Summary
Sanntid kvantitative polymerase kjedereaksjon analyse kombinert med omvendt transkripsjon (RT-qPCR) har vært mye brukt til å måle nivået av RNA virusinfeksjoner. Her presenterer vi en direkte RT-qPCR analysen, som ikke krever en RNA rensing trinn, utviklet for kvantifisering av flere RNA-virus, inkludert dengue virus.
Abstract
I dag, sanntid polymerase kjedereaksjon (PCR) teknologien er et uunnværlig verktøy for deteksjon og kvantifisering av viral genomer i forskningslaboratorier og molekylære diagnose, på grunn av sin følsomhet, spesifisitet, og bekvemmelighet. Men i de fleste tilfeller kvantitative PCR (qPCR) analysen vanligvis brukes til å oppdage virusinfeksjon har stolt på rensing av viral nukleinsyre før PCR-trinn. I denne studien utvikles fluorescens-baserte omvendt transkripsjon qPCR (RT-qPCR) analysen gjennom en kombinasjon av en behandling buffer og en ettrinns RT PCR reagens slik at hele prosessen, fra avlingen av kultur nedbryting av virusinfiserte celler til deteksjon i sanntid, kan utføres uten viral RNA rensing. Etablerte protokollen gjør det mulig for kvantifisering av et bredt spekter av RNA konsentrasjoner av dengue virus (DENV) innen 90 min. I tillegg er tilpasningsevne direkte RT-qPCR analysen til evalueringen av en antiviral agent demonstrert ved en i vitro eksperimentere med en tidligere rapporterte DENV hemmer, mycophenolic syre (MPA). Videre kan andre RNA-virus, inkludert gulfeber virus (YFV), Chikungunya virus (CHIKV) og meslinger viruset (MeV), kvantifiseres av direkte RT-qPCR med samme protokoll. Derfor er direkte RT-qPCR analysen beskrevet i denne rapporten nyttig for overvåking RNA-virus replikering i en enkel og rask måte, som vil bli videreutviklet til en lovende plattform for en høy gjennomstrømming screening-undersøkelse og klinisk diagnose.
Introduction
Slekten Flavivirus av Flaviviridae familie består av mer enn 70 innhyllet, positiv-strandet RNA virus som overføres av mygg og flått. Viktigere, fører flavivirus infeksjon hos mennesker ofte til alvorlig klinisk sykdom, for eksempel hemoragisk feber og encefalitt1. Faktisk en siste utbruddet av Zika viruset (ZIKV), en flavivirus, spredd eksplosivt i hele Amerika og har vist seg å være assosiert med nevrologiske komplikasjoner, inkludert microcephaly2,3. Flaviviruses, har derfor betydelig kliniske og økonomisk innvirkning på moderne samfunn.
En viktig flavivirus er dengue virus (DENV), en mygg-borne virus vidt distribuert i tropiske og subtropiske områder av verden. DENV overføres av Aedes mygg, inkludert Aedes albopictus og Aedes aegypti, noe som resulterer i global spredning av dengue utbrudd4. Foreløpig World Health Organization (WHO) klassifiserer dengue sykdom som tre kategorier: dengue uten varselsignaler, Venezuela varselsignaler og alvorlig dengue4. Selv om primær infeksjon med en av de fire serotypene av DENV (DENV-1-4) er ofte asymptomatisk eller selvbegrensende, har Epidemiologiske studier vist at sekundær infeksjon av ulike serotyper øker risikoen for mer alvorlige former for dengue. Det er verdt å merke seg at antistoff avhengige forbedring av DENV infeksjon forårsaket av ikke - eller subneutralizing antistoffer produsert i primære infeksjonen har blitt foreslått som en potensiell mekanisme av alvorlig dengue som skjedde som sekundær infeksjon. Imidlertid er ingen bestemt antiviral stoffet tilgjengelig for DENV infeksjon5.
For utvikling av antivirale midler mot DENV er rutine og robuste analyser, som er mottakelig for en høy gjennomstrømming innstilling, avgjørende for å oppdage virus replikering kvantitativt. Konvensjonelt, har biologiske metoder (f.eks, plakk analysen) for kvantifisering smittsomme virus og immunologiske analyser (f.eksenzym knyttet immunosorbent analysen [ELISA]) for å oppdage virus antigener blitt brukt til å overvåke DENV replikering i vitro og vivo6,7. Men disse analyser er ofte arbeidskrevende og krever flere dager å fullføre, som hindrer håndtering av store antall prøver. I denne forbindelse RT-qPCR er en pålitelig analysen for å oppdage DENV infeksjon: det er bestemt, følsom og relativt rask7. I tillegg har RT-qPCR teknikken flere fordeler i høy gjennomstrømming format. Likevel krever typisk prosedyren for RT PCR RNA-virus utvinning av viral nukleinsyrer fra innsamlede eksemplene. Selv om ulike metoder for utvinning kan være ansatt for RT-qPCR, er flere trinn fortsatt behov for å få renset viral RNA. Også krever RT-qPCR analyser vanligvis dyrt spinn kolonner eller farlige organiske løsemidler, og dermed gjør forberedelsesprosessen mer tungvint. Siden unngå mishandling og/eller krysskontaminering mellom prøvene er en kritisk faktor for vellykket kvantifiseringen av viral genomer, er en mindre arbeidskrevende og tidkrevende metode foretrukket, spesielt hvis RT-qPCR er på høy gjennomstrømming format.
