Summary
Análise de reação em cadeia de polimerase quantitativo em tempo real combinada com transcrição reversa (RT-qPCR) tem sido amplamente utilizada para medir o nível de infecções por vírus de RNA. Aqui nós apresentamos um ensaio de RT-qPCR direto, que não requer uma etapa de purificação de RNA, desenvolvida para a quantificação de vários vírus de RNA, incluindo o vírus da dengue.
Abstract
Actualmente, a tecnologia de reação em cadeia (PCR) em tempo real do polymerase é uma ferramenta indispensável para a detecção e quantificação de genomas virais em laboratórios de pesquisa, bem como para o diagnóstico molecular, por causa da sua sensibilidade, especificidade, e loja de conveniência. No entanto, na maioria dos casos, o ensaio quantitativo de PCR (qPCR) geralmente usado para detectar a infecção pelo vírus tem contado com a purificação do ácido nucleico viral antes da etapa PCR. Neste estudo, o ensaio de qPCR (RT-qPCR) transcrição reversa baseada em fluorescência é desenvolvido através da combinação de um buffer de processamento e um reagente de RT-PCR de uma etapa para que todo esse processo, desde a colheita do sobrenadante de cultura de infectados por vírus células até a detecção em tempo real, podem ser executadas sem purificação de RNA viral. O protocolo estabelecido permite a quantificação de uma concentração de ampla gama de RNA do vírus da dengue (DENV) dentro de 90 min. Além disso, a capacidade de adaptação do ensaio RT-qPCR direto para a avaliação de um agente antiviral é demonstrada por um experimento em vitro usando um inibidor DENV relatado anteriormente, ácido micofenólico (MPA). Além disso, outros vírus RNA, incluindo o vírus da febre amarela (YFV), vírus Chikungunya (CHIKV) e vírus do sarampo (MeV), podem ser quantificados por RT-qPCR direto com o mesmo protocolo. Portanto, o ensaio de RT-qPCR direto descrito neste relatório é útil para monitorar a replicação de vírus de RNA de forma simples e rápida, que será desenvolvida em uma plataforma promissora para um estudo de seleção da elevado-produção e diagnóstico clínico.
Introduction
O género Flavivirus da família Flaviviridae é composto por mais de 70 envelopado, positivo-stranded vírus de RNA que são transmitidas por mosquitos e carrapatos. Importante, flavivirus infecção nos seres humanos, muitas vezes leva à doença clínica grave, tais como a de febre e encefalite hemorrágica1. Com efeito, um recente surto do vírus Zika (ZIKV), um flavivirus, espalhou-se explosivamente nas Américas e foi mostrado para ser associado com complicações neurológicas, incluindo microcefalia2,3. Flavivírus, portanto, tem impacto clínico e econômico significativo na sociedade moderna.
Um importante flavivirus é o vírus da dengue (DENV), um vírus transmitidas por mosquitos, amplamente distribuído nas áreas tropicais e subtropicais do mundo. DENV é transmitida por mosquitos Aedes , incluindo o Aedes albopictus e Aedes aegypti, resultando na propagação global de focos de dengue4. Atualmente, a Organização Mundial de saúde (OMS) classifica a doença da dengue como três categorias: dengue, sem sinais de alerta, dengue com sinais de alerta e graves da dengue4. Embora a infecção primária dentre os quatro sorotipos de DENV (DENV-1 a -4) é frequentemente assintomática ou auto-limitada, estudos epidemiológicos têm demonstrado que a infecção secundária dos diferentes sorotipos aumenta o risco das formas mais graves de dengue. É interessante notar essa melhoria de anticorpo-dependente de infecção DENV causada por não - ou subneutralizing de anticorpos produzidos durante a infecção primária tem sido proposto como um mecanismo potencial da dengue grave que ocorreu como a infecção secundária. No entanto, nenhuma droga antiviral específica está disponível para DENV infecção5.
Para o desenvolvimento de antivirais contra DENV, rotina e ensaios robustos, que são favoráveis a uma configuração de alta produtividade, são essenciais para a detecção de replicação de vírus quantitativamente. Convencionalmente, ensaios biológicos (por exemplo, ensaio de placa) para quantificar o vírus infecciosos e testes imunológicos (por exemplo, ensaio enzima-lig da imunoabsorção [ELISA]) para a detecção de antígenos virais têm sido utilizados para monitorar DENV a replicação in vitro e in vivo6,7. No entanto, estes ensaios são muitas vezes trabalhosos e exigem vários dias de se realizar, que impede a manipulação de um grande número de amostras. Nesse sentido, RT-qPCR é um ensaio confiável para detectar infecção DENV: é relativamente rápida, sensível e específica7. Além disso, a técnica de RT-qPCR tem mais vantagens em um formato de alta produtividade. No entanto, o procedimento típico de RT-PCR para vírus RNA exige a recuperação de viral de ácidos nucleicos de amostras coletadas. Apesar de vários métodos de extração podem ser empregados para RT-qPCR, várias etapas são ainda necessárias para obter RNA viral purificado. Também, ensaios de RT-qPCR normalmente requerem colunas caro rotação ou solventes orgânicos perigosos, tornando o processo de preparação mais complicado. Desde que, evitando o manuseio incorreto e/ou contaminação cruzada entre amostras é um fator crítico para o sucesso quantificação dos genomas virais, um método menos trabalhoso e demorado é o preferido, particularmente se o RT-qPCR deve ser aplicada aos formato de alta produtividade.
