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Biochemistry

Mesures de Liposome unique pour l’étude des Enzymes membranaires Proton-pompage, à l’aide de l’électrochimie et microscopie fluorescente

Published: February 21, 2019 doi: 10.3791/58896
Automatic Translation
1, 2, 1
1School of Biomedical Sciences & the Astbury Centre for Structural Molecular Biology, University of Leeds, 2Department of Chemistry and Nano-Science Center, University of Copenhagen

Summary

Nous présentons ici un protocole afin d’étudier le mécanisme moléculaire de la translocation des protons à travers les membranes lipidiques des liposomes unique, à l’aide du cytochrome bo3 à titre d’exemple. Combinant l’électrochimie et la microscopie de fluorescence, les variations de pH dans la lumière des vésicules unique, contenant un seul ou plusieurs enzymes, peuvent être détectés et analysés individuellement.

Abstract

Enzymes de proton-pompage d’électron transfert chaînes couple rédox de translocation des protons à travers la membrane, création d’une force proton-motrice utilisée pour la production d’ATP. Le caractère amphiphile des protéines membranaires nécessite une attention particulière à leur maniement et reconstitution dans l’environnement lipidique naturel est indispensable lorsque l'on étudie les processus de transport de membrane comme proton translocation. Ici, nous détaillons une méthode qui a été utilisée pour l’étude du mécanisme de proton-pompage des enzymes d’oxydoréduction membranaires, prenant du cytochrome bo3 d' Escherichia coli par exemple. Une combinaison de microscopie par fluorescence et de l’électrochimie est utilisée pour contrôler l’état redox des quinone piscine et moniteur changements de pH dans la lumière. En raison de la résolution spatiale de la microscopie fluorescente, des centaines de liposomes peuvent être mesurés simultanément, tandis que la teneur enzymatique peut être réduite à une seule enzyme ou le transporteur par liposome. L’analyse respectifs seule enzyme peut révéler des patrons dans la dynamique fonctionnelle d’enzyme qui pourrait sinon être masquée par le comportement de l’ensemble de la population. Nous incluons une description d’un script pour l’analyse d’image automatique.

Introduction

Informations sur les mécanismes enzymatiques et cinétique sont généralement obtenues au niveau d’ensemble ou échelle macroscopique avec population enzyme par milliers à des millions de molécules, où les mesures représentent une moyenne statistique. On sait, toutefois, que des macromolécules complexes telles que les enzymes peuvent démontrer hétérogénéité dans leur comportement et mécanismes moléculaires observés au niveau de l’ensemble ne sont pas nécessairement valables pour chaque molécule. Ces écarts sur l’échelle de la molécule individuelle ont été largement confirmés par des études sur les enzymes unique avec une variété de méthodes émergent pendant les dernières deux décennies1. Notamment, la détection par fluorescence de l’activité enzymatique individuels a été utilisée pour étudier l’hétérogénéité de l’activité d’enzymes,2,3 et découvrez l’effet de mémoire ce qu’on appelle (périodes d’activité d’enzymes élevés ont réussi par des périodes de faible activité et vice versa)4,5.

De nombreuses études seule enzyme exigent que les enzymes sont immobilisées sur la surface ou dans l’espace fixe dans une autre façon de rester suffisamment longtemps dans le champ de vision pour l’observation continue. Encapsulation d’enzyme dans des liposomes a été démontrée pour permettre l’immobilisation d’enzymes tout en empêchant toute incidence négative due la surface enzymes ou protéines interactions6,7. En outre, les liposomes offrent une possibilité unique pour étudier les protéines de la membrane unique dans leur naturelle lipidique bi-couche environnement8,9,10.

Une classe de protéines membranaires, transporteurs, exerce une translocation directionnelle des substances à travers la membrane de la cellule, un comportement qui ne peut être étudiée lorsque les protéines sont reconstituées dans les lipides des bicouches (p. ex., liposomes)11, 12,13. Par exemple, translocation des protons, exposée par plusieurs enzymes des chaînes de transport d’électrons procaryotes et eucaryotes, joue un rôle important dans la respiration cellulaire en créant une force proton-motrice utilisée pour la synthèse d’ATP. Dans ce cas, le proton de l’activité de pompage est couplé au transfert d’électron, bien que les modalités de ce processus souvent demeure insaisissable.

Récemment, nous avons démontré la possibilité de détection par fluorescence couple avec électrochimie pour étudier l’activité des enzymes unique de l’oxydase d’ubiquinol terminal d' Escherichia coli ( bo3du cytochrome) de pompage protonique reconstitué dans les liposomes14. Ceci a été réalisé par encapsulation d’un colorant fluorescent membrane imperméable sensibles au pH dans la lumière de liposomes, préparé à partir d’e. coli lipides polaires (Figure 1 a). La quantité de protéines a été optimisée pour que la plupart des liposomes figurant non plus aucun ou qu’une seule molécule d’enzyme reconstituée (selon la distribution de Poisson). Les deux substrats du cytochrome bo3 ont été fournis en ajoutant l’ubiquinone au mélange lipidique qui formaient les liposomes et oxygène (ambiante) en solution. Les liposomes sont ensuite faiblement adsorbés sur une électrode d’or ultra-lisse semi-transparent, recouverte d’un monocouches auto-assemblées de 6-mercaptohexanol. Enfin, l’électrode est monté sur le fond d’une cellule simple spectroélectrochimiques (Figure 1 b). Contrôle électrochimique de l’état redox de quinone piscine permet de déclencher avec souplesse ou de bloquer la réaction enzymatique à tout moment, tandis que le colorant sensibles au pH sert à surveiller les changements de pH à l’intérieur de la lumière des liposomes par suite de la translocation des protons par le enzymes. En utilisant que l’intensité de la fluorescence d’un colorant fluorescent Deuxièmement, liés aux lipides, la taille et le volume des liposomes individuelles peut être déterminée et donc la quantification de l’activité de pompage de protonique enzyme. En utilisant cette technique, nous avons notamment constaté que cytochrome bo3 molécules sont capables d’entrer dans un état de fuite spontanée qui dissipe rapidement la force motrice de proton. Le but de cet article est d’introduire la technique de mesure unique liposome en détail.

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Protocol

1. préparation d’un mélange de lipides/UQ-10/FDLL

NOTE : E. coli lipides utilisés pour la préparation des liposomes devraient être aliquotés et soigneusement mélangé avec l’ubiquinone-10 (substrat de l’enzyme) et longueur d’onde fluorescents dye-labeled lipides (pour la détermination de la taille des liposomes) avant le reconstitution.

