Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at konstruere en pleural effusion model i rotter ved intratrakeal instillation af polyacrylat/nanosilica.
Abstract
Pleural effusion er et udbredt kliniske fund af mange lungesygdomme. Under en nyttig animalske pleural effusion model er meget vigtigt at studere disse lungesygdomme. Tidligere pleural effusion modeller var mere opmærksomme på biologiske faktorer snarere end nanopartikler i miljøet. Her introducerer vi en model for at gøre pleural effusion i rotter ved intratrakeal instillation af polyacrylat/nanosilica, og en metode til nanopartikel isolation i pleural effusion. Ved intratrakeal instillation af polyacrylat/nanosilica med koncentrationer af 3,125, 6,25 og 12,5 mg/kg∙mL, den pleural effusion i rotter præsenteret på dag 3, toppede dage 7-10 i 6,25 og 12,5 mg/kg∙mL grupper, derefter langsomt faldt og forsvandt på dag 14. Når koncentrationen af polyacrylat/nanosilica steg, er pleural effusion produceret mere og hurtigere. Denne pleural væske blev opdaget af ultralydsundersøgelse eller CT brystet scanning og bekræftet af dissektion af rotter. Silica nanopartikler blev observeret i den rats' pleural effusion af transmissions-elektronmikroskop. Disse resultater viste, at eksponering for polyacrylat/nanosilica fører til induktion af pleural effusion, som var i overensstemmelse med vores tidligere rapport i mennesker. Desuden, er denne model til gavn for den yderligere undersøgelse af projektgruppen for Nanotoksikologi og pleural effusion sygdomme.
Introduction
Pleural effusion er et meget fælles kliniske manifestation af lungesygdomme med en række forskellige årsager. Under en nyttig animalske pleural effusion model er meget vigtigt at studere disse lungesygdomme, de to pleural membran lag, pleural effusion mekanismer og dens behandling roller. Men nogle rapporteret pleural effusion modeller hovedsagelig fokusere på den malignt pleural effusion eller biologiske faktorer snarere end nanopartikler i miljøet1,2. Her, introducere vi en ny model af pleural effusion, der er enkelt, sikkert og effektivt.
Med udviklingen af nanoteknologi og den omfattende brug af nanoproducts er der en bekymring om de potentielle risici ved nanomaterialer for miljøet og menneskers sundhed3,4. Nanomaterialer indføre risikofaktorer og føre potentielt til nye risici på arbejdspladsen eller gennem miljøforurening. In vitro og in vivo undersøgelser viser, at nanomaterialer kan føre til flere organskader til lungerne, hjertet, leveren, nyrerne, og nervesystemet, såvel som den reproduktive og immunsystemets5,6. Derudover rapporteret nogle undersøgelser, at den specifikke toksicitet af nanomaterialer var på grund af deres unikke fysisk-kemiske egenskaber3,4,7.
Vi har rapporteret, at en gruppe af arbejdstagere med erhvervsmæssig eksponering for nanomaterialer klinisk præsenteret med pleural og perikardial effusion, lungefibrose og granuloma8,9. Silica nanopartikler var isoleret i disse patienters pleural effusion9. For at gengive og kontrollere den pleural effusion induceret af den inhalerede nanopartikler i menneskelige, gennemførte vi eksperimentet ved indgyde polyacrylat/nanosilica (PA/NPSi) via luftvejene hos rotter, som efterlignede menneskelige respiration i en reel miljø, og fandt at intratrakeal instillation af PA/NPSi kan resultere i pleural effusion i rotter. Vi indfører her, hvordan man laver pleural effusion i rotter ved intratrakeal instillation af PA/NPSi, og hvordan at isolere nanopartikler i pleural effusion. Denne model kan være nyttige for den yderligere undersøgelse af projektgruppen for Nanotoksikologi og pleural effusion sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Undersøgelsen fulgte retningslinjerne i Capital medicinske universitet (Beijing, P.R Kina) for pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Alle procedurer blev godkendt af den dyr etiske udvalg af Capital medicinske universitet i Kina.
1. eksperimentel præparater
Bemærk: Acclimate de kvindelige specifikt patogenfrie Wistar rotter (vægt: 200 ± 10 g) til de eksperimenterende miljøer for en uge før administration (miljøforhold: lys / mørke: 12h / 12h, temperatur 22 ± 2 ° C, luftfugtighed 50 ± 10%).
