Summary
여기, 선물이 polyacrylate/nanosilica의 intratracheal 주입에 의해 쥐에서 흉 막 유출 모델을 구성 하는 프로토콜.
Abstract
흉 막 유출은 많은 폐 질병의 유행 임상 발견. 유용 동물 흉 막 유출 모델 데 이러한 폐 질병을 공부 하기 아주 중요 하다. 이전 흉 막 유출 모델 환경에서 나노 입자 보다는 생물학적 요인에 더 많은 관심을 지불. 여기, 우리는 모델 polyacrylate/nanosilica의 intratracheal 주입에 의해 쥐에서 흉 막 유출 및 흉 막 유출에 나노 절연 방법 소개. 3.125, 6.25, 12.5 mg/kg∙mL의 농도가 polyacrylate/nanosilica의 intratracheal 점, 여 주 3, 6.25와 12.5 mg/kg∙mL 그룹에서 7-10 일에 정점에 쥐에 흉 막 유출 다음 천천히 감소 하 고 하루 14에서 사라졌다. Polyacrylate/nanosilica의 농도 증가, 흉 막 유출은 생산 더 빠르고. 흉 막 액이 초음파 검사 또는 CT 가슴 검색 및 쥐의 해 부에 의해 확인 검색 되었습니다. 실리 카 나노 입자는 전송 전자 현미경으로 쥐의 흉 막 유출에서 관찰 되었다. 이 결과 polyacrylate/nanosilica에 노출 흉 막 유출, 인 간에 있는 우리의 이전 보고서와 일치 했다의 유도에 이르게 했다. 또한,이 모델 nanotoxicology와 흉 막 유출 병의 추가 연구에 대 한 도움이 됩니다.
Introduction
흉 막 유출 원인의 다양 한 폐 질환의 매우 일반적인 임상 형상 이다. 데 유용한 동물 흉 막 유출 모델 공부 이러한 폐 질환, 2 개의 흉 막 층, 흉 막 유출, 메커니즘 및 치료의 역할을 매우 중요 하다. 그러나, 일부 악성 흉 막 유출 또는 생물학적 요인 보다는 환경1,2에서 나노 입자에 주로 초점을 흉 막 유출 모델 보고. 여기, 우리는 간단 하 고 안전 하 고 효과적인 흉 막 유출의 새로운 모델을 소개 합니다.
나노기술의 발전과 nanoproducts의 광범위 한 사용 환경 및 인간의 건강3,4나노의 잠재적인 위험에 대 한 우려가 있다. 나노 위험 요소를 소개 하 고 잠재적으로 직장 내에서 또는 환경 오염을 통해 새로운 위험으로 이어질. 생체 외에서 그리고 vivo에서 학문은 보여준다 폐, 심장, 간, 신장, 그리고 신 경계 뿐만 아니라 생식과 면역 체계의5,6에 나노 다중 장기 손상에서 발생할 수 있습니다. 또한, 일부 연구 보고 특정 독성 나노 재료의 그들의 독특한 물리 화학적 특성3,,47때문 이었다.
우리는 나노에 직업 노출 노동자의 그룹 임상 흉 막 및 pericardial 유출, 폐 섬유 증과 육아8,9발표 보고 있다. 실리 카 나노 입자는이 환자의 흉 막 유출9에서 고립 되었다. 재현 하 고 인간의 흡입된 나노 입자에 의해 유도 된 흉 막 유출 확인, 우리 실시 실험 polyacrylate/nanosilica (PA/NPSi)를 주입 하 여 실제 인간의 호흡 유사 쥐에 호흡기를 통해 환경, 그 intratracheal을 발견 하 고 PA/NPSi의 주입 쥐에서 흉 막 유출 될 수 있습니다. 여기, PA/NPSi의 intratracheal 주입에 의해 쥐에서 흉 막 유출 확인 하는 방법과 흉 막 유출에 나노 입자를 분리 하는 방법을 소개 합니다. 이 모델은 nanotoxicology와 흉 막 유출 병의 추가 연구에 대 한 유용할 수 있습니다.
