Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Stabiele DNA motieven, 1D en 2D nanostructuren opgebouwd uit kleine cirkelvormige DNA-moleculen

Published: April 12, 2019 doi: 10.3791/58744
Automatic Translation
1, 1, 1
1State Key Laboratory of Coordination Chemistry, School of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing University

Summary

Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor T4 afbinding en denatureren pagina zuivering van kleine cirkelvormige DNA moleculen, gloeien en inheemse pagina analyse van circulaire tegels-, montage- en AFM beeldvorming van 1D en 2D DNA nanostructuren, evenals agarose gel elektroforese en centrifugeren zuivering van eindige DNA nanostructuren.

Abstract

Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor synthese van kleine cirkelvormige DNA moleculen, gloeien van circulaire DNA motieven, en de bouw van 1D en 2D DNA nanostructuren. Decennia, wordt de snelle ontwikkeling van DNA nanotechnologie toegeschreven aan het gebruik van de ANI van de lineaire als het uitgangsmateriaal. Bijvoorbeeld, staat de tegel DAO (dubbel crossover, antiparallel, vreemd half-draais) bekend als een bouwsteen voor bouw van 2D DNA roosters; de structuur van de kern van DAO bestaat uit twee lineaire single-stranded (ss) oligonucleotides, zoals twee touwen maken een rechterhand granny knoop. Hierin, een nieuw soort DNA tegels genaamd cDAO (gekoppelde DAO) zijn gebouwd met behulp van een kleine cirkelvormige ss-DNA van c64nt of c84nt (circulaire 64 of 84 nucleotiden) als onderdeel van de steiger en verschillende lineaire ss-Ani als het nietje strengen. Perfecte 1D en 2D nanostructuren zijn samengesteld uit cDAO tegels: oneindige nanowires, nanobuisjes, nanospirals en nanoribbons; en eindige nano-rechthoeken. Gedetailleerde protocollen worden beschreven: 1) voorbereiding door T4 ligase en zuivering door denaturering van de pagina (polyacrylamide gelelektroforese) van kleine cirkelvormige oligonucleotides, 2) gloeien van stabiele cirkelvormige tegels, gevolgd door inheemse pagina-analyse, 3) monteren van oneindige 1D nanowires, nanorings, nanospirals, oneindige 2D roosters van nanotubes en nanoribbons en eindige 2D nano-rechthoeken, gevolgd door de AFM (Atomic Force microscopie) imaging. De methode is eenvoudig, robuust en betaalbaar voor de meeste labs.

Introduction

DNA-moleculen zijn gebruikt om te bouwen van allerlei nanostructuren decennia. Typische motieven omvatten DAE (dubbele crossover, antiparallel, zelfs half-draais) en DAO tegels1,2,3, star tegels4,5,6,7, single gestrand (ss) tegels8,9,10, en DNA origami11,12,13. Deze DNA motieven en roosters zijn samengesteld uit lineaire ss-Ani. Onlangs, anderen en we hebben het gebruik van circulaire ss-oligonucleotides gemeld als steigers bouwen motieven, nanotubes 1D en 2D roosters14,15,16,17. Door het invoegen van een Holliday junction (HJ)18,19,20,21 in het midden van c64nt, kunnen een paar van twee gekoppelde DAO tegels gevormde17. Dit nieuwe cDAO motief en derivaten daarvan zijn stabiel en stijf genoeg te monteren 2D DNA roosters maximaal 3 × 5 µm2. In deze paper gebruiken we een term voor "circulaire tile", die is gedefinieerd als een stabiele complexe DNA-molecule met de geconstrueerd met een cirkelvormige steiger en andere lineaire nietjes van ss-oligonucleotides, en een andere term voor "lineaire tile", die is opgebouwd uit een volledige reeks van lineaire SS-oligonucleotides.