Her rapporterer vi et enkelt RT-qPCR prosedyre for å måle DENV RNA i en kultur nedbryting av infiserte celler som ikke involverer viral RNA rensing. Denne optimaliserte RT-qPCR protokollen består av to trinn: i) inkubasjonstiden for en nedbryting av DENV-infiserte cellekultur med behandling buffer og ii) ettrinns RT-qPCR på en sanntid PCR-instrument. Følgelig kan DENV RNA i en kultur supernatant oppdages innen 90 min (figur 1). Vi beskriver også bruk av den direkte RT-qPCR til andre RNA virusinfeksjoner.
Protocol
1. forberedelse av malen DNA RNA standard
- Forberede en PCR blanding (totalt volum på 50 μL, tabell 1) med en plasmider DNA vektor som inneholder DENV-2 Ny Guinea C (NGC, tiltredelse nummer: AF038403.1) 3' uoversatt regionen (3' UTR)8 og primere (T7-DENV 3 'UTR Fwd og DENV 3' UTR Rvs) i en 0,2 mL tube, som beskrevet i tabell 2.
Merk: Dette trinnet er gjennomføres under en ren hette (eller i et rent rom) å unngå forurensning av amplicon-relaterte produkter. - PCR-forsterke cDNA av T7 sekvens-smeltet DENV 3' UTR i en thermocycler, med følgende: 30 sykluser (98 ° c for 10 s, 55 ° C for 5 s og 72 ° C for 5 s).
- Bland PCR reaksjon med 10 μL av 6 x gel-lasting fargestoff og belastning på en 1% agarose gel med en DNA molekylær stige varierer fra 0,1 til 10 kilobase par (kbp).
- Visualisere PCR produktet (479 base parene [bp]) under lang-bølgelengde UV lys DNA visualisering metode og en gel tenkelig system. Kuttet ut DNA bandet bruker ren skalpell.
- Ekstra DNA ved hjelp av en DNA rensing kit (Tabell for materiale).
Merk: Dette rensing trinnet kan utføres utenfor ren panseret, men det er viktig å holde et rent miljø under prosessen for å unngå RNase forurensning, som er et stort problem i DENV RNA standard syntese fremgangsmåten.- Veie gel sektoren og tilsett 100 μL av fangst buffer per 100 mg gel sektoren i et 1,5 mL microcentrifuge rør.
- Oppløse gel av inkubasjon på 60 ° C i 5-15 min.
- Montere en DNA rensing kolonne med en samling rør og overføre 600 μL oppløst prøven kolonnen rensing.
- Sentrifuge 16.000 x g for 30 s og kast gjennomflytsenhet. Hvis prøven volumet er større enn 600 μL, gjelder resten av prøven kolonnen DNA rensing etter første spinn og gjenta dette trinnet.
- Bruke 500 μL vaske bufferen til kolonnen DNA rensing.
- Sentrifuger 16.000 x g for 30 s.
- Plass kolonnen i en ny 1,5 mL microcentrifuge tube.
- Tilsett 50 μL av elueringsbufferen og ruge kolonnen ved romtemperatur for 1 min.
- Sentrifuge på maksimumshastigheten for 1 min for elute DNA.
- Måle optisk tetthet DNA på 260 nm på et spektrofotometer bruker 3 μL eluted prøven. Bruk samme volum elueringsrør bufferen som en tom.
Merk: Malen DNA kan lagres på 20 ° C før bruk.
2. syntese av DENV 3 UTR RNA Standard
Merk: Opprettholde ribonuclease (RNase)-miljø som mulig å utføre følgende trinn. Av reagensen som skal utføres i en ren hette, nuclease-fri Pipetter for flergangsbruk, tips og rør.
- Bland i vitro transkripsjon (PES) reaksjon (med et totalvolum på 20 μL) med 100 ng T7 RNA promoter sekvens-smeltet DENV 3 UTR DNA mal (fra trinn 1.6) i et 0,2 mL PCR rør som beskrevet i tabell 3.
- Inkuber blandingen på 37 ° C i thermocycler for 2T.
- Tilsett 1 μL av DNase IVT reaksjonen og fortsette inkubering på 37 ° C i 15 min.
- Rense den i vitro transkribert RNA bruker en RNA rensing kit (Tabell for materiale).
- Legge til 80 μL RNase-fri H2O og 350 μL fangst buffer, inkludert 1% β-mercaptoethanol.
- Tilsett 250 μL av 100% etanol IVT reaksjonen og bland det godt av pipettering.
- Sett sammen en RNA rensing kolonne med en samling rør og overføre RNA prøven til kolonnen rensing.
- Sentrifuge det på 8000 x g for 15 s og kast gjennomflytsenhet.
- 500 μL vaske bufferen gjelder kolonnen RNA rensing og sentrifuge det 8000 x g i 2 minutter.
- Plass kolonnen i en 1,5 mL microcentrifuge tube.
- Tilsett 50 μL av RNase-fri H2O og ruge kolonnen ved romtemperatur for 1 min.
- Sentrifuge det maksimale hastighet for 1 min til elute RNA.
- Måle den optiske densitet for RNA på 260 nm på et spektrofotometer, bruker 3 μL eluted prøven. Bruk samme volum H2O som en tom.
- Fastslå hvor kopien av den syntetiserte DENV 3 UTR. 1 ng av DENV 3 UTR (462 baser, figur 2) sammenlignes 4.05 x 109 kopier.
- Lagre RNA standarden ved-80 ° C før bruk.
3. behandling av Virus eksemplar for RT-qPCR
Merk: Trinn 3.1-3.3 er utføres innenfor en biologiske sikkerhetskabinett kabinett. Spesielt må håndtering av kultur nedbryting som inneholder en smittsom virus være gjennomført under biosikkerhet nivå 2 (eller høyere) miljø.
