Summary
반전 녹음 방송 (실시간 정량)와 함께 하는 실시간 정량 중 합 효소 연쇄 반응 분석은 RNA 바이러스 감염의 수준을 측정 하 널리 사용 되었습니다. 여기는 직접 실시간 정량 분석 결과, 뎅기열 바이러스를 포함 하 여 여러 RNA 바이러스의 정량화에 대 한 개발 하는 RNA 정화 단계를 필요 하지 않는 선물이.
Abstract
현재, 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 기술은 감도, 특이성, 때문에 필수 도구 탐지 및 정량화 연구 실험실, 바이러스 성 게놈의 뿐만 아니라 분자 진단 및 편의입니다. 그러나, 대부분의 경우, 정량 PCR (정량) 분석 결과 일반적으로 검출 하기 위하여 이용 바이러스 감염 PCR 단계 전에 바이러스 성 핵 산 정화에 의존 하고있다. 이 연구에서는 형광 기반 반전 녹음 방송 (실시간 정량) 정량 분석 결과 개발 처리 버퍼와 원스텝 RT-PCR 시 약의 결합을 통해 전체 프로세스, 바이러스 감염의 문화 상쾌한의 수확을 실시간 탐지까지 셀 바이러스 성 RNA 정화 없이 수행할 수 있습니다. 설립된 프로토콜 90 분 이내 뎅기열 바이러스 (DENV)의 넓은 범위 RNA 농도의 정량화를 수 있습니다. 또한, 항 바이러스 대리인의 평가를 직접 실시간 정량 분석 결과의 적응성을 이전에 보고 된 DENV 억제 물, mycophenolic 산 (MPA)를 사용 하 여 생체 외에서 실험에 의해 증명 됩니다. 또한, 다른 RNA 바이러스, 황열병 바이러스 (YFV), (MeV), 홍 역 바이러스, Chikungunya 바이러스 (CHIKV) 등 같은 프로토콜 정량 직접 RT-Pcr에 의해 측정할 수 있습니다. 따라서,이 보고서에 설명 된 직접 실시간 정량 분석 결과 더 높은 처리량 검열 연구 및 임상 진단을 위한 유망한 플랫폼으로 개발 될 것입니다 간단 하 고 빠른 방법에 있는 RNA 바이러스 복제를 모니터링 하기 위한 유용 합니다.
Introduction
속 Flavivirus Flaviviridae 가족의 구성 이상 70 덮여, 모기와 진드기에 의해 전송 되는 양성 가닥 RNA 바이러스. 중요 한 것은, 인간은 종종 flavivirus 감염 출혈 열과 뇌염1등 심각한 임상 질병, 이끌어 낸다. 사실, Zika 바이러스 (ZIKV)는 flavivirus의 최근 발발 아메리카에 걸쳐 폭발적으로 확산 하고있다 고 microcephaly2,3를 포함 한 신경 합병증과 관련 된 것으로 표시 되었습니다. Flaviviruses, 그러므로, 현대 사회에 중요 한 임상 및 경제 영향을 미칠.
중요 한 flavivirus 뎅기열 바이러스 (DENV), 세계의 열 대와 아열대 지역에서 광범위 하 게 배포 모기 품 어진 바이러스입니다. DENV는 Aedes 모기, Aedes albopictus 등 Aedes aegypti, 결과 뎅기열 발생4의 글로벌 확산에 의해 전송 됩니다. 세계 보건 기구 (WHO)에서 뎅기열 병 세 가지 범주로 분류 하는 현재,: 뎅기열 경고 표시, 경고 표시, 및 심한 뎅기열4뎅기열 없이. DENV (DENV-1-4)의 1 차 감염 4 serotypes 중 하나는 종종 있지만 무 증상 또는 자기 제한, 역학 연구 다른 serotypes의 2 차 감염의 더 심각한 형태의 뎅기열 위험을 증가 나타났습니다. 그것은 비-DENV 감염의 항 체-종속 기능 향상 협조할 또는 2 차 감염으로 발생 한 심한 뎅기열의 잠재적인 메커니즘으로 제안 되었습니다 1 차 감염 기간 동안 생산 하는 항 체를 subneutralizing. 그러나, 특정 항 바이러스 약은 DENV 감염5가능 하다.
DENV에 대 한 항 바이러스 제의 개발에 대 한 루틴 및 높은 처리량 설정 의무가 있는 강력한 분석 양적 바이러스 복제를 탐지 하기 위한 필수적입니다. 전통적으로, 전염 성 바이러스 및 바이러스 항 원 검출을 위한 면역학 분석 (예를 들어, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 [일 라]) 측정을 위한 생물학적 분석 (예를 들어, 패 분석 결과) DENV를 모니터링 하는 데 사용 되었습니다. 복제 생체 외에서 그리고 vivo에서6,7. 그러나,이 분석 실험은 수시로 힘 드는 고 필요를 위해 몇 일 샘플의 많은 수의 처리를 방해 하. 이와 관련, 실시간 정량은 DENV 감염을 탐지 하기 위한 신뢰할 수 있는 분석 결과: 그것은 특정, 민감한, 그리고 상대적으로 빠른7. 또한, 실시간 정량 Pcr 기술은 높은 처리량 형식에 더 많은 이점이 있다. 그럼에도 불구 하 고, RNA 바이러스에 대 한 RT-PCR의 일반적인 절차는 수집 된 샘플에서 바이러스 성 핵 산의 복구를 요구 한다. 다양 한 추출 방법 실시간 정량 pcr 채택 될 수 있다, 비록 정화 바이러스 성 RNA를 여러 단계 여전히 필요 합니다. 또한, 실시간 정량 Pcr 분석 실험은 일반적으로 비싼 스핀 열 또는 유해 유기 용 매, 그로 인하여 더 성가신 만드는 준비 과정 필요 합니다. 실패 또는 샘플 간의 교차 오염을 방지 하는 것입니다 바이러스 성 게놈의 성공적인 정량화에 대 한 중요 한 요소, 덜 힘들고 시간이 걸리는 방법 이므로, 실시간 정량 Pcr에 적용할 경우에 특히 높은 처리량 형식입니다.