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Protocol
연구 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 수도 의과대학 (베이징, 홍보 중국)의 지침을 따라. 모든 절차는 동물 윤리 위원회의 자본 의료 대학 중국에 의해 승인 되었다.
1. 실험 준비
참고: 적응 여성 특정 병원 체 무료 Wistar 쥐 (무게: 200 ± 10g) 1 주일 전에 관리에 대 한 실험 환경 (환경 조건: 빛 / 어둠: 12 h/12 h, 온도 22 ± 2 ° C, 습도 50 ± 10%).
- 3.125, 6.25, 12.5 mg/mL, 각각10의 농도에 정상적인 염 분에 희석 PA/NPSi 정지 (현장에서 에멀젼 중 합 nanosilica Ø:20 ± 5 nm)의 신선한 10 mL을 사용 합니다. 관리, 전에 나노 집계를 방지 하기 위하여 20-30 분 동안 정지 하 고 10 분에 대 한 소용돌이 sonicate.
- 똑같이 20 쥐의 총 4 개 그룹으로 분할: PA/NPSi의 각 농도 대 한 한 그룹 (0, 3.125, 6.25, 그리고 12.5 mg/mL).
- 그들 anesthetize, 에테르 (99.5%)의 1.5 mL와 닫힌된 컨테이너에 쥐를 배치 또는 다른 승인 IACUC 프로토콜입니다. 후에 마 취의 60-90 s, 페달 반사 응답의 부족에 대 한 확인 합니다. 쥐가 호흡을 확인 합니다.
- 보드에 마 취 쥐를 넣고 너무 보드에 나일론의 소독에 앞 니를 수정.
- 입을 열고 수술 집게와 정면 렌즈의 도움으로 glottis의 그것의 균열을 노출 합니다.
- 쌓아 소독된 무딘 바늘으로 양자 기관지에 좋은 튜브를 사용 하 여 1 mL의 총 각 쥐의 폐에 PA/NPSi 서 스 펜 션의 0.5 mL와 쥐.
- 부정사 위치에 쥐를 5-10 분에 천천히 복구 하자 플라스틱 보드에 쥐를 놓습니다.
2. 흉 막 유출에 대 한 초음파 검사
- 선형 배열 트랜스듀서는 초음파 시스템 사용 (주파수: 8 MHz) 1, 3, 7 및 14 일10에 쥐를 검사.
- 쥐에 게 마 취 (10 %chloral 하이드 레이트, 0.35 mL/100 g, i.p.) 고 페달 반사의 부족에 대 한 확인 합니다.
- 쥐의 가슴 및 위 복 부는 전기 면도기를 사용 하 여에서 머리를 제거 합니다. 다음 부정사 위치에 장착 플레이트에 쥐를 놓습니다.
- 코팅된 젤으로 피부를 커버 하 고 있는 공간에 subcostal 영역 검출 흉 막 액을 변환기를 두고.
참고:는 토로 정확 하 게 탐지 하기 위해 왼쪽 및 오른쪽 측면 위치 선정 되었다 초음파 검사 수행. - 초음파 검사와 하자 쥐 10 분에 천천히 복구 후 부정사 위치에 플라스틱 보드에 쥐를 넣어.
3입니다. 가슴 CT 흉 막 유출에 대 한 검색
- 7-14 일 후 관리에 10 %chloral 하이드 레이트 (i.p)와 쥐를 anesthetize. 쥐 페달 반사 반응 하지 않는 경우 마 취의 충분 한 깊이 고려 합니다.
참고: 7 일 후 관리는 CT 스캔 하 여 흉 막 유출 관찰 하는 가장 적절 한 시간. - 경향이 위치에 플라스틱 시트에 쥐를 놓고 다음 다음 설정을 64 채널 ct. 사용을 사용 하 여 흉 막 유출 조사 하는 가슴을 스캔: 64 mm x 0.625 m m 검출기 구성 120 kV (피크), 및 350 마스.