- Mix 199 μL behandling bufferen og 1 μL nuclease uten proteinasen K.
- Serielt fortynne den syntetiserte DENV 3 UTR RNA (fra trinn 2.6) 1:10 å få 5 x 109 til 5 x 103 Kopier/μL av RNA standard bruker celle kultur medium (f.eksDMEM med 10% fosterets bovin serum og antibiotika [DMEM/10% FBS]) inneholder 40 enheter/mL RNase hemmer.
- Mix 5 μL kultur nedbryting av DENV-infiserte celler og DENV 3 UTR RNA standard med 5 μL behandling buffer/proteinasen K løsning (fra trinn 3.1) 8-tube PCR strimler eller en 96-brønns PCR plate. Som en ikke-mal (NTC), blande 5 μL celle kultur medium (dvs.ingen virus er inkludert) med 5 μL behandling buffer/proteinasen K løsningen.
- Etter en kort sentrifugering, ruge eksemplene i en thermocycler med følgende: 1 syklus (av 25 ° C for 10 min og 75 ° C i 5 min).
Merk: Bearbeidet prøver kan holdes på 4 ° C hvis sanntid PCR analyse er gjort på samme dag. For langtidslagring, skal prøvene lagres på-80 ° C.
4. sanntid PCR analyse
Merk: Det anbefales å utføre trinnene 4.1-4,4 innenfor ren hette å redusere forurensning av amplicon-relaterte produkter eller RNase.
- Forberede en RT-qPCR master blanding med en ettrinns RT PCR reagens (Tabell for materiale) i en 1,5 mL microcentrifuge tube (RNase-ledig) DENV 3' UTR-spesifikke primer og en fluorogenic sonde (tabell 1). Skalere opp volumet av hver komponent (Tabell 4) 11% mer av antall blodprøver, inkludert standard RNA og NTC reaksjonene.
- Aliquot 8 μL master blandingen inn i brønnen skal brukes i en 96-brønns sanntid PCR plate (Tabell for materiale).
- Kort sentrifuge behandlet blodprøver, inkludert DENV 3 UTR RNA standard og NTC (fra trinn 3.4) og tilsett 2 μL av prøvene i hver brønn av 96-brønns sanntid PCR plate.
- Forsegle PCR platen med optisk klar lim.
- Kort sentrifuge platen på 200 x g å fjerne luftbobler.
- Plasser platen i en real-time PCR instrument og bla platen ved hjelp av følgende: 1 syklus av RT scenen (25 ° C i 10 min), 1 syklus av polymerase aktivisering scenen (95 ° C i 2 minutter), 40 sykluser av forsterkning scenen (95 ° C for 10 s og 60 ° C for 30 s [enkelt datainnsamling på dette trinnet]).
- Fastslå hvor kopien av den DENV i prøver benytter en sanntid PCR-tilknyttet programvare.
- I vinduet Oppsett for tilordne av en reaksjon som skal analyseres som Ukjent prøve.
- Tilordne av den serielt utvannet DENV 3 UTR RNA som Standard og skriv forventet kopien antall RNA standarden i hver brønn (f.ekshvis 5 x 103 Kopier/μL av RNA standardløsning brukes, skriver du inn 5000). Tilordne brønnen som Negativ kontroll for NTC.
- I vinduet analyse , klikk på analyser og kontroller at korrelasjonskoeffisienten (R2) av standardkurve generert er lik eller større enn 0,98.
- Vanligvis bruker standardinnstillingene for Ct (terskel: auto, planlagt start syklusen: auto, planlagt slutt syklus: auto) for analyse.
Merk: Antall kopier av Ukjent prøver automatisk beregnes basert på terskelverdier for syklusen (Ct) av personlige reaksjoner. Beregnet kopien antall hvert utvalg anses som RNA eksemplarer per 10 μL RT-qPCR reaksjon (f.eksHvis 12,345 er angitt i en Ukjent prøve, dette betyr at 12,345 eksemplarer av DENV i reaksjonen).
Representative Results
Hvis kvantifisering av DENV av RT-qPCR analyse, en standard antall kjente eksemplaret, som kan bli oppdaget av den samme primeren, er en forutsetning. I denne protokollen, den 462 nukleotid lange RNA som inneholder den 3 'UTR sekvens av DENV-2 NGC belastningen var i vitro transkribert fra T7 RNA promoter-smeltet DENV-2-3' UTR DNA mal, som hadde blitt forsterket av PCR og renset (figur 2A og 2B). Når en seriell 10 ganger fortynning av standard DENV RNA (fra 5 x 109 til 5 x 102 kopier i en 10 μL RT-qPCR reaksjon) ble utsatt for en direkte RT-qPCR analyse med 3 UTR-spesifikke primere og en fluorogenic undersøke9, en lineær kurven med en god korrelasjonskoeffisient (R2 = 0.98726) ble innhentet (figur 2C).