Aqui, nós relatamos um simples procedimento de RT-qPCR para medir DENV RNA em um sobrenadante de cultura de células infectadas que não envolve purificação de RNA viral. Este protocolo de RT-qPCR otimizado é composto de duas etapas: i) a incubação de um sobrenadante de cultura de células infectadas DENV com um buffer de processamento e uma etapa ii) RT-qPCR num instrumento de PCR em tempo real. Por conseguinte, DENV RNA em uma sobrenadante de cultura pode ser detectado no prazo de 90 min (Figura 1). Também descrevemos a aplicação do RT-qPCR direto para outras infecções por vírus de RNA.
Protocol
1. preparação do modelo de DNA de RNA Standard
- Preparar uma mistura de PCR (volume total de 50 μL, tabela 1) usando um plasmídeo vetor contendo DENV-2 Nova Guiné C (NGC, número de adesão: AF038403.1) primers e 3' não região (3' UTR)8 (T7-DENV 3 'UTR Fwd e DENV 3' UTR Rvs) em um tubo de 0,2 mL, como descrito na tabela 2.
Nota: Este passo está a ser conduzida sob um capô limpo (ou em uma sala limpa) para evitar a contaminação dos produtos relacionados com amplicons. - PCR-amplificação do cDNA de T7 sequência-fundido DENV 3' UTR em um thermocycler, usando as seguintes condições: 30 ciclos (de 98 ° C, durante 10 s, 55 ° C por 5 s e 72 ° C por 5 s).
- Misture a reação de PCR com 10 μL de 6 x tintura gel de carregamento e carga-um agarose 1% gel com uma escada de DNA molecular que variam de 0,1 a 10 mil pares (kbp).
- Visualize o produto do PCR (479 pares de bases [bp]) sob a luz UV de comprimento de onda longo usando um método de visualização de DNA e um sistema de imagem de gel. Corte a banda de DNA usando um bisturi limpo.
- Extrair DNA usando um kit de purificação de DNA (Tabela de materiais).
Nota: Este passo de purificação pode ser executado fora do capô limpo, mas é essencial para manter um ambiente limpo durante o processo para evitar a contaminação de RNase, que é um grande problema nas etapas seguintes DENV RNA síntese padrão.- Pesar o gel-slice e adicionar 100 μL de tampão de captura por 100 mg de gel de fatia em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
- Dissolva o gel por incubação a 60 ° C, durante 5 a 15 min.
- Montar uma coluna de purificação de DNA com um tubo de coleta e transferência de 600 μL da amostra dissolvida à coluna de purificação.
- Centrifugar a 16.000 x g por 30 s e descarte o escoamento. Se o volume da amostra for maior que 600 μL, aplique o resto da amostra para a coluna de purificação de DNA após a primeira rodada e repita este passo.
- Aplique 500 μL de tampão à coluna de purificação de DNA de lavagem.
- Centrifugar a 16.000 x g por 30 s.
- Coloque a coluna para um novo tubo de microcentrifuga de 1,5 mL.
- Adicionar 50 μL de tampão de eluição e incubar a coluna à temperatura ambiente durante 1 min.
- Centrifugar a velocidade máxima durante 1 min Eluir o DNA.
- Medir a densidade óptica de DNA em 260 nm em um espectrofotômetro usando 3 μL da amostra eluted. Use o mesmo volume de tampão de eluição como um espaço em branco.
Nota: O modelo de DNA pode ser armazenado a-20 º C até o uso.
2. síntese do DENV 3' UTR RNA Standard
Nota: Manter a ribonuclease (RNase)-ambiente livre tanto quanto possível para executar as seguintes etapas. A afinação do reagente deve ser realizada dentro de uma capa limpa, usando tubos, dicas e pipetas de nuclease-livre.
- Misture a reação em vitro transcrição (IVT) (de um volume total de 20 μL) com 100 ng de T7 RNA promotor sequência-fundido DENV 3' UTR DNA modelo (da etapa 1.6) em um tubo PCR de 0,2 mL conforme descrito na tabela 3.
- Incube a mistura a 37 ° C no thermocycler por 2 h.
- Adicionar 1 μL de DNase para a reação de IVT e continuar a incubação a 37 ° C por 15 min.
- Purificar o em vitro transcrito de RNA usando um kit de purificação de RNA (Tabela de materiais).
- Adicione 80 μL de livre de RNase H2O e 350 µ l de buffer de captura, incluindo 1% β-Mercaptoetanol.
- Adicionar 250 μL de etanol 100% para a reação de IVT e misture bem por pipetagem.
- Montar uma coluna de purificação de RNA com um tubo de coleta e transferir a amostra de RNA para a coluna de purificação.
- Centrifugar-a 8.000 x g durante 15 s e descarte o escoamento.
- Aplicam-se à coluna de purificação de RNA 500 μL de tampão de lavagem e centrifugue a 8.000 x g por 2 min.
- Coloca a coluna em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
- Adicionar 50 μL de livre de RNase H2O e incubar a coluna à temperatura ambiente durante 1 min.
- -Centrifugar a velocidade máxima durante 1 min Eluir o RNA.
- Medir a densidade óptica do RNA em 260 nm em um espectrofotômetro, utilizando 3 μL da amostra eluted. Use o mesmo volume de H2O como um espaço em branco.
- Determine o número de cópia do sintetizado DENV 3' UTR RNA. 1 ng do DENV 3' UTR RNA (462 bases, Figura 2) é comparável a 4,05 x 109 cópias.
- Armazene o padrão de RNA a-80 ° C até o uso.
3. processamento de amostras de vírus para RT-qPCR
Nota: Passos 3.1 – 3.3 devem ser executadas dentro de uma câmara de segurança biológica. Em particular, manipulação do sobrenadante de cultura contendo um vírus infeccioso deve ser conduzida sob o ambiente de nível 2 (ou superior) de biossegurança.