여기, 우리는 바이러스 성 RNA 정화를 포함 하지 않는 감염 된 세포의 문화 상쾌한에 DENV RNA를 측정 하기 위한 간단한 실시간 정량 Pcr 절차 보고. 이 최적화 된 실시간 정량 Pcr 프로토콜은 두 단계 구성: 처리 버퍼와 한 단계 ii) 실시간 정량 실시간 PCR 장비에서 DENV에 감염 된 세포 배양의 상쾌한의 i) 외피. 따라서, 표면에 뜨는 문화 DENV RNA 90 분 (그림 1) 내에서 검색할 수 있습니다. 우리는 또한 다른 RNA 바이러스 감염을 직접 실시간 정량 Pcr의 응용 프로그램을 설명합니다.
Protocol
1. RNA 표준의 DNA 템플렛 준비
- 준비는 PCR 혼합 (50 μ, 표 1의 총 볼륨)를 사용 하 여 DENV-2 뉴 기니 C를 포함 하는 플라스 미드 DNA 벡터 (NGC, 승인 번호: AF038403.1) 3' 되지 않은 지역 (3' UTR)8 및 뇌관 (T7-DENV 3 'UTR Fwd 및 DENV 3' UTR Rvs) 0.2 mL 튜브에서로 표 2에서 설명합니다.
참고:이 단계는 깨끗 한 후드 (또는) 클린 룸에서 실시 하는 amplicon 관련 제품의 오염을 피하기 위하여. - PCR 증폭 t 7의 cDNA 순서-융합 DENV 3' UTR는 thermocycler, 다음과 같은 조건을 사용 하 여에서: 30 사이클 (98 ° C 10의 s, 55 ° C 5에 대 한 s, 및 5 위한 72 ° C s).
- 0.1에서 10 kilobase 쌍 (kbp)에 이르기까지 DNA 분자 사다리 젤 로드 염료 및 부하에 1 %agarose 젤 x 6의 10 μ와 PCR 반응 혼합.
- 긴 파장의 자외선 DNA 시각화 방법과 젤 이미징 시스템을 사용 하 여 아래 PCR 제품 (479 기본적인 쌍 [bp])를 시각화 합니다. 깨끗 한 메스를 사용 하 여 DNA 밴드를 잘라.
- DNA 정제 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 DNA를 추출 합니다.
참고:이 정화 단계는 깨끗 한 후드 밖에 서 수행할 수 있습니다 하지만 다음 DENV RNA 표준 합성 단계에서 주요 문제는 RNase 오염을 피하기 위하여 과정에서 깨끗 한 환경 유지에 필수적 이다.- 젤 조각 무게 고 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 젤 조각 100 밀리 그램 당 캡처 버퍼의 100 μ를 추가 합니다.
- 5-15 분 동안 60 ° C에 외피에 의해 젤을 디졸브.
- 컬렉션 튜브 DNA 정화 열을 조립 하 고 정화 열에 녹아 샘플의 600 μ를 전송.
- 30 s를 통해 흐름 삭제 16000 x g 에서 원심. 샘플 볼륨 600 μ 보다 큰 경우, 첫 번째 스핀 후 DNA 정화 열 샘플의 나머지 부분을 적용 하 고이 단계를 반복.
- DNA 정화 열 버퍼 세척의 500 μ를 적용 합니다.
- 30 16000 x g 에서 원심 분리기 s.
- 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 열을 놓습니다.
- 차입 버퍼의 50 μ를 추가 하 고 1 분 동안 실내 온도에 열의 품 어.
- DNA elute 1 분 최대 속도로 원심.
- 260에 DNA의 광학 밀도 측정 eluted 샘플의 3 μ를 사용 하 여 분 광 광도 계에 nm. 차입 버퍼의 동일한 볼륨을 사용 하 여 빈으로.
참고: DNA 템플릿을 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 사용까지.
2. DENV 3' UTR RNA 표준의 합성
참고: 유지 ribonuclease (RNase)-무료 환경으로 다음 단계를 수행 수. 시의 설정 nuclease 무료 pipets, 팁, 그리고 튜브를 사용 하 여 깨끗 한 후드 안에 수행 되어야 한다.
- 생체 외에서 전송 (IVT) 반응 (20 μ의 총 볼륨)의 100 혼합 T7 RNA 발기인 순서 융합 DENV 3' UTR DNA에서에서 서식 파일 (1.6 단계) 표 3에 설명 된 대로 0.2 mL PCR 튜브의 ng.
- 2 h thermocycler에서 37 ° C에 혼합물을 품 어.
- 1 μ DNase의 IVT 반응에 추가 하 고 15 분 동안 37 ° C에는 부 화를 계속.
- 정화는 생체 외에서 RNA는 RNA 정화 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 복사할.
- RNase 무료 H2O의 80 μ와 350 추가 1% β-mercaptoethanol을 포함 하 여 캡처 버퍼의 μ.
- 100% 에탄올의 250 μ IVT 반응에 추가 하 고 pipetting으로 잘 섞는다.