  1. À l’aide d’une seringue en verre, transférer 200 µL de stock de chloroforme de lipides polaires extrait de Escherichia coli (25 mg/mL) dans des flacons en verre pour faire des parties aliquotes de 5 mg.
  2. Ajouter 50 µL de 1 mg/mL ubiquinone-10 (UQ-10 ; dans le chloroforme) pour les lipides pour rendre le rapport final de l’UQ-10 : lipides au 1/100 (1 % w/w).
  3. Ajouter 20 µL de 1 mg/mL (0,4 % w/w) d’un lipide de marqués au colorant fluorescent de longueur d’onde (FDLL) à la composition des lipides/UQ-10.
  4. Homogénéiser la solution de chloroforme au vortex court et faire évaporer la plus grande partie du chloroforme sous un léger courant d’azote ou argon. Éliminer les traces de chloroforme entièrement par évaporation supplémentaire sous vide pendant au moins 1 h.
    NOTE : Les aliquotes de lipides peuvent être stockés sous atmosphère inerte à-20 ° C pendant plusieurs mois.

2. reconstitution du Cytochrome bo3

Remarque : Pour la purification de cytochrome bo3 d’e. coli, suivre le protocole de Rumbley et al. 15 afin d’assurer la haute pureté d’échantillons de l’enzyme nativement-plié, ajouter chromatographie d’exclusion après la purification d’affinité décrite par Rumbley et al. 15

  1. Ajouter 312,5 µL de 40 mM MOPS-KOH/60 mM K2donc4, pH 7,4, une partie aliquote de lipides/UQ-10/FDLL sec mélanger (5 mg, étape 1.4) et mélanger avec vortex jusqu'à ce que le film lipidique est entièrement remis en suspension, suivie de 2 min de traitement dans un bain à ultrasons.
  2. Ajouter 125 µL de 25 mM 8-hydroxypyrène-1,3,6-trisulphonic acide (STPH), un colorant fluorescent sensibles au pH qui doit être encapsulé dans les liposomes.
  3. Ajouter 137,5 µL de 250 mM n-octyl-β-D-glucopyranoside (PSF) agent tensio-actif, mélanger à l’aide de vortex et ultrasons dans un bain d’eau à ultrasons pendant 10 min pour s’assurer que tous les lipides sont solubilisés dans les micelles de surfactant. Transférer la dispersion dans un tube en plastique de 1,5 mL.
    NOTE : Suspension trouble des lipides devienne transparente après la solubilisation avec agent tensio-actif.
  4. Ajouter la quantité requise de cytochrome bo3 (voir la remarque ci-dessous) et ajouter de l’eau ultrapure pour rendre un volume total de 50 µL (cytochrome bo3 solution avec l’eau). Incuber à 4 ° C pendant 10 min sur un mélangeur à rouleaux.
    NOTE : Montant typique pour les conditions de la seule enzyme est 0,1 – 0,2 % (p/p protéines-à-lipides, c'est-à-dire. 5 à 10 µg de protéines), même si elle peut être augmentée jusqu'à 1 à 2 % (50 à 100 µg de protéines), si l’objectif est de n'observer que l’activité électrochimique (voir ci-dessous). Comme témoin négatif, liposomes sans cytochrome bo3 peuvent être préparés.
  5. Peser 2 x 50 mg et 2 x 100 mg de microbilles de polystyrène dans quatre 1,5 mL-bouchons et fermez avec le film de paraffine pour éviter le dessèchement.
    NOTE : Avant utilisation, microbilles de polystyrène doivent être lavés avec du méthanol, de l’eau et stocké dans l’eau selon le manuel du fabricant.
    Remarque : Si on utilise un mélange de l’eau/faisant, microbilles de polystyrène peuvent commodément être transférées au chapeau avec une micropipette avec une pointe large. L’eau peut alors être retiré les microbilles à l’aide d’une micropipette pointe fine.
  6. Ajouter le 1st50 mg de microbilles de polystyrène dans le mélange de reconstitution (étape 2.4) en mettant le cap avec des microbilles de polystyrène sur le tube de 1,5 mL-plastique avec dispersion et en effectuant un essorage court pendant quelques secondes. Incuber à 4 ° C sur un mélangeur à rouleaux de microbilles de polystyrène d’adsorber le surfactant pendant 30 min.
    1. Répéter les ajouts de microbilles en polystyrène et des incubations comme suit : ajouter 50 mg de microbilles pour 60 min d’incubation ; ajouter 100 mg de microbilles pour 60 min d’incubation ; et ajouter 100 mg de microbilles pour 120 min d’incubation.
      Remarque : La solution ci-dessus les microbilles sédentarisés devient translucide au cours de l’étape 2.6 comme protéoliposomes sont forment.
  7. Séparer les microbilles de polystyrène à l’aide d’une micropipette pointe fine de la solution protéoliposomes. Diluer la dispersion 90 ml de 20 mM MOPS-KOH/30 mM K2SO4, pH 7,4 (MOPS tampon) et le transfert dans un tube d’ultracentrifugeuse Ti45.
  8. Ultracentrifugeuse la dispersion à l’aide de Type 45 Ti rotor à 125 000 x g (à rmax) pendant 1 h granuler protéoliposomes.
    NOTE : Tubes de centrifugeuse plus petites peuvent être utilisés même si la dilution en volume grand tampon contribue à réduire la concentration de la STPH non capsulées dans la suspension définitive.
  9. Jeter le surnageant, rincer les pellets avec 20 mM MOPS-KOH/30 mM K2donc4, pH 7,4 tampon (sans resuspendant le culot). Après avoir jeté le tampon de lavage, une nouvelle suspension protéoliposomes dans 500 µL de tampon de VADROUILLES en pipettant également, il en arrière avec une micropipette pointe fine. Puis transférez dans un tube en plastique de 1,5 mL.
  10. Centrifuger la suspension pendant 5 min à 12 000 g pour enlever les débris. Transvaser le surnageant (protéoliposomes reconstitués) dans un nouveau flacon.
  11. Stocker la dispersion protéoliposomes reconstitués à 4 ° C durant la nuit et d’utiliser en 2 jours.