- Bruge en frisk 10 mL af PA/NPSi suspensioner (nanosilica Ø:20 ± 5 nm af in situ emulsion polymerisation) fortyndet i normal saltvand i koncentrationer på 3.125, 6,25 og 12,5 mg/mL, henholdsvis10. Før administration, der sonikeres suspensioner for 20-30 min og vortex for 10 min for at forhindre nanopartikler sammenlægning.
- Lige dele ialt 20 rotter i fire grupper: en gruppe for hver koncentration af PA/NPSi (0, 3.125, 6,25 og 12,5 mg/mL).
- For at anesthetize dem, placere rats i en lukket beholder med 1,5 mL Eter (99,5%) eller nogen andre IACUC godkendt protokoller. Efter 60-90 s af anæstesi, kontrollere, om manglen reaktion på pedal refleks. Sikre at rotterne vejrtrækning.
- Sætte den bedøvede rotte på bord og lave dens forreste tænder med en steriliseret linje af nylon i bestyrelsen for.
- Åbne sin mund og udsætte sine revne af glottis ved hjælp af en kirurgisk pincet og frontal linse.
- Indgyde rotter med 0,5 mL af PA/NPSi suspension til hver rotte lunge til alt af 1 mL ved hjælp af et fint rør med en steriliseret stump kanyle ind i den bilaterale bronkier.
- Placer rotter på en plast bord i en liggende stilling og lad rotterne komme langsomt i 5-10 min.
2. ultralydsundersøgelse for pleural effusion
- Bruge en ultralyd system med en lineær array transducer (frekvens: 8 MHz) til at undersøge rotter på dag 1, 3, 7 og 1410.
- Give anæstesi (10% Kloral hydrat, 0,35 mL/100 g, i.p.) til rotter og kontrollere, om manglen pedal reflekser.
- Fjerne håret fra rats' brystet og øvre del af maven ved hjælp af en elektrisk barbermaskine. Derefter placere rotten på en monteringsplade i en liggende stilling.
- Dække huden med den coatede gel, og derefter placere transduceren på den interkostale rum og subcostal område til at opdage den pleural væske.
Bemærk: For at opdage at effusion præcist, venstre og de højre laterale holdninger blev valgt til at udføre en ultralydsundersøgelse. - Sætte rotten på en plast bord i en liggende stilling efter ultralydsundersøgelse og lad rotterne komme langsomt i 10 min.
3. brystet CT scanning for pleural effusion
- På dag 7 og 14 efter administration, bedøver rotter med 10% Kloral hydrat (i.p). Overvej det tilstrækkelig dybde af anæstesi når rotten ikke reagerer på pedal reflekser.
Bemærk: Dag 7 efter administration er den mest passende tid til at observere pleural effusion af CT-scanning. - Placere rotten på en plastfolie i en udsat position og derefter scanne sit bryst for at undersøge pleural effusion ved hjælp af en 64-kanals CT. Use følgende indstillinger: 64 mm x 0,625 mm detektor konfiguration, 120 kV (peak) og 350 mAs.
4. opkrævning af pleural effusion og isolation af nanopartikler i den pleural effusion
- Efter bryst CT-scanning af rotter og under anæstesi af Kloral hydrat, kontrollere den pedal refleks af rotter, Barber hår fra maven til brystet, og derefter desinficere huden af jod.
- Bringe rotter til det kirurgiske område.
- Under anæstesi, hurtigt skåret 1-1,5 cm af huden og mavemuskler til formet som et sværd langs midterlinjen med intakt mellemgulvet.
- Forsigtigt åbne brystet og inspicere bilaterale pleural hulrum med hjælp fra pincet, især de bilaterale costal phrenic vinkler. 1-2 mL af lysegul pleural effusion opsamles med en 2 mL steril sprøjte.
- Når først gennemstegt, ofre rotter med IACUC godkendt protokollen.
- Der centrifugeres i pleural effusion i et 2 mL tube for 15 min på 300 x g for at isolere nanopartikler.