- 컬렉션 튜브와 RNA 정화 열을 조립 하 고 정화 열에 RNA 샘플을 전송.
- 8, 000에서 원심 g 15 s와 흐름을 통해 삭제에 대 한 x.
- RNA 정화 열 세척 버퍼의 500 μ를 적용 하 고 2 분 동안 8000 x g 에서 원심.
- 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 열을 놓습니다.
- RNase 무료 H2O의 50 μ를 추가 하 고 1 분 동안 실내 온도에 열의 품 어.
- RNA elute 1 분 최대 속도로 원심.
- 260에 RNA의 광학 밀도 측정 eluted 샘플의 3 μ를 사용 하 여 분 광 광도에 nm. H2O의 동일한 볼륨을 사용 하 여 빈으로.
- 합성된 DENV 3' UTR RNA의 복사본 수를 결정 합니다. 1 RNA DENV 3' UTR의 ng (462 기초, 그림 2)은 109 부 x 4.05.
- -80 ° C에서 RNA 표준 사용까지 저장 합니다.
3. 실시간 정량에 대 한 바이러스 샘플의 처리
참고: 단계 3.1-3.3 생물 안전 캐비닛 안에 수행할 수 있습니다. 특히, biosafety 수준 2 (또는 더 높은) 환경에 전염 성 바이러스를 포함 하는 문화 상쾌한의 처리를 실시 해야 합니다.
- 처리 버퍼 및 가수분해 nuclease 무료 공화국의 1 μ의 믹스 199 μ
- 직렬 합성된 DENV 3' UTR RNA (2.6 단계)에서 희석 1:10 5 x 109 RNA 표준 사용 하 여 5 x 103 복사본/μ를 세포 배양 매체 (예를 들어, 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 항생제 [DMEM/10% FBS] 보충 DMEM) 40 단위/mL RNase 억제제를 포함 하.
- 버퍼/가수분해 K 솔루션 (3.1 단계)에서 처리의 5 μ와 DENV에 감염 된 세포와 DENV 3' UTR RNA 표준의 문화 상쾌한의 믹스 5 μ 8 튜브 PCR 스트립 또는 PCR 96 잘 접시를 사용 하 여. 비-템플릿 컨트롤 (NTC), 혼합 세포 배양 매체의 5 μ (즉, 바이러스는 포함) 처리 버퍼/가수분해 K 솔루션의 5 μ로.
- 간단히 원심 분리 후 thermocycler 다음 조건을 사용 하 여 샘플을 품 어: (25 ° C 10 분 및 5 분 동안 75 ° C)의 1 주기.
참고: 가공된 샘플 경우 실시간 PCR 분석은 같은 날에 4 ° C에서 보관할 수 있습니다. 장기 저장을 위한 샘플-80 ° c.에 저장 한다
4. 실시간 PCR 분석
참고: 그것은 좋습니다 amplicon 관련 제품 또는 RNase의 오염을 최소화 하기 위해 깨끗 한 후드 내부 단계 4.1-4.4 하.
- 원스텝 RT-PCR 시 약 (자료 테이블)와 실시간 정량 마스터 믹스 (RNase 무료) 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 준비 DENV 3' UTR 전용 프라이 머를 사용 하 여 fluorogenic 프로브 (표 1). 각 구성 요소 (표 4) 샘플, 표준 RNA와 NTC 반응 등의 총 수의 11% 이상에 따르면의 볼륨을 확장할.
- 96-잘 실시간 PCR 플레이트 (자료 테이블)에 사용 하 우물에 마스터 믹스의 aliquot 8 μ.
- 짧게 처리 샘플, 표준 DENV 3' UTR RNA와 NTC를 포함 하 여 (단계 3.4)에서 원심 고 96 잘 실시간 PCR 플레이트의 각 음에 샘플의 2 μ를 추가 합니다.
- 광학 투명 접착 필름으로 PCR 접시를 봉인.
- 짧게 원심 200 x g 공기 방울을 제거 하는 접시.
- 실시간 PCR 악기에 접시를 놓고 다음과 같은 조건을 사용 하 여 접시를 주기: RT의 1 주기 단계 (10 분 동안 25 ° C), 중 합 효소 활성화 단계 (2 분 동안 95 ° C)의 1 개 주기 증폭 단계의 40 주기 (95 ° C 10 s와 30에 대 한 60 ° C에 대 한 s [단일 데이터 취득이이 단계에서]).
- 실시간 PCR 관련 소프트웨어를 사용 하 여 샘플에서 DENV RNA의 복사본 수를 결정 합니다.
- 설치 창에서 알 수 없는 샘플으로 분석 하는 반응의 우물을 할당 합니다.
- 순차적으로 희석된 DENV 3' UTR RNA의 표준 으로 잘 할당 하 고 각 잘에서 RNA 표준 예상된 복사본 수를 입력 (예를 들어, 5 x 103 복사본/μ RNA 표준 솔루션의 사용 하는 경우 입력 5000). NTC에 대 한 부정적인 제어 로 우물을 지정 합니다.
- 분석 창에서 분석 을 클릭 하 고 생성 된 표준 곡선의 상관 계수 (R2)에 해당 하거나 0.98 보다 큰 있는지 확인 합니다.
- 일반적으로 사용 하는 기본 Ct 설정 (임계값: 자동, 초기 시작 주기: 자동, 기준선 끝 주기: 자동) 분석에 대 한.