Deretter ble denne direkte RT-qPCR analysen brukt for å kvantifisere DENV i kultur nedbryting av virus-infiserte celler. DENV-2 (Singapore isolere EDEN2 329510), som hadde blitt overført i C6/36 mygg celler og titreres av plakk analysen ved hjelp av BHK-21 celler11, var serielt utvannet (fra 8 x 106 til 80 plakk formasjon enheter [PFU] /mL). DENV prøvene var så behandlet med en lik mengde behandling bufferen som inneholder proteinasen K for å deproteinize virions og utsatt for en direkte RT-qPCR analysen målretting DENV 3' UTR RNA sekvens. Igjen, en god sammenheng (R2 = 0.99981) mellom den DENV smittsomme titer og Ct, en syklus nummer som anses å være punktet der fluorescerende signalet stiger med eksponentiell vekst over bakgrunnen, ble innhentet (figur 3A). Når Ct-verdiene som er generert fra en seriell fortynning av DENV aksjer med kjente smittsomme titers var plottet på standardkurven laget med transkribert i vitro 3' UTR RNA, alle tomter hentes fra 8 x 106 til 80 PFU/mL (lik 8 x 103 8 x 10-2 PFU i en 10 μL RT-qPCR reaksjon) var innen de utsatt for standard RNA (5 x 109 til 5 x 103 kopierer en 10 μL RT-qPCR reaksjon, figur 3B), som angir at DENV prøver med et bredt spekter av smittsomme titers kan analyseres på samme tid, bruker denne direkte RT-qPCR. Parallell eksperimenter, ble effekten av behandlingen buffer eller proteinasen K behandling på deteksjon av viral RNA av RT-qPCR analyse undersøkt. Selv om behandling av en logg fortynning av DENV prøven (8 x 106 til 8 x 102 PFU/mL) med fosfat-bufret saltvann (PBS) alene før RT-qPCR (1:1 fortynning av virus utvalget med PBS) og en inkubasjonstiden for 25 ° C for 10 min og 75 ° C i 5 min vakte en regresjons-kurven (Figur 3 c, svart linje) og de betyr Ct verdiene ved PBS behandling var forsinket 2.6-3.2 sykluser i forhold til Ct ved behandling buffer/proteinasen K behandling (Figur 3 c, prikket linje). I tillegg ble den høyeste fortynning av viruset (8 x 102 PFU/mL [8 x 10-1 PFU per 10 μL RT-qPCR reaksjon]) ikke funnet med denne PBS behandling (Figur 3 c). I fravær av proteinasen K under behandling buffer behandling (Figur 3 c, grå linje), ble en lignende regresjon generert; men forsinkelsen i forsterkning (0,1-0,8 sykluser) var fortsatt observert i forhold til behandling reaksjonen som inneholder proteinasen K (Figur 3 c, prikket linje). Disse data viser at blant forholdene testet, behandling av DENV prøven med behandling buffer med proteinasen K forbedrer sensitiviteten av RT-qPCR analysen.
Direkte RT-qPCR analysen ble ytterligere vurdert for anvendelse sin godkjenning av antivirale midler mot DENV. Mycophenolic syre (MPA), en nonnucleoside hemmer av inosine monofosfat dehydrogenase som brukes som en immunsuppressive i transplantasjon, har blitt rapportert å hemme DENV i vitro12,13. Selv om de tidligere studiene ansatt en konvensjonell plakk analysen eller en flyt cytometri analysen å oppdage viral antigener å demonstrere den hemmende effekten av MPA på DENV infeksjon12,13, i denne studien var direkte RT-qPCR brukt for å evaluere den MPA antiviral aktivitet. HeLa celler, som hadde vært sådd i en tetthet 5 x 104 celler/godt i en 24-vel plate 1 dag før infeksjon, ble utsatt for DENV-2 på en MOI 1 1t og, etter vasking, kultivert med DMEM/10% FBS i nærvær av 50-0.016 μg/mL MPA ( eller 0,1% dimethyl sulfoxide [DMSO]). Kulturen supernatant var samlet 3 dager etter smitte og utsatt for direkte RT-qPCR analysen med DENV 3 UTR bestemt primer og en fluorescerende sonde. Figur 4 viser DENV RNA kopiene (per reaksjon) i kultur supernatants av infiserte celler behandlet med økende konsentrasjoner av MPA, som var bestemt av en i vitro transkribert 3' UTR RNA-standarden. Med en behandling av 50 μg/mL (156 μM) MPA, en reduksjon 99.87 ± 0,02% i DMSO-behandlet kontroll kultur ble observert (Figur 4). Viktigere, IC50 (50% inhibitoriske konsentrasjon) verdien for MPA bestemmes av dataene i Figur 4 var 0,79 μM, som ligner verdiene rapportert tidligere12,13. Dette resultatet, derfor indikerer at denne direkte RT-qPCR-analysen er et nyttig og pålitelig metode for å vurdere den hemmende effekten av antivirale midler på DENV infeksjon.
Til slutt, programmer til direkte RT-qPCR analysen andre RNA-virus ble testet. Når en lager av gulfeber viruset (YFV) 17D vaksine belastning (Flaviviridae), som hadde blitt forsterket i Vero celler og titreres på BHK-21 celler, ble utsatt for direkte RT-qPCR ved hjelp av undersøke YFV-17 D-spesifikk primere og en fluorogenic14, som beskrevet i tabell 1, en standard kurve med god direkte sammenheng mellom virus titers og Ct kan genereres med en 10 ganger føljetong fortynning av virus lager (3.2 x 105 til 3,2 PFU/mL, figur 5A). Likeledes direkte RT-qPCR analyse av Chikungunya virus (CHIKV, Togaviridae) Ross belastning lager, som hadde blitt forsterket i Vero celler og titreres på BHK-21 celler, CHIKV-spesifikke primer og en fluorogenic sonde15 (tabell 1), ga en god regresjon mellom smittsomme titers (4.4 x 108 4.4 x 103 PFU/mL) og Ct verdier (figur 5B). Dette var også tilfellet for påvisning av en seriell fortynning (8 x 102 til 8 x 10-2 PFU/mL, figur 5C) av meslinger viruset (MeV, Paramyxoviridae) som ble overført og titreres med Vero celler, bruker en tidligere rapportert primer og en fluorogenic sonde16 (tabell 1). Disse dataene viser tilpasningsevne direkte RT-qPCR analysen for kvantitative påvisning av ulike RNA-virus.