4. 흉 막 유출 및 흉 막 유출에 나노 입자의 절연의 수집
- 후 가슴 CT 검색과 쥐의 아래 chloral 수화물의 마 취는 쥐의 페달 반사를 확인, 가슴, 복 부에서 머리를 면도 및 다음 요오드에 의해 피부를 소독.
- 외과 영역에 쥐를가지고.
- 마 취, 신속 하 게 피부와 복 부 근육의 1-1.5 cm 그대로 횡 경 막과 중간 선 따라 칼 잘라.
- 조심 스럽게 가슴 열고 양측 흉 막 구멍 핀셋, 특히 양측 늑 골 인할지 각도의 도움으로 검사 합니다. 2 mL의 멸 균 주사기와 빛 노란색 흉 막 유출의 1-2 mL를 수집 합니다.
- 완료 되 면, 승인 IACUC 프로토콜 쥐를 희생.
- 300 x g 에서 15 분 동안 2 mL 튜브에 흉 막 유출은 나노 입자를 분리 하기 위해 원심.
- 상위 레이어의 밝은 액체를 한 방울도 사용 하 고 60-80 kV의 가속 전압에서 전송 전자 microscope(TEM,) 아래 합니다.
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Representative Results
흉부 초음파를 사용 하 여, 우리 모든 그룹에서 1 일 없는 흉 울트라 바이올렛 effusions를 발견. 그러나, 3 일, 흉 막 유출 6.25와 12.5 mg/kg∙mL 그룹에 등장. 주로 오른쪽 늑 골 인할지 각도 pericardial 유출만 12.5 mg/kg∙mL 그룹에서 제시 하는 동안에 유출이 했다. 또한, 7 일에 흉 막 유출 (비디오 1)와 pericardial 유출 (비디오 2) 6.25 mg/kg∙mL 그룹 (그림 1)에서 발견 되었다. 흉 막 유출 7-10 일에 가장 큰 정도로 서서히 증가 하 고 점차적으로 감소. 14 일에 아니 흉 막 유출 모든 그룹에서 더 이상 하지만 늑 막의 접착의 부호와 함께 발견 되었다. 10
7과 14 일, 거기 3.125 6.25 mg에 흉 막 유출의 흔적/kg∙mL 그룹10. 그러나, 12.5 mg/kg∙mL 그룹에서 가슴 CT 검사 (그림 2a, b) 흉 막 유출의 작은 금액을 암시 무딘 후부 costophrenic 각으로 비정상적인 했다. 유체 레벨의 흔적 관찰 되었다, 때문에 물의 부족 한 양을 설명 했다.
쥐의 해 부, 시 3-7 일에는 6.25 mg/kg∙mL 및 12.5 mg/kg∙mL 그룹에 황색 또는 무색 울트라 바이올렛 effusions 관찰합니다. 흉 막 유출의 볼륨 1-1.8 mL 6.25 mg/kg∙mL 및 12.5 mg/kg∙mL 그룹에 각 흉 막 캐비티에에서 변화 한다. 3.125 mg/kg∙mL의 그룹에서 흉 막 구멍에 아무 액체 전체 실험 과정에서 나타났다.
가장, 개별적으로 제시 하는 NPSi 나노 입자 및 클러스터 형성 물기 흉 막 액에서 했다. 평균 직경 (Ø: 20 ± 5 nm) 흉 막 액에서 형태는 준비에 NPSi와 일치 했다. 나노 입자는 대부분 구형 하 고 잘 분산 하 고 개별 나노 입자의 평균 크기는 ~ 20 ± 5 nm (그림 3a, b).
그림 1 : 제 7 일에 sonographic 발견 하 여 흉 막 유출의 대표 이미지. (a, b) 흉 막 및 pericardial 충 치에 없는 액체로 3.125 mg/kg∙mL 그룹에 쥐에서 sonographic 이미지. (c, d) 명백한 흉 막 유출 및 pericardial 유출 6.25 mg/kg∙mL 그룹에 쥐에서 sonographic 이미지. (e, f) 흉 막 및 pericardial 충 치에 더 많은 유체와 12.5 mg/kg∙mL 그룹에 쥐에서 sonographic 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 쥐에서 흉부 CT 이미지의 대표 이미지. 흉 막 유출 (는) 및 무료 액체의 부정적인 찾는 12.5 mg/kg∙mL 그룹에 쥐 하지만 흉 막 캐비티 (b)에 무딘 후부 costophrenic 각에서 CT 이미지 없이 3.125 mg/kg∙mL 그룹에 쥐에서 CT 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 실리 카 나노 입자 polyacrylate/nanosilica 펜션과 쥐의 흉 막 유출에. (한) 실리 카 나노 입자 polyacrylate/실리 카 나노에. (b) 실리 카 나노 클러스터 또는 개별 양식 쥐의 흉 막 유출에. 눈금 막대: 200 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
비디오 1입니다. 6.25 mg/kg∙mL 그룹에 쥐에 흉 막 유출. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
비디오 2입니다. 6.25 mg/kg∙mL 그룹에 쥐에 pericardial 유출. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
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Discussion
초음파는 폐 질환, 흉 막 캐비티11무료 액체에 그것의 우수한 감도 때문에 확인 하기 위한 가장 편리한 도구입니다. 초음파 공기와 폐12에서 체액의 음향 임피던스에 대비를 즉시 검색할 수 있습니다 때문입니다. 게다가, 초음파는 중부 보다 작은 동물 모델에서 더 유연 그럼에도 불구 하 고, 폐에 공기는 음파를 반영 하 고 나노 주입 후 intrapulmonary 변화를 관찰에서 장애가. 따라서, 우리는 가슴 CT 검사 및 폐 초음파 intrapulmonary 변경 및 흉 막 액 조사를 결합.
영상 데이터를 탐색, 후 우리 놀라운 이미징 결과 발견. 첫째, 우리의 모델 PA/NPSi, 실제로 흉 하 고 쥐 모델에서 초기 단계에서 pericardial 토로로 각 성 했다 특이 한 독성을 유발 하는 설명 했다. 둘째,이 모델은 성공적으로 복제 발생과 인간 polyserous 울트라 바이올렛 effusions;의 개발 한편, 이러한 프로세스는 흉 막 및 pericardial 유출, 폐 섬유 증과 육아8,9제시 우리의 환자에서 관찰 되었다. 따라서, 이러한 사실을 암시는 흉 막 또는 pericardial 막 같은 묽 막 이었다 PA/NPSi의 부상 목표 중 하나는 비슷한 자연에서 석면으로 인 한. 또한, polyserous 울트라 바이올렛 effusions의 타임 라인은 우리의 연구 결과 의해 결론으로 의미 있는.
우리의 모델의 디자인, intratracheal 문제는 중요 한 단계 이었다. 이 방법은 나노 입자의 독성은 이전 연구13tracheal을 통해 본문을 입력 한 확인 했습니다. 그러나,이 방법의 죄수 했다 다음과 같습니다: PA/NPSi 필수 기관 및 그것의 자극으로 인해 발생 하는 기침에 기계적 손상을 방지에 매우 실험적인 기술 미세 관으로 양자 기관지로 얻은 했다. 따라서, 한계점 intratracheal 주입의 적절 한 깊이 했다. 한편, 적절 한 마 취 유지 전술 단계에 중요 했다.