Dit protocol laat zien hoe de bouw van vijf soorten DNA nanostructuren met kleine cirkelvormige DNA moleculen als steigers: 1) oneindige nanowires van 1 D c64nt en c84nt, 2) een oneindige 2D cDAO-c64nt-O en cDAO-c64nt-E (-O vertegenwoordigt een oneven aantal 5 half-draais en -E vertegenwoordigt een even getal van 4 half-draais) roosters, 3) oneindige 2D cDAO-c84nt-O en cDAO-c84nt-E roosters, 4) eindig 2D 5 × 6 cDAO-c64nt-O en 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O rechthoeken, 5) oneindige 1 D acDAO-c64nt-E nanorings en nanospirals (Zie Figuur 3-5 voor de schematische tekeningen en beelden van de bovenstaande vijf soorten DNA nanostructuren). De 1D-c64nt en c84nt-nanowires zijn samengesteld uit elke steiger van het c64nt en c84nt respectievelijk twee lineaire nietjes is gekoppeld. Elke ronde tegel van de cDAO-c64nt, acDAO-c64nt, cDAO-c74nt of cDAO-c84nt is respectievelijk van de overeenkomstige steiger of c64nt, c74nt, c84nt met vier lineaire nietjes gegloeid. De oneindige 2D roosters zijn samengesteld uit hetzelfde soort twee cirkelvormige tegels met verschillende reeksen. De twee eindige 2D rechthoek roosters zijn samengesteld uit twee sets van 32 circulaire sub stenen respectievelijk. Om geld te besparen, wordt slechts één-sequenced c64nt, c74nt en c84nt gebruikt als de respectieve steiger terwijl verschillende overhangen worden gebruikt om te ontharden de 32 cDAO-c64nt, 12 cDAO-c74nt en 20 cDAO-c84nt circulaire sub tegels respectievelijk in sub tegel onthardende eerst, vervolgens Meng de overeenkomstige 32 circulaire sub tegels en toepassing van het tweede lattice gloeien stap om te assembleren de eindige 5 × 6 cDAO-c64nt-O en 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O roosters, respectievelijk. Zeker, anders sequenced circulaire steigers worden aangenomen om te verzamelen van een verscheidenheid van eindige grootte nanostructuren, maar het kost meer geld en arbeid. De oneindige 1D acDAO-c64nt-E nanorings en nanospirals zijn uit één-sequenced asymmetrische acDAO-c64nt-tegels met lineaire Connecties van een even aantal 4 half-draais gegloeid. Er zijn twee benaderingen te monteren van oneindige 2D roosters van circulaire tegels van cDAO-c64nt en cDAO-c84nt, die respectievelijk door de intertile afstanden uit een even aantal 4 en een oneven aantal 5 half-beurten worden onderscheiden. De voormalige vereist alle tegels worden uitgelijnd identiek; de laatste vereist afwisseling van de gezichten van twee naburige tegels langs de spiraalvormige assen. Als de tegel rigide en vlakke, zoals cDAO-c64nt is, beide benaderingen zal het genereren van vlakke nanoribbons; Als de tegel is gebogen naar één richting, zoals cDAO-c84nt, de intertile aansluiting van een even aantal 4 halve bochten genereert nanobuisjes, overwegende dat de intertile aansluiting van een oneven aantal 5 halve bochten zal produceren vlakke nanoribbons als gevolg van de afschaffing van kromming-vooringenomen groei door alternatieve uitlijning van gebogen tegels. De succesvolle vergadering van 1D en 2D DNA nanostructuren van circulaire tegels geeft verschillende voordelen van deze nieuwe aanpak: stabiliteit en stevigheid van circulaire tegels over lineaire tegels, chirale tegels voor montage van asymmetrische nanostructuren zoals afgedwongen nanorings en nanoribbons, nieuwe visies op het begrip van de mechanica van het DNA en moleculaire structuren, enz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bereiding van de ANI van de circulaire