Figur 1: arbeidsflyten direkte RT-qPCR analysen. Kultur nedbryting av DENV-infiserte celler er behandlet med en behandling buffer inneholder proteinasen K å løslate viral RNA (eksempel behandling trinn). Behandlet prøven deretter blandet med en ettrinns RT PCR reagens og utsatt for sanntids PCR analysen med DENV 3' UTR-spesifikke primer og en fluorogenic sonde. Nivåene av viral RNA oppdaget i de respektive prøvene kan bestemmes av en serielt utvannet standard bruker i vitro transkribert DENV RNA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: en standardkurve generert av DENV 3 UTR RNA. (A) Standard RNA inneholder 3 UTR av DENV-2 NGC ble transkribert i vitro fra et T7 RNA promoter sekvens-smeltet PCR fragment. (B) Purified DENV 3 UTR RNA (250 ng) var visualisert på en 1% agarose gel (høyre felt). Venstre veibane viser molekylvekt merket RNA geleelektroforese. (C) en logg fortynning av DENV 3 'UTR RNA-standarden ble behandlet med behandling bufferen som inneholder proteinasen K og utsatt for en sanntid PCR analyse ved hjelp av en ettrinns RT-qPCR reagens og DENV 3' UTR-spesifikke primerne og en fluorogenic sonde. Betyr Ct verdiene (n = 3) innhentet i respektive fortynninger var plottet mot det estimerte antallet av 3 UTR RNA (5 x 109 til 5 x 102 RNA kopierer en 10 μL RT-qPCR reaksjon). R2 er korrelasjonskoeffisienten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: kvantifisering av DENV på virus lager av direkte RT-qPCR. (A) i høy-titer DENV-2 lager produsert i C6/36 celler var serielt fortynnet 10-fold (8 x 106 til 8 x 101 PFU/mL) med DMEM/10% FBS inneholder en RNase hemmer og utsatt for direkte RT-qPCR analysen med DENV 3' UTR-spesifikke primere /probe. (B) Ct verdier skaffet RT-qPCR Logg-utvannet DENV aksjer (sirkler) var plottet på en standard kurve av de 3 UTR RNA (trekanter) transkribert i vitro. Bruk av 8 x 106 PFU/mL aksjer i en direkte RT-qPCR analysen tilsvarer 8 x 103 PFU av virus i en 10 μL RT-qPCR reaksjon. (C) dette panelet viser effekten av bufferen og proteinasen K behandlinger på deteksjon av viral RNA. DENV utvannet aksje (8 x 106 til 8 x 102 PFU/mL) ble inkubert med en lik mengde behandling bufferen som inneholder proteinasen K (hvite sirkler), behandling buffer alene (grå sirkler) eller PBS (svart sirkler) og deretter utsatt for direkte RT-qPCR analysen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: evaluering av den hemmende effekten av MPA av direkte RT-qPCR. HeLa celler ble infisert med DENV-2 på en MOI 1 og kultivert i nærvær av økende konsentrasjoner av MPA, en tidligere rapportert hemmer DENV (eller 0,1% DMSO). Tre dager etter smitte, var kultur supernatants av infiserte celler samlet og utsatt for direkte RT-qPCR analysen med DENV 3' UTR-spesifikke primere/sonde. Kopien antall viral RNA ble bestemt av DENV 3' UTR RNA standard transkribert i vitro. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: bruk av direkte RT-qPCR for påvisning av andre RNA-virus. Serielt utvannet virus aksjer (A) YFV, (B) CHIKV og (C) MeV ble utsatt for direkte RT-qPCR analysen bruker PCR primere og fluorogenic sonder gjelder for de respektive viral RNA sekvensene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Formål | navn | Sekvens (5 - 3') | Merk |
| T7 formidler-smeltet DENV-2-3'UTR cDNA forsterkning | T7-DENV 3 UTR Fwd | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGc gaa tTA GAA GGC AAA ACT AAC ATG AAA | Kursiv, T7 selskapet; små, spacer; fet, DENV-2 NGC nukleotider 10,270-10,292 |
| DENV 3 UTR Rvs | AGA ACC TGT TGA TTC AAC AGC | DENV-2 NGC nukleotider 10,723-10,703 | |
| RT-qPCR analyse av DENV | DENV-2 3' UTR F | AAG GAC TAG AGG TTA VITS VITS ACC C | Referanse 9 |
| DENV-2 3' UTR R | GGC GTT CTG TGC CTG GAA TGA VS | ||
| Sonden 2 Den-2-4 | 6FAM-AAC AGC ATA TTG ACG CTG GGA AAG ACC-TAMRA | ||
| RT-qPCR analyse av YFV | YFV NS5 F | GAA CAG TGA TCA GGA ACC CTC TCT | Referanse 14 |
| YFV NS5 R | GGA TGT TTG GTT CAC AGT AAA TGT G | ||
| YFV NS5 Probe | 6FAM-CTA CGT GTC TGG AGC CCG CAG CAA T-TAMRA | ||
| RT-qPCR analyse av CHIKV | CHIK E1 F | TCG ACG CGC CCT CTT TAA | Referanse 15 |
| CHIK E1 R | ATC GAA TGC ACC GCA CAC T | ||
| CHIK E1 P | 6FAM-ACC AGC CTG CAC CCA TTC CTC AGA C-TAMRA | ||
| RT-qPCR analyse av MeV | MeV N F | TGG KATTEN CTG AAC TCG GTA TCA C | Referanse 16 |
| MeV N R | TGT CCT CAG TAG TAT GCA TTG CAA | ||
| MeV N P | 6FAM-CCG AGG ATG CAA GGC TTG TTT CAG A-TAMRA |
Tabell 1: Oligonucleotide primer og fluorogenic sonde sekvenser brukt i denne studien.