나노 입자를 사용 하 여, 연구 목적에 대 한 미세 입자는 점점 더 많은 관심을 따기. 미세 입자의 작은 직경 더 도전적인 그들을 보호 하는. 다른 한편으로, 20 ± 5 nm의 직경을 가진 나노 실리 카는 실제로 증가 직경의 감소와 어려움에 발생 하는이 연구를 위해 준비 하는 높은-기술 준비 방법이 필요 합니다. 따라서, 우리의 기술 프로 중 하나 이었던 이전 연구13,14보다 작은 나노 실리 카의 직경 이었다. 이 연구의 또 다른 장점은 우리가 나노 tracheal 통해 보다 피부 또는 순환13,,1516유도 했다. 예를 들어 정 맥 노출 조사 대상 기관 또는 보조 손상에 의해 유발의 상해를 구분 하기 어려운 대상 기관에서 우리를 방해. 따라서, 우리의 의견으로, intratracheal 문제는 다가오는 미래에는 폐의 나노 독성을 조사 하는 가장 좋은 방법은 여야 한다. 게다가, 나노 입자의 복용량 보다는 이전 연구13, 더 높은 비용 효율성 비율을 제시 했다.
흉 막 및 PA/NPSi에 의해 유도 된 pericardial 유출, 염증 반응 및 반응 산소 시스템 (선생님)의 생산을의 원인 것입니다. 우리는 다음과 같이 설명 했다: 첫째로,는 nanosilica 선생님 농도 증가, 염증 성 생산 유발, 미토 콘 드 리아 도발은 원인과 감소 티 레벨 두 vivo에서 그리고 생체 외에서5,6. 둘째, 염증 및 선생님의 생산 폐 또는 승진 끝에 흉 막 유출의 형성은 흉 막 모세 혈관의 침투성에 틈새 액체 증가. 게다가, 흉 막 림프의 잠재적인 장애 또한 흉 막 액의 축적에 참여 수 있습니다. 흉 막 액의 더 많은 누적 된 삼 압력 증가 했다는 마지막으로 흉 막 캐비티에 PA/NPSi의 증 착을 유도. 이 결과 우리의 이전 동물 실험과 일치 고 보고 환자8,10.
흉 막 유출 자체, 대 한 병원에서 유행 했다. 그럼에도 불구 하 고, 많은 호흡기 또는 조직의 질병 흉 막 유출이 될 수 있습니다. 따라서, 동물 모델을 구축 하는 것은 흉 막 유출의 etiological 연구를 혜택 것 이다. 이전 연구 보고 nanosilica13,17의 폐 독성. 그러나, 이전 보고 흉 막 유출 모델 나노18,19보다는 생물학적 요인에 주로 집중. 따라서, 나노 입자의 복용량 열려있는 문제에 남아 있었다. 우리의 모델 시연 6.25 mg의 PA/NPSi 집중 후 3 일에 발생 한 흉 막 유출/kg∙mL intratracheal 주입에 의해 관리 하 고 7-10 일에 만족 했다. 또한,와 함께 펜 실바 니 아/NPSi, 제작 더 빠르고 흉 막 유출의 농도 증가. 또한, 흉 막 유출의 우리의 모델 잘 제어 하 고 효과적인 했다 생물학 모델18,19와 비교. 정리해 보면, 우리의 모델 특히 nanotoxicity의 추가 연구에 관해서는 흉 막 유출 뿐만 아니라 질병의 미래 연구에 대 한 도움이 될 것 이다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
현재 연구 및 생산이이 문서에는 국가 자연 과학 재단의 중국 (그랜트 81773373, 81172614 및 그랜트 81441089)에 의해 투자 되었다. 우리 박사 진 연의 박사 팬 유지, 응급 부, 북경 조 양 병원의 박사 숨어 펭의 부의 초음파 의학, 북경 조 양 병원 도움 비디오 제작에 대 한 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acuson S2000 Color Doppler ultrasound system | Siemens Medical Solutions, Mountain View ,CA | ||
| Polyacrylate/nanosilica | Fudan University,Shanghai, China | made by order with nanosilica(20±5)nm | |
| 10% chloral hydrate | Beijing Chemical Works | 302-17-0 | |
| Light speed 16 spiral computed tomography | GE Healthcare, US | ||
| Specific pathogen-free Wistar | Animal Center of Lianhelihua (Beijing, China) | Wistar rats |
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