3. fabrication d’électrodes en or semi-transparente

Remarque : La surface d’or lisse est obtenue par une méthode de décapage de modèle d’une couche de 30 nm d’épaisseur d’or 99,99 % d’une plaquette de silicium atomiquement lisse. La faible épaisseur de la couche d’or est important car il doit être semi transparent permettant l’observation de la fluorescence. Détails d’or évaporation (dépôt en phase vapeur physique, PVD) peut se trouver ailleurs16 et seul modèle-décapage est abordé ici. Alternativement, ultra-lisse or jetons peuvent être achetés ailleurs (voir Table des matières).

  1. Coller le verre jusqu'à 9 lamelles (0,17 mm d’épaisseur) sur la surface or évaporée avec bi-composant époxy de fluorescence faible. Guérir la colle à 80 ° C pendant 4 h.
  2. Juste avant la modification par un monocouches auto-assemblées (étape 4), détacher les lamelles de verre des plaquettes de silicium avec une lame. En raison de la minceur des feuillets couverture, faites attention en détachant les lamelles pour pas casser ou briser les lames de verre.

4. modification de la Surface d’or avec des monocouches auto-assemblées (SAM)

  1. Préparer 5 mL de solution d’eau de 1 mM 6-mercaptohexanol (6MH).
  2. Trempez fraîchement détachés lamelles or-enduit (étape 3.1) dans 6MH solution et laisser une nuit entre 20 et 25 ° C (> 16 h) pour former le SAM.
    NOTE : Les solutions de thiols ont une odeur désagréable, donc un récipient fermé doit être utilisé lors de l’incubation de la lamelle couvre-objet or-enduit.
  3. Le lendemain, retirer la lamelle couvre-objet or-enduit de la solution de 6MH, laver brièvement avec l’eau ou du méthanol, puis avec de l’isopropanol. Sèche sous un débit de gaz douce.

5. électrochimique tests dactivité Protéoliposomes

Remarque : L’activité électrochimique d’enzyme est d’abord vérifiée sur une couche de liposomes étroitement emballés (étape 5) et les couvertures de vésicule inférieures sont utilisés dans des vésicules unique expérience pour mesurer les variations de pH dans la lumière des liposomes (étape 6).

  1. Assembler la lamelle or-enduit dans une cellule électrochimique-spectro (voir Figure 1). Prendre contact à l’or avec un fil plat extérieur d’une zone définie par un joint torique en caoutchouc.
  2. Ajouter 2 mL de la solution tampon d’électrolyte et placez la référence et les électrodes auxiliaires dans la cellule.
    NOTE : Tel que discuté dans la section Discussion, références électrodes sans chlorure sont préférables pour empêcher la formation Au (I) Cl au cours de l’électrochimie. Ici, un Hg/Hg2SO4 (Sam. K2SO4) sert à l’électrode de référence et de potentiels sont donnés par rapport à l’électrode hydrogène Standard (SHE) à l’aide de 0,658 V vs SHE pour le Hg/Hg2SO4 (sat. K2SO4).
  3. Exécutez spectroscopie d’impédance électrochimique (0,1 Hz à 100 kHz) au potentiel (OCP) potentiel de cellules ouvertes afin d’évaluer la qualité de SAM. Convertir des valeurs d’impédance à l’admission et de diviser par 2πω pour tracer un terrain de Cole-Cole, où ω est la fréquence (voir ce qui suit fait référence à16,17,18 pour plus d’informations sur la conversion et l’interprétation impédance spectres).
    NOTE : SAMs Compact et denses de 6MH devraient donner sa fin à demi-cercle tracé de Cole-Cole et donnent des valeurs de capacité dans la gamme de 2,5 à 3,0 µF/cm2 (Figure 2 a). Si on obtient une déviation significative de demi-cercle forme ou des valeurs de capacité d’out-of-range, changer l’électrode.
  4. Exécuter les voltampérogrammes cycliques vides (CVs) avec scan taux 100 et 10 mV/s dans la région de potentiel -0,3 – 0,8 V. Un CV typique est montré sur (Figure 2 b, ligne pointillée).
    Remarque : Cela devrait démontrer presque pur comportement capacitif et une absence de courant faradique significatif, même dans des conditions ambiantes d’oxygène utilisée ici.
  5. Ajouter protéoliposomes (concentration finale lipides 0,5 mg/mL, 1-2 % (p/p) rapport du cytochrome bo3 de lipides) à la cellule électrochimique et mélanger légèrement avec une pipette. Attendez que l’adsorption des protéoliposomes sur la surface de l’électrode est fini (30-60 minutes à température ambiante).
    Remarque : Les voltampérogrammes cycliques (CVs) à 10 mV/s peut être exécuté lors de l’adsorption de protéoliposomes de suivre le processus. L’adsorption est terminée lorsque CVs consécutives arrêter changer. On trouvera des informations sur les techniques de CV dans les manuels suivants. 19 , 20
  6. Laver la cellule en changeant la solution tampon au moins 10 fois, mais éviter de laisser la surface de l’électrode complètement sec.
  7. La spectroscopie d’impédance électrochimique à OCP (Figure 2 a, ligne bleue) pour confirmer que le SAM sur l’électrode d’or reste inchangé et CVs avec scan tarifs 10 à 100 mV/s pour observer l’oxydation catalytique ubiquinol (et réduction de l’oxygène) par le cytochrome Bo 3 aux potentiels de l’apparition de réduction électrochimique quinone sur 0 V vs SHE) (Figure 2 b).