참고: 알 수 없는 샘플 복사본 수는 개별 반응의 주기 (Ct) 임계값에 따라 자동으로 계산 됩니다. 각 샘플의 계산 된 복사 번호 RNA 복사본 당 10 μ 실시간 정량 Pcr 반응 으로 간주 됩니다 (예를 들어, 12,345 는 알 수 없는 샘플에 표시 된 경우, 즉 DENV RNA의 12,345 사본에 반응)입니다.
Representative Results
실시간 정량 분석에 의해 DENV RNA의 정량화에 대 한 동일한 뇌관에 의해 검출 될 수 있다 알려진된 복사본 수의 표준 설정, 필수. 이 프로토콜, 462 뉴클레오티드 긴 RNA는 3 'UTR DENV-2 NGC 스트레인의 시퀀스는 생체 외에서 T7 RNA에서 복사할 발기인-융합 DENV-2 3' 포함 된 UTR DNA 템플렛, PCR에 의해 증폭 되 고 정화 된 했다 (그림 2A 와 2B). 때 DENV RNA (5 x 109 10 μ 실시간 정량 Pcr 반응에서 5 x 102 복사본)에서 직접 실시간 정량 분석을 복종 되었다 표준의 직렬 10 희석 사용 하 여 3' UTR 특정 뇌관 및는 fluorogenic 프로브9, 선형 좋은 상관 계수 곡선 (R2 = 0.98726) (그림 2C)를 취득 했다.
다음, 직접 실시간 정량 분석 결과이 바이러스에 감염 된 세포의 문화 상쾌한에 DENV 계량에 적용 되었습니다. DENV-2 (싱가포르 격리 EDEN2 329510), C6/36 모기 세포에 전파 고 패 분석 결과 BHK 21 셀11을 사용 하 여 적정, 직렬 (8 x 106 80 플 라크 형성 단위 [PFU] /mL)에서 희석 되었다. DENV 샘플 다음 가수분해 K virions를 deproteinize에 포함 된 처리 버퍼의 동등한 양으로 취급 되었고 DENV 3' UTR RNA 시퀀스를 대상으로 직접 실시간 정량 분석 결과를 받게. 다시, 좋은 상관 관계 (R2 = 0.99981)과 사이 DENV 감염 titer Ct, 형광 신호 배경 위에 기하급수적으로 상승 하는 지점 수 간주 되는 주기 수 (그림 3A) 얻은. 알려진된 감염 titers와 DENV의 직렬 희석에서 생성 된 Ct 값으로 표준 곡선에 표시 했다 때 체 외에서 복사할 3' UTR 80 PFU/mL (8 x 103 크거나 8 x 106 에서 얻은 음모의 모든 RNA 10-2 PFU 10 μ 실시간 정량 Pcr 반응에서 x 8) 표준 RNA에 들어서는 그의 범위 안에 (5 x 103 5 x 109 10 μ 실시간 정량 Pcr 반응, 그림 3B에서 복사), DENV 감염의 다양 한 샘플을 나타내는 titers 같은 시간에이 직접 실시간 정량 Pcr를 사용 하 여 분석할 수 있습니다. 병렬 실험에서 실시간 정량 분석에 의해 버퍼 또는 바이러스 성 RNA의 검출에 가수분해 K 치료 처리의 효과 조사 했다. 하지만 로그 희석 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) RT-정량 (PBS 가진 바이러스 샘플의 1:1 희석)와 25 ° C 10 분 및 5 분 동안 75 ° C의 외피 elicited 전에 혼자와 DENV 샘플 (8 x 106 8 x 102 PFU/mL)의 치료는 회귀 곡선 (그림 3C, 검은 선), 그리고 PBS 처리 하 여 얻은 평균 Ct 값 2.6-3.2 주기 지연 버퍼/가수분해 K 치료 (그림 3C, 점선)를 처리 하 여 얻은 Ct에 비해. 또한, 바이러스 (8 x 102 x 10-1 PFU 10 μ 실시간 정량 Pcr 반응 당 [8] PFU/mL)의 높은 희석이 PBS 치료 (그림 3C)와 함께 검색 되지 않을. 처리 버퍼 처리 (그림 3C, 회색 선) 동안 가수분해 K의 부재에서 비슷한 회귀 생성 했다; 그러나, 증폭에 지연 (0.1-0.8 사이클) 여전히 상대적인 가수분해 K (그림 3C, 점선)를 포함 하는 처리 반응 관찰 되었다. 이러한 데이터, 테스트 조건 중 치료 성분 K 함께 처리 버퍼 DENV 샘플의 RT 정량 분석 결과의 감도 향상을 나타냅니다.
직접 실시간 정량 분석 결과 더 DENV에 대 한 항 바이러스 대리인 확인에 그것의 적용에 대 한 평가 했다. Mycophenolic 산 (MPA), 이식, 계통이 사용 되는 inosine monophosphate 효소의 nonnucleoside 억제제12,13 생체 외에서DENV 억제에 보고 되었습니다. 연구 분석 결과 기존의 플 라크 또는 DENV 감염12,13에 MPA의 억제 효과 설명 하는 바이러스 항 원 검출을 교류 cytometry 분석 결과 고용, 비록 현재에서 연구, 직접 실시간 정량 MPA의 항 바이러스 활동을 평가에 적용 됩니다. 헬러 세포, 했다 시드 5 x 104 셀/잘 24-잘 접시의 조밀도에 감염 이전에 1 일, DENV-2 1 h 1의 나를 노출 했다 하 고, 세척, 후 경작 DMEM/10% FBS와 50-0.016 μ g/mL의 MPA ( 또는 0.1% 디 메 틸 sulfoxide [DMSO]). 표면에 뜨는 문화는 감염 후 3 일 수집 DENV 3' UTR 특정 뇌관과 형광 프로브를 사용 하 여 직접 실시간 정량 분석 결과를 복종 하 고. 그림 4 에 감염 된 세포를 체 외에서 복사할 3' UTR RNA 표준에 의해 결정 했다 MPA의 농도 증가 함께 치료의 문화 supernatants (반응) 당 DENV RNA 복사본을 보여 줍니다. 50 μ g/mL (156 μ M)의 치료와 함께 MPA, DMSO 처리 제어 문화의 99.87 ± 0.02% 감소 (그림 4) 관찰 되었다. 중요 한 것은, 그림 4 에 표시 된 데이터에 의해 결정 하는 MPA의 IC50 (50% 금지 농도) 값은 0.79 μ 값과 유사한 보고 이전12,13. 이 결과 따라서이 직접 실시간 정량 분석 결과 DENV 감염에 항 바이러스 대리인의 억제 효과 평가 하기 위한 유용 하 고 신뢰할 수 있는 방법 임을 나타냅니다.
마지막으로, 다른 RNA 바이러스를 직접 실시간 정량 분석 결과의 응용 프로그램은 테스트 되었습니다. YFV-17 D-특정 뇌관 및는 fluorogenic로14를 프로브 변형의 황열병 바이러스 (YFV) 17 D 백신 (Flaviviridae) 했다 Vero 세포에서 증폭 되어 고 BHK 21 셀에 적정, 주식 실시간 정량 Pcr를 사용 하 여 직접 높였을 때 표 1에 설명 된 바이러스 titers Ct 값 사이 좋은 직접적인 상관 관계와 함께 표준 곡선 생성 될 수 바이러스 주식의 10 직렬 희석으로 (3.2 x 105 3.2 PFU/mL, 그림 5A). 마찬가지로, Chikungunya 바이러스 (CHIKV, Togaviridae)의 실시간 정량 분석을 직접 로스 스트레인 재고 Vero 세포에서 증폭 되어 졌고 CHIKV 전용 프라이 머를 사용 하 여 fluorogenic 프로브15 (표 1), BHK 21 셀에 적정 전염 성 titers 사이 좋은 회귀 했다 (4.4 x 108 4.4 x 103 PFU/mL)와 Ct 값 (그림 5B). 이것은 또한 전파 되었으며 Vero 세포로, 이전에 사용 하 여 적정 했다 홍 역 바이러스 (백만 전자 볼트, Paramyxoviridae)의 직렬 희석 (8 x 102 8 x 10-2 PFU/mL, 그림 5C)의 검출을 위한 경우 보고 된 뇌관 및 fluorogenic 조사16 (표 1) 이 데이터는 다양 한 RNA 바이러스의 정량적 검출에 대 한 직접적인 실시간 정량 분석 결과의 적응성을 보여 줍니다.
그림 1: 직접 실시간 정량 분석 결과의 워크플로. DENV에 감염 된 세포의 문화 상쾌한 바이러스 성 RNA (샘플 처리 단계) 출시 K 성분을 포함 하는 처리 버퍼 처리 됩니다. 가공된 샘플 다음 단계 RT-PCR 시 약을 혼합 하 고 DENV 3' UTR 특정 뇌관과 fluorogenic 프로브를 사용 하 여 실시간 PCR 분석 결과를 받게. 각 샘플에서 발견 하는 바이러스 성 RNA의 수준을 순차적으로 희석된 한 표준에 의해 결정 될 수 있다 생체 외에서 사용 하 여 복사할 DENV RNA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: RNA DENV 3' UTR에 의해 생성 된 표준 곡선. (A) 표준 RNA 포함 3' UTR의 DENV 2 NGC 베낀 생체 외에서 PCR 파편을 융합 하는 시퀀스 T7 RNA 발기인에서 했다. (B) 정화 DENV 3' UTR RNA (250 ng) 1 %agarose 젤 (오른쪽 차선)에 가시화 했다. 왼쪽된 차선 RNA 전기 이동 법에 대 한 분자량 마커를 보여줍니다. DENV 3 'UTR RNA 표준 K 성분을 포함 된 처리 버퍼 처리 되었고 원스텝 실시간 정량 Pcr 시 약 및 DENV 3를 사용 하 여 실시간 PCR 분석 대상이' UTR 특정 뇌관 및 fluorogenic 프로브 세트의의 (C) A 로그 희석 평균 Ct 값 (n = 3)에서 각각 희석 3' UTR RNA의 예상된 수량에 대 한 표시 했다 (5 x 102 RNA를 5 x 109 10 μ 실시간 정량 Pcr 반응에서 복사). R2 는 상관 계수 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 직접 실시간 정량으로 바이러스 재고가 DENV RNA의 정량화. C6/36 세포에서 생산 하는 (A) 높은 titer DENV-2 주식은 10 배 희석 직렬 (8 x 106 8 x 101 PFU/mL) DMEM/10% FBS와 RNase 억제제를 포함 하 고 DENV 3' UTR 전용 프라이 머를 사용 하 여 직접 실시간 정량 분석 결과를 받게 /probe입니다. (B) Ct 값 로그 희석 DENV 재고 (원)의 실시간 정량 Pcr에 의해 얻은 문자 3' UTR RNA (삼각형)의 표준 곡선에 표시 했다 생체 외에서. 8 x 106 PFU/mL 주식 직접 실시간 정량 분석 결과에서 사용 하 여 실시간 정량 Pcr 반응 8 x 103 10 μ에 바이러스의 PFU에 해당합니다. (C)이이 패널 처리 버퍼 및 바이러스 성 RNA의 검출에 가수분해 K 치료의 효과 보여줍니다. DENV 희석 주식 (8 x 106 8 x 102 PFU/mL) 가수분해 K (흰색 원), 버퍼 혼자 (회색 원), PBS (검은 동그라미)를 처리 하 고 다음 직접 대상이 포함 된 처리 버퍼의 동등한 양으로 알을 품는 실시간 정량 Pcr의 시험 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 직접 실시간 정량 Pcr에 의해 MPA의 억제 효과의 평가. HeLa 세포는 DENV-2 1, MPA, DENV (또는 0.1 %DMSO)의 이전에 보고 된 억제제의 농도 증가의 교양의 나에 감염 되었다. 3 일 후 감염, 감염 된 세포의 문화 supernatants 수집 되었고 DENV 3' UTR 전용 프라이 머/프로브를 사용 하 여 직접 실시간 정량 분석 결과를 받게. 바이러스 성 RNA의 복사본 수에 의해 결정 되었다 DENV 3' UTR RNA 표준 베낀된 체 외. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 다른 RNA 바이러스의 검출에 대 한 직접적인 실시간 정량의 응용 프로그램. 순차적으로 희석된 바이러스 주식 (A) YFV, (B) CHIKV, 및 (C) 백만 전자 볼트의 PCR 뇌관을 사용 하 여 직접 실시간 정량 Pcr 분석 실험을 복종 되었다 그리고 fluorogenic 그들의 각각 바이러스 성 RNA 시퀀스에 특정 프로브. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 목적 | 이름 | 시퀀스 (5'-3') | 참고 |
| T7 발기인 융합 DENV-2 3'UTR cDNA 증폭 | T7 DENV 3' UTR Fwd | TAA 전술 GAC TCA CTA 태그 GGc gaa tTA GAA GGC AAA 법 AAC ATG AAA | 기울임꼴, T7 발기인; 소문자, 공백; 굵게, DENV-2 NGC 뉴클레오티드 10,270-10,292 |
| Rvs DENV 3' UTR | AGA ACC TGT TGA TTC AAC AGC | DENV-2 NGC 뉴클레오티드 10,723-10,703 | |
| DENV의 실시간 정량 분석 | DENV-2 3' UTR F | 아 그 GAC 태그 AGG 온 개 그 개 그 ACC C | 참조 9 |
| DENV-2 3' UTR R | GGC GTT CTG TGC CTG GAA TGA 안내 | ||
| 프로브 2 덴-2-4 | 6FAM-AAC AGC ATA TTG ACG CTG GGA 아 그 ACC-TAMRA | ||
| YFV의 실시간 정량 분석 | YFV NS5 F | GAA CAG TGA TCA GGA ACC CTC TCT | 참고 14 |
| YFV NS5 R | GGA TGT TTG GTT CAC AGT AAA TGT G | ||
| YFV NS5 프로브 | 6FAM-CTA CGT GTC TGG AGC CCG CAG CAA T-TAMRA | ||
| CHIKV의 실시간 정량 분석 | CHIK E1 F | TCG ACG CGC CCT CTT TAA | 기준 15 |
| CHIK E1 R | ATC GAA TGC ACC GCA CAC T | ||
| CHIK E1 P | 6FAM-ACC AGC CTG CAC CCA TTC CTC AGA C-TAMRA | ||
| MeV의 실시간 정량 분석 | MeV N F | TGG 고양이 CTG AAC TCG GTA TCA C | 참고 16 |
| MeV N R | TGT CCT CAG 태그 문신 GCA TTG CAA | ||
| MeV N P | 6FAM-CCG AGG ATG CAA GGC TTG TTT CAG A-TAMRA |
표 1: Oligonucleotide 뇌관 및 fluorogenic 프로브 시퀀스가이 연구에 사용 된.
| 구성 요소 | 사진 농도 | 볼륨 (μ) | 최종 농도 |
| PrimeSTAR 최대 프리 믹스 | 2 x | 25 | 1 x |
| T7 DENV 3' UTR Fwd | 1 Μ M | 10 | 200 nM |
| Rvs DENV 3' UTR | 1 Μ M | 10 | 200 nM |
| pEU/DENV 3 ' UTR | 1 ng/μ | 1 | 20 세/μ |
| H2O nuclease 무료 | 4 | ||
| 총 | 50 |
표 2: PCR의 구성 요소는 DENV 3' UTR 템플릿 DNA의 준비에 대 한 믹스.
| 구성 요소 | 사진 농도 | 볼륨 (μ) | 최종 농도 |
| T7 시퀀스 융합 DENV 3' UTR DNA 템플렛 | (변수) | x | 100 반응 당 ng |
| ATP 솔루션 | 75 m m | 2 | 7.5 m m |
| CTP 솔루션 | 75 m m | 2 | 7.5 m m |
| GTP 솔루션 | 75 m m | 2 | 7.5 m m |
| UTP 솔루션 | 75 m m | 2 | 7.5 m m |
| 반응 버퍼 | 10 배 | 2 | 1 x |
| T7 효소 혼합 | 2 | ||
| 재조합 RNase 억제제 | 40 단위/μ | 1 | 2 단위/μ |
| H2O nuclease 무료 | 7-x | ||
| 총 | 20 |
표 3:는 IVT의 구성 요소는 표준 DENV 3' UTR RNA 합성에 대 한 믹스.
| 구성 요소 | 사진 농도 | 볼륨 (μ) | 실시간 정량 Pcr 반응에서 최종 농도 |
| iTaq 범용 프로브 반응 혼합 | 2 x | 5.00 | 1 x |
| iScript 고급 역전사 | 40 x | 0.25 | 100 반응 당 ng |
| 뇌관/프로브 믹스 | DENV-2 3' UTR F: 3 Μ M | 1.00 | 300 nM |
| DENV-2 3' UTR 연구: 3 Μ M | 300 nM | ||
| 프로브 2 덴-2-4: 2 μ M | 200 nM | ||
| H2O nuclease 무료 | 1.75 | ||
| 부분합 | 8.00 |
표 4: DENV RNA의 실시간 RT 정량 분석에 대 한 마스터 믹스의 구성 요소. 유의 처리 DENV 샘플 (또는 표준 RNA)의 2 μ 8 μ 마스터 믹스 (반응 당 10 μ의 총)에 추가 되어야 한다.
Discussion
오늘, 형광 기반 실시간 PCR에 의해 바이러스 성 핵 산 검출의 감도 속도7인 병원 성 인간의 바이러스의 분자 진단에 대 한 황금 표준 되고있다. 이것은 특히 뎅기열17등 급성 전염병의 초기 단계에서 바이러스 감염을 확인 중요 합니다. 또한, 기본 DNEV 연구의 분야에서 실시간 정량 분석 결과 생체 외에서 문화, DENV의 복제 생물학과 항 바이러스 억제제의 발견에 대 한 이해로 이어질 것입니다 바이러스 복제를 모니터링 하기 위한 필수적인 도구입니다. 이 연구에서는 형광 기반 실시간 PCR 분석 결과 더 개발 되었다 처리 버퍼와 원스텝 RT-PCR 시 약의 조합에 의해 감염 된 세포의 문화 상쾌한에 DENV RNA 정화 없이 실시간 정량으로 측정할 수 있게 되었다 바이러스 성 RNA 게놈입니다. 패 분석 결과, ELISA, 등 기존의 실시간 정량 고용 RNA 정화6,7, 바이러스 복제를 감지 하는 일상적인 분석 실험에 비해 실시간 정량 분석 결과의 간단한 프로토콜의 시간 큰 감소 귀착되 고 DENV RNA를 측정 하는 데 필요한 단계입니다. 유전 자료의 손실과 오염 최소화에 이점이 중요 한 기능 이기도 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 깨끗 한 후드의 사용 IVT (2.1 단계)의 설정 및 amplicon 관련 제품 또는 RNase의 교차 오염을 피하기 위해 실시간 정량 (단계 4.1-4.4) 반응에 필수적입니다 주목 해야한다. 그것은 또한 표면에 뜨는, 전염 성 바이러스는 biosafety 내각 (단계 3.3) 실험실 감염의 위험을 줄이기 위해 내부를 포함 하 여 문화를 처리 하기 위해 중요 한.
직접 실시간 정량 분석 결과의 또 다른 중요성은 다양 한 바이러스 성 RNA 복사본 또는 샘플의 농도 희석 하지 않고 동시에 분석할 수 있습니다. 순차적으로 희석된 DENV 3' UTR RNA 표준 사용 되었다 때 직접 실시간 정량 Pcr 프로토콜 선형 표준 곡선 7 배나 통해 생산과 정량화 하한값은 500 RNA 사본 (그림 2). 감염 된 세포의 문화 상쾌한에 DENV, 8 x 103 10 μ에서 8 x 10-2 PFU 바이러스의 검출에 대 한 실시간 정량 3' UTR RNA 표준, DENV의 범위 내에서 되었고 낮은 검출 한계 (8 x 10-2 PFU) 11를 포함 하도록 계산 400 ± 7,077 RNA 복사본 (그림 3B). 메모, 여러 flavivirus 연구18,,1920에서 보고의 바이러스 감염 titer (즉, PFU) DENV 샘플에서 바이러스 성 RNA 복사본의 더 큰 비율 또한이 연구에서 관찰 되었다. 이 크게 결함 (즉, 비 전염 성)의 존재 인 것으로 간주 됩니다 바이러스 또는 감염 및 죽은 세포에서 출시 무료 바이러스 성 RNA. 비록이 연구에서 얻은 RNA 복사본: PFU의 비율 (1.1 x 105 105 RNA 복사본/PFU x 1.3) (3 로그 1에서 비율 범위)21,20이전에 표시 된 데이터와 일치,이 있을 수 있습니다 바이러스 긴장, 셀, 또는 고용 문화 조건에 차이에 기인 합니다. 불일치에 대 한 또 다른 가능성이 설명, RNA 정화 프로세스가 여기에 설명 된 직접 실시간 정량 분석 결과에서 포함 되었다, 이후 문화 상쾌한에 더 DENV RNA 검출 될 수 바이러스의 손실 없이 실시간 PCR 분석은 유전 재료입니다.
직접 실시간 정량의 단순 96 잘 접시 등 다 잘 형식에서 샘플의 많은 수를 처리 하는 능력을 향상 시킵니다. 따라서,이 속성 안티 DENV 약물의 발견에 대 한 높은 처리량 검열 연구를 직접 실시간 정량 분석 결과의 미래 응용 프로그램을 지원 합니다. 실제로,이 보고서에서 안티 DENV 억제제, MPA의 유효성 검사에 대 한 직접적인 실시간 정량 분석 결과의 적용, 검사 및 결과 나타났다는 직접 실시간 정량 분석 결과 (그림 4)에 의해 얻은 MPA의 IC50 값 비교 상 패 분석 결과12,13를 사용 하 여 이전 연구에서 보고. 이 직접 실시간 정량 적절 하 게 항 바이러스 대리인의 억제 효과 평가 하기 위한 유용한 분석 결과 이며, 약물 연구를 미래에 심사에 채택 될 수 있는 방법을 보여 줍니다.
이 연구에서는 시도 다른 RNA 바이러스의 검출에 직접 실시간 정량 Pcr을 적용 되었다. 다른 3 개의 RNA 바이러스 (YFV, CHIKV, 및 백만 전자 볼트)의 10 희석 다른 속으로 분류 될 때 그림 5에서 같이 (Flaviviridae, Togaviridae, 그리고 Paramyxoviridae, 각각)를 사용 하 여 시험 되었다 이전 보고 뇌관 및 fluorogenic 프로브 각각 바이러스 성 RNA 시퀀스에 특정 합니다. 좋은 수천 감염 titers Ct 값 직접 실시간 정량 Pcr 분석 실험에 의해 얻은 했다 그리고 상관 관계 했다 4-6 선형 크기 순서. 이 직접 실시간 정량 Pcr 프로토콜은 단순히 바이러스 특정 뇌관을 변경 하 여 다양 한 종류의 RNA 바이러스에 fluorogenic 조사 건의 한다.
그럼에도 불구 하 고, 검출 감도이 연구 (그림 5)에서 테스트 바이러스 중 다양 합니다. 대상 바이러스 RNA의 검출 향상 시킬 수 있는 프로토콜의 한 수정 뇌관/프로브 시퀀스의 새로운 집합을 사용 하도록 해야 합니다. 또한, 성공적인 직접 실시간 정량 분석 결과 대 한 중요 한 단계는 샘플 단계 (단계 3.1-3.4)를 처리 하는 동안 바이러스 성 게놈의 효율적인 출시 될 생각 이다. 이 비 싸여 바이러스 같은 안정적인 바이러스의 정량적 검출을 위한 특별 한 중요성의 것입니다. 비록 예비 실험, Coxsackievirus b 3로 (CVB3), Picornaviridae에 속하는 비 싸여 RNA 바이러스 앞에서 설명한 CVB3 특정 뇌관 및 형광 프로브22를 사용 하 여 직접 실시간 정량 Pcr 분석 실험을 복종 되었다는 긍정적인 amplicon 신호 높은 titer (1 x 105 PFU/mL) 바이러스 재고와도 감지 되지 않을 수 있습니다. 이 크게 비 싸여 바이러스의 높은 물리적 무결성에 기인 될 여겨진다. 지금까지 핵 산 정화 RNA 릴리스에서 다른 프로토콜을 사용 하는 몇 가지 RNA 바이러스를 검출 하기 위하여 개발 되었다 필요로 하지 않는 일부 RT-PCR 분석 실험 단계23,,2425, 26. 따라서, 잠재적으로 탐지의 감도 증가 대체 (또는 추가) 치료의 높은 온도에서 바이러스 샘플의 보육 등의 사용.
요약 하자면,이 연구에서 개발 된 직접 실시간 정량 Pcr 프로토콜 감염 된 세포의 문화 상쾌한에 바이러스 성 RNA를 측정 하는 간단 하 고 신속 하지만 신뢰할 수 있는 방법 이었다. 이 단순 직접 실시간 정량 분석 결과 바이러스 복제의 높은 처리량 분석에 대 한 약속을 보유 하 고 짧은 시간에 샘플 수를 처리할 수 있습니다. 또한, 다른 RNA 바이러스를 직접 실시간 정량 Pcr 프로토콜의 응용 프로그램 또한 입증 되었다. 이 방법은, 따라서 해야 합니다는 RNA 바이러스 감염 연구 실험실 설정에서 가능 하 게, 임상 진단에 효율적으로 모니터링 하기 위한 유용한 도구.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 감사 Subhash G. Vasudevan (듀크-싱가포르 국립 대학 대학원의과 대학, 싱가포르) DENV-2는 YFV에 대 한 EDEN2 3295 및 Shunro Imura (검역 역, 고베) 분리에 대 한 일 백신 긴장. 저자는 또한 그들의 도움에 대 한 학과의 미생물학 및 감염 관리의 회원 들에 게 감사. 이 작품은 MEXT KAKENHI 보조금 번호 JP16737900에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PrimeSTAR Max DNA Polymerase | Takara Bio. Inc | R045A | Comparable PCR reagent kit can be used. |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | Comparable thermal cycler instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
| 6x Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7024S | Comparable gel loading dye can be used. |
| 2-Log DNA Ladder | New England BioLabs | N3200 | 0.1-10.0 kilobase pairs. Comparable DNA molecular ladder can be used. |
| Gel Scene Tablet | Astec | GST-33 | Comparable gel imaging system can be used. |
| illustra GFX PCR Purification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 28-9034-70 | Comparable gel extraction kit can be used. |
| BioSpectrometer | Eppendorf | 6135000905 | Comparable spectrophotometer can be used. |
| MEGAscrip T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1334 | |
| TURBO DNase | Thermo Fisher Scientific | AM2238 | Included in MEGAscrip T7 Transcription Kit. |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio. Inc | 2313A | 40 units/μL |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Comparable RNA purification kit can be used. |
| CellAmp Direct RNA Prep Kit | Takara Bio. Inc | 3733Q | |
| Proteinase K | Nacalai Tesque | 15679-06 | >600 units/mL. Comparable reagent can be used. |
| iTaq Universal Probes One-Step Kit | Bio-Rad | 1725141 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | Comparable plate or tube can be used dependent on the real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Comparable film or optical cap can be used dependent on the real-time PCR plate or tube. |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | StepOnePlus-01 | Comparable real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
References
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