- ΜL de mistura 199 de um buffer de processamento e 1 μL de nuclease livre proteinase K.
- Serialmente diluir o sintetizado DENV 3' UTR do RNA (da etapa 2.6) 01:10 para obter 5 x 109 para 5 x 103 cópias/μL de RNA usando padrão (por exemplo, DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino e antibióticos [DMEM/10% FBS]) o meio de cultura de células contendo inibidor de RNase 40 unidades/mL.
- Misturar 5 μL do sobrenadante de cultura de células infectadas DENV e norma DENV 3' UTR RNA com 5 μL de solução tampão/proteinase K (da etapa 3.1) de processamento usando tiras PCR 8-tubo ou um prato PCR de 96 poços. Como um controle de não-modelo (NTC), misturar 5 μL de meio de cultura celular (ou seja, nenhum vírus é incluído) com 5 μL de solução de tampão/proteinase K o processamento.
- Após uma breve centrifugação, incubar as amostras em um thermocycler usando as seguintes condições: 1 ciclo (de 25 ° C por 10 min e 75 ° C por 5 min).
Nota: Amostras processadas podem ser mantidas a 4 ° C se a análise PCR em tempo real é feita no mesmo dia. Para armazenamento a longo prazo, as amostras devem ser armazenadas a-80 ° C.
4. análise PCR em tempo real
Nota: É altamente recomendável executar etapas 4.1 – 4.4 dentro de um capô limpo para minimizar a contaminação de produtos relacionados com amplicons ou RNase.
- Preparar uma mistura de RT-qPCR mestre com um reagente de RT-PCR de One-Step (Tabela de materiais) em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL (RNase-livre) usando DENV 3' UTR específicos primers e uma sonda fluorogenic (tabelas 1). Aumenta o volume de cada componente (tabela 4), de acordo com mais 11% do número total de amostras, incluindo as reações de RNA e NTC padrão.
- Alíquota 8 μL da mistura mestre dentro do poço para ser usado em uma placa PCR de 96 poços em tempo real (Tabela de materiais).
- Brevemente, Centrifugar as amostras processadas, incluindo o padrão de DENV 3' UTR RNA e NTC (da etapa 3.4) e adicione 2 μL das amostras a cada poço da placa PCR de 96 poços em tempo real.
- A placa PCR com película adesiva opticamente clara do selo.
- Brevemente, centrifugar a placa a 200 x g para remover as bolhas de ar.
- Colocar a placa em um instrumento PCR em tempo real e ciclo a placa usando as seguintes condições: 1 ciclo do RT (25 ° C por 10 min), fase 1 ciclo da fase de ativação do polymerase (95 ° C por 2 min), 40 ciclos da fase de amplificação (95 ° C por 10 s e 60 ° C por 30 s [única aquisição de dados nesta etapa]).
- Determine o número de cópia do RNA DENV em amostras usando um software associada a PCR em tempo real.
- Na janela de configuração , atribua o poço de uma reação que deve ser analisado como amostra desconhecida .
- Atribuir o poço do serialmente diluída DENV 3' UTR RNA como padrão e digite o número esperado de cópia do padrão de RNA em cada poço (por exemplo, se 5 x 103 cópias/μL de solução padrão de RNA é utilizado, digite 5.000). Atribua o bem como Controlo negativo para NTC.
- Na janela de análise , clique em Analyze e certifique-se que o coeficiente de correlação (R2) da curva padrão gerado é equivalente ou superior a 0,98.
- Em geral, utilizar as predefinições de Ct (limiar: auto, ciclo começar a linha de base: auto, ciclo de fim de linha de base: auto) para análise.
Nota: O número de cópia das amostras desconhecidas é automaticamente calculado com base nos valores de ciclo (TC) limiar das reações individuais. O número de cópia calculado de cada amostra é considerado como cópias de RNA por 10 reação de RT-qPCR μL (por exemplo, se 12.345 é indicado em uma amostra desconhecida , isto significa que 12.345 cópias de RNA DENV estão presentes em a reação).
Representative Results
Para a quantificação do RNA do DENV por análise de RT-qPCR, um padrão do número de cópia conhecida, que pode ser detectado pelo primer mesmo conjunto, é um pré-requisito. Neste protocolo, a 462 RNA nucleotídeos de comprimento contendo os 3'UTR sequência da estirpe DENV-2 NGC era em vitro transcrito de RNA T7 promotor-fundidos DENV-2 3' UTR ADN molde, que tinha sido amplificado por PCR e purificado (Figura 2A e 2B). quando uma diluição de 10 vezes serial da norma DENV RNA (a partir de 5 x 109 para 5 x 102 cópias em uma reação de RT-qPCR 10 μL) foi submetida a uma análise de RT-qPCR direta usando 3' UTR específicos primers e um fluorogenic sonda9, um linear curva com um bom coeficiente de correlação (R2 = 0.98726) foi obtido (Figura 2).