  1. Gebruik alle lineaire Ani geboden door commerciële bedrijven direct zonder verdere zuivering.
  2. Centrifugeer de DNA-monsters bij 5.000 × g gedurende 5 min voor het verzamelen van alle DNA-pellets op de bodem van de buizen. Het toevoegen van een passende hoeveelheid TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) te ontbinden van het DNA.
  3. Meten van de concentratie van "a" ng/µL voor elke oplossing van de ss-DNA met behulp van een micro UV-spectrometer op 260 nm. "A" ng/µL converteren naar "b" µM na b = een × 10-3 / (molecuulgewicht van het DNA onderdeel). De hoeveelheid TE oplossing voor het maken van een 10 µM DNA stamoplossing aanpassen.
  4. T4 DNA ligase gebruiken om verbinding te maken met de uiteinden van het 3' en 5' 5'-phosphorylated lineaire DNA sjablonen ( Figuur 1) van c64nt, c74nt en c84nt voorzien van commerciële bedrijven rechtstreeks.
  5. Meng de 5'-phosphorylated lineaire bundel van DNA (3,5 µM) en de bijbehorende splint bundel van DNA (4.5 µM) in 80 µL TE buffer in een 200 µL PCR reageerbuis15. Incubeer de buis in een open thermo fles gevuld met 95 ° C water. Het warme water tot kamertemperatuur (25 ° C) afkoelen voor ongeveer 2-3 uur onder de lab-sfeer.
  6. Voeg 10 µL van 10 x T4 buffer (660 mM Tris-HCl, 66 mM MgCl2, 100 mM DTT, 1 mM ATP) en 10 µL van T4 ligase (300 U/µL) aan het mengsel tot een eindvolume van 100 µL. het mengsel in een thermocycler Incubeer gedurende 16 uur bij 16 ° C.
    Opmerking: De bovenstaande DNA concentraties en het volume van de reactie van ~ 100 µL zijn geoptimaliseerd voor de hoge afbinding efficiëntie en het hoge rendement van juiste oligo-monomeer cyclisatie. Twee of meer buizen van afbinding reacties in de zelfde tijd volgens de proefopzet worden uitgevoerd. Een alternatieve incubatie procedure voor afbinding vervangt stap 1.6 is 4 uur bij 25 ° C.
  7. Na de incubatie, inactivering van de T4 ligase in 95 ° C water voor 5 minminutes. Vervolgens de buis overbrengen in een waterbad van ijs en incubeer gedurende 5 minuten afkoelen.
  8. Voeg 10 µL van 10 x Exonuclease ik buffer en 10 µL van Exonuclease ik (5 U/µL) aan het mengsel gehard en Incubeer de buis bij 37 ° C in een waterbad voor 30 min te selectief verteren de resterende lineaire ANI's en de circularized Ani intact laten.
  9. Een 10% denaturering pagina gel voor te bereiden.
    1. Draag rubberen handschoenen en bril bij de voorbereiding van het gel van de pagina in de zuurkast. Voeg 6.67 mL van 30% (g/v) oplossing van acrylamide/bisacrylamide (19:1), 2 mL 10 x TAE· Mg buffer (40 mM Tris, 40 mM HAc, 1 mM EDTA, pH 8.0, 12.5 mM Mg(Ac)2), 8,4 g ureum (7 M) en gedeïoniseerd water tot een eindvolume van 20 mL in een centrifugebuis 40 mL.
      Let op: De oplossing van de acrylamide/bisacrylamide oplossing (19:1) 30% (g/v) is giftig.
    2. Voeg 20 µL van tetramethylethylenediamine (TEMED) en 100 µL van ammoniumnitraat persulfate (APS, 10% w/v) tot de 40 mL tube voor overdracht de gel-oplossing voor de Elektroforese van het systeem onmiddellijk. Een 1.5 mm dik en 10-well kam invoegen. Minstens 20 min wachten voor de oplossing van de gel is gestold.
    3. Instellen van een constante spanning van 80 V voor een gel van 85 × 80 × 1.5 mm3 (breedte × hoogte × dikte). 1 x TAE· toevoegen De buffer van de mg aan de Elektroforese van het systeem en prerun de gel voor 20 min 10 V/cm.
  10. Zet de PCR-test-buis van stap 1.8 in 95 ° C water gedurende 5 minuten aan de inactivering van Exonuclease ik. Vervolgens de buis overbrengen in een waterbad van ijs en incubeer gedurende een ander 5 min.
  11. Voeg 20 µL van formamide in de buis tot een eindvolume van 140 µL en meng de oplossing. De oplossing voor 7-9 denatureren pagina gel putjes even met 16-20 µL voor elke gel goed verdelen. Meng 2 µL van het laden van de kleurstof (0.05% bromophenol blauw, 0.05% xyleen cyanol FF, 60% glycerol, 10 mM Tris-HCl, 60 mM EDTA, pH 7,6) met 8 µL van de corresponderende lineaire DNA van de voorloper (10 µM) en spuit het mengsel bij een afzonderlijke bron voor verwijzing.
    Opmerking: De toevoeging van formamide is te verhogen van de dichtheid van het laden oplossing voor het zinken naar de bodem van de pagina gel goed en ook om zich te distantiëren van sommige dubbele strandde DNA residuen.
  12. Voer de gel voor ongeveer 2 h 10 V/cm en stoppen wanneer xyleen cyanol FF op de positie van de 2/3 van de glasplaat met het blote oog is.
  13. Draag rubberen handschoenen en bril om huiden en ogen te beschermen. Neem de gel uit de glasplaat. Plaats de gel op een fluorescerende TLC (dunne laag chromatografie) plaat. De gel doelbandbreedtes afgesneden door een scheermesje zo precies als schaduw door UV-bestraling (Figuur 2).
    Let op: Het UV-licht is schadelijk voor de ogen en huiden.
    Opmerking: Onder UV bestraling bij 254 nm DNA zal absorberen het licht en werpen een schaduw op de TLC-plaat. De circulaire DNA liep iets langzamer dan de overeenkomstige voorloper lineaire DNA. Sommige onverteerd lineaire Ani en ongewenste circulaire ANI in kleine hoeveelheden die de schaduw doel band omringen zal vervuilen de circulaire DNA als ze verzameld worden.
  14. Breng de gel bands in een tube van 2,0 mL microcentrifuge. Droge lucht of klap drogen de gel bands en vervolgens Prak de gels tot een pasta met een spatel of de afgeplatte roerstaaf. Zorg ervoor dat de gel heeft is volledig verpletterd in een pasta, die essentieel zijn voor het hoge rendement van circulaire DNA. Voeg twee keer van de gel volume gedeïoniseerd water in de buis en schud de buis bij kamertemperatuur 's nachts.
  15. Filtreer het mengsel voor het verzamelen van het supernatant in een tube van 2,0 mL microcentrifuge. Eventuele resterende DNA herstellen door spoelen met kleine hoeveelheid gedeïoniseerd water en filter opnieuw te combineren het supernatant.
  16. Pak het eluent met gelijke volume van n-butanol. Herhaal deze procedure totdat het waterige volume is teruggebracht tot ongeveer 200 µL.
  17. Voeg 500 µL van absolute ethanol (−20 ° C) en 20 µL van 3 M NaOAc (pH 5.1) aan het mengsel voor DNA neerslag. Opslaan van de buis op −20 ° C gedurende 30 minuten.
  18. Centrifugeer de buis bij 12.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 ° C, de vloeistof wordt weggeworpen. De resterende DNA neerslag is ongeveer 100 µL in de buis.
  19. Voeg 600 µL van 75% ethanol (−20 ° C) aan de buis en sla het op −20 ° C gedurende 30 minuten. Centrifugeer bij 12.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 ° C, verwijder dan het supernatant. De resterende DNA neerslag is ongeveer 100 µL oplossing in de buis opnieuw. Herhaal de procedure twee keer.
  20. Na de laatste centrifugeren, verwijder het supernatant zoveel mogelijk. Droog de resten met een vacuüm concentrator.
  21. Winkel de gezuiverde circulaire DNA in de buis bij −20 ° C.
  22. Resuspendeer de circulaire DNA in TE buffer te maken van een 10 µM circulaire DNA stamoplossing volgens stap 1.3 wanneer nodig.