6. détection enzymatique proton pompage par microscopie de Fluorescence

  1. Modifier l’électrode d’or comme dans l’étape 5, mais en utilisant 100 x moins protéoliposomes par rapport à l’étape 5.5 (c.-à-d., 5 µg/mL). Pour les études de la seule enzyme, réduire le cytochrome bo3 rapport lipides à 0,1 à 0,2 % (p/p).
    NOTE : Liposomes adsorbe faiblement sur la surface de l’électrode qui permet seule vésicule suivi par microscopie de fluorescence. Dans ces conditions de single-enzyme, la quantité d’enzyme immobilisée sur la surface de l’électrode est insuffisante pour l’observation d’un courant catalytique.
  2. Placez la cellule électrochimique sur l’objectif de l’huile (60 X) d’un microscope à fluorescence inversé avec une goutte d’huile à immersion. À l’aide de filtres appropriés pour fluorescence FDLL, se concentrer sur la surface de l’électrode. Liposomes unique doivent apparaître comme des points lumineux à la limite de diffraction de l’objectif de microscope /. Prendre une image de fluorescence FDLL.
  3. Basculer vers l’un des jeux de filtres de fluorescence STPH le microscope pour vérifier que la fluorescence STPH est clairement visible et reconnaissable de l’arrière-plan (dans le temps d’exposition choisi, reportez-vous à l’étape 6.4). Augmenter l’intensité de la lumière, si ce n’est pas le cas.
  4. Programmer le logiciel de microscope pour effectuer une acquisition d’images chronométré par une alternance de deux jeux de filtres HPTS (menu Applications | Acquisition de ND de Define/Run). Définir le délai entre l’acquisition d’image au minimum. Dans cette expérience, utiliser une exposition de s 1 et 0,3 s delay, (en raison du mouvement de la tourelle).
    NOTE : Le rapport entre les intensités de fluorescence à ces deux canaux sera plus tard transformé en pH à l’intérieur les liposomes à chaque instant. La durée de l’acquisition peut varier selon le taux de changement de pH attendus ; 5 min est utilisé dans cet article.
  5. Ajustez les réglages de la potentiostat pour modifier le potentiel lors de l’acquisition de l’image. Par exemple, dans cette expérience, utiliser la séquence suivante : 0 – 60 s: aucun potentiel n’appliqué (c.-à-d. OCP) ; 60-s : 180 -0,2 V (vs SHE) ; 180-300 s : 0,4 V (vs SHE). Dans ce cas, seul le potentiel appliqué à la deuxième phase (-0,2 V vs SHE) est suffisant pour réduire efficacement la piscine de la quinone.
  6. Exécutez simultanément l’acquisition d’images chronométré (microscope) et la séquence potentielle (potentiostat) en démarrant manuellement les deux mesures en même temps.
    Remarque : L’expérience peut être répétée sur la même électrode plusieurs fois en déplaçant la platine du microscope vers une autre zone sur la surface. Le délai entre l’acquisition doit être au moins 5-10 min pour s’assurer de l’équilibration du pH complète des liposomes sur la surface. Différentes durées et patrons potentiels peuvent être appliqués selon le besoin, bien que le temps d’imagerie est limitée en raison de Photoblanchiment de STPH lors de l’acquisition.

7. l’analyse des Images de Fluorescence

Remarque : Une expérience typique produit une série d’images avec un pas de temps (p. ex., 2.6 s) pour chacun des deux canaux, c.-à-d. (durée * 2 / 2.6) images. Un exemple de cette image la valeur enregistrée au cours d’une expérience seule enzyme sont accessibles via la recherche données Leeds référentiel21. Un traitement d’image se compose de plusieurs étapes à l’aide de Fidji (ImageJ) et haut niveau analyse mathématique, programmation des logiciels de langue (désormais appelée comme logiciel de script, consultez la Table des matières pour plus de détails).

  1. Fidji permet de séparer le fichier de laps de temps, aligner les images et enregistrer en tant que canaux séparés et des délais.
    1. Fichier de laps de temps ouvert à l’aide de l’importateur Bioformats fournie dans les îles Fidji (commande macro : exécuter (« Bio-Formats importateur »)).
    2. Utilisez le plugin StackReg pour aligner chaque image à la première pour tenir compte des mouvements de scène possible ou dérive thermique s’est produite lors de l’acquisition (commande macro : exécuter ("StackReg", "transformation = Translation")).
    3. Enregistrer des fichiers image non compressée séparés pour chaque canal et chaque pas de temps au format TIFF dans un seul dossier.
    4. Extrait les métadonnées de fichiers de laps de temps des horodatages exacte pour chaque image et les enregistrer comme un fichier CSV dans le même dossier que les images. Vous pouvez également extraire des horodatages en utilisant le logiciel d’acquisition et enregistrer manuellement dans un fichier CSV à l’aide d’un tableur.
      Remarque : Le dossier avec les images et les horodatages est maintenant prêt à être analysé par le logiciel de script. 7.1.1 les étapes. – 7.1.4. peut être automatisée à l’aide d’un script de Fidji (un script écrit en Python pour le traitement par lots des fichiers de laps de temps est fourni, utilisez «Ctrl-Maj-N» (sous Windows), puis fichier | Ouvert pour charger le script).
  2. Utiliser un logiciel de script pour le traitement automatisé des images. Charger le code fourni dans le logiciel, cliquez sur exécuter à la fin. Lorsque vous êtes invité, sélectionnez le dossier contenant les images de l’étape 7.1.
    Remarque : Un script pour l’analyse est fourni en tant que script direct mlx-format, avec des commentaires exhaustifs, à identifier les liposomes unique, fixez-les sur fonction 2D gaussiennes, filtrez-les et quantifier les valeurs de pH à chaque moment. Les sous-étapes suivantes sont exécutées automatiquement par le script.
    1. Charger toutes les images de délais d’exécution pour une expérience unique dans la mémoire.
    2. Moyenne de toutes les images pour un seul canal (sélectionnez le canal avec l’intensité de fluorescence plus haut) et l’image mise en moyenne permet d’identifier tous les taux maximaux qui peut-être correspondre aux liposomes unique.
    3. Ajuster les maximums définis sur l’image mise en moyenne pour la 2D-gaussienne fonctionnent et sauvegarder l’a entraîné ajuster les paramètres pour chaque liposome (voir la Figure 4 a par exemple liposome équipée).
    4. Filtrer les taux maximaux selon les critères attendus des liposomes unique, comme la taille, la circularité et intensité. Rejeter les liposomes qui sont mal équipés en raison de la faible signal/bruit, étroitement voisins liposome ou d’être trop près du bord de l’image.
    5. Charger l’horodatage du fichier externe et adapter chaque liposome filtré à la fonction gaussienne 2D sur chaque image de laps de temps séparément.
      Remarque : L’utilisation de la programmation parallèle et multi-core CPU peut améliorer considérablement la vitesse de calcul à ce stade.
    6. Filtrer les liposomes, toujours selon des critères similaires comme au point 7.2.4 mais appliquée dans chaque période de temps.
    7. Sur chaque pas de temps, définir le ratio d’intensité de fluorescence d’un liposome comme étant le rapport des volumes entourées équipée fonction 2D-gaussien à deux canaux. Calculer les valeurs de pH du rapport des intensités déterminées par les deux canaux de STPH et à l’aide d’une courbe d’étalonnage (étape 8). Tracer les courbes de pH-temps qui en résulte pour les liposomes et observer leur pH change lorsque le potentiel est appliqué.