Em seguida, aplicou-se este ensaio de RT-qPCR direto para quantificar o DENV no sobrenadante de cultura de células infectadas por vírus. DENV-2 (Singapore isolar 3295 EDEN210), que tinha sido propagados em células de mosquito C6/36 e titulado por ensaio de placa usando de células BHK-2111, foi diluído em série (de 8 x 106 a 80 placa formação unidades [PFU] /mL). DENV amostras foram então tratadocom com um volume igual de solução tampão de processamento com proteinase K para deproteinize virions e submetido a um ensaio de RT-qPCR direto visando o DENV 3' sequência de RNA UTR. Novamente, uma boa correlação (R2 = 0.99981) entre o título DENV infeccioso e o Ct, um número de ciclo que é considerado o ponto onde o sinal fluorescente aumenta com o crescimento exponencial acima o plano de fundo, obteve-se (Figura 3A). Quando valores de Ct gerados a partir de uma diluição serial da unidade populacional DENV com títulos infecciosos conhecidos foram plotados na curva padrão feita com em vitro transcrito 3' UTR RNA, todos os lotes obtidos a partir de 8 x 106 a 80 PFU/mL (igual a 8 x 103 a 8 x 10-2 PFU em uma reação de RT-qPCR 10 μL) estavam dentro da faixa daqueles sujeitos a padrão do RNA (5 x 109 para 5 x 103 copia em uma reação de RT-qPCR 10 μL, Figura 3B), indicando que o DENV amostras com uma vasta gama de infecciosas títulos podem ser analisados ao mesmo tempo, usando este direto RT-qPCR. Em experiências paralelas, foi investigado o efeito do processamento de buffer ou tratamento de proteinase K na detecção de RNA viral por RT-qPCR análise. Embora o tratamento de uma diluição de registro da amostra DENV (8 x 106 a 8 x 102 PFU/mL) com tampão fosfato salino (PBS) sozinho antes da RT-qPCR (diluição de 1:1 da amostra do vírus com PBS) e uma incubação de 25 ° C por 10 min e 75 ° C por 5 min suscitou um curva de regressão (Figura 3, linha preta) e os valores médios de Ct obtidos pelo tratamento PBS foram adiados, 2.6 – 3.2 ciclos quando comparado ao Ct resultante da transformação tratamento tampão/proteinase K (Figura 3, linha pontilhada). Além disso, a maior diluição do vírus (8 x 102 PFU/mL [8 x 10-1 PFU por reação de RT-qPCR 10 μL]) não pode ser detectada com este tratamento de PBS (Figura 3). Na ausência de proteinase K durante o tratamento de buffer de processamento (Figura 3, cinza linha), foi gerada uma regressão semelhante; no entanto, o atraso na amplificação (0,1 – 0,8 ciclos) observou-se, ainda, em relação a reação de transformação contendo proteinase K (Figura 3, linha pontilhada). Estes dados indicam que, entre as condições testadas, tratamento da amostra com buffer de processamento juntamente com proteinase K DENV melhora a sensibilidade do ensaio de RT-qPCR.
O ensaio de RT-qPCR direto novo foi avaliado para sua aplicabilidade para validar antivirais contra DENV. Ácido micofenólico (MPA), um inibidor de inibidor da inosina monofosfato desidrogenase que é usado como um imunossupressor no transplante, tem sido relatado para inibir DENV em vitro12,13. Embora os estudos anteriores empregou um ensaio da chapa convencional ou um ensaio de citometria de fluxo para detecção de antígenos virais para demonstrar o efeito inibitório do MPA na DENV infecção12,13, no presente estudo, foi direto RT-qPCR aplicado para avaliar a atividade antiviral do MPA. As células HeLa, que tinham sido semeadas em uma densidade de 5 x 104 células/poço em uma placa de 24 1 dia antes da infecção, foram expostas ao DENV-2 em um MOI de 1 para 1 h e, após a lavagem, cultivadas com DMEM/10% FBS, na presença de 0.016 – 50 μg/mL (MPA ou 0,1% Dimetilsulfóxido [DMSO]). A sobrenadante de cultura foi coletada 3 dias após a infecção e submetida a ensaio de RT-qPCR direto usando DENV 3' UTR específicas cartilhas e uma sonda fluorescente. A Figura 4 mostra as cópias de RNA DENV (por reação) nos sobrenadantes de cultura de células infectadas tratadas com concentrações crescentes de MPA, que foram determinadas por um em vitro transcrito 3' padrão de RNA UTR. Com um tratamento de 50 μg/mL (156 μM) MPA, uma redução de 99.87 ± 0,02% da cultura tratada com DMSO controle observou-se (Figura 4). Importante, o valor de50 (50% de concentração inibitória) IC para MPA determinado pelos dados mostrados na Figura 4 foi de 0,79 μM, que é semelhante aos valores anteriormente relatados12,13. Este resultado, portanto, indica que este ensaio de RT-qPCR direto é um método útil e confiável para avaliar o efeito inibitório sobre a infecção do DENV dos agentes antivirais.
Finalmente, aplicações do ensaio RT-qPCR direto para outros vírus de RNA foram testadas. Quando um estoque de febre amarela (YFV) 17D vacina estirpe do vírus (Flaviviridae), que tinha sido ampliado em células Vero e titulado em células BHK-21, foi sujeitado a direto RT-qPCR utilizando primers específicos YFV-17 D e um fluorogenic sonda14, como descrito na tabela 1, uma curva padrão com boa correlação direta entre a concentração de vírus e valores de Ct pôde ser gerada com uma 10 vezes diluição serial da unidade populacional de vírus (3,2 x 105 PFU/ml 3.2, Figura 5A). Da mesma forma, direcionar a análise de RT-qPCR do vírus Chikungunya (CHIKV, por Togaviridae) estoque de estirpe Ross, que tinha sido ampliado em células Vero e titulado em células BHK-21, utilizando primers específicos CHIKV e uma sonda fluorogenic15 (tabela 1), deu uma boa regressão entre títulos infecciosos (4.4 x 108 4.4 x 103 PFU/mL) e valores de Ct (Figura 5B). Este foi também o caso para a detecção de uma diluição serial (8 x 102 a 8 x 10-2 PFU/mL, Figura 5) do vírus do sarampo (MeV, Paramyxoviridae) que havia sido propagado e titulado com células Vero, usando anteriormente primers relatados e uma sonda fluorogenic16 (tabela 1). Estes dados demonstram a adaptabilidade do ensaio RT-qPCR direto para a detecção quantitativa de vários vírus de RNA.