2. gloeien van montage oplossingen

  1. Voorbereiden op elke tegel of nanostructural vergadering oplossing te zijn voor c64bp, c84bp, HJ-c64nt, aHJ-c64nt, HJ-c84nt, tHJ-c84nt, cDAO-c64nt, acDAO-c64nt, cDAO-c84nt, c64nt, c84nt en acDAO-c64nt-E met een ontworpen set van lineaire en circulaire ANI's één-pot gloeien.
    1. Voor elke vergadering oplossing, Meng 2 µL van 10 x TAE· Mg buffer, 1 µL van elk DNA-stockoplossing van een verzameling van lineaire en circulaire strengen in gelijke molaire ratio's, en extra TE buffer in een reageerbuis van 200 µL PCR tot een uiteindelijke concentratie van elk onderdeel op 0,5 µM en een eindvolume van 20 µL. Anneal de oplossing van de vergadering in een Thermo fles van 95 ° C tot 25 ° C meer dan 48 uur.
  2. Voorbereiden op elke vergadering oplossing van 2D oneindige roosters van cDAO-c64nt-E, cDAO-c64nt-O, cDAO-c84nt-E en cDAO-c84nt-O met een ontworpen set van lineaire en circulaire ANI in twee stappen gloeien.
    1. Bereid elke voorloper sub tegel montage oplossing door het mengen van 2 µL van 10 x TAE· Mg buffer, 1 µL van elk DNA-stockoplossing van een verzameling van lineaire en circulaire strengen in gelijke molaire verhoudingen, en extra TE buffer in een reageerbuis van 200 µL PCR een eindconcentratie van 0,5 µM voor elk onderdeel en een eindvolume van 20 µL. Anneal in de eerste sub tegel onthardende stap, elke voorloper sub tegel oplossing in een PCR thermocycler methode een snelle-lineaire koeling van 95 ° C tot 25 ° C meer dan 2,5 h.
    2. Bereid de oplossing van elke vergadering van de bovenstaande vier oneindige roosters door het mengen van 10 µL van elk van de twee bijbehorende sub tegel oplossingen samen voor een eindconcentratie van 0,25 µM voor elk onderdeel. Anneal in het tweede lattice gloeien stap, het 20 µL mengsel in een PCR thermocycler met een langzame koeling methode van verblijf bij 50 ° C voor 2 h en afkoeling met een snelheid van 0,1 ° C per 5 minuten tot 20 ° C, ongeveer 24 uur in totaal.
      Opmerking: Twee parallelle experimenten kunnen worden uitgevoerd gelijktijdig of later in de tweede onthardende stap voor elk 2D oneindige lattice.
  3. Voorbereiden op montage oplossingen van twee vergaderingen van de eindige rechthoek van 5 × 6 cDAO-c64nt-O en 5 × 6 cDAO-c74 & c84nt-O in twee stappen gloeien.
    1. Bereid elke voorloper sub tegel montage oplossing door het mengen van 1 µL van 10 x TAE· Mg buffer, 0,5 µL van elk DNA-stockoplossing van een verzameling van lineaire en circulaire strengen in gelijke molaire verhoudingen, en extra TE buffer in een reageerbuis van 200 µL PCR een eindconcentratie van 0,5 µM voor elk onderdeel en een eindvolume van 10 µL. Anneal in de eerste onthardende stap, elke voorloper sub tegel oplossing in een PCR thermocycler methode een snelle-lineaire koeling van 95 ° C tot 25 ° C meer dan 2,5 h.
    2. Bereid elke eindige rechthoek rooster montage oplossing door het mengen van 32 x (2 µL van elke oplossing sub tegel) samen in een reageerbuis van 200 µL PCR om een eindconcentratie van ~ 15 nM voor elke sub tegel en een eindvolume van 64 µL. Anneal in de tweede onthardende stap, het 64 µL mengsel in een PCR thermocycler met een langzame koeling methode van verblijf bij 50 ° C voor 2 h en afkoeling tegen een tarief van 0,1 ° C per 5 minuten tot 20 ° C, ongeveer 24 uur in totaal.
      Opmerking: Vijf parallelle experimenten kunnen worden uitgevoerd gelijktijdig of later in de tweede onthardende stap voor elk samenstel van eindige rechthoek.

3. inheemse pagina-analyse

  1. Bereiden van een 10% native pagina volgende stap 1.9 met uitzondering van de ureum-component.
  2. Voor controlemonsters van c64bp en c84bp, voeg 2 µL van elke vergadering oplossing en 1 µL van het laden van de kleurstof aan 3 µL van TE buffer als besturingselementen afzonderlijk. Voor elk van de andere vergaderingen vermeld in Figuur 3, voeg 1 µL van elke vergadering oplossing en 1 µL van het laden van de kleurstof aan 4 µL van TE buffer.
  3. Elk van de bovenstaande oplossingen voor een gel goed te injecteren. Voeg 5 µL van DNA marker (25-500 bp) bij een afzonderlijke bron voor verwijzing.
  4. Stel de gel voor ongeveer 4 uur op 10 V/cm in een waterbad van ijs. De xyleen cyanol FF zal opraken van de glasplaat.
  5. Draag rubberen handschoenen en bril om huiden en ogen te beschermen. Neem de gel uit de glasplaat en het onderdompelen in 100 mL gedeïoniseerd water met 10 µL van een nucleïnezuur gel vlek voor 30 min.
    Let op: De nucleic zuur oplossing voor de vlek van de gel is giftig.
  6. Observeren van de gel onder een UV-imaging systeem en maak een foto van de gekleurde gel (Figuur 3).

4. zuivering van eindige roosters

  1. Een native 2% agarose gel voorbereiden door elektroforese zuivering van eindige roosters.
    1. Meng 1 g agarose poeder, 5 mL van de 10 x TBE· Mg buffer (89 mM Tris, 89 mM boorzuur, 2 mM EDTA, pH 8.0, 12.5 mM Mg(Ac)2), 2 µL van nucleic zuur gel vlek en 47.5 mL gedeïoniseerd water in een fles van 250 mL driehoek. Kook het mengsel totdat de belletjes worden kleine en dichte. Warm water in de fles aan een totaal volume van 50 mL en een concentratie van 2% agarose toevoegen.
    2. Dikke handschoenen dragen. Giet de gel-oplossing in een kunststof gel doos van 7 x 10 x 1 cm3 (breedte × lengte × dikte). Invoegen van een 1,5 mm dik en 12-well gel kam. Wachten op de gel om af te koelen tot kamertemperatuur. Indien nodig, zet u de gel in een koelkast 4 ° C.
      Let op: Wees bewust van het broeien omdat de oplossing erg warm is.
    3. Voeg toe 0,5 x TBE· Mg buffer in de Elektroforese van het systeem. Prerun de gel 5 V/cm voor 20 min in een bad met ijs water op een constante spanning van 50 V.
    4. Injecteer 20 µL van de oplossing van de eindige lattice in stap 2.3 in elke agarose gel goed voorbereid en 5 µL van een DNA-markering (100-3000 bp) toevoegen aan een afzonderlijke goed. De gel gedurende 2 uur op 5 V/cm in een bad met ijs water uitgevoerd.
    5. Draag rubberen handschoenen en bril om huiden en ogen te beschermen. Knip het doel gel bands met een vergelijkbaar met de 1000 bp markering onder UV-licht en snijd ze in fijne stukjes en plaats de geplette gels in een filter kolom8positie.
    6. Centrifugeer de kolom bij 2.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Pak de oplossing van het monster door de kolom. Het verzamelen van de oplossing voor beeldvorming van de AFM.
  2. Eindige roosters zuiveren door PEG neerslag.
    1. Mix-50 µL van de oplossing van de eindige rooster bereid in stap 2.3 met een gelijk volume van 15% PEG8000 (m/v) buffer (20 mM Mg(Ac)2, 5 mM Tris, 1 mM EDTA en 505 mM NaCl)22. Centrifugeer de oplossing bij 18.000 × g bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
    2. Verwijder het supernatant en voeg 100 µL van PEG buffer. Herhaal het centrifugeren.
    3. Na het verwijderen van de bovendrijvende substantie, Los de pellet in 1 x TAE· Mg buffer voor beeldvorming van de AFM.
      Opmerking: Zuivering is nodig voor de eindige roosters van 5 × 6 cDAO-c64nt-O en 5 × 6 cDAO-c74 & c84nt-O voor beeldvorming van de AFM en andere toepassingen. Als de opbrengst te laag is, verhoogt de snelheid van centrifugeren. Als het product niet zuiver genoeg is, herhaalt u stap 4.2.2.

5. AFM Imaging

  1. Voor c64nt nanowire, c84nt nanowire, acDAO-c64nt-E storten oneindige 2D roosters van cDAO-c64nt-E(O), en cDAO-c84nt-E(O), 2 μL van ontharde monster op een vers gekloofd mica oppervlak. Laat gedurende 2 minuten voor adsorptie van DNA roosters aan het oppervlak mica. Het oppervlak met 100 µL van gedeïoniseerd water twee keer wassen en droog het met perslucht.
  2. Verkrijgen AFM beelden van oneindige DNA roosters in de lucht door het scannen van het oppervlak van mica met driehoekige AFM sondes onder te tikken modus. Stel de volgende parameters voor het scannen: scan grootte van 0,5 ~ 5 µm, scanresolutie van 512 lijnen, en scan rate van 3,5 Hz (Figuur 4).
  3. Voor eindige DNA roosters van 5 × 6 cDAO-c64nt-O en 5 × 6 cDAO-c74 & c84nt-O, storten 80 µL van 1 x TAE· Mg buffer op een vers gekloofd mica oppervlak. Voeg vervolgens 5 µL van eindige monsters in de buffer. Laat gedurende 2 minuten voor adsorptie van DNA roosters aan het oppervlak mica. Voeg een andere 50 µL van 1 x TAE· Mg buffer op de AFM-sonde.
  4. Verkrijgen AFM beelden van eindige DNA roosters in vloeistof door het scannen van het oppervlak van mica met driehoekige AFM sondes onder te tikken modus. Stel de volgende parameters voor het scannen: scan grootte van 0,5-1 µm, scanresolutie van 256 lijnen, en scan snelheid van 1,5 Hz (Figuur 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De circulaire DNA beweegt iets langzamer dan zijn voorloper lineaire DNA in denaturering pagina (Figuur 2) omdat de porie binnen de circulaire DNA is doorgedrongen en achterlijk door gel vezels23,24,25. De correcte afbinding reactie efficiëntie van oligo-monomeer cyclisatie hangt af van de volgorde van het substraat en concentratie, reactie temperatuur, tijd, enz. Als de concentratie van een voorloper van lineaire DNA is hoog genoeg op ongeveer 3,5 µM, de producten van de cyclisatie van c64nt (of c84nt) en de voorloper van verwijzing in dit protocol kan direct schaduw als banden in de TLC-plaat onder UV-licht zonder het sterven. Als de bands van circulaire DNA zijn vaag of onzichtbaar, met vermelding van een defect aan de afbinding reactie of een veel lage product rendement. Soms zijn er twee bands boven de voorloper van de lineaire band, een extra oligo-dimeer ring met uitzondering van de juiste oligo-monomeer ring verwijzen. Laat de hogere banden alleen en verzamelen de lagere ones. De gezuiverde circulaire DNA-producten kunnen worden gezien als wit poeder in de buis na vacuüm drogen. Behalve de denatureren pagina, kan de zuiverheid van het DNA ook worden gemeten door UV spectrometer. De piek van de absorptie van DNA is op 260 nm. Twee criteria van de kwaliteitsnorm voor de zuiverheid van DNA zijn de absorptie ratio van 280 nm/260 nm bij 1.8 en die van 280 nm/230 nm algemeen in het bereik voor 2.0-2.2. Als de bovenstaande twee verhoudingen van de forfaitaire waarde afwijken, moeten de overblijfselen opnieuw worden geëxtraheerd door volgende stappen 1.18-1.20. De opbrengsten van c64nt en c84nt voor de juiste oligo-monomeer cyclisatie worden gemeten in de range van 30-60% volgens dit protocol.

Inheemse pagina analyse biedt veel informatie over het motief van stabiliteit, zuiverheid, stijfheid, vergadering modus monomeer of polymeer, enz (Figuur 3). De families c64nt assemblage van c64bp, HJ-c64nt aHJ-c64nt, cDAO-c64nt en acDAO-c64nt hebben slechts één helder en schoon band voor elke vergadering, die ze zijn stabiel monomeer motieven. Terwijl de c84nt vergadering families van HJ-c84nt, tHJ-c84nt en cDAO-c84nt tegels uitstrijkjes rond hun belangrijkste bands hebben, die kleine bijproducten met uitzondering van de target monomeer motieven aangeeft. Ongeacht de kleine bijproduct van onjuiste associates, kunnen uitstekende cDAO-c84nt-O (E) roosters met hoge opbrengsten worden gemonteerd. Als u een afbeelding van de Elektroforese van het helder en schoon, het laadvolume niet meer dan 10 µL moet worden en de hoeveelheid DNA moet 0.01 ~ 0.02 µg/mL.

Het succes van experimenten wordt ten slotte geëvalueerd door 1D en 2D DNA nanostructuren beeld door de AFM (Figuur 4 en Figuur 5). Elke vergadering heeft haar eigen morfologische kenmerken in de omvang van de micrometer zoals nanowires met nanobuisjes, nanospirals, nanoribbons, enz. Bovendien, de gedetailleerde texturen van de DNA-assemblages in de nanometerschaal gecorreleerd aan hun theoretische circulaire tegel grootte en organisatie modi zeer goed respectievelijk zijn de sleutel voor de verificatie van de succesvolle en correcte montage. Daarom moeten zowel panoramisch en hoge resolutie AFM beelden in micrometer en nanometer schalen worden verkregen. Keuzen van AFM methoden en sondes zijn cruciaal voor de AFM-afbeeldingen van hoge kwaliteit. De kracht van de scan moet zo klein als 50 pN26worden aangepast. Als de scan kracht te groot is, zou het schadelijk zijn voor de DNA nanostructural patronen. Het milieu schoon is een andere belangrijke parameter om een schone en mooie afbeelding met hoge resolutie AFM in vloeistof. Alle buffers moeten worden gefilterd door 0,22 µm filter; de sonde houder en pincet worden door wasmiddel gewassen en gespoeld met gedeïoniseerd water. Als het milieu vervuild is door deeltjes, zou de sondepunt worden beschadigd of klampte zich vast door deeltjes in de buffer, dus die de kwaliteit van de beelden van de AFM.

Figure 1
Figuur 1 . Synthese van circulaire DNA. Het flow-diagram wordt aangegeven hoe een lang 5'-phosphorylated lineaire oligonucleotide blauw evolueert naar een circulaire DNA-molecule. De twee korte rode strengen vertegenwoordigen de splint oligonucleotides. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 . Denaturering pagina foto van DNA cyclisatie producten onder UV-licht zonder het sterven. Een voorloper van lineaire 64nt DNA band is in de rijstrook uiterst links en haar producten cyclisatie van circulaire 64nt (c64nt) DNA worden weergegeven als 9 bands op de dezelfde horizontale niveau in andere 9 rijstroken. De 9 bands van c64nt zal voor abstraheren van de ANI van de circulaire worden afgesneden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3. Native pagina foto's na de stervende en schematische dubbel-spiraalvormige modellen van circulaire tegels. Beide polymeren van c64nt nanowire en c84nt nanowire worden vertegenwoordigd door hun eenvoudigste opvouwbare eenheid cellen, waarin de twee stippen boven uitgelijnd en onder elke eenheidscel geven de oneindige uitlijning van eenheid cellen verticaal omhoog en omlaag, met gelijke afstand tussen duplexen te formulier nanowires. Monomeer circulaire tegels van c64bp, c84bp, HJ-c64nt, aHJ-c64nt, HJ-c84nt en tHJ-c84nt in hebben A) geen uitstekende overhangen uit hun ringen, terwijl cDAO-c64nt, acDAO-c64nt en cDAO-c84nt in B) beide overhangen 10 bp blunt-ended respectievelijk hebben. Raadpleeg de tabel van DNA-sequenties voor sequenties. Dit cijfer is gewijzigd van een eerder gepubliceerde figuur17. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4. AFM beelden van typische 1D en 2D oneindige DNA assembly's gescand in lucht. C64nt nanowire A), B) oneindige acDAO-c64nt-E C) oneindige cDAO-c64nt-E, D) oneindige cDAO-c64nt-O, E) oneindige cDAO-c84nt-E en F) oneindige cDAO-c84nt-O door kleverige einde samenhang worden gegloeid. Alle details van de structuur in deze AFM beelden komen overeen met de maten van de tegel en de organisatie modi heel goed. Raadpleeg de tabel van DNA-sequenties voor sequenties. Dit cijfer is gewijzigd van een eerder gepubliceerde figuur17. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 . AFM beelden van eindige rechthoek assembly's gescand in vloeistof. De eindige rechthoek vergadering van A) 5 × 6 cDAO-c64nt-O uit 32 cDAO-c64nt sub tegels, en B) 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O bestaat bestaat uit 12 cDAO-c74nt en 20 cDAO-c84nt sub tegels. Raadpleeg de tabel van DNA-sequenties voor sequenties. Dit cijfer is gewijzigd van een eerder gepubliceerde figuur17. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Tabel van DNA-sequenties. Klik hier om dit bestand te downloaden. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De protocollen die in dit artikel richten zich op de synthese van kleine cirkelvormige DNA moleculen en de assemblage van DNA nanostructuren gepresenteerd. De meeste van willekeurig sequenced DNA ontwerpen kan worden gebruikt in dit protocol. De zuiverheid van de ANI van de circulaire is essentieel voor het succes van DNA assemblages. De opbrengst van de productie van cyclisatie kan worden verbeterd door een verlaging van de concentratie van 5'-phosphorylated lineaire DNA; echter, dit zal het verhogen van de werklast voor de productie van dezelfde hoeveelheden de ANI van de circulaire. De lengte van DNA-strengen splint beïnvloedt ook de correcte afbinding reactie, het is geoptimaliseerd om te worden ongeveer 20 nucleotiden lang voor zowel c64nt als c84nt.

Een geschikte concentratie van magnesium kationen (bijv., 12,5 mM) in de oplossing tijdens en na de vergadering is zeer belangrijk voor de vorming en het onderhoud van DNA nanostructuren. Zo heeft een magnesium catie concentratie van 12.5 mM wordt altijd gehouden tijdens de processen van het gloeien, inheemse pagina, de Elektroforese van het gel van de agarose en PEG buffer centrifugeren zuivering, AFM beeldvorming, enz.

Voor eindige rechthoek assemblages van 5 × 6 cDAO-c64nt-O en 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O, de zuivering van het agarose gel heeft geen invloed op de details van de structuur, terwijl de PEG buffer centrifugeren zuivering schaadt de details van de structuur van DNA nanostructuren in de hoge resolutie beelden van de AFM.

Profiteer van de stabiliteit en stevigheid van circulaire tegels, het is veel gemakkelijker te produceren overzichtelijk en groot-formaat één kristallijne 2D roosters van circulaire modules dan van de lineaire tegels en scaffolded origami9,11, hoewel extra werk nodig is te synthetiseren en te zuiveren van de circulaire DNA-moleculen. Met slechts één circulaire DNA als dezelfde kern structuur, kunnen veel circulaire modules gegenereerd worden met verschillende overhangen; door middel van specifieke kleverige einde cohesions van overhangen kan eindige nanostructuren worden gebouwd; deze strategie vermindert de werklast en de kosten van eindige nanostructuren. Een belangrijk voordeel van circulaire DNA nanostructuren is de resolutie van secundaire en tertiaire structuur van DNA moleculen en hun belangrijke elementen zoals Holliday kruispunt van de details van de textuur van één kristallijne roosters. De 1D, 2D- en 3D-nanostructuren gebouwd van circulaire modules en hun mogelijke toepassingen in biologie, geneeskunde en nano-engineering wordt een nieuwe familie lid van DNA nanotechnologie in de toekomst.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.

Acknowledgments

We zijn dankbaar voor financiële steun uit het NSFC (subsidies nr. 91753134 en 21571100), en de sleutel laboratorium van Bioelectronics van Zuidoost-Staatsuniversiteit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T4 ligase TaKaRa 2011A
T4 buffer TaKaRa 2011A
TE buffer Sangon B548106
Thermo bottle Thermos SK-3000
Thermo cycler Bio Gener GE4852T
Exonuclease I TaKaRa 2650A
Exonuclease I buffer TaKaRa 2650A
30% (w/v) Acryl/Bis solution (19:1) Sangon B546016
TAE premix podwer Sangon B540023
Mg(Ac)2·4H2O Nanjing Chemical Reagent C0190550223
Urea Sangon A510907
TEMED BBI A100761
Ammonium Persulfate Nanjing Chemical Reagent 13041920295
Power supply Beijing Liuyi DYY-8C
Water bath Sumsung DK-S12
Formamide BBI A100314
DNA Marker (25~500 bp) Sangon B600303
DNA Marker (100~3000 bp) Sangon B500347
Loading buffer Sangon B548313
PAGE electrophoresis systerm Beijing Liuyi 24DN
Filter ASD 5010-2225 0.22 µM
UV imaging System Tanon 2500R
n-butanol Sangon A501800
Absolute Ethanol SCR 10009257
NaOAc Nanjing Chemical Reagent 12032610459
Centrifuge eppendorf Centrifuge 5424R
Vacuum concentrator CHRIST RVC 2-18
Ultraviolet spectrum Allsheng Nano-100
nucleic acid stain Biotium 16G1010 GelRed
Agarose Biowest G-10
Agarose electrophoresis systerm Beijing Liuyi DYCP-31CN
Heating Plate Jiangsu Jintan DB-1
TBE premix podwer  Sangon B540024
filter column Bio-Rad 7326165 Freeze 'N Squeeze column
AFM Bruker Dimension FastScan
PEG8000 BBI A100159
Mica Ted Pella BP50
triangular AFM probe in air Bruker FastScan-C
triangular AFM probe in fulid Bruker ScanAsyst-fluid+
DNA strands Sangon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsu-Ju, F., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
  2. Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
  3. Liu, F., Sha, R., Seeman, N. C. Modifying the surface features of two-dimensional DNA crystals. Journal of the American Chemical Society. 121 (5), 917-922 (1999).
  4. Yan, H., Park, S. H., Finkelstein, G., Reif, J. H., LaBean, T. H. DNA-templated self-assembly of protein arrays and highly conductive nanowires. Science. 301 (5641), 1882-1884 (2003).
  5. Liu, D., Wang, M., Deng, Z., Walulu, R., Mao, C. Tensegrity: Construction of rigid DNA triangles with flexible four-arm DNA junctions. Journal of the American Chemical Society. 126 (8), 2324-2325 (2004).
  6. Tian, C., Li, X., Liu, Z., Jiang, W., Wang, G., Mao, C. Directed self-assembly of DNA tiles into complex nanocages. Angewandte Chemie: International Edition. 53 (31), 8041-8044 (2014).
  7. Wang, P., et al. Retrosynthetic analysis-guided breaking tile symmetry for the assembly of complex DNA nanostructures. Journal of the American Chemical Society. 138 (41), 13579-13585 (2016).
  8. Ke, Y., Ong, L. L., Shih, W. M., Yin, P. Three-dimensional structures self-assembled from DNA bricks. Science. 338 (6111), 1177-1183 (2012).
  9. Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles. Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).
  10. Ke, Y., et al. DNA brick crystals with prescribed depths. Nature Chemistry. 6 (11), 994-1002 (2014).
  11. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
  12. Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
  13. Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
  14. Ackermann, D., Schmidt, T. L., Hannam, J. S., Purohit, C. S., Heckel, A., Famulok, M. A double-stranded DNA rotaxane. Nature Nanotechnology. 5 (6), 436-442 (2010).
  15. Zheng, H., Xiao, M., Yan, Q., Ma, Y., Xiao, S. J. Small circular DNA molecules act as rigid motifs to build DNA nanotubes. Journal of the American Chemical Society. 136 (29), 10194-10197 (2014).
  16. Wang, M., Huang, H., Zhang, Z., Xiao, S. J. 2D DNA lattices constructed from two-tile DAE-O systems possessing circular central strands. Nanoscale. 8 (45), 18870-18875 (2016).
  17. Guo, X., Wang, X. M., Wei, S., Xiao, S. J. Construction of a holliday junction in small circular DNA molecules for stable motifs and two-dimensional lattices. ChemBioChem. 19 (13), 1379-1385 (2018).
  18. Holliday, R. A mechanism for gene conversion in fungi. Genet. Res. 5 (2), 282-304 (1964).
  19. Duckett, D. R., et al. The structure of the Holliday junction. Structure and Methods, Human Genome Initiative and DNA Recombination. 1 (1), 157-181 (1990).
  20. Ariyoshi, M., Vassylyev, D. G., Iwasaki, H., Nakamura, H., Shinagawa, H., Morikawa, K. Atomic structure of the RuvC resolvase: A holliday junction-specific endonuclease from E. coli. Cell. 78 (6), 1063-1072 (1994).
  21. Eichman, B. F., Vargason, J. M., Mooers, B. H., Ho, P. S. The Holliday junction in an inverted repeat DNA sequence: sequence effects on the structure of four-way junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (8), 3971-3976 (2000).
  22. Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angewandte Chemie: International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).
  23. de Gennes, P. G. Reptation of a polymer chain in the presence of fixed obstacles. The Journal of Chemical Physics. 55 (2), 572-579 (1971).
  24. Slater, G. W., Noolandi, J. New biased reptation model for charged polymers. Physical Review Letters. 55 (15), 1579 (1985).
  25. Lilley, D. M. J. Analysis of branched nucleic acid structure using comparative gel electrophoresis. Quarterly Reviews of Biophysics. 41 (1), 1-39 (2008).
  26. Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve-based AFM. Nature Protocols. 9 (5), 1113-1130 (2014).

Tags

Chemie kwestie 146 DNA circulaire DNA Holliday Junction DNA nanotechnologie circulaire tegel Polyacrylamide gelelektroforese Atomic Force microscopie
Stabiele DNA motieven, 1D en 2D nanostructuren opgebouwd uit kleine cirkelvormige DNA-moleculen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guo, X., Wang, X. M., Xiao, S. J.… More

Guo, X., Wang, X. M., Xiao, S. J. Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules. J. Vis. Exp. (146), e58744, doi:10.3791/58744 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter