inställningsläget :
      1. Välj monokromator, FL (fluorescens)och Kinetic för optisk konfiguration, Läs lägen och läsa typ, respektive.
      2. Under Våglängd inställningarväljer du en 9 och 15 nm excitation och utsläpp bandpass, respektive. För analyser ställa med propidium jodid (PI), de excitation och utsläpp våglängderna att 535 och 617 nm, respektive.
      3. Under Plattan typ, Välj 96 brunnarna för formatet plattan och förinställda plattan konfiguration motsvarar en svart vägg klar botten pläterar.
      4. Under Läsa areal, markera de brunnar som ska analyseras i hela den kinetic.
      5. Under PMT och optik, förinställda blixtar per läsning till 6 och markera rutan för Läs från botten.
      6. Enligt Timing, sätt 00:30:00 i rutan Totala bearbetningstid för en 30 min kinetiska analys och infoga 00:05:00 för det intervallet.
        Obs: För varje gång peka och en våglängd, läsa en fullständig 96 brunnar tallrik är 30 s.
      7. Bekräfta de angivna inställningarna i Inställningsinformation till höger och välj OK. Tryck på Läs för att initiera den kinetiska kör.
    3. Ställ in parametrarna imaging med detta inom inställningsläget:
      1. Välja Minimax, Imagingoch slutpunkt för optisk konfiguration, Läs lägen och läsa typ, respektive.
      2. Våglängder, Välj under genomlysning, och en eller båda rutorna fluorescens motsvarar excitation och utsläpp våglängder av 456/541 nm (GFP) och 625/713 nm (PI).
      3. Använda samma alternativ för Plattan typ och Läsa areal som definieras i steg 1.3.2.3 och 1.3.2.4.
      4. Under Väl inställningen yta, väljer du antalet platser inom en brunn för att avbildas.
        Obs: 12 platser motsvarar en full-bra bild.
      5. Under Bild förvärv inställningar, Välj exponeringstiderna för genomlysning, 541 (GFP) och 713 (PI). För GFP, bild hela väl med en exponeringstid på 20 ms/bild. För överförbara ljus (TL) och PI fluorescens, förvärva en enda bild av centrera av varje brunn med exponeringstiderna 8 och 20 ms, respektive.
      6. Bekräfta de angivna inställningarna i Inställningar Information till höger och välj OK. Förvärv tiden för imaging hela ytan av varje brunn (12 bilder per brunn) av en plattan med 96 brunnar och en våglängd är ~ 15 min. Tryck på Läs för att initiera imaging.
        Obs: Förvärv tiden av en enda bild/väl av en plattan med 96 brunnar kräver ~2.5 min/platta för en våglängd. De parametrar som beskrivs ovan motsvarar den särskilda utrustningen i vårt laboratorium. Spectrofluorometric mätningar: en xenon blixt lampa visar 1,0 nm increment excitation våglängder (250-850 nm) med en justerbar 9 eller 15 nm bandpass, en Fotomultiplikator tube detektor med en > 6 logga dynamiska omfånget och justerbar 15 eller 25 nm strålning bandpass. Imaging cytometer: en belysning ljuskälla klarar av vitt ljus, 460 nm och 625 nm excitation våglängder med en 20 nm bandpass, utsläpp filter centrerad på 541 nm (108 nm bandpass) och 713 nm (123 nm bandpass), respektive, och en 4 X-objektiv kopplad till en 1,25 12-bitars kostnad – tillsammans enhet megapixelkamera.

2. analys

Obs: Vid tiden för analysen, celler måste vara 70-90% konfluenta. Under tvätta stegen, bör medium tas bort från och tillämpas på sidovägg brunnen (inte direkt ovanför cellerna). Hålla temperaturen av LLO vid < 4 ˚C att förhindra dess aggregering tills steg 3.1.5.

  1. Förbereda ett lager av 30 µM PI i M1 och ett lager av 30 µM PI i M2 pre värmde vid 37 ˚C.
  2. Försiktigt tvätta cellerna i plattan 1 med en 12-flerkanals mikropipett och 200 µL tips, enligt följande:
    1. För reparation-tillåtande villkor, bort odlingsmedium och tvätta cellerna två gånger med 200 µL per brunn M1 värmas före vid 37 ˚C. Ersätta mediet med 100 µL per brunn i varma M1 som innehåller 30 µM PI.
    2. För reparera restriktiva-villkor, ta bort odlingsmedium och tvätta cellerna en gång med 200 µL per brunn varma M2 innehållande 5 mM EGTA till kelat Ca2 +, följt av en tvätt med 200 µL per brunn M2. Ersätta mediet med 100 µL per brunn varma M2 innehållande 30 µM PI.
    3. Efter odlingsmedium har tvättas och ersatt med medium innehållande propidium jodid, flytta direkt till steg 2.1.3.
  3. Bild tallriken 1 under genomlysning, GFP och PI som detaljerad under 1.3.3 (före kinetic). Detta steg tar 15-20 min.
  4. Under perioden 15 min i steg 2.1.3 förbereda plattan 2 med hjälp av en 12-flerkanals mikropipett och 200 µL tips enligt följande:
    1. Placera en 96-väl rund botten polypropylen mikroplattan på is. Konfigurera den plattan med en experimentell design motsvarande till tallrik 1 (figur 1).
    2. För reparation-tillåtande villkor, tillsätt 100 µL per brunn av iskall M1 innehållande 60 µM PI, följt av tillägg av 100 µL per brunn av iskall M1 som innehåller 4 x LLO eller inte för kontroll.
    3. För reparation-restriktiva villkor, tillsätt 100 µL per brunn iskall m2 innehållande 60 µM PI, följt av tillägg av 100 µL per brunn iskall m2 innehållande 4 x LLO eller inte för kontroll.
  5. Efter imaging plate placera 1 (steg 2.1.3), omedelbart det på isen, för att skilja plattan från direkt kontakt med isen med aluminiumfolie. Låt plattan 1 svalna i 5 min.
  6. Med hjälp av en 12-flerkanals mikropipett och 200 µL tips, överföra 100 µL från varje brunn i plattan 2 (steg 2.1.4) till de motsvarande brunnarna i plattan 1. För att korrekt distribuera toxinet i media av plattan 1, infoga tipsen nedan menisken och mata försiktigt ut volymen utan att införa bubblor.
    Obs: Pipettera inte upp och ner, eftersom detta kan av misstag lossa cellerna.
  7. Låt plattan för en ytterligare 1 min så att toxinet binda till cellerna och omedelbart överföra tallrik 1 till plattan läsaren för kinetiska analysen använder spectrofluorometer läge (steg 1.3.2).
  8. I slutet av den kinetiska assay, omedelbart bilden tallrik 1 (efter kinetic) med steg 1.3.3.