8. effectuer une courbe d’étalonnage de la Fluorescence de STPH

Remarque : Pour convertir rapport de fluorescence STPH au pH intravésiculaire, une courbe d’étalonnage doit être tout d’abord établie qui prendrait en compte les conditions particulières d’expériences comme facteur de transmission or, filtres de qualité, etc.. Cette étape doit être effectuée qu’une fois ou deux fois et les données d’étalonnage peuvent être utilisées tant que les paramètres d’installation et de mesure restent les mêmes à l’étape 6.

  1. Préparer une électrode avec les liposomes faiblement adsorbés (sans cytochrome bo3 comme décrit aux étapes 5 et 6.1).
  2. Ajouter 2 µL de solution de gramicidine 0,1 mg/mL dans de l’éthanol à 2 mL de tampon pour créer la concentration de 100 ng/mL.
  3. Capturer les deux images de fluorescence pour les deux canaux de STPH.
  4. Changer le pH de la cellule par l’addition de petites parties aliquotes de 1 M HCl ou 1 M H2SO4. Mesurer le pH de la mémoire tampon avec un pH-mètre standard et capturer les deux images de fluorescence pour les deux canaux de STPH.
  5. Répétez les étapes 8,4 pour des pH allant de 6 à 9.
  6. À l’aide de l’algorithme de 7,2, s’adapter, filtrer et calculer le ratio moyen de fluorescence HPTS de liposomes individuels à chaque pH. Prenez le ratio STPH moyen tous les liposomes.
  7. Ajustement de la dépendance qui en résulte de pH-rapport à l’équation suivante :
    Equation, où pKun, Run et Rbsont des paramètres d’ajustement.
  8. Utilisez pKun, Run et Rbpour convertir le ratio HPTS de liposomes individuels à l’étape 7.2.7. aux valeurs de pH.

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Representative Results

La qualité de l’or-modified lamelle couvre-objet (l’électrode) avec une SAM de 6MH est vérifiée avant chaque expérience avec spectroscopie d’impédance électrochimique. Figure 2 a montre représentatifs parcelles de Cole-Cole mesurées par spectroscopie d’impédance électrochimique, avant et après que les liposomes sont adsorbés. Si la qualité de SAM suffit, spectroscopie d’impédance doit démontrer un comportement capacitif presque pur, résultant en un tracé de Cole-Cole demi-cercle. Le diamètre de l’arc de cercle dans un tracé de Cole-Cole est égale à la capacité de la double couche de la surface de l’électrode, qui devrait être dans la gamme de2 µF/cm 2,5 à 3,0. Noter que la capacité ne doit pas significativement changer adsorption de liposomes, bien qu’une légère augmentation de la capacité pourrait être observé (bas de couverture, Figure 2 a, haute de liposomes) ou un léger changement d’impédance peut être observé à faible fréquences (haut de couvertures, Figure 2 a, liposome faible).

Électrochimie peut être utilisé pour tester l’activité catalytique du cytochrome bo3 dans les protéoliposomes, où catalytiques courants mesurés avec la voltampérométrie cyclique reflètent l’activité de l’ubiquinol-oxygène oxydoréductase. Cependant, courants catalytiques importants ne peuvent être détectées à des quantités élevées de protéoliposomes adsorbé et une couche étroitement emballée de protéoliposomes sur la lamelle couvre-objet or modifiés est nécessaire. Figure 2 b illustre représentant voltampérogrammes cycliques (CVs) de l’électrode avant et après adsorption de liposomes avec soit une couverture de liposome haute ou basse. Aucun courant faradique n’est observée sur le CV vide parce que la réduction de l’oxygène par l’électrode d’or nu est bloquée par le SAM. Lorsque la surface est imprégnée de liposomes avec haute cytochrome bo3 contenu (1,3 % (p/p) dans ce cas), une vague catalytique clair en raison de la réduction de l’oxygène est observé avec un potentiel d’apparition de 0 V, c'est-à-dire le potentiel de l’ubiquinone réduction (Figure 2 b, ligne bleue). La piscine d’ubiquinone agit en tant que substrat pour l’enzyme naturel et un médiateur de l’électron, transfert des électrons de l’enzyme à la surface de l’électrode. Nous constatons que sous une couverture élevée liposome, sans distinction de vésicules individuelles est possible en microscopie et couverture inférieure est nécessaire pour les études de liposome unique. Couverture de liposome faible (mais riche en protéines de lipides), le courant catalytique est considérablement réduit, à peine distinguables de fond (Figure 2 b, ligne rouge). Notez que dans des conditions seule enzyme (protéine faible ratio lipide), le courant catalytique est encore plus faible et ne peut être évalué de façon fiable.

La figure 3 montre les images de fluorescence des liposomes adsorbés sur les électrodes à trois couvertures différentes. Toutes les images ont été prises dans des conditions identiques de lumière et de l’exposition et leur éclat a été tout aussi ajusté pour permettre une comparaison directe. Colorant-contenant-liposomes sont visibles sur les images comme des points lumineux. La partie centrale de l’image a été photobleached pendant quelques minutes pour révéler le niveau de fluorescence de fond (notons que FDLL est relativement photostable et n’est pas photobleached complètement à la Figure 3). Les images sur les deux canaux de STPH sont superposables, où le rapport entre les deux canaux (410/535 et 470/535) correspond à un pH de 7.4 utilisé dans cette expérience. Un plus grand nombre de liposomes est visible avec le canal FDLL, qui indique la présence de liposomes qui n’ont aucun STPH encapsulé. La différence entre les canaux STPH et FDLL est plus prononcée à des garanties plus élevées, peut-être parce que pour une couverture de haute liposome, liposomes sont plus susceptibles d’éclater ou de fusible sur la surface.

L’analyse d’image exige l’alignement des cadres (contre la première image) en utilisant le ImageJ, plugin StackReg. L’alignement est indispensable dans la plupart des situations, car une légère dérive thermique de l’échantillon se produit habituellement dans les délais de l’expérience, en changeant les coordonnées de liposome. Tous une analyse plus approfondie est effectuée à l’aide d’un code de logiciel script. Ce code effectue identification automatique liposome. Comme la taille des liposomes sont inférieures à la limite de diffraction d’Abbe, leur fluorescence est considérée comme un point spread function beaucoup plus grande que le diamètre réel liposome (Figure 4 a). Le code correspond à l’intensité de la fluorescence de chaque vésicule sur deux canaux à une fonction gaussienne 2D (Figure 4 a) et calcule leur rapport volumétrique intensité qui peut être converti en pH à l’aide d’une courbe d’étalonnage. En effectuant ces actions sur tous les délais d’exécution, le pH est obtenu à l’intérieur de chaque vésicule dans des délais de l’expérience (film 1). Figure 4 b montre des médianes de tous les changements de pH de vésicule dans une image unique lorsque la teneur en cytochrome bo3 est 1,3 %. Une augmentation du pH (pompage de proton) est bien visible quand un potentiel entre -0,1 et -0,3 V est appliqué, mais pas pour 0 V depuis ce dernier n’est pas suffisant pour réduire la piscine de la quinone. Lorsque le cytochrome bo3 contenu est beaucoup plus faible (protéine-à-de lipides 0,1 %, Figure 4), les courbes de la médianes deviennent presque impossibles à distinguer de celles des liposomes vides (Figure 4). La différence devient évidente lorsqu’on examine les traces de pH individuels de liposomes aléatoires (Figure 5, 6 et 7). Alors que les liposomes sans cytochrome bo3 n’affichent aucun changement de pH important en ce qui concerne le bruit (Figure 7), une sélection de liposomes montrent une augmentation (principalement) ou une diminution du pH quand un potentiel est appliqué ce actives cytochrome bo3 (Figures 6, zone grise). La différence évidente de pH-traces entre les liposomes est compatible avec le faible ratio de protéine-à-lipide, où cytochrome bo3 n’est présent que dans un petit sous-ensemble de l’activité de liposomes. La prévalence d’une augmentation du pH sur la diminution s’explique par la méthode de reconstitution qui favorise une orientation « extérieure » des molécules d’enzyme (environ 75 %). La fraction des liposomes qui affichent une variation de pH augmente quand le cytochrome bo3 ratio lipidique est plus élevé (Figure 5). Notez également que certains des liposomes arrêter de pomper des protons et passer en mode de dissipation du proton avant la fin de l’application éventuelle. Nous attribuons ce comportement aux molécules bo3 cytochrome entrant dans un « état de la fuite », qui permet des protons de couler dans le lumen de liposome14.

L’analyse des traces pH y compris leur montage et détermination du proton pompage/fuite des tarifs peut être fait à l’aide d’un script nous ont publiés précédemment14,22 et peuvent être obtenus auprès du référentiel de Leeds de données de recherche 23 , 24.

Figure 1
Figure 1 : principe de la méthode. (A) le principe du suivi de l’activité enzymatique unique et (B) le schéma du montage expérimental utilisé dans ce travail avec une découpe pour illustrer une partie interne de la cellule. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : réaction électrochimique des liposomes. (A) parcelles de Cole-Cole mesurée à l’OCP (0,22 V vs SHE ; ligne carrée noir) avant et après les liposomes (cytochrome p/p 1,3 % bo3) adsorption des solutions à des concentrations de 5 µg/mL (ligne de cercle rouge) et 500 µg/mL (ligne de cercle bleu). B voltampérogrammes cycliques à 100 mV/s (panneau de gauche) et 10 mV/s (panneau de droite) de l’UA-SAM (pointillé noir) avant et après les liposomes (cytochrome p/p 1,3 % bo3) adsorption des solutions à des concentrations de 5 µg/mL (ligne rouge) et 500 µg/mL (ligne bleue). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : la microscopie de Fluorescence des liposomes. Images de fluorescence des liposomes à différentes couvertures de surface : surfaces incubé pendant 30 min avec une solution de liposomes de 5 µg/mL (rangée du haut), 20 µg/mL (rangée du milieu) et 500 µg/mL (rangée du bas). Colonne de gauche correspond à l’installation de filtre d’excitation/émission 470/535 nm (1 canal STPHst ) ; colonne du milieu - 410/535 nm (2 canaux STPHnd ) ; colonne de droite - 560/645 nm (canal FDLL). Les images ont été prises au grossissement 90 X (60 X objectif et 1,5 X grossissement du microscope avant de l’appareil photo), 1 exposition s et intensité lumineuse semblable. Barreaux de l’échelle correspond à 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : identification de Liposome et changement de pH. (A) vue 3D d’une partie de l’image de fluorescence contenant un liposome unique typique. Son intensité de fluorescence est considérée comme un point spread function (surface de couleur) qui est équipée d’une fonction gaussienne 2D (maille noir). PH (B-D), affiché comme la médiane de toutes les vésicules au sein de la zone de l’image unique (généralement plusieurs centaines) à différents potentiels appliqués. De 0-60 s, aucun potentiel n’est appliquée (OCP). Entre 60 et 180 s (zone grise) différents potentiels ont été appliquées : 0 V (noir), -0,1 V (rouge), -0,2 V (vert), -0,3 V (bleu). Entre 180 et 300 s, 0,4 V vs. Elle a été appliquée. Le cytochrome bo3 ratios lipides étaient (B) (C) 1,3 % 0,1 %, (D) 0 %. Les traces sont compensées pour plus de clarté. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : traces de pH de liposomes contenant 1,3 % d’enzyme. Traces de pH changent de 72 liposomes unique, choisis au hasard, contenant du cytochrome bo3 (1,3 % w/w) mesurés et analysés au cours d’une expérience. De 0-60 s, aucun potentiel n’est appliquée (OCP) ; entre 60 et 180 s (zone grise) -0,2 V vs. ELLE ; entre 180 et 300 s, 0,4 V vs. Elle a été appliquée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : traces de pH de liposomes contenant 0,1 % d’enzyme. Traces de pH changent de 72 liposomes unique, choisis au hasard, contenant du cytochrome bo3 (0,1 % p/p) mesurés et analysés au cours d’une expérience. De 0-60 s, aucun potentiel n’est appliquée (OCP) ; entre 60 et 180 s (zone grise) -0,2 V vs. ELLE ; entre 180 et 300 s, 0,4 V vs. Elle a été appliquée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : des traces des liposomes sans enzyme pH. Traces de variation de pH de 72 liposomes unique, choisi au hasard, sans cytochrome bo3 mesurés et analysés au cours d’une expérience. De 0-60 s : Aucun potentiel n’est appliquée (OCP) ; entre 60 et 180 s (zone grise) -0,2 V vs. ELLE ; entre 180 et 300 s, 0,4 V vs. Elle a été appliquée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Movie 1
Movie 1 : Animation de variation de pH unique liposome. (panneau supérieur) Changement d’une fluorescence de liposome sur deux canaux de STPH (représenté par le tracé 3D de la surface de la zone correspondante) pendant 300 s de l’expérience. Le potentiel réducteur a été appliqué entre 60 s et 180 s. parcelle correspondant (panneau inférieur) du ratio d’intensité volumétrique de deux canaux de STPH par rapport au temps. La zone d’application potentielle réducteur est ombrée en gris. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

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Discussion

La méthode décrite est apte à étudier la proton pompage de protéines membranaires respiratoire qui peuvent être reconstituées dans des liposomes et sont en mesure d’échanger des électrons avec la piscine de la quinone. L’activité de pompage de proton peut être contrôlé au niveau de single-enzymatique à l’aide de colorants sensibles au pH (ratiométrique) encapsulés dans le lumen de liposome (Figure 1 a).

La méthode repose sur la capacité de l’ubiquinone (ou autres quinones), incorporé dans la bicouche lipidique, d’échanger des électrons avec des électrodes modifiées avec un SAM18. Les propriétés de l’électrode d’or, modifiée avec une SAM, sont très spécifiques. Liposomes besoin s’adsorber sur l’et la SAM doit être suffisamment mince pour permettre l’oxydation électrochimique rapide et réduction du pool quinone dans les liposomes. Ce qui est important, l’interaction entre l’électrode et le liposome doit être assez faible ne pas à porter atteinte à l’intégrité de la membrane lipidique. En outre, selon les détails du système expérimental, il est souhaitable si le SAM empêche les réactions catalysées par or côté, telles que la réduction de l’oxygène. Enfin, SAM doit être stable dans la fenêtre de potentielle utilisée. L’utilisation d’électrodes en or ultra-plat modifié avec SAM de haute qualité de 6MH répond à ces exigences dans le cas du cytochrome bo3. Décapage des électrodes en or de plaquettes de silicium atomiquement bémol crée une surface ultra-lisse or avec une SAM idéale proche comme indiqué par les spectres d’impédance. Veuillez noter que nous formons la SAM de 6MH dans l’eau. Nous avons précédemment enregistré sur SAMs avec 6MH à l’isopropanol16, mais ces SAMs présentent des valeurs plus élevées de capacité de la double-couche et de spectres d’impédance qui indiquent une surface plus hétérogène (i.e., défauts plus) avec une résistance plus faible. En outre, lorsque SAMs de 6MH sont préparées à partir d’une solution d’eau, moins réduction de l’oxygène fond (due à la réduction de l’oxygène catalysée or) est observée par rapport à SAMs formé d’une solution d’éthanol/isopropanol. Toutes ces observations indiquent que SAMs de 6MH dans les solutions de l’eau ont une qualité supérieure avec moins de défauts. SAMs de meilleure qualité peuvent également être formées de thiol-composés avec chaines d’alcane plus longues (par exemple, 1-hydroxy-décane-thiol), mais la cinétique de transfert d’électrons deviennent plus lent que l’épaisseur de SAM augmente.

Au cours de l’électrochimie (spectro), ions chlorure devraient être évitées dans la solution tampon puisqu’ils peuvent chemosorb sur la surface d’or à hauts potentiels, éventuellement détériore la qualité de SAM. Pour la même raison, une électrode de référence sans chlorure doit être préférée.

Un autre point important est la perméabilité du fond des liposomes à protons, qui doivent être suffisamment bas pour permettre l’accumulation de protons à la suite de la translocation des protons enzymatique sur l’échelle de temps d’expérience. La composition exacte de lipide peut influencer cette perméabilité. Dans notre travail, nous utilisons polaire e. coli extraits lipidiques additionnés de l’ubiquinone-10. Perméabilité aux protons s’est avérée dépendent fortement de la longueur de chaîne d’acide gras25, même si cela a été contredite dans les études avec de compositions plus complexes lipides26. Fait intéressant, l’ubiquinone récemment a été démontré que pour améliorer la stabilité de membrane27. Enfin, des détergents résiduels de la procédure de reconstitution des protéines peuvent influencer la fuite de protons et c’est pourquoi il est important de supprimer les détergents aussi complètement que possible à l’aide de microbilles de polystyrène hydrophobe, dilution suivie par centrifugation et rinçage complet de la cellule électrochimique après que protéoliposomes sont adsorbés sur la surface. Si douteux, perméabilité liposome peut être vérifiée en suivant le changement de pH de lumen (via STPH) en réponse à un saut de pH externe28.

Mesure de la seule enzyme exigent unilamelar liposomes et liposomes plus petits sont censés montrent des changements de pH plus rapide ou plus comme des diminutions de volume de la lumière. Pour y parvenir, les microbilles de polystyrène sont ajoutés progressivement en petites quantités, conduisant à la lenteur de la formation de liposomes. Dans de telles conditions, les liposomes petites de taille homogène sont formés avec un diamètre moyen de 70 nm et un indice de polydispersité de 0,24 à notre affaire14. STPH aussi s’adsorbe sur les microbilles de polystyrène, réduisant la capacité de microbilles de polystyrène à adsorber le détergent. Ainsi, les microbilles de polystyrène excès il faut additionner pour compenser sa perte. Traitement avec des microbilles de polystyrène a été observé à réduire la concentration de STPH dans la suspension de lipides-protéines par environ un quart (à partir de 5 mM à 3-4 mM). Cependant, la concentration réelle de STPH dans le lumen de le liposome pourrait être plus élevée puisque les liposomes sont formés dès le début sur le traitement avec des microbilles de polystyrène. Au lieu de STPH, autres colorants sensibles au pH peuvent être utilisés. Cependant, il est important que le colorant est membrane imperméable et ratiométrique. Ce dernier permet d’éviter les erreurs expérimentales en raison de Photoblanchiment et des quantités variables de colorant encapsulé.

Calculs simples sont possibles pour estimer si, stochastique, la plupart des liposomes non-vides ne contiennent qu’une seule molécule d’enzyme. En supposant un diamètre moyen de liposomes de 70 nm, un poids moléculaire de lipides de 750 Da et un quartier de lipides de 0,65 nm2 nous donnent une masse de liposomes de 5.2x10-17 g, c'est-à-dire 9.6x1013 liposomes par préparation (5 mg de lipides). À 0,1 % du cytochrome bo3 (MW = 144 kDa), 2 x 1013 molécules d’enzyme sont présents, soit un taux de protéine : liposome 0,2. En utilisant une distribution de Poisson, on peut calculer plus loin que la probabilité de trouver une molécule d’enzyme (17 %) par liposome est dix fois plus élevé que la probabilité de trouver plus d’une molécule (1,7 %). Des calculs plus précis sont possibles si les pertes de l’enzyme et de lipides au cours de la reconstitution, déterminé à partir des essais correspondants sont pris en compte. Ce dernier peut être estimé d’un dosage protéique et en mesurant la fluorescence FDLL de liposomes préparés.

Une fois que le protocole est établi et traces seule enzyme sont enregistrés, plus modifications de la méthode est réalisable selon le but. On pourrait penser à un ajout d’inhibiteur enzymatique ou l’introduction d’un ionophore dans le système. Il faut pour vérifier que l’addition de solvants utilisés pour préparer l’ionophore ou stock inhibiteur n’influencent pas l’état de SAM ou de perméabilité des liposomes.

La technique décrite ici est limitée à un groupe particulier d’enzymes qui sont des transporteurs de protons membranaires et de conversion de quinone. L’équipement et des conditions expérimentales utilisée ici ont été optimisées pour l’activité enzymatique du cytochrome bo3. Ici, la résolution temporelle est de 2-3 secondes, déterminées par la durée d’exposition et le temps qu’il faut pour la tourelle pour changer les filtres. La durée de l’expérience est limitée par Photoblanchiment de colorant fluorescent et, donc, par l’intensité de la lumière. Nous avons trouvé précédemment taux translocation des protons moyenne de cytochrome bo3 à 73 ± 2.2 protons/s en utilisant cette technique, bien que les activités jusqu'à 20 protons/s ont été détectées. Pour utiliser ces techniques pour les enzymes ayant une activité plus ou moins, paramètres d’acquisition image doivent être adaptées (i.e., intensité, durée d’exposition et la durée de l’essai de la lumière). À l’avenir, cette méthode peut être étendue vers autre transport d’électrons proton pompage des enzymes, un exemple étant complexe mitochondrique de conduite j’ai. Autres enzymes peuvent nécessiter des protocoles différents de reconstitution, et cet aspect devra être optimisé pour chaque transporteur différent. Pompes de proton qui ne sont pas de conversion de quinone enzymes peuvent également être étudiées, par exemple, pilotée par l’ATP29, bien que dans ce cas translocation des protons ne peut pas être déclenchée par voie électrochimique, mais l’ajout d’un initiateur (p. ex., ATP) est requis. Dans ce dernier cas, il n’y a pas besoin d’utiliser une lamelle couvre-objet or modifiés. Par ailleurs, autant qu’un colorant fluorescent membrane imperméable et ion sensibles soit utilisé, cette méthode peut être étendue aux autres pompes ioniques, par exemple, le sodium et de potassium.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs reconnaissent le BBSRC (BB/P005454/1) pour un soutien financier. NH a été financé par le programme de jeunes chercheurs VILLUM Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-Mercapto-1-hexanol (6MH) Sigma 451088 97%
8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS) BioChemika 56360
Aluminium holder (Electrochemical cell) Custom-made 30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm
Auxiliary electrode platinum wire
Chloroform VWR Chemicals 83627
E.coli polar lipids Avanti 100600C 25 mg/mL in chloroform
Epoxy EPO-TEK 301-2FL low fluorescence epoxy
Fiji (ImageJ 1.52d) Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)
Filter cube ("ATTO633") Chroma Technology Corporation Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm
Filter cube ("HPTS1") Chroma Technology Corporation Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm
Filter cube ("HPTS2") Chroma Technology Corporation Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm
Filter cube ("Texas Red") Chroma Technology Corporation Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm
Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) ThermoFisher Scientific T1395MP TexasRed-DHPC was used in this work (λexc 595 nm; λem 615 nm)
Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative) ATTO-TEC AD 633-161 ATTO633-DOPE can be used as alternative (λexc 630 nm; λem 651 nm)
Gel filtration column GE Healthcare 28-9893-33 HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification
Glass coverslips VWR International 631-0172 No 1.5
Glass syringe Hamilton 1725 RNR 250 µL
Glass vials Scientific Glass Laboratories Ltd T101/V1 1.75 mL capacity
Gold GoodFellow 99.99%
Gramacidin Sigma G5002
Mercury sulfate reference electrode Radiometer (Hash) E21M012
Microcentrifuge Eppendorf Minispin NL040
Microscope Nikon Eclipse Ti
Microscope Camera Andor Zyla 5.5 sCMOS
Microscope Lamp Nikon Intensilight C-HGFI
NIS-Elements AR 5.0.2 Nikon Microscope acquisition software
n-Octyl β-D-glucopyranoside Melford Laboratories B2007
Nova 1.10 Metrohm Potentiostat control software
Objective Nikon Plan Apo λ 60x/1.4 oil
OriginPro 2017 OriginLab Plotting software
O-ring (Electrochemical cell) Orinoko Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm
Plastic tubes Eppendorf 3810X 1.5 mL
Polystyrene microbeads Bio-RAD 152-3920 Biobeads, 20-50 mesh
Potentiostat Metrohm Autolab PGSTAT 128N
Potentiostat CH Instruments CHI604C
Scripting software Matlab R2017a Required toolboxes: 'Image Processing Toolbox', 'Parallel Computing Toolbox', 'Curve Fitting Toolbox', 'System Identification Toolbox', 'Optimization Toolbox'
Silicon wafers IDB Technologies LTD Si-C2 (N<100>P) Ø 25 mm, 525 um thick
Teflon cell (Electrochemical cell) Custom-made Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm
Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces Platypus Technologies AU.1000.SWTSG Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand)
Thin micropipette tips Sarstedt 70.1190.100 or similar gelloader tips 200 µL
Ubiquinone-10 Sigma C-9538
Ultracentrifuge Beckman-Coulter L-80XP with Ti 45 rotor
Ultrasonic bath Fisher Scientific FB15063

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References

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Mesures de Liposome unique pour l’étude des Enzymes membranaires Proton-pompage, à l’aide de l’électrochimie et microscopie fluorescente
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Mazurenko, I., Hatzakis, N. S.,… More

Mazurenko, I., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. C. Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy. J. Vis. Exp. (144), e58896, doi:10.3791/58896 (2019).

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