- Brug en dråbe af det øverste lag, som er den lyse væske og observere under en transmissions elektron microscope(TEM,) ved en accelererende spænding på 60-80 kV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af en thorax ultralyd, fandt vi ingen pleural udbrud på dag 1 i alle grupper. Men på dag 3, pleural effusion dukkede op i grupperne 6,25 og 12,5 mg/kg∙mL. At effusion var hovedsagelig i den højre costal phrenic vinkel, mens perikardieeffusion kun præsenteret i 12,5 mg/kg∙mL group. Derudover på dag 7, blev både pleural effusion (Video 1) og perikardieeffusion (Video 2) opdaget i 6,25 mg/kg∙mL group (figur 1). Pleural effusion steg langsomt i videst muligt omfang på dage 7-10 og faldt derefter gradvist. Dag 14 fandtes ingen pleural effusion længere men i vedhæftning af lungehinden tegn i alle grupper. 10
På dag 7 og 14, der var ingen tegn på den pleural effusion i 3,125 og 6,25 mg/kg∙mL grupper10. Men i gruppen 12,5 mg/kg∙mL brystet CT scanning var unormale med stumpe posterior costophrenic vinkel, som antydet en lille mængde af pleural effusionfigur 2(a, b). Ingen tegn på væske niveau blev observeret, hvilket blev forklaret på grund af en utilstrækkelig mængde af vand.
Ved dissektion af rotter observeret vi rav eller farveløs udbrud i 6,25 mg/kg∙mL og 12,5 mg/kg∙mL grupper på dage 3 og 7. Mængder af pleural effusion varierer fra 1-1,8 mL i hver pleural hulrum i 6,25 mg/kg∙mL og 12,5 mg/kg∙mL grupper. I gruppen af 3,125 mg/kg∙mL, ingen væske i pleural hulrum dukkede op i den fulde eksperimenterende proces.
Med TEM, NPSi nanopartikler fremlægges individuelt og klynger dannet i drænet pleural væske. Den gennemsnitlige diameter (Ø: 20 ± 5 nm) og morfologi i pleural væske var i overensstemmelse med NPSi i den rede suspension. Nanopartikler var for det meste sfæriske og godt spredte, og den gennemsnitlige størrelse af en individuel nanopartikel var ~ 20 ± 5 nm (fig. 3a, b).
Figur 1 : Repræsentant billeder af pleural effusion af sonographic resultater på dag 7. (a, b) Sonographic billeder fra en rotte i gruppen 3,125 mg/kg∙mL med ingen væske i pleural og perikardial hulrum. (c, d) Sonographic billeder fra en rotte i gruppen 6,25 mg/kg∙mL med tilsyneladende pleural effusion og perikardieeffusion. (e, f) Sonographic billeder fra en rotte i gruppen 12,5 mg/kg∙mL med meget mere væske i pleural og perikardial hulrum. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Repræsentative billeder af thorax CT billeder i rotter. CT image fra en rotte i gruppen 3,125 mg/kg∙mL med ingen pleural effusion (en) og CT billede fra en rotte i gruppen 12,5 mg/kg∙mL med en negativ konstatering af gratis væske men stumpe posterior costophrenic vinkel i pleural hulrum (b). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Silica nanopartikler i polyacrylat/nanosilica suspension og en rotte pleural effusion. (en) Silica nanopartikler i polyacrylat/silica nanocomposite. (b) Silica nanopartikler i en rotte pleural effusion med klynger eller individuelle form. Skalalinjen: 200 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1. Den pleural effusion i en rotte i gruppen 6,25 mg/kg∙mL. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Video 2. Perikardieeffusion i rotte i gruppen 6,25 mg/kg∙mL. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sonografi er den mest bekvemme værktøj til bestemmelse af lungesygdomme, på grund af sin fremragende følsomhed over for den fri væske i pleural hulrum11. Det er fordi Sonografi kan straks afsløre kontrasten i akustisk impedans af luft og væsker i lunge12. Desuden er Sonografi mere fleksible i en lille dyr model end CT. Ikke desto mindre luft i lungerne afspejles lydbølge og hindres i at kunne observere de intrapulmonary ændringer efter nanopartikler instillation. Derfor, vi kombineret brystet CT scanning og lunge Sonografi at undersøge de intrapulmonary ændringer og den pleural væske.
Efter at have udforsket de billeddiagnostiske data, fandt vi de imaging resultater bemærkelsesværdig. For det første viste vores model, at PA/NPSi, faktisk induceret usædvanlige toksicitet, som blev manifesteret som den pleural og perikardieeffusion tidligt i rotte model. For det andet, denne model korrekt gengivet forekomst og udvikling af menneskelige polyserous udbrud; i mellemtiden, disse processer blev observeret hos vores patienter, der præsenteres med pleural og perikardial effusion, lungefibrose og granuloma8,9. Således, disse fakta antydede, at serøs membran som den pleural membran eller perikardial membranen var en af de skade mål for PA/NPSi, som var samme karakter som den ene forårsaget af asbest. Tidslinjen af polyserous udbrud var også meningsfyldt indgås af vores resultater.
Som for design af vores model var intratrakeal instillation det afgørende skridt. Denne metode sikres, at toksiciteten af nanopartikel ind i kroppen gennem den luftrør, som var forskellig fra den tidligere undersøgelse13. Ulemper ved denne metode var imidlertid som følger: PA/NPSi blev indpodet i bilaterale Bronkie af de fine rør, som krævede meget eksperimentelle færdigheder til at forebygge den mekaniske skader til luftrøret og hoste forårsaget på grund af sin irritation. Det kritiske punkt var således den korrekte dybde af intratrakeal instillation. I mellemtiden opretholde ordentlig anæstesi var afgørende for at udfylde det ovennævnte skridt.
Brug af nanopartikler, de fine partikler i forskningsøjemed er picking up mere og mere opmærksomhed. Den mindre diameter i de fine partikler, jo mere udfordrende det er at beskytte dem. På den anden side kræves nano-silica med en diameter på 20 ± 5 nm faktisk en high-tech forberedelse metode til at forberede sig til denne undersøgelse, forårsagede en stigning i sværhedsgrad med faldet i diameter. Således var en af professionelle af vores teknik diameteren af nano-silica, som var mindre end den foregående undersøgelse13,14. En anden fordel ved denne undersøgelse var, at vi induceret nanopartikel via luftrør og ikke hud eller omsætning13,15,16. For eksempel, hæmmet den intravenøse eksponering os i efterforskningen af målorgan, hvilket var svært at skelne skaden af målorgan udløst af den primære eller sekundære skader. Derfor, efter vores mening intratrakeal instillation skal være den bedste måde til at undersøge lungerne nanopartikel toksicitet i den kommende fremtid. Desuden, doseringen af nanopartikel var lavere end den foregående undersøgelse13, som præsenteret en højere lønsomhedsforhold.
Det pleura og perikardieeffusion induceret af PA/NPSi, vil betændelse reaktion og produktion af reaktive oxygen system (ROS) være årsag til der. Vi forklarede det som følger: for det første nanosilica øget ROS koncentrationer, induceret inflammatoriske produktion, forårsaget mitokondrie depolarisering og reduceret glutathion niveauer både in vivo og in vitro-5,6. For det andet, inflammation og produktion af ROS steg den interstitielle væske i lungerne eller permeabilitet af pleural kapillærerne, der fremmes dannelsen af pleural effusion i slutningen. Desuden, den potentielle værdiforringelse af pleural lymfe dræning kan også være involveret i ophobning af pleural væsken. Med flere ophobning af pleural væske, var oncotic pres steget, som endelig induceret aflejring af PA/NPSi i pleural hulrum. Dette resultat var i overensstemmelse med vores tidligere animalsk eksperimenter og rapporteret patienter8,10.
For den pleural effusion, selv var det udbredt i klinikken. Ikke desto mindre kan mange respiratorisk eller systemiske sygdomme forårsage pleural effusion. Derfor ville konstruere en dyremodel gavne den ætiologiske undersøgelse af den pleural effusion. Den forrige undersøgelse rapporterede lunge toksicitet af nanosilica13,17. Men de tidligere rapporterede pleural effusion modeller primært fokuseret på den biologiske faktorer snarere end nanopartikler18,19. Derfor forblev dosis af nanopartikel et åbent spørgsmål. Vores model demonstreret at pleural effusion opstod på dag 3 efter en PA/NPSi koncentration af 6,25 mg/kg∙mL blev administreret af intratrakeal instillation og toppede på dage 7-10. Desuden, med stigende koncentrationer af PA/NPSi, den pleural effusion produceret mere og hurtigere. Derudover var sammenlignet med biologiske modeller18,19, vores model af pleural effusion godt-kontrollerbare og effektive. For at opsummere, vores model ville være gavnlige for fremtidige studier af pleural effusion sygdomme, samt med hensyn til den yderligere undersøgelse af nanotoxicity i særdeleshed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Den foreliggende undersøgelse og produktion til denne artikel blev finansieret af den National Natural Science Foundation of China (Grant 81773373, 81172614 og Grant 81441089). Vi takker Dr. Jin Yan og Dr. Pan Yujie, afdeling af nødsituationer, Beijing Chaoyang Hospital, og Dr. Qu Peng af Institut for ultralyd medicin, Beijing Chaoyang Hospital for at hjælpe med video-produktion.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acuson S2000 Color Doppler ultrasound system | Siemens Medical Solutions, Mountain View ,CA | ||
| Polyacrylate/nanosilica | Fudan University,Shanghai, China | made by order with nanosilica(20±5)nm | |
| 10% chloral hydrate | Beijing Chemical Works | 302-17-0 | |
| Light speed 16 spiral computed tomography | GE Healthcare, US | ||
| Specific pathogen-free Wistar | Animal Center of Lianhelihua (Beijing, China) | Wistar rats |
References
- Stathopoulos, G. T., et al. Nuclear factor-kappaB affects tumor progression in a mouse model of malignant pleural effusion. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (2), 142-150 (2006).
- Shen, J., et al. The dosage-toxicity-efficacy relationship of kansui and licorice in malignant pleural effusion rats based on factor analysis. Journal of Ethnopharmacology. 186, 251-256 (2016).
- Nel, A., Xia, T., Mädler, L., Li, N. Toxic potential of materials at the nanolevel. Science. 311 (5761), 622-627 (2006).
- Maynard, A. D., et al.
- Duan, J., et al. Toxic effects of silica nanoparticles on zebrafish embryos and larvae. PLoS One. 8 (9), 74606 (2013).
- Skuland, T., Ovrevik, J., Låg, M., Schwarze, P., Refsnes, M. Silica nanoparticles induce cytokine responses in lung epithelial cells through activation of a p38/TACE/TGF-α/EGFR-pathway and NF-κΒ signaling. Toxicology and Applied Pharmacology. 279 (1), 76-86 (2014).
- Oberdörster, G., Oberdörster, E., Oberdörster, J. Nanotoxicology: an emerging discipline evolving from studies of ultrafine particles. Environmental Health Perspectives. 113 (7), 823-839 (2005).
- Song, Y., Li, X., Du, X. Exposure to nanoparticles is related to pleural effusion, pulmonary fibrosis and granuloma. European Respiratory Journal. 34 (3), 559-567 (2009).
- Song, Y., et al. Nanomaterials in humans: identification, characteristics, and potential damage. Toxicologic Pathology. 39 (5), 841-849 (2011).
- Zhu, X., et al. Polyacrylate/nanosilica causes pleural and pericardial effusion, and pulmonary fibrosis and granuloma in rats similar to those observed in exposed workers. International Journal of Nanomedicine. 11, 1593-1605 (2016).
- Havelock, T., et al. Pleural procedures and thoracic ultrasound: British Thoracic Society Pleural Disease Guideline 2010. Thorax. 65, Suppl 2 61-76 (2010).
- Jha, A., Ullah, E., Gupta, P., Gupta, G., Saud, M. Sonography of multifocal hydatidosis involving lung and liver in a female child. Journal of Medical Ultrasound. 40 (4), 471-474 (2013).
- Hikaru, N., et al. Histological analysis of 70-nm silica particles-induced chronic toxicity in rats. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72, 626-629 (2009).
- Sun, L., et al. Cytotoxicity and mitochondrial damage caused by silica nanoparticles. Toxicology in Vitro. 25, 1619-1629 (2011).
- Hikaru, N., et al.
- Liu, T. I., et al. Single and repeated dose toxicity of mesoporous hollow silica nanoparticles in intravenously exposed mice. Biomaterials. 32, 1657-1668 (2011).
- Ding, M., et al. Diseases caused by silica: Mechanisms of injury and disease development. International Immunopharmacology. 2, 173-182 (2002).
- Shen, J., et al. The dosage-toxicity-efficacy relationship of kansui and licorice in malignant pleural effusion rats based on factor analysis. Journal of Ethnopharmacology. 186, 251-256 (2016).
- Ji, J. H., et al. Twenty-eight-day inhalation toxicity study of silver nanoparticles in Sprague-Dawley rats. Inhalation Toxicology. 19 (10), 857-871 (2007).