Figura 1: fluxo de trabalho do ensaio direto RT-qPCR. O sobrenadante de cultura de células infectadas DENV é tratado com um buffer de processamento que contém a proteinase K para liberar o RNA viral (etapa de processamento de amostra). A amostra processada, em seguida, é misturada com um reagente de RT-PCR de uma etapa e submetida ao ensaio de PCR em tempo real usando DENV 3' UTR específicos primers e uma sonda fluorogenic. Os níveis de RNA viral detectada nas respectivas amostras podem ser determinados por um padrão serialmente diluído usando em vitro transcrito DENV RNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: uma curva padrão gerada pelo DENV 3' UTR RNA. (A) padrão RNA contendo 3' UTR de DENV-2 NGC foi transcrito em vitro de um fragmento do PCR de sequência-fundido promotor T7 RNA. (B) Purified DENV 3' UTR-RNA (250 ng) foi visualizado em um gel de agarose a 1% (pista da direita). Na faixa da esquerda mostra o marcador de peso molecular para a electroforese do RNA. (C), A diluição de log as DENV 3 'UTR RNA standard foi tratada com o buffer de processamento que contém a proteinase K e submetido a uma análise PCR em tempo real, usando um reagente de uma etapa RT-qPCR e DENV 3' UTR-primeiras demão específicas e um conjunto de sonda fluorogenic. Os valores médios de Ct (n = 3) obtidos nas respectivas diluições foram plotadas contra a quantidade estimada de 3' UTR RNA (5 x 109 para 5 x 102 RNA copia em uma reação de RT-qPCR 10 μL). R2 é o coeficiente de correlação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: A quantificação do RNA do DENV no estoque de vírus por RT-qPCR direto. (A), a alta-título DENV-2 estoque produzido em células C6/36 foi diluído em série 10-fold (8 x 106 a 8 x 101 PFU/mL) com DMEM/10% FBS contendo um inibidor de RNase e submetido ao ensaio de RT-qPCR direto usando DENV 3' UTR específicos as primeiras demão /Probe. (B) Ct valores obtidos por RT-qPCR de estoque DENV log-diluído (círculos) foram plotados em uma curva padrão do 3' UTR RNA (triângulos) transcrita in vitro. O uso de 8 x 106 PFU/mL caldo em um ensaio de RT-qPCR direto corresponde a 8 x 103 PFU de vírus em um 10 μL reação de RT-qPCR. (C), este painel mostra o efeito do processamento de buffer e tratamentos de proteinase K na detecção de RNA viral. Estoque DENV diluído (8 x 106 a 8 x 102 PFU/mL) foi incubada com um volume igual de solução tampão de processamento com proteinase K (círculos brancos), processamento de buffer sozinho (círculos cinza) ou PBS (círculos pretos) e em seguida submetido para o direct Ensaio de RT-qPCR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: avaliação do efeito inibitório do MPA por RT-qPCR direto. As células HeLa estavam infectadas com DENV-2 em um MOI de 1 e cultivadas na presença de concentrações crescentes de MPA, um inibidor anteriormente relatado de DENV (ou 0,1% DMSO). Três dias após a infecção, sobrenadantes de cultura de células infectadas foram coletadas e submetidas a ensaio de RT-qPCR direto usando DENV 3' UTR específicos cartilhas/sonda. O número de cópia do RNA viral foi determinado pelo DENV 3' UTR RNA transcrito padrão em vitro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: aplicação do RT-qPCR direto para a detecção de outros vírus RNA. Reservas de vírus serialmente diluída de (A) YFV CHIKV (B) e (C) MeV foram submetidas a ensaio de RT-qPCR direto usando iniciadores de PCR e fluorogenic sondas específicas para suas respectivas sequências de RNA virais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Finalidade | Nome | Sequência (5' - 3') | Nota |
| Promotor T7-DENV-2 3 fundido ' amplificação do cDNA UTR | T7-DENV 3' UTR Fwd | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGgaa c tTA GAA GGC AAA ACT AAC ATG AAA | Itálico, promotor T7; minúscula, espaçador; negrito, DENV-2 NGC nucleotídeos 10.270-10.292 |
| DENV 3' UTR Rvs | ANTONIO ACC TGT TGA TTC AAC AGC | Nucleotídeos de DENV-2 NGC 10.723-10.703 | |
| Análise de RT-qPCR de DENV | DENV-2 3' UTR F | AAG GAC TAG AGG TTA GAG GAG ACC C | Referência 9 |
| DENV-2 3' UTR R | GGC GTT CTG TGC CTG GAA TGA TG | ||
| Sonda 2 Den-2-4 | 6FAM-AAC AGC ATA TTG ACG GGA CTG AAG ACC-TAMRA | ||
| Análise de RT-qPCR de YFV | YFV NS5 F | GAA CAG TGA TCA GGA TCT CTC DE ACC | Referência 14 |
| YFV NS5 R | GGA TGT TTG GTT CAC AGT AAA TGT G | ||
| YFV NS5 sonda | 6FAM-CTA CGT GTC TGG AGC CAG CCG CAA T-TAMRA | ||
| Análise de RT-qPCR de CHIKV | CHIK E1 F | TCG ACG CGC CCT CTT TAA | Referência 15 |
| CHIK E1 R | ATC GAA TGC ACC GCA CAC T | ||
| CHIK E1 P | 6FAM-ACC AGC CTG CAC CCA CTC TTC AGA C-TAMRA | ||
| Análise de RT-qPCR MEV | MeV N F | TGG GATO CTG AAC TCG GTA TCA C | Referência 16 |
| MeV N R | TGT CCT CAG TAG TAT GCA TTG CAA | ||
| MeV N P | 6FAM-CCG AGG ATG CAA GGC TTG TTT CAG A-TAMRA |
Tabela 1: Primeira demão do Oligonucleotide fluorogenic sonda de sequências utilizadas neste estudo.
| Componentes | Concentração das ações | Volume (μL) | Concentração final |
| PrimeSTAR Max Premix | 2 x | 25 | 1 x |
| T7-DENV 3' UTR Fwd | 1 ΜM | 10 | 200 nM |
| DENV 3' UTR Rvs | 1 ΜM | 10 | 200 nM |
| pEU/DENV 3' UTR | 1 ng/μL | 1 | 20 pg/μL |
| Livre de nuclease H2O | 4 | ||
| Total | 50 |
Tabela 2: Componentes de um PCR mix para a preparação de DENV 3' UTR modelo de DNA.
| Componentes | Concentração das ações | Volume (μL) | Concentração final |
| T7 sequência-fundido DENV 3' UTR DNA modelo | (variável) | x | 100 ng por reação |
| Solução de ATP | 75 mM | 2 | 7,5 mM |
| Solução CTP | 75 mM | 2 | 7,5 mM |
| Solução de GTP | 75 mM | 2 | 7,5 mM |
| Solução UTP | 75 mM | 2 | 7,5 mM |
| Amortecedor da reação | 10 x | 2 | 1 x |
| T7 Mix de enzima | 2 | ||
| Inibidor de RNase recombinante | 40 unidades/μL | 1 | 2 unidades/μL |
| Livre de nuclease H2O | 7 - x | ||
| Total | 20 |
Tabela 3: Componentes de um IVT mix para sintetizar o padrão DENV 3' UTR RNA.
| Componentes | Concentração das ações | Volume (μL) | Concentração final em uma reação de RT-qPCR |
| mistura de reação de sondas de iTaq universal | 2 x | 5,00 | 1 x |
| iScript avançado transcriptase reversa | x 40 | 0.25 | 100 ng por reação |
| Mistura de primer/sonda | DENV-2 3' UTR F: 3 ΜM | 1.00 | 300 nM |
| DENV-2 3' UTR R: 3 ΜM | 300 nM | ||
| Sonda 2 Den-2-4: 2 μM | 200 nM | ||
| Livre de nuclease H2O | 1,75 | ||
| Subtotal | 8,00 |
Tabela 4: componentes de uma mistura de mestre para análise de RT-qPCR em tempo real do RNA DENV. Note-se que 2 μL da amostra DENV transformada (ou padrão do RNA) deve ser adicionado à mistura mestre 8-μL (um total de 10 μL por reação).
Discussion
Hoje, a deteção do ácido nucleico viral por PCR em tempo real baseado em fluorescente está se tornando um padrão-ouro para o diagnóstico molecular do vírus patogénicos humanos, devido à sua sensibilidade e rapidez7. Isto é particularmente importante para confirmar a infecção pelo vírus na fase inicial de doenças infecciosas agudas como febre dengue17. Também, no campo da pesquisa básica DNEV, RT-qPCR ensaio é uma ferramenta indispensável para monitorar a replicação do vírus em cultura em vitro , que levará a uma compreensão da biologia do DENV replicação e a descoberta de inibidores antivirais. Neste estudo, o ensaio PCR em tempo real baseado em fluorescente foi desenvolvido por uma combinação de um buffer de processamento e um reagente de RT-PCR de uma etapa para que o RNA DENV no sobrenadante de cultura de células infectadas era capaz de ser quantificado por RT-qPCR sem purificação o genoma de RNA viral. Quando comparado com os ensaios de rotina para detectar a replicação do vírus, tais como o ensaio de placa, ELISA ou convencional RT-qPCR empregando RNA purificação6,7, um protocolo simplificado do ensaio RT-qPCR resultou em uma grande redução do tempo e etapas necessárias para quantificar DENV RNA. Esta também é uma característica importante que tem vantagens em minimizar a contaminação e perda de materiais genéticos. No entanto, deve notar-se que o uso de um capuz limpo é essencial na instalação do IVT (passo 2.1) e reações de RT-qPCR (etapas 4.1 – 4.4) para evitar a contaminação cruzada de produtos relacionados com amplicons ou RNase. Também é crucial lidar com a cultura de sobrenadante, incluindo vírus infeccioso, dentro de uma segurança biológica do armário (passo 3.3) para reduzir o risco de infecção de laboratório.
Outro significado de ensaio de RT-qPCR direto é que uma ampla gama de cópias de RNA virais pode ser analisada ao mesmo tempo sem diluição ou concentração da amostra. Quando uma serialmente diluída DENV 3' UTR RNA norma foi usada, o protocolo de RT-qPCR direto produzido uma curva padrão linear ao longo de sete ordens de magnitude, e o limite de quantificação inferior foi 500 cópias de RNA (Figura 2). Para a detecção de DENV no sobrenadante de cultura de células infectadas, 8 x 103 a 8 x 10-2 vírus PFU em um 10 μL RT-qPCR estavam dentro do padrão de intervalo de DENV 3' UTR RNA, e do limite de detecção inferior (8 x 10-2 PFU) foi calculado para conter 11 , 400 cópias de RNA ± 7.077 (Figura 3B). Digno de nota, como relatado em vários flavivirus estudos18,19,20, a maior proporção de cópias de RNA virais a título de vírus infecciosos (i.e., PFU) em amostras DENV também foi observada neste estudo. Essa superestimativa será assumida que é em grande parte devido à presença de defeituoso (isto é, não-infecciosa) vírus ou livre do RNA viral lançado de células infectadas e mortas. Embora a relação de cópias de RNA: PFU obtidos neste estudo (1,1 x 105 a 1,3 x 105 RNA cópias/PFU) era incompatível com os dados mostrados anteriormente (intervalo de rácios de 1 log 3)21,20, esta pode ser atribuída à diferença em estirpes de vírus, células ou as condições de cultura empregadas. Outra provável explicação para a discrepância é que, uma vez que nenhum processo de purificação de RNA foi envolvido no ensaio de RT-qPCR direto aqui descrito, mais DENV RNA no sobrenadante de cultura poderia ser detectado pela análise PCR em tempo real, sem a perda de viral materiais genéticos.
A simplicidade do RT-qPCR direto aumenta a capacidade de lidar com um grande número de amostras em formatos múltiplos bem, como uma placa de 96 poços. Portanto, essa propriedade ajudará a futura aplicação de ensaio de RT-qPCR direto para um estudo de rastreio com throughput alto para a descoberta de drogas anti-DENV. Com efeito, neste relatório, aplicação do ensaio RT-qPCR direto para a validação de um inibidor de anti-DENV, MPA, foi examinada, e o resultado mostrou que um valor de IC50 MPa obtidos pelo ensaio de RT-qPCR direto (Figura 4) foi comparável à relatado em estudos anteriores usando placa ensaio12,13. Isto demonstra que RT-qPCR direto é um ensaio útil para avaliar adequadamente o efeito inibitório de antivirais e pode ser adotado em uma estudo de despistagem no futuro de drogas.
Neste estudo, foram feitas tentativas de aplicar o RT-qPCR direto para a detecção de outros vírus de RNA. Como mostrado na Figura 5, quando 10 vezes diluições de três outros vírus de RNA (YFV CHIKV e MeV) classificados em gêneros diferentes (Flaviviridae, por Togaviridaee Paramyxoviridae, respectivamente) foram examinados usando anteriormente relatados primers e fluorogenic sondas específicas para as respectivas sequências de RNA virais. Boas correlações entre títulos infecciosos e Ct valores foram obtidas pelos ensaios de RT-qPCR diretos, e as correlações foram 4-6 lineares ordens de magnitude. Isto sugere que o protocolo de RT-qPCR direto é adaptável a vários tipos de vírus de RNA, simplesmente alterando os primers específicos do vírus e fluorogenic sondas.
No entanto, a sensibilidade da deteção variou entre os vírus testados neste estudo (Figura 5). Uma modificação do protocolo que pode melhorar a detecção do RNA do vírus de destino deve ser a utilização de um novo conjunto de sequências de primer/sonda. Além disso, um passo fundamental para o ensaio de RT-qPCR direto bem sucedido é pensado para ser o lançamento eficiente do genoma viral durante a amostra processamento passo (passos 3.1-3.4). Isso seria de particular importância para a detecção quantitativa de vírus estáveis como um vírus não-envelopado. Embora como uma experiência preliminar, Coxsackievirus B3 (CVB3), um vírus de RNA não-envelopado pertencentes a Picornaviridae, foi submetida a ensaio de RT-qPCR direto usando iniciadores de CVB3 específicas descritas anteriormente e sonda fluorescente22, um sinal positivo amplicon não podia ser detectado mesmo com um estoque de vírus alta-título (1 x 105 PFU/mL). Este é considerado pela maior parte ser atribuída à alta integridade física do vírus não-envelopado. Até agora, alguns ensaios de RT-PCR que não exigem a purificação do ácido nucleico foram desenvolvidos para detectar diversos vírus de RNA, que utilizam protocolos diferentes na versão RNA passo23,24,25, 26. assim, o uso dos tratamentos alternativos (ou adicionais), tais como uma incubação de uma amostra de vírus em uma alta temperatura, potencialmente aumenta a sensibilidade da deteção.
Em resumo, o protocolo de RT-qPCR direto desenvolvido neste estudo foi um método simples e rápido, mas confiável para quantificação do RNA viral em um sobrenadante de cultura de células infectadas. Devido a esta simplicidade, o ensaio de RT-qPCR direto poderia processar um número de amostras em um curto período de tempo, que é uma promessa para a análise de alta produtividade da replicação do vírus. Além disso, a aplicação do protocolo de RT-qPCR direto para outros vírus RNA também foi demonstrada. Esta abordagem deve, portanto, ser uma ferramenta útil para monitorar eficientemente as infecções de vírus de RNA em uma configuração de laboratório de pesquisa e, possivelmente, em diagnósticos clínicos.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores agradecer Subhash G. Vieira (Duke-NUS Graduate Medical School, Singapura) o DENV-2 isolar 3295 EDEN2 e Shunro Imura (estação de quarentena Kobe, Japão) para o YFV estirpe de vacina 17D. Os autores também são gratos aos membros do departamento de Microbiologia e controle de infecção para sua assistência. Este trabalho é apoiado por MEXT KAKENHI Grant número JP16737900.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PrimeSTAR Max DNA Polymerase | Takara Bio. Inc | R045A | Comparable PCR reagent kit can be used. |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | Comparable thermal cycler instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
| 6x Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7024S | Comparable gel loading dye can be used. |
| 2-Log DNA Ladder | New England BioLabs | N3200 | 0.1-10.0 kilobase pairs. Comparable DNA molecular ladder can be used. |
| Gel Scene Tablet | Astec | GST-33 | Comparable gel imaging system can be used. |
| illustra GFX PCR Purification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 28-9034-70 | Comparable gel extraction kit can be used. |
| BioSpectrometer | Eppendorf | 6135000905 | Comparable spectrophotometer can be used. |
| MEGAscrip T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1334 | |
| TURBO DNase | Thermo Fisher Scientific | AM2238 | Included in MEGAscrip T7 Transcription Kit. |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio. Inc | 2313A | 40 units/μL |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Comparable RNA purification kit can be used. |
| CellAmp Direct RNA Prep Kit | Takara Bio. Inc | 3733Q | |
| Proteinase K | Nacalai Tesque | 15679-06 | >600 units/mL. Comparable reagent can be used. |
| iTaq Universal Probes One-Step Kit | Bio-Rad | 1725141 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | Comparable plate or tube can be used dependent on the real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Comparable film or optical cap can be used dependent on the real-time PCR plate or tube. |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | StepOnePlus-01 | Comparable real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
References
- Pastorino, B., Nougairede, A., Wurtz, N., Gould, E., de Lamballerie, X. Role of host cell factors in flavivirus infection: Implications for pathogenesis and development of antiviral drugs. Antiviral Research. 87 (3), 281-294 (2010).
- Fauci, A. S., Morens, D. M. Zika Virus in the Americas--Yet Another Arbovirus Threat. New England Journal of Medicine. 374 (7), 601-604 (2016).
- Wen, Z., Song, H., Ming, G. L. How does Zika virus cause microcephaly? Genes and Development. 31 (9), 849-861 (2017).
- Guzman, M. G., Harris, E. Dengue. Lancet. 385 (9966), 453-465 (2015).
- Low, J. G., Ooi, E. E., Vasudevan, S. G. Current Status of Dengue Therapeutics Research and Development. Journal of Infectious Diseases. 215 (suppl_2), S96-S102 (2017).
- Sukhavachana, P., Nisalak, A., Halstead, S. B. Tissue culture techniques for the study of dengue viruses. Bulletin of the World Health Organization. 35 (1), 65-66 (1966).
- Tang, K. F., Ooi, E. E.
- Suzuki, Y., et al. Characterization of RyDEN (C19orf66) as an Interferon-Stimulated Cellular Inhibitor against Dengue Virus Replication. PLoS Pathogens. 12 (1), e1005357 (2016).
- Callahan, J. D., et al. Development and evaluation of serotype- and group-specific fluorogenic reverse transcriptase PCR (TaqMan) assays for dengue virus. Journal of Clinical Microbiology. 39 (11), 4119-4124 (2001).
- Low, J. G., et al. Early Dengue infection and outcome study (EDEN) - study design and preliminary findings. Annals of the Academy of Medicine, Singapore. 35 (11), 783-789 (2006).
- Hishiki, T., et al. Interferon-mediated ISG15 conjugation restricts dengue virus 2 replication. Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 95-100 (2014).
- Diamond, M. S., Zachariah, M., Harris, E. Mycophenolic acid inhibits dengue virus infection by preventing replication of viral RNA. Virology. 304 (2), 211-221 (2002).
- Takhampunya, R., Ubol, S., Houng, H. S., Cameron, C. E., Padmanabhan, R. Inhibition of dengue virus replication by mycophenolic acid and ribavirin. Journal of General Virology. 87 (Pt 7), 1947-1952 (2006).
- Akondy, R. S., et al. Initial viral load determines the magnitude of the human CD8 T cell response to yellow fever vaccination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (10), 3050-3055 (2015).
- Edwards, C. J., et al. Molecular diagnosis and analysis of Chikungunya virus. Journal of Clinical Virology. 39 (4), 271-275 (2007).
- Hummel, K. B., Lowe, L., Bellini, W. J., Rota, P. A. Development of quantitative gene-specific real-time RT-PCR assays for the detection of measles virus in clinical specimens. Journal of Virological Methods. 132 (1-2), 166-173 (2006).
- Peeling, R. W., et al.
- Bae, H. G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay. Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).
- Colton, L., Biggerstaff, B. J., Johnson, A., Nasci, R. S. Quantification of West Nile virus in vector mosquito saliva. Journal of the American Mosquito Control Association. 21 (1), 49-53 (2005).
- Richardson, J., Molina-Cruz, A., Salazar, M. I., Black, W. 4th Quantitative analysis of dengue-2 virus RNA during the extrinsic incubation period in individual Aedes aegypti. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 74 (1), 132-141 (2006).
- Wang, W. K., et al. Detection of dengue virus replication in peripheral blood mononuclear cells from dengue virus type 2-infected patients by a reverse transcription-real-time PCR assay. Journal of Clinical Microbiology. 40 (12), 4472-4478 (2002).
- Gnadig, N. F., et al. Coxsackievirus B3 mutator strains are attenuated in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), E2294-E2303 (2012).
- Rudenko, N., Golovchenko, M., Cihlarova, V., Grubhoffer, L. Tick-borne encephalitis virus-specific RT-PCR--a rapid test for detection of the pathogen without viral RNA purification. Acta Virologica. 48 (3), 167-171 (2004).
- Pastorino, B., et al. Development of a TaqMan RT-PCR assay without RNA extraction step for the detection and quantification of African Chikungunya viruses. Journal of Virological Methods. 124 (1-2), 65-71 (2005).
- Nishimura, N., et al. Detection of noroviruses in fecal specimens by direct RT-PCR without RNA purification. Journal of Virological Methods. 163 (2), 282-286 (2010).
- Kang, K., et al. A direct real-time polymerase chain reaction assay for rapid high-throughput detection of highly pathogenic North American porcine reproductive and respiratory syndrome virus in China without RNA purification. Journal of Animal Science and Biotechnology. 5 (1), 45 (2014).