| Komponenter | Lager konsentrasjon | Volum (μL) | Siste konsentrasjon |
| PrimeSTAR Max Premix | 2 x | 25 | 1 x |
| T7-DENV 3 UTR Fwd | 1 ΜM | 10 | 200 nM |
| DENV 3 UTR Rvs | 1 ΜM | 10 | 200 nM |
| pEU/DENV 3' UTR | 1 ng/μL | 1 | 20 pg/μL |
| Nuclease-gratis H2O | 4 | ||
| Totalt | 50 |
Tabell 2: Komponenter i et PCR blanding forberedelse til DENV 3 UTR mal DNA.
| Komponenter | Lager konsentrasjon | Volum (μL) | Siste konsentrasjon |
| T7 rekkefølge-smeltet DENV 3 UTR DNA mal | (variabel) | x | 100 ng per reaksjon |
| ATP løsning | 75 mM | 2 | 7.5 mM |
| CTP løsning | 75 mM | 2 | 7.5 mM |
| GTP løsning | 75 mM | 2 | 7.5 mM |
| UTP løsning | 75 mM | 2 | 7.5 mM |
| Reaksjon Buffer | 10 x | 2 | 1 x |
| T7 Enzym Mix | 2 | ||
| Rekombinant RNase hemmer | 40 enheter/μL | 1 | 2 enheter/μL |
| Nuclease-gratis H2O | 7 - x | ||
| Totalt | 20 |
Tabell 3: Komponentene i en IVT blanding for å syntetisere DENV 3 UTR RNA standarden.
| Komponenter | Lager konsentrasjon | Volum (μL) | Siste konsentrasjon i en RT-qPCR-reaksjon |
| iTaq universell sonder reaksjonen blanding | 2 x | 5.00 | 1 x |
| iScript avansert revers transkriptase | 40 x | 0,25 | 100 ng per reaksjon |
| Primer/sonde blanding | DENV-2 3' UTR F: 3 ΜM | 1.00 | 300 nM |
| DENV-2 3' UTR R: 3 ΜM | 300 nM | ||
| Sonden 2 Den-2-4: 2 μM | 200 nM | ||
| Nuclease-gratis H2O | 1.75 | ||
| Delsum | 8.00 |
Tabell 4: komponenter av en master blanding for sanntids RT-qPCR analyse av DENV. Merk at 2 μL av behandlet DENV eksempel (eller standard RNA) bør legges til 8-μL master mix (totalt 10 μL per reaksjon).
Discussion
I dag, blir viral nukleinsyre gjenkjenning av fluorescerende-baserte sanntid PCR en gull-standard for molekylær diagnostisering av patogene menneskelig virus, på grunn av sin følsomhet og hurtighet7. Dette er spesielt viktig for bekrefter virusinfeksjon i den tidlige fasen av akutt smittsomme sykdommer som denguefeber17. Også innen grunnforskning DNEV er RT-qPCR analysen et uunnværlig verktøy for overvåking virus replikering i i vitro kultur, som vil føre til en forståelse av replikering biologi av DENV og oppdagelsen av antivirale hemmere. I denne studien ble fluorescerende-baserte sanntid PCR analysen videreutviklet av en kombinasjon av en behandling buffer og en ettrinns RT PCR reagens slik at DENV RNA i kultur nedbryting av infiserte celler kunne kvantifiseres av RT-qPCR uten rensing viral RNA genomet. Sammenlignet med rutinemessig analyser å oppdage virus replikering, som plakk analysen, ELISA eller konvensjonelle RT-qPCR ansette RNA rensing6,7, forenklet protokollen RT-qPCR analysen resulterte i en stor reduksjon av tiden og trinnene som er nødvendig å kvantifisere DENV RNA. Dette er også en viktig funksjon som har fordeler i å redusere forurensning og tap av genetisk materiale. Det bør imidlertid bemerkes at bruk av en ren hette er avgjørende i oppsett av IVT (trinn 2.1) og RT-qPCR (trinn 4.1-4.4) reaksjoner å unngå kryss-kontaminering av amplicon-relaterte produkter eller RNase. Det er også avgjørende for å håndtere kulturen supernatant, inkludert smittsomme virus, inne en biosafety kabinett (trinn 3.3) å redusere fare for laboratoriet infeksjon.
En annen betydningen av direkte RT-qPCR analysen er at en rekke viral RNA kopier kan analyseres samtidig uten fortynning eller konsentrasjon av prøven. Når en serielt utvannet DENV 3 UTR RNA standard ble brukt, direkte RT-qPCR protokollen produsert en lineær standardkurve syv størrelsesordener, og den nedre grensen for kvantifisering var 500 RNA eksemplarer (figur 2). For deteksjon av DENV i kultur nedbryting av infiserte celler, 8 x 103 til 8 x 10-2 PFU virus i en 10 μL RT-qPCR var innen rekkevidde av DENV 3 UTR RNA standarden, og den nedre grensen for påvisning (8 x 10-2 PFU) ble beregnet inneholder 11 , 400 ± 7,077 RNA kopier (figur 3B). Av notatet, som rapportert i flere flavivirus studier18,19,20, ble større forholdet mellom viral RNA kopi av virus smittsomme titer (dvs., PFU) i DENV prøver også observert i denne studien. Denne overvurdering antas for å være hovedsakelig på grunn av defekt (dvs.ikke-smittsomme) virus eller gratis viral RNA løslatt fra infiserte og døde celler. Selv om forholdet mellom RNA Kopier: PFU innhentet i denne studien (1.1 x 105 til 1,3 x 105 RNA Kopier/PFU) var inkonsekvent med dataene vist tidligere (prosenter varierer fra 1 til 3 logg)21,20, kan dette være tilskrevet forskjellen i viruset stammer, celler eller oppdrettsforholdene ansatt. En annen sannsynlig forklaring for avviket er at siden ingen RNA renselsesprosess var involvert i direkte RT-qPCR analysen beskrevet her, kan flere DENV RNA i kultur nedbryting registreres i sanntid PCR analyse uten tap av viral genetisk materiale.
Enkelheten av den direkte RT-qPCR forbedrer evnen til å håndtere et stort antall prøver i flere godt formater, for eksempel en 96-brønns plate. Derfor vil denne egenskapen hjelpe fremtidige anvendelsen av direkte RT-qPCR analysen til en høy gjennomstrømming screening-undersøkelse for å anti-DENV narkotika. Faktisk, i denne rapporten, bruk av direkte RT-qPCR analysen for å validere en anti-DENV hemmer, MPA, ble undersøkt, og resultatet viste at en IC50 verdien av MPA ved direkte RT-qPCR analysen (Figur 4) var sammenlignes rapportert i tidligere studier med plakett analysen12,13. Dette viser at direkte RT-qPCR er en nyttig analysen for riktig vurderer den hemmende effekten av antivirale midler og kan adoptert i en narkotikarelaterte screening studie i fremtiden.
I denne studien ble det gjort forsøk å bruke den direkte RT-qPCR gjenkjenning av andre RNA-virus. Som vist i figur 5, når 10 ganger fortynninger av tre andre RNA virus (YFV, CHIKV og MeV) klassifisert i ulike genera (Flaviviridae, Togaviridaeog Paramyxoviridae, henholdsvis) ble undersøkt ved hjelp av tidligere sonder rapporterte primere og fluorogenic gjelder for de respektive viral RNA sekvensene. God sammenhenger mellom smittsomme titers og Ct ble oppnådd ved direkte RT-qPCR analyser, og sammenhenger var 4-6 lineær størrelsesordener. Dette tyder på at direkte RT-qPCR protokollen er tilpasningsdyktig til ulike typer RNA-virus ved å endre virus-spesifikke primerne og fluorogenic sonder.
Likevel følsomheten av variert blant virus testet i denne studien (figur 5). En endring av protokollen som kan forbedre gjenkjenning av målet virus RNA skal bruke et nytt sett med primer/sonde sekvenser. I tillegg er et viktig skritt for vellykket direkte RT-qPCR analysen antatt å være effektiv utgivelsen av viral genomet under prøven behandlingstrinn (trinn 3.1-3.4). Dette vil være spesielt viktig for kvantitative påvisning av stabil virus som et ikke-innhyllet virus. Selv som en innledende forsøket, Coxsackievirus B3 (CVB3), et ikke-innhyllet RNA-virus tilhører Picornaviridae, ble utsatt for direkte RT-qPCR analysen med tidligere beskrevet CVB3-spesifikke primere og fluorescerende sonde22, en positiv amplicon signalet ikke kunne avklares selv med en høy-titer (1 x 105 PFU/mL) virus lager. Dette anses å være i stor grad tilskrives høy fysiske integriteten til ikke-innhyllet virus. Så langt, noen RT PCR analyser som ikke krever rensing av nukleinsyre er utviklet for å oppdage flere RNA-virus, som benytter ulike protokoller i RNA utgivelsen trinn23,24,25, 26. dermed bruk av de alternative (eller flere) behandlingene, for eksempel en inkubasjonstiden for et virus utvalg ved høy temperatur, potensielt øker følsomheten til gjenkjenning.
Oppsummert var direkte RT-qPCR protokollen utviklet i denne studien en enkel og rask, men pålitelig metode for kvantifisere viral RNA i en kultur nedbryting av infiserte celler. På grunn av denne enkelhet, kan direkte RT-qPCR analysen behandle en rekke prøver på kort tid, som holder løftet for høy gjennomstrømming analyse av virus replikering. Videre ble bruk av direkte RT-qPCR protokollen til andre RNA-virus også demonstrert. Denne tilnærmingen bør derfor være et nyttig verktøy for effektiv overvåking RNA-virusinfeksjoner i forskning laboratorium omgivelser og, muligens i klinisk diagnoser.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Subhash G. Vasudevan (Duke-NUS utdannet Medical School, Singapore) for den DENV-2 isolere EDEN2 3295 og Shunro Imura (Kobe karantene Station, Japan) for YFV 17D vaksine belastning. Forfatterne er også takknemlige til instituttet for mikrobiologi og infeksjonskontroll medlemmer for deres hjelp. Dette arbeidet er støttet av MEXT KAKENHI Grant nummer JP16737900.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PrimeSTAR Max DNA Polymerase | Takara Bio. Inc | R045A | Comparable PCR reagent kit can be used. |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | Comparable thermal cycler instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
| 6x Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7024S | Comparable gel loading dye can be used. |
| 2-Log DNA Ladder | New England BioLabs | N3200 | 0.1-10.0 kilobase pairs. Comparable DNA molecular ladder can be used. |
| Gel Scene Tablet | Astec | GST-33 | Comparable gel imaging system can be used. |
| illustra GFX PCR Purification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 28-9034-70 | Comparable gel extraction kit can be used. |
| BioSpectrometer | Eppendorf | 6135000905 | Comparable spectrophotometer can be used. |
| MEGAscrip T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1334 | |
| TURBO DNase | Thermo Fisher Scientific | AM2238 | Included in MEGAscrip T7 Transcription Kit. |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio. Inc | 2313A | 40 units/μL |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Comparable RNA purification kit can be used. |
| CellAmp Direct RNA Prep Kit | Takara Bio. Inc | 3733Q | |
| Proteinase K | Nacalai Tesque | 15679-06 | >600 units/mL. Comparable reagent can be used. |
| iTaq Universal Probes One-Step Kit | Bio-Rad | 1725141 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | Comparable plate or tube can be used dependent on the real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Comparable film or optical cap can be used dependent on the real-time PCR plate or tube. |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | StepOnePlus-01 | Comparable real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
References
- Pastorino, B., Nougairede, A., Wurtz, N., Gould, E., de Lamballerie, X. Role of host cell factors in flavivirus infection: Implications for pathogenesis and development of antiviral drugs. Antiviral Research. 87 (3), 281-294 (2010).
- Fauci, A. S., Morens, D. M. Zika Virus in the Americas--Yet Another Arbovirus Threat. New England Journal of Medicine. 374 (7), 601-604 (2016).
- Wen, Z., Song, H., Ming, G. L. How does Zika virus cause microcephaly? Genes and Development. 31 (9), 849-861 (2017).
- Guzman, M. G., Harris, E. Dengue. Lancet. 385 (9966), 453-465 (2015).
- Low, J. G., Ooi, E. E., Vasudevan, S. G. Current Status of Dengue Therapeutics Research and Development. Journal of Infectious Diseases. 215 (suppl_2), S96-S102 (2017).
- Sukhavachana, P., Nisalak, A., Halstead, S. B. Tissue culture techniques for the study of dengue viruses. Bulletin of the World Health Organization. 35 (1), 65-66 (1966).
- Tang, K. F., Ooi, E. E.
- Suzuki, Y., et al. Characterization of RyDEN (C19orf66) as an Interferon-Stimulated Cellular Inhibitor against Dengue Virus Replication. PLoS Pathogens. 12 (1), e1005357 (2016).
- Callahan, J. D., et al. Development and evaluation of serotype- and group-specific fluorogenic reverse transcriptase PCR (TaqMan) assays for dengue virus. Journal of Clinical Microbiology. 39 (11), 4119-4124 (2001).
- Low, J. G., et al. Early Dengue infection and outcome study (EDEN) - study design and preliminary findings. Annals of the Academy of Medicine, Singapore. 35 (11), 783-789 (2006).
- Hishiki, T., et al. Interferon-mediated ISG15 conjugation restricts dengue virus 2 replication. Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 95-100 (2014).
- Diamond, M. S., Zachariah, M., Harris, E. Mycophenolic acid inhibits dengue virus infection by preventing replication of viral RNA. Virology. 304 (2), 211-221 (2002).
- Takhampunya, R., Ubol, S., Houng, H. S., Cameron, C. E., Padmanabhan, R. Inhibition of dengue virus replication by mycophenolic acid and ribavirin. Journal of General Virology. 87 (Pt 7), 1947-1952 (2006).
- Akondy, R. S., et al. Initial viral load determines the magnitude of the human CD8 T cell response to yellow fever vaccination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (10), 3050-3055 (2015).
- Edwards, C. J., et al. Molecular diagnosis and analysis of Chikungunya virus. Journal of Clinical Virology. 39 (4), 271-275 (2007).
- Hummel, K. B., Lowe, L., Bellini, W. J., Rota, P. A. Development of quantitative gene-specific real-time RT-PCR assays for the detection of measles virus in clinical specimens. Journal of Virological Methods. 132 (1-2), 166-173 (2006).
- Peeling, R. W., et al.
- Bae, H. G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay. Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).
- Colton, L., Biggerstaff, B. J., Johnson, A., Nasci, R. S. Quantification of West Nile virus in vector mosquito saliva. Journal of the American Mosquito Control Association. 21 (1), 49-53 (2005).
- Richardson, J., Molina-Cruz, A., Salazar, M. I., Black, W. 4th Quantitative analysis of dengue-2 virus RNA during the extrinsic incubation period in individual Aedes aegypti. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 74 (1), 132-141 (2006).
- Wang, W. K., et al. Detection of dengue virus replication in peripheral blood mononuclear cells from dengue virus type 2-infected patients by a reverse transcription-real-time PCR assay. Journal of Clinical Microbiology. 40 (12), 4472-4478 (2002).
- Gnadig, N. F., et al. Coxsackievirus B3 mutator strains are attenuated in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), E2294-E2303 (2012).
- Rudenko, N., Golovchenko, M., Cihlarova, V., Grubhoffer, L. Tick-borne encephalitis virus-specific RT-PCR--a rapid test for detection of the pathogen without viral RNA purification. Acta Virologica. 48 (3), 167-171 (2004).
- Pastorino, B., et al. Development of a TaqMan RT-PCR assay without RNA extraction step for the detection and quantification of African Chikungunya viruses. Journal of Virological Methods. 124 (1-2), 65-71 (2005).
- Nishimura, N., et al. Detection of noroviruses in fecal specimens by direct RT-PCR without RNA purification. Journal of Virological Methods. 163 (2), 282-286 (2010).
- Kang, K., et al. A direct real-time polymerase chain reaction assay for rapid high-throughput detection of highly pathogenic North American porcine reproductive and respiratory syndrome virus in China without RNA purification. Journal of Animal Science and Biotechnology. 5 (1), 45 (2014).