3. analys: Cell uppräkning

  1. Bestämma antalet cell baserat på den nukleära fluorescens med programvaran mikroplattan cell uppräkning.
    1. I Inställningar, Välj Re-analysoch under avsnittet kategori inom Image Analysis Settings Välj Diskret objekt analys med 541 som våglängd för att hitta objekt.
    2. Inom alternativet hitta objekt, använda den Rita på bilder att finna metod, Välj atomkärnor under fliken Inställningar och klicka på tillämpa.
    3. Tryck OK och Läs för att inleda cellen räknar algoritm.
  2. Alternativt, om inga sådana verktyg är tillgängliga, använda en bild analys programvara såsom ImageJ att räkna upp celler.
    1. I ImageJ, öppna bildfilen som stack.
    2. Konvertera stacken till 8-bitars gråskalebilder genom att klicka på bilden i menyraden, håll muspekaren över typ, och välj 8-bitars.
    3. Subtrahera bakgrunden: Klicka på bild i menyraden, Hovra över Justeraoch välj Ljusstyrka/kontrast. Justera det lägsta värdet för att ta bort bakgrund buller och väljer Verkställ.
    4. Tröskeln att skapa binära bilder: Klicka på bild i menyraden, Hovra över Justeraoch välj tröskelvärde. Välj mörk bakgrund, justera de lägsta och högsta tröskelvärdena och klicka på Verkställ.
    5. Vid sammanträffande atomkärnor, kan en vattendelare verktyg användas till segmentet kärnor. Klicka på processen i menyn, håll muspekaren över binära och välj vattendelare.
      Obs: Detta kommer automatiskt att skilja anslutna atomkärnor.
    6. Analysera de maskerade bilderna av användaren angivna kriterier (storlek och loopkontroll) för att förfina identifiering av atomkärnor och utesluta cellfragment.
      1. Klicka på analysera i menyn och sedan analysera partiklar. Ange önskad storlek (pixel ^ 2) och loopkontroll (värdet 1 är en perfekt cirkel) varierar som är tillräckliga för att omfatta enskilda celler/kärnor.
      2. I Visa listrutan, Välj det eller de handlingsalternativ som önskas, kontrollera sammanfattaoch klicka på OK för att få blodkroppar.

4. analys: Kinetic kurvor

  1. Överföra kinetiska data från programvaran plate reader till en analysdata programvara.
  2. För varje experimentella villkor, den genomsnittliga fluorescens stödnivåerna replikerar vid varje tidpunkt, tillsammans med motsvarande standardavvikelsen och medelvärdet för varje experimentella villkor standardfel.
  3. För varje experimentella villkor, spåra motsvarande kinetiska kurvan: PI intensitet (y-axeln) kontra tid (x-axeln).
  4. För att beräkna resealing effektivitet av en viss behandling villkorar, beräkna arean under kurvan (AUC) av den + LLO i M1 (AUC(M1)) och + LLO i M2 (AUC(M2)). Använd den metod som föreslås nedan för att bedöma effektivitet (E) återförslutning:
    Equation
  5. Utför en jämförelse mellan kontroll och test behandling genom att bestämma kvoten effektivitet (REff) anges nedan:
    Equation 2
    REFF = 1, test behandling har ingen effekt på reparation
    REFF < 1, test behandling hämmar reparation
    REFF > 1, test behandling förbättrar reparation
  6. Beräkna arean under kurvan med hjälp av följande ekvation:
    Equation 3, där k är det totala antalet uppföljningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cell räknar noggrannhet: HeLa celler används ofta som en modell cellinje för att utforska membran reparationsmekanismer. Vid bedömningen av membran reparation på populationsnivå cell, är det viktigt att plattan celler i samma koncentration i alla brunnar för tolkning av korrekt data. Det är också viktigt att kontrollera vid tiden för analysen att cell nummer är likvärdiga över brunnar. HeLa celler som konstitutivt express Histon 2B smält till GFP (H2B-GFP) infördes i denna analys att automatiskt räkna celler som bygger på detektion av deras fluorescerande atomkärnor. För att fastställa noggrannheten i cell uppräkning, var dubbla seriella utspädningar av HeLa H2B-GFP celler klädd i tre exemplar i en plattan med 96 brunnar och odlade i 4 h. Denna tid är tillräcklig för cell fastsättning och ger begränsad celldelning. Full wells var avbildad under genomlysning (TL) och god Jordbrukarsed fluorescens illuminations och blodbilden bedömdes utifrån GFP fluorescens med hjälp av plattan läsaren analys programvara (figur 2A och 2B). Genomsnittliga cell räknas ± standardavvikelsen var plottas mot cell sådd koncentrationer, och en rad bästa passform anges en 1.08:1 förhållandet mellan celltal till cell sådd, visar riktigheten av rösträkningen (figur 2 c). Av imaging alla brunnarna före en kinetisk test, kan det säkerställas att cell nummer är konsekvent mellan alla brunnar. Dessutom av imaging brunnar efter kinetiska analysen, kan en fastställa om exponering för toxinet orsakade cell avlossning.

Uttryck för god Jordbrukarsed stör inte propidium jodid (PI) intensitet mätningar (IPI): att säkerställa att H2B-GFP nuclear association inte stör PI stiftelseurkunden eller PI fluorescens intensitet mätning iPI, jagPI jämfördes i HeLa och HeLa H2B-GFP celler som utsattes, eller inte, 1 nM LLO (figur 3). I avsaknad av PI fanns det en lika låg nivå av bakgrunden fluorescens i HeLa och HeLa H2B-GFP, som anger att GFP inte blöda igenom PI fluorescens utsläpp filter. I närvaro av PI, men avsaknad av LLO fanns det en liknande basala PI fluorescens utsläpp i både HeLa och HeLa H2B-GFP som inte förändrades över tiden. Detta bekräftade att uttryck för GFP inte påverkar mätning av PI fluorescens och anges att PI inte tränger icke-skadade celler över tidsramen för experimentet. Tillägg av LLO resulterade i en ökning i PI fluorescens över tiden som var liknande i både HeLa och HeLa H2B-GFP. Denna ökning beror cell sårande av LLO kombinerat med PI association med nukleinsyror. Tillsammans upprätta dessa resultat att uttrycket av Histon-2B-GFP inte påverkar PI stiftelseurkunden eller mätning av dess fluorescens.

PI fluorescens stör inte GFP-baserade cell räknar: Reciprocally, var det viktigt att kontrollera att PI nukleära inkorporering i skadade celler inte stör GFP-baserade cell räknar. Representativa fluorescens bilder av HeLa och HeLa H2B-GFP utsätts för 1 nM LLO i närvaro av PI visade att det fanns en markant ansamling av PI i skadade celler post kinetik, som beräknade (figur 4A). Imaging visade också att PI skulle blöda igenom GFP fluorescens upptäckt (figur 4A och tabell 1). Denna fluorescens crossover uppskattades bäst på efter kinetiska bilder av HeLa celler som inte uttrycker GFP, men fortfarande visas grön fluorescerande atomkärnor (figur 4A). Denna crossover kan också styrkas genom mätning av GFP fluorescensintensiteten (IGFP) i HeLa H2B-GFP celler, som ökade signifikant efter kinetiska jämfört med före kinetic (figur 4B). Ännu viktigare, påverkar inte PI fluorescens crossover cell räkna eftersom segmentering processen inblandade i uppräkning av atomkärnor är opåverkad av en ökning av GFP fluorescens (figur 4 c).

Mäta plasmamembranet återförslutning effektivitet: I det här avsnittet presenterar vi de grundläggande metod som används för att mäta effektiviteten av membran återförslutning. För att bevis processen för membran återförslutning, HeLa H2B-GFP celler exponerades, eller inte, till 1 nM LLO i närvaro (M1) eller frånvaro (M2) av extracellulära Ca2 + (figur 5). Som förväntat, i avsaknad av LLO, förblev jagPI konstant i M1 och M2. Tillägg av LLO i Ca2 +-innehållande medium resulterade i en stadig ökning i PI fluorescensintensiteten (jagPI), medan den i avsaknad av extracellulära Ca2 +, det var en betydligt brantare ökning PI fluorescens, återspeglar den avsaknad av membran återförslutning. Att utvärdera resealing effektivitet, som definieras som celler förmåga att reparera i M1 i förhållande till M2 (steg 1.5.4.1), området under M1 och M2 kurvorna (AUC) var beslutsamt och effektiviteten i reparation (E) beräknades till 0.287.

Ett alternativ till PI: PI ubiquitously har använts som markör för plasmamembranet skador. Det finns dock andra nukleinsyra bindande färgämnen som passar även i denna analys. Exempelvis en membran impermeant carbocyanine nukleinsyra bindande dye (CNABD) utställningar ett emissionsspektrum som når in i långt röda och har en hög specificitet för dubbel stranded DNA. PI binder å andra sidan både DNA och RNA40,41. Till skillnad från PI överlappar den excitation och utsläpp spektra av CNABD inte med de av GFP möjliggör bättre spektral upplösning mellan de två fluorokromer. Den CNABD som används i detta protokoll har dessutom en extinktionskoefficient nästan dubbelt som Pi, vilket innebär att denna färg är mer kapabla att absorbera energi än PI för deras respektive excitation våglängder, vilket resulterar i en starkare fluorescens-utsläpp. Kvantitativa fluorescens analys av CNABD och god Jordbrukarsed bilder som visade att detta färgämne uppvisar en stor fluorescens dynamiskt omfång, avger inte avsevärt på våglängderna av GFP fluorescens och påverkar inte celltal (figur 6A-D). Faktiskt HeLa H2B-GFP cellerna inkuberas i M1 eller M2 media som innehåller CNABD och skadats av 1 nM LLO uppvisade en 4 - och 5.5 - faldig ökning ICNABD i förhållande till de icke-skadade kontrollerna, respektive (figur 7A). För jämförelse, celler utsätts för 1 nM LLO i närvaro av PI uppvisade en 2,5 - och 3 - faldig ökning i PI fluorescensintensiteten i M1 och M2, respektive (figur 5). Gillar PI, CNABD utställningar öka fluorescensintensitet med ökande LLO koncentration i M1 (figur 7A), och den resulterande reparation effektiviteten beräknades enligt steg 1.5.4.1 (figur 7B). Vi rapporterar som cellen återförslutning effektivitet minskar när LLO koncentrationen ökar. Detta fenomen beror på att celler minskar deras kapacitet att återförsluta när alltför stora skador orsakas.

Kvalitetsbedömning av membran reparation analysen: en kritisk aspekt av någon analysmetod är dess robusthet eller kapacitet att upptäcka och lösa meningsskiljaktigheter mellan negativa och positiva kontrollerna. Signalen variationen mellan positiva och negativa kontroller måste visa tillräckligt dynamiskt omfång och reproducerbarhet. I denna membran reparation analys är de positiva och negativa kontrollerna celler utsätts för LLO i reparation-tillåtande (M1) och reparation-konkurrensbegränsande (M2) villkor, respektive. Två metoder togs att bedöma tillförlitligheten i denna analys för hög genomströmning analys. Först, den Z-faktorn, eller screening fönster koefficient, avgör huruvida en given uppsättning villkor ger en stor tillräckligt dynamiskt omfång, medan redovisning av signal variabilitet. Z-faktorer inom spänner 0 < Z ≤ 0,5 och 0,5 < Z ≤ 1 motsvarar ett acceptabelt och mycket bra test, respektive42,43. En begränsning av använda den Z-faktorn för kvalitetsbedömning är att testade förhållanden vanligen uppvisar mer moderata värden jämfört med de extrema positiva och negativa kontrollerna. Därför, som en andra metod, beräknade vi den strikt standardiserade genomsnittliga skillnaden (SSMD, β), som kan identifiera skillnader mellan experimentella förhållanden som annars skulle kategoriseras som ett negativt resultat utifrån en kvalificerad Z-faktor44 ,45. SSMD värden kan kategoriseras in i verkställer styrka alltifrån ingen effekt (β = 0) till mycket stark (β ≥ 5). Exponering för 0,25 och 0,5 nM LLO använder data från figur 7A och AUC för jämförelse av M1 kontra M2 villkor, och producerade Z-värden av 0.3100813 och 0.137313 och β = 6.0672 och 4.803308, respektive, som anger att ett fönster av LLO koncentrationer är lämplig för analysen. När koncentrationen av LLO ökas utöver 1 nM, klyftan i den ICNABD stänger kinetiska kurvor mellan M1 och M2 villkor som leder till drastiskt minskad Z-faktor och SSMD värden (figur 7B). Sådana höga koncentrationer av LLO motsvarar förhållanden där reparation potential uppvägs av skador och därmed förnekar användningen av analysen att identifiera faktorer som membran reparation. Detta illustreras ytterligare av minskningen i reparation effektivitet (E) LLO koncentration ökar (figur 7B). Alla data (Z-faktor, SSMD och E) genererades med 3 biologiska replikat och 3 tekniska replikerar per experimentella villkor för assay validering. Tillsammans, dessa data visar att denna analys har den förväntade robustheten för en hög genomströmning analys med LLO koncentrationer underlägsen 1 nM för HeLa cells.

Bevis på principen: när robustheten i analysen var etablerad, vi utförde ytterligare experiment som bevis på principen att denna analys har känslighet och upplösning för att identifiera en defekt i reparationsprocessen. Dessutom ansåg vi att hög genomströmning analyser används som en screening process att identifiera ”hits” inom stora skärmar, vilket kan innebära mindre än 3 biologiska replikerar. Det är således relevant att experimentell design ger detektering kraft att identifiera ”hits” inom en enda analys. Därför, under en hög genomströmning skärm, assay layouten kan justeras för att rymma 4 tekniska replikat för att öka statistiska makt i ett enda experiment. Cellerna var klädd i fyra exemplar och var förbehandlade 1 h före analysen med desipramin, en farmakologiska hämmare av det lysosomala protein sura sphingomyelinase (ASM) som spelar en roll i plasmamembranet reparation15,17 ,46. Ännu viktigare, påverkade behandling med desipramin inte blodbilden under hela analysen, vilket möjliggör lämpliga jämförelse mellan desipramin- och icke-behandlade celler (figur 8A). Hämning av ASM i desipramin-behandlade celler resulterade i en defekt i membran återförslutning effektivitet vid exponering för LLO, vilket illustreras av minskningen i E och REff (figur 8B och 8 C). Använder en blandade effekter modell, behandlade en jämförelse av desipramin-icke-behandlade celler utsätts för 0,25 och 0,5 nM LLO i M1 visade p-värden för 0.0010 och 1 x 10-10, respektive. Tillsammans, indikerar data att 0,25 och 0,5 nM LLO är lämpliga koncentrationer att identifiera defekter i reparation i en hög genomströmning experimentell miljö, med möjligt statistiska analyser av ett enda experiment en gång replikerar den tekniska höjs till fyra . Observera att den statistiska metoden av blandade effekter modellen mellan fyra exemplar inte kommer hänsyn till eventuella variationer över flera biologiska replikat. Eventuella betydelsefulla resultat med hjälp av en biologisk replikera bör kontrolleras i ytterligare experimentella inställningar.

Figure 1
Figur 1: försöksplanering. Flödesdiagram skildrar en representativ plattan design konfigurerad för att testa effekten av sju provningsvillkor jämfört med kontroll ej behandlade celler. Ytterligare kontroller bör inkluderas om så är lämpligt, som för anföra som exempel drog fordon. Celler är pläterade (skylt (1) 24 h innan experimentet. På dagen för experimentet, celler i plattan 1 tvättas med M1 eller M2 medium pre värmas vid 37 ° C, och plattan är avbildad (TL, GFP och PI fluorescens) före kinetic. Under de 15 min imaging, reagenser läggs på is till plattan 2. Tallrik 1 placeras omedelbart på is för 5 min efter imaging, och 100 μL/brunn överförs från plattan 2 till tallrik 1. Tallrik 1 placeras i plattan läsaren att köra kinetiska analysen vid 37 ° C i 30 min, följt av imaging (TL, GFP och PI fluorescens). Data analyseras sedan för att räkna celler och bedöma reparation effektivitet i alla experimentella förhållanden. I stora datamängder, kan analys automatiseras. Dessutom kan antalet tekniska replikat ökas till 4 i hög genomströmning skärmar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Cell räknar noggrannhet. HeLa-celler som uttrycker GFP-märkta Histon 2B var seedad i exemplar vid de angivna koncentrationerna. (A) celler var avbildad vid 37 ° C under genomlysning (TL) och god Jordbrukarsed fluorescens (12 bilder per brunn) och en cell upptäckt algoritm användes för att avgränsa enskilda kärnor (i lila). Skalstapeln = 1 mm. (B) högre förstoring av TL, GFP och cell upptäckt (lila) bilder (zoomade 2 X). Skalstapeln = 100 μm. (C) bild analysprogramvara användes för att räkna antalet celler och cellen räkningarna var plottas mot initialen cellen sådd koncentration. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Propidium jodid fluorescens mätningar påverkas inte av Histon 2B-GFP uttryck. Histon 2B-GFP uttrycka och icke-uttryckande HeLa celler exponerades, eller inte, till 1 nM LLO i närvaro (heldragna linjer) eller saknas (streckade linjer) 30 μM PI i Ca2 +-innehållande medium (M1). Kinetic analysen mäts PI fluorescens intensiteter av spectrofluorometry var 5 minut under 30 minuter vid 37 ° C. Data är genomsnittliga PI fluorescensintensiteten (IPI) uttrycks i relativa fluorescens enheter (RFU) ± SEM (n = 3 oberoende experiment, varje utförs i exemplar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Cell uppräkning är opåverkad av PI fluorescens. (A) representativa före och efter kinetiska bilder (TL, PI och god Jordbrukarsed) celler utsätts, eller inte, 1 nM LLO i M1. Skalstapeln = 100 μm. (B) kvantitativa fluorescence mikroskopi analys (jagGFP± SEM) visade ökad GFP fluorescens mätning på grund av PI nukleära inkorporering vid cell sårande av LLO (efter kinetic). (C) GFP-baserade cell uppräkning var opåverkad av ökningen av GFP intensitet. Celltalet per brunn uttrycktes genomsnittliga ± SEM. (i B och C: svart barer = pre kinetiska data, röda staplar = efter kinetiska data; n = 3 oberoende experiment, varje utförd i exemplar; tvåsidiga Students t-test användes för att analysera kvantitativa fluorescens intensitet och cell räknas från förvärvade bilder, ** p < 0,01). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: mäta plasmamembranet återförslutning effektivitet. Histon 2B-GFP uttrycker HeLa celler exponerades, eller inte, till 1 nM LLO i Ca2 +-innehållande (M1) eller Ca2 +-gratis (M2) medium innehållande 30 μM PI. Kinetiska data representerar PI fluorescensintensiteten (IPI) i relativa fluorescens enheter (RFU) ± SEM, mätt under 30 minuter vid 37 ° C. n = 3 oberoende experiment, varje utförs i exemplar. Resealing effektivitet mättes som anges i protokollet steg 1.5.4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Carbocyanine nukleinsyra bindande färgämne som en alternativ färg att bedöma membran återförslutning. HeLa H2B-GFP celler exponerades, eller inte, till 0,5 nM LLO under 30 minuter vid 37 ° C i närvaro av 1 μM CNABD i Ca2 +-innehållande (M1) eller Ca2 +-gratis (M2) medium. (A) bilder av HeLa H2B-GFP celler förvärvades före och efter kinetiska i M1 som innehåller färgämnet. Skalstapeln = 100 μm. (B och C) integrerade CNABD och god Jordbrukarsed fluorescens stödnivåer mättes med hjälp av bildgivande cytometer och uttrycks i relativa fluorescens enheter (RFU) ± SEM. (D) GFP fluorescens bilder bearbetades för att räkna upp HeLa H2B-GFP celler (svart barer = före kinetic, röda staplar = efter kinetiska data, n = 3 oberoende experiment, varje utförs i exemplar). Tvåsidiga Students t-test användes för att analysera kvantitativa fluorescensintensiteten och blodkroppar från förvärvade bilder, ** p < 0,01, *** p < 0,001) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: effekten av LLO koncentration på återförslutning effektivitet, Z-faktor och SSMD. (A) HeLa H2B-GFP cellerna inkuberas i M1 eller M2 innehållande 1 μM CNABD var utsatt för ökande koncentrationer av LLO och utsätts för kinetiska analysen under 30 minuter vid 37 ° C. Data är uttryckta i CNABD intensitet (ICNABD) i relativa fluorescens enheter (RFU) ± SEM. (B), Z-faktorn och strikt standardiserade genomsnittliga skillnaden (SSMD) beräknades som en kvalitetsbedömning för robustheten av membran reparation analys, med arean under kurvan (AUC) som ett mått för kinetiska kurvor42,43,44,45. Resealing effektivitetsvinsterna beräknades enligt beskrivningen i avsnitten protokoll och resultat (n = 3 oberoende experiment, varje utförs i exemplar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: Cell exponering för desipramin orsakar defekter i återförslutning. HeLa H2B-GFP celler (klädd i fyra exemplar) var förbehandlade med 30 μM desipramin (eller inte) för 1 h vid 37 ° C och sedan utsätts för 0,25 eller 0,5 nM LLO i närvaro av 1 μM CNABD i Ca2 +-innehållande (M1) eller Ca2 +-gratis (M2) medium. Cellerna var avbildad (före och efter kinetic) och utsätts för kinetiska analysen vid 37 ° C för 30 min. (A) celler var uppräknad; data är uttryckt som genomsnittlig cell räknas ± SEM. (B) CNABD fluorescensintensiteten (ICNABD) uttrycks i relativa fluorescens enheter (RFU) ± SEM. (C) Resealing effektivitetsvinster beräknades i närvaro och frånvaro av desipramin. En blandad effekter modell användes på logg-omvandlad intensitetsvärdena förutsatt att en slumpmässig intercept för varje teknisk replikat. För att fånga båda en förskjutning och förändring i form av kinetiska kurvorna, testades den huvudsakliga effekten av behandling skick och effekten interaktion mellan behandling skick och tid gemensamt för statistisk signifikans. Tvåsidiga Students t-test användes för att analysera blodkroppar från förvärvade bilder. P-värde beräknades med hjälp av blandade effekter-modellen. (4 tekniska replikeras, ett experiment). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Imaging Cytometer utsläpp kanal specifikationer
Fluorophore Fluorophore ex / em (nm) Grön kanal (ex / em ± bandpass, nm) Röda kanalen (ex / em ± bandpass, nm)
GOD JORDBRUKARSED 488/510 460/541 ± 20/108 625/713 ± 20/123
PI 533/617
CNABD 642/661

Tabell 1: GFP, PI och CNABD magnetisering och utsläpp toppar och de gröna och röda kanal excitation och utsläpp bandpasses för den imaging cytometer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denna analys mäter effektiviteten i membran återförslutning på cellnivån befolkning med hög genomströmning kapacitet. Det kan användas till skärmen för cellulära komponenter eller drogen bibliotek som skulle kunna påverka membran reparation. Beskrivna analysen använde ett plattan med 96 brunnar format, men det kan anpassas till 384 brunnar för högre genomströmning. En fördel med denna analys är dess förmåga att erhålla fluorescens mätningar av vidhäftande levande celler i realtid utan att behöva alltför stora cell bearbetning såsom cell avlossning, fixering eller fluorescens märkning efter fixering. Multimode plattan läsare, som den som används i detta protokoll, har tillräcklig känslighet för snabb spectrofluorometric mätningar med intervall så lågt som 30 s för en plattan med 96 brunnar. Förvärvet av fluorescens bilder ger ytterligare information inklusive cell uppräkning, eventuella förändringar i cellmorfologi och potentiella identifiering av olika cellpopulationer. Närvarande analysen fastställer inte kineticsen av plasmamembranet återförslutning på enstaka cellnivå, men identifierar försöksbetingelser (farmakologiska föreningar eller cellulära komponenter) som kan påverka, positivt eller negativt, membranet återförslutning på cell populationsnivå.

Flera andra experimentella metoder har utvecklats för att bedöma membranet återförslutning mekanismer. Mekaniska störningar av microneedle punktering, pärla nötning och laser ablation har exempelvis använts för att modellera mekaniska membran skador. Mätning av sårade och reparera har involverat fluorescence mikroskopi eller flöde flödescytometri av kvantifiera tillträdeet av fluorescerande sonder (FM 1-43, propidium jodid, fluorescein-konjugerad dextrans) eller spårning fluorescerande protein chimärer47 ,48,49,50. Alla dessa metoder har sina fördelar; men är de inte mottaglig för high-throughput screening i levande celler som presenteras i denna analys.

Närvarande analysen var optimerad för att analysera celler sårad av proteinet pore-bilda LLO, som bildar stora porer som tillåter den massiva Ca2 + tillströmningen som provocerade av mekaniska brister av plasmamembranet resealing effektivitet. Även om por-bilda toxiner representerar en form av plasmamembranet skada, reparation av stora toxin porer och mekaniska sår föreslogs att dela gemensamma Ca2 +-beroende vägar17,51. Det är viktigt att notera att LLO interaktion med cellmembranet komponenter såsom kolesterol kan påverka cellsignalering och därmed kan påverka membran återförslutning mekanismer jämfört med mekaniska sår. Vår kunskap om membran reparation är fortfarande begränsad och ytterligare studier krävs för att fastställa om återförslutning av mekaniska sår skiljer sig från återförslutning efter bildandet av toxin porer. I området i närheten finns det flera fördelar med att använda LLO. Första, inledande av membran skador kan synkroniseras genom att höja temperaturen från 4 till 37 ° C. Andra, löslig form av LLO (inte bunden till cellmembranet) oåterkalleligt aggregat vid neutralt pH och 37 ° C, således begränsa cytotoxiska effekter och om upphävande av behovet av att tvätta cellerna. Slutligen, graden av skada kan justeras genom att variera koncentrationen av toxin. En begränsning av denna analys är dock temperaturen växla mellan 37 och 4 ° C, vilket kan påverka mekanismen reparation som vesikulär transport, endocytos och membran fluiditet, bland andra processer, som påverkas av temperatur52, 53,54. Det är viktigt att kontrollera att eventuella farmakologiska hämmare som ingår i analysen inte stör bildandet av LLO porer genom att utföra en hemolys analysen i närvaro (kontra frånvaro) av den drog55. På grund av potentiella batch skillnader i LLO aktivitet är det viktigt att förbereda ett lager av LLO som är stort nog för en hel hög genomströmning skärm55.

Vi ingår användning av celler som uttrycker kärn-lokaliserad Histon-2B-GFP chimera som ett sätt att räkna upp celler före och efter membran reparation analysen via mikroskopbilder följt av automatiserad bildanalys. Ännu viktigare, motsvarande cell räknar över villkor och oföränderliga cell räknas före och efter den kinetiska assay avgörande som PI eller CNABD fluorescens stödnivåer inte lätt normaliseras. Verkligen resulterar en skillnad i celltal i skillnader i graden av skada av en viss koncentration av LLO, som inte kan korrigeras för via fluorescens normalisering på grund av variationer i återförslutning effektivitet (figur 7). Vi visade att Histon-2B-GFP uttryck inte stör utsläpp av PI eller CNABD införlivande eller fluorescens. Däremot påverkar inte PI eller CNABD inkorporering GFP-baserade cell uppräkning. Om andra kombinationer av fluorophores skall användas, vore det nödvändigt att bedöma potentiella spektrala överlappning mellan fluorokromer, som utfördes i detta arbete. Även om PI har använts i stor utsträckning att mäta membran skador, visar vi att CNABD är ett utmärkt substitut som uppvisar högre fluorescens quantum avkastning, vilket resulterar i ett större dynamiskt omfång som passar kännetecknar återförslutning effektivitet.

Z-faktor och SSMD bekräftat att denna analys har robustheten som behövs för att utföra hög genomströmning analyser. Beräkningen av resealing effektivitet är en kritisk och tillförlitliga verktyg för att identifiera potentiella hits. Dessutom kan blandade effekter modellen användas som ett statistiskt verktyg för att utvärdera träffar inom en enda analys. Experimentell planen måste innehålla minst tre tekniska replikat om skärmen kan upprepas flera gånger. Quadruplicates bör användas om statistiska verktyg, såsom den blanda effekter modellen, som ska ingå i en enda experiment, om huruvida det kommer att upprepas. Det rekommenderas dock att utföra skärmen flera gånger och att validera resultaten genom att utföra kompletterande experiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi erkänner Dr Jesse Kwiek (The Ohio State University) för vänligt att tillåta oss att använda hans multi-mode upptäckt plattform för vissa preliminära experiment. Forskning som redovisas i denna artikel stöddes av det nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar av det nationella Institutes of Health award nummer RO1AI107250 till Stephanie Seveau. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader Molecular Devices i3x
MiniMax 300 Imaging cytometer Molecular Devices 5024062
TO-PRO-3 ThermoFisher Scientific T3605
Propidium Iodide ThermoFisher Scientific P3566
HeLa ATCC CCL2
HeLa H2B-GFP Millipore SCC117
Trypsin-EDTA 0.25% ThermoFisher Scientific 25200056
96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate Corning 3603
Hanks' balanced Salts Sigma-Aldrich H4891
EGTA ISC BioExpress 0732-100G
HEPES Fisher Scientific BP310-500
D-(+)-Glucose, HybriMax Sigma-Aldrich G5146-1KG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Demonbreun, A. R., McNally, E. M. Plasma Membrane Repair in Health and Disease. Current Topics in Membranes. 77, 67-96 (2016).
  2. Howard, A. C., McNeil, A. K., McNeil, P. L. Promotion of plasma membrane repair by vitamin E. Nature Communications. 2, 597 (2011).
  3. Howard, A. C., et al. A novel cellular defect in diabetes: membrane repair failure. Diabetes. 60 (11), 3034-3043 (2011).
  4. Lozano, M. L., et al. Towards the targeted management of Chediak-Higashi syndrome. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9, 132 (2014).
  5. Vainzof, M., et al. Dysferlin protein analysis in limb-girdle muscular dystrophies. Journal of Molecular Neuroscience. 17 (1), 71-80 (2001).
  6. Huynh, C., et al. Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (48), 16795-16800 (2004).
  7. Cooper, S. T., McNeil, P. L. Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology. Physiological Reviews. 95 (4), 1205-1240 (2015).
  8. Steinhardt, R. A., Bi, G., Alderton, J. M. J. M. Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release. Science. 263 (5145), 390-393 (1994).
  9. De Mello, W. C. Membrane sealing in frog skeletal-muscle fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (4), 982-984 (1973).
  10. Fishman, H. M., Tewari, K. P., Stein, P. G. Injury-induced vesiculation and membrane redistribution in squid giant axon. Biochimica et Biophysica Acta. 1023 (3), 421-435 (1990).
  11. Davenport, N. R., Bement, W. M. Cell repair: Revisiting the patch hypothesis. Communicative & Integrative Biology. 9 (6), 1253643 (2016).
  12. McNeil, P. L., et al. Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane. Journal of Cell Science. 113 (11), 1891-1902 (2000).
  13. Terasaki, M., Miyake, K., McNeil, P. L. Large plasma membrane disruptions are rapidly resealed by Ca2+-dependent vesicle-vesicle fusion events. Journal of Cell Biology. 139 (1), 63-74 (1997).
  14. Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. Journal of Cell Biology. 131 (6 Pt. 2), 1747-1758 (1995).
  15. Tam, C., et al. Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair. Journal of Cell Biology. 189 (6), 1027-1038 (2010).
  16. Rodriguez, A., et al. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. Journal of Cell Biology. 137 (1), 93-104 (1997).
  17. Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106 (2), 157-169 (2001).
  18. Jimenez, A. J., et al. ESCRT machinery is required for plasma membrane repair. Science. 343 (6174), 1247136 (2014).
  19. Pathak-Sharma, S., et al. High-Throughput Microplate-Based Assay to Monitor Plasma Membrane Wounding and Repair. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 305 (2017).
  20. Hamon, M. A., et al. Listeriolysin O: the Swiss army knife of Listeria. Trends in Microbiology. 20 (8), 360-368 (2012).
  21. Seveau, S. Multifaceted activity of listeriolysin O, the cholesterol-dependent cytolysin of Listeria monocytogenes. Subcellular Biochemistry. 80, 161-195 (2014).
  22. Osborne, S. E., Brumell, J. H. Listeriolysin O: from bazooka to Swiss army knife. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 372 (1726), (2017).
  23. Lukoyanova, N., Hoogenboom, B. W., Saibil, H. R. The membrane attack complex, perforin and cholesterol-dependent cytolysin superfamily of pore-forming proteins. Journal of Cell Science. 129 (11), 2125-2133 (2016).
  24. Tweten, R. K. Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins. Infection and Immunity. 73 (10), 6199-6209 (2005).
  25. Koster, S., et al. Crystal structure of listeriolysin O reveals molecular details of oligomerization and pore formation. Nature Communications. 5, 3690 (2014).
  26. Duncan, J. L., Schlegel, R. Effect of streptolysin O on erythrocyte membranes, liposomes, and lipid dispersions. A protein-cholesterol interaction. Journal of Cell Biology. 67 (1), 160-174 (1975).
  27. Morgan, P. J., et al. Subunit organisation and symmetry of pore-forming, oligomeric pneumolysin. FEBS Letters. 371 (1), 77-80 (1995).
  28. Leung, C., et al. Stepwise visualization of membrane pore formation by suilysin, a bacterial cholesterol-dependent cytolysin. eLife. 3, (2014).
  29. Marchioretto, M., et al. What planar lipid membranes tell us about the pore-forming activity of cholesterol-dependent cytolysins. Biophysical Chemistry. 182, 64-70 (2013).
  30. Palmer, M., et al. Assembly mechanism of the oligomeric streptolysin O pore: the early membrane lesion is lined by a free edge of the lipid membrane and is extended gradually during oligomerization. European Molecular Biology Organization Journal. 17 (6), 1598-1605 (1998).
  31. Bavdek, A., et al. pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. Federation of European Biochemical Society Journal. 279 (1), 126-141 (2012).
  32. Schuerch, D. W., Wilson-Kubalek, E. M., Tweten, R. K. Molecular basis of listeriolysin O pH dependence. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (35), 12537-12542 (2005).
  33. Cassidy, S. K., O'Riordan, M. X. More than a pore: the cellular response to cholesterol-dependent cytolysins. Toxins (Basel). 5 (4), 618-636 (2013).
  34. Lam, J., et al. Host cell perforation by listeriolysin O (LLO) activates a Ca(2+)-dependent cPKC/Rac1/Arp2/3 signaling pathway that promotes L. monocytogenes internalization independently of membrane resealing. Molecular Biology of the Cell. , (2017).
  35. Gekara, N. O., Weiss, S. Lipid rafts clustering and signalling by listeriolysin O. Biochemical Society Transactions. 32 (Pt 5), 712-714 (2004).
  36. Magassa, N., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. Streptococcus pyogenes cytolysin-mediated translocation does not require pore formation by streptolysin O. European Molecular Biology Organization Reports. 11 (5), 400-405 (2010).
  37. Baba, H., et al. Induction of gamma interferon and nitric oxide by truncated pneumolysin that lacks pore-forming activity. Infection and Immunity. 70 (1), 107-113 (2002).
  38. Carrero, J. A., Vivanco-Cid, H., Unanue, E. R. Listeriolysin o is strongly immunogenic independently of its cytotoxic activity. Public Library of Science One. 7 (3), e32310 (2012).
  39. Coconnier, M. H., et al. Listeriolysin O-induced stimulation of mucin exocytosis in polarized intestinal mucin-secreting cells: evidence for toxin recognition of membrane-associated lipids and subsequent toxin internalization through caveolae. Cell Microbiology. 2 (6), 487-504 (2000).
  40. Suzuki, T., et al. DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 45 (1), 49-53 (1997).
  41. Bink, K., et al. TO-PRO-3 is an optimal fluorescent dye for nuclear counterstaining in dual-colour FISH on paraffin sections. Histochemistry and Cell Biology. 115 (4), 293-299 (2001).
  42. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  43. Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nature Methods. 6 (8), 569-575 (2009).
  44. Zhang, X. D. A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays. Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).
  45. Zhang, X. D. A new method with flexible and balanced control of false negatives and false positives for hit selection in RNA interference high-throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 12 (5), 645-655 (2007).
  46. Idone, V., et al. Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis. Journal of Cell Biology. 180 (5), 905-914 (2008).
  47. Davenport, N. R., et al. Membrane dynamics during cellular wound repair. Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2272-2285 (2016).
  48. Defour, A., Sreetama, S. C., Jaiswal, J. K. Imaging cell membrane injury and subcellular processes involved in repair. Journal of Visualized Experiments. (85), (2014).
  49. Lee, J. J. A., et al. Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
  50. Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. Journal of Visualized Experiments. (52), (2011).
  51. Corrotte, M., et al. Toxin pores endocytosed during plasma membrane repair traffic into the lumen of MVBs for degradation. Traffic. 13 (3), 483-494 (2012).
  52. Kuismanen, E., Saraste, J. Low temperature-induced transport blocks as tools to manipulate membrane traffic. Methods in Cell Biology. 32, 257-274 (1989).
  53. Togo, T., et al. The mechanism of facilitated cell membrane resealing. Journal of Cell Science. 112, 719-731 (1999).
  54. Johnson, S. A., et al. Temperature-dependent phase behavior and protein partitioning in giant plasma membrane vesicles. Biochimica et Biophysica Acta. 1798 (7), 1427-1435 (2010).
  55. Lam, J. G. T., et al. Host cell perforation by listeriolysin O (LLO) activates a Ca(2+)-dependent cPKC/Rac1/Arp2/3 signaling pathway that promotes Listeria monocytogenes internalization independently of membrane resealing. Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 270-284 (2018).

Tags

Immunologi infektion och fråga 143 plasmamembranet återförslutning membran reparation muskeldystrofi propidium jodid carbocyanine nukleinsyra bindande dye por-bilda toxin listeriolysin O
Hög genomströmning mätning av plasmamembranet återförslutning effektivitet i däggdjursceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lam, J. G. T., Song, C., Seveau, S.… More

Lam, J. G. T., Song, C., Seveau, S. High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (143), e58351, doi:10.3791/58351 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter