Summary
Vi presenterer en protokoll for et fargemetrisk analyse av citrate syntase aktivitet for kvantifisering av intakt mitokondrie masse i Drosophila tissue homogenater.
Abstract
Mitokondrier spiller de mest prominente rollene i cellenes metabolisme ved å produsere ATP gjennom oksidativt fosforylering og regulere en rekke fysiologiske prosesser. Mitokondrie dysfunksjon er en primær årsak til en rekke metabolske og nevrodegenerative sykdommer. Intakt mitokondrier er avgjørende for riktig funksjon. Enzymet citrate syntase er lokalisert i mitokondrie matrise og dermed kan brukes som en kvantitativ enzym markør av intakt mitokondrie masse. Gitt at mange molekyler og trasé som har viktige funksjoner i mitokondrier er svært bevart mellom mennesker og Drosophila, og at en rekke kraftige genetiske verktøy er tilgjengelige i Drosophila, Drosophila fungerer som en god modell for å studere mitokondrie funksjon. Her presenterer vi en protokoll for rask og enkel måling av citrate syntase aktivitet i vev homogenate fra voksen fluer uten å isolere mitokondrier. Denne protokollen er også egnet for måling av citrate syntase aktivitet i larver, kulturperler celler, og pattedyr vev.
Introduction
Mitokondrier er best kjent som kraft-produserende organeller i de fleste eukaryote organismer, som produserer energi valuta, ATP, gjennom tricarboxylic syre syklus (dvs. Krebs syklus) og oksidativt fosforylering. Mitokondrier er også funnet å spille viktige roller i en rekke andre fysiologiske prosesser, slik som regulering av apoptose1, ca2 + homeostase2,3, reaktiv oksidasjon arter (ros) generasjon4, og endoplasmatiske retikulum (er)-stress respons5. Mitokondrie dysfunksjon kan påvirke noen organ i kroppen i alle aldre og er en primær årsak til metabolsk, aldring-relaterte6, og nevrodegenerative sykdommer7. Intakt mitokondrier er mechanistically relatert til mitokondrie funksjon. Dermed riktig kvantifisering av intakt mitokondrie massen er svært viktig for å evaluere mitokondrie funksjon8. Citrate syntase, en rate-begrensende enzym i det første trinnet av tricarboxylic acid syklus9, er lokalisert i mitokondrie matrise innen eukaryote celler, og dermed kan brukes som en kvantitativ markør for tilstedeværelsen av intakt mitokondrie masse9,10. Citrate syntase aktivitet kan også brukes som en normalisering faktor for intakt mitokondrie proteiner11,12.
Frukten fly, Drosophila melanogaster, er et utmerket modell system for å studere mitokondrie funksjon, som mange molekyler og stier som spiller sentrale roller i mitokondrier er evolutionarily bevart fra Drosophila til mennesker13,14,15. Her presenterer vi en protokoll for en rask og enkel metode for måling av citrate syntase aktivitet ved et fargemetrisk analysen i Drosophila vev homogenater16 i en 96 brønn plateformat. I citrate syntase aktivitet analysen, citrate syntase i Drosophila vev homogenate katalyserer reaksjonen av oxaloacetate med acetyl koenzym A (acetyl COA) å danne citrate COA-sh og H+. CoA-SH reagerer deretter med 5, 5 '-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) for å generere en farget produkt, 2-Nitro-5-thiobenzoate (TNB), som lett kan måles spektrofotometrisk ved 412 NM. Citrate syntase aktivitet kan gjenspeiles av frekvensen av farge produksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fargemetrisk citrate syntase aktivitet analysen for D. melanogaster16
- Samle ti voksne fluer for hver prøve. Samle minst tre eksemplarer prøver for hver genotype.
- Forbered 500 μL av is kald utvinnings buffer som inneholder 20 mM HEPES (pH = 7,2), 1 mM EDTA og 0,1% Triton X-100 i et 1,5 mL reagensrør for hver prøve.
- Bedøve voksen fluer med CO2 på en anestesi pad og isolere ønsket vev. For å isolere den voksne fly thoraxes, for eksempel fikse fly thoraxes av et par tang, og deretter isolere fly abdomens ved å skjære langs grensen av thorax og magen ved hjelp av en saks. Samle fly thoraxes for muskel citrate syntase aktivitet analysen.
Merk: Bestem den friske vekten av vev på dette trinnet hvis du bruker den til å normalisere citrate syntase aktivitet. - Overfør 10 voksne fly thoraxes til 100 μL av iskald utvinnings buffer umiddelbart og homogenisere med morter på is. For å holde prøvene iskald, homogenisere prøvene for 5-10 s på isen, deretter har prøvene sitte på isen for 5 s, og gjenta til alle vev i røret er homogenisert helt.
Merk: tape røret, kontroller homogenater for å sikre at det ikke er noen propper i homogenater og at vevet i røret er homogenisert helt. Alle sample behandlinger bør utføres på isen. - Ta 10 μL av hver homogenisert prøve i et nytt rør for protein innholds måling. Oppbevar prøvene for protein måling på isen.
Merk: protein prøvene kan fryses og oppbevares ved-80 ° c for senere analyse. Protein konsentrasjonene tjene som en intern parameter for normalisering av citrate syntase aktiviteter. - Tilsett 400 μL av iskald avsugs buffer til hver gjenværende prøve for å lage et total volum på 500 μL. Bland godt ved å forsiktig pipettering opp og ned minst 5x, unngå boble dannelse. For hver reaksjon, tilsett 1 μL av fortynnet celle lysat til 150 μL av den nylagde reaksjons løsningen (20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM DTNB, 0,3 mM acetyl CoA, 1 mM aspartat yre). Bland godt og umiddelbart ved å forsiktig pipettering, unngå boble dannelse. Mål absorbansen ved 412 NM hver 10-30 s for 4 min ved 25 ° c ved hjelp av en plate leser som kan måle absorbansen ved 412 NM med et minste intervall på 10 s.
Merk: endre tuppen før du pipettering en annen reagens og unngå dannelse av bobler i brønnene. Ufullstendig blanding av reagensene kan forårsake variasjoner i målingene. Den citrate syntase aktivitet analysen bør gjøres ved romtemperatur umiddelbart etter at prøvene er samlet inn, da denne analysen brukes til å kvantifisere intakt mitokondrie masse. Reaksjons bufferen bør forberedes umiddelbart før bruk, og bør ikke lagres. - Plotte data som optisk tetthet (OD) absorbansen (ABS) (Y-akse) kontra tid (i minutter) (X-akse). Deretter beregne skråningen for den lineære delen av kurven, der reaksjonshastigheten er
Del verdien av prøven proteinkonsentrasjon å normalisere citrate syntase aktivitet. Citrate syntase-aktiviteten beregnes som
Merk: prøven proteinkonsentrasjon kan måles ved et proteinkonsentrasjon analysen Kit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 presenterer et eksempel på kinetisk KURVER for OD absorbansen på 412 NM over tid innhentet ved hjelp av citrate syntase aktivitet fargemetrisk analysen for å måle Drosophila thorax vev homogenater av ulike genotyper. Det er velkjent at PGC-1 α er en Master regulator av mitokondrie kognitiv. PGC-1 α er funksjonelt bevart mellom Drosophila og mennesker. Drosophila RNF34 (dRNF34) er en E3 ubiquitin ligase for Drosophila PGC-1 Α, dPGC-1, og fremmer dPGC-1 protein degradering17. Transmission Electron mikroskopi og mitokondrie DNA qPCR har vist at knockdown av dRNF34 i Drosophila muskelen øker mitokondrie innhold, som er undertrykt av knockdown av dPGC-117. Basert på disse resultatene vi hypotetisk gjennomsnitt at knockdown av dRNF34 i Drosophila muskelen ville øke mitokondrie citrate syntase aktivitet, som bør reverseres ved knockdown av dPGC-1. Faktisk bruker fargemetrisk analysen av citrate syntase aktivitet beskrevet her, fant vi ut at knockdown av dRNF34 i Drosophila muskelen økte mitokondrie citrate syntase aktivitet, som ble reversert ved knockdown av dPGC-1. Spesielt ved hjelp av metoden beskrevet her, en første lineær enzymatisk hastighet ble etablert for hver analysen (figur 1). Trendlinjer med sine formler og koeffisient av besluttsomhet (R2) er vist i grafen (figur 1). Bakkene i trendlinjene representerer maksimal reaksjonshastighet, som tilsvarer den maksimale citrate syntase aktivitetene til de forskjellige genotyper. Bakkene for de forskjellige genotyper er forskjellige (figur 1). Koeffisient av besluttsomhet er nærmere 1; formlene i trendlinjene er mer pålitelige. Protein konsentrasjonen normalisert maksimal citrate syntase aktiviteter av forskjellige genotyper ble beregnet fra figur 1 data (figur 2). Den maksimale citrate syntase aktivitet fly thoraxes med muskel-spesifikke dRNF34 knockdown økt, som ble reversert av muskel-spesifikke dPGC-1 knockdown (figur 2).
Figur 1: et eksempel på kinetisk kurver for fargemetrisk analysen av citrate syntase aktivitet. Den voksne fly thorax homogenater av (a) 24B-Gal4 > + (b) 24B-GAL4 > dRNF34RNAi (II), og (c) 24B-Gal4 ≫ dRNF34RNAi (II), dPGC-1RNAi ble utsatt for fargemetrisk analysen av citrate syntase aktivitet. De horisontale aksene representerer reaksjonstider, og de vertikale aksene representerer OD-absorbencies ved 412 NM. En lineær enzymatisk hastighet ble etablert for hver genotype. Trendlinjene ble tegnet, og formlene og R2 av trendlinjene vises i grafen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: maksimal citrate syntase aktiviteter beregnet fra kinetisk kurver og normalisert av proteinkonsentrasjon. Den maksimale citrate syntase aktivitet fly thoraxes med muskel-spesifikke dRNF34 knockdown økt, som ble reversert av muskel-spesifikke dPGC-1 knockdown. Alle data er representert som betyr ± SEM (*p < 0,01, av Anova test, og Tukey ' s test for flere sammenligninger, n = 3, 10 thoraxes per gjenskape). Dette tallet er modifisert fra Wei et al.17. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metabolske studier med Drosophila som modell må ta hensyn til genetisk bakgrunn, kosthold, og lager vedlikehold av fluene18. For å unngå virkningene av ulike genetiske bakgrunner på måling av citrate syntase aktivitet, bør ulike stammer av Drosophila være backcrossed til kontroll belastningen for 10 generasjoner. Den genetiske bakgrunnen for alle Drosophila stammer som brukes i våre eksperimenter er w1118, så vi brukte w1118 som en kontroll. Vanligvis tror vi w1118 er en god kontroll, som det er genetisk bakgrunn for de fleste Drosophila stammer og er mye lettere å backcross enn Canton-S. Dietten og lager vedlikehold må være nøyaktig den samme for alle eksperimentelle grupper. I våre eksperimenter, er fluer normalt opprettholdes ved 25 ° c og 50-60% relativ luftfuktighet. Prøve Forberedelses trinnet bør også utføres med forsiktighet. De krysser som er satt opp for eksperimentet bør være i en lignende og hensiktsmessig skala. For å sette opp et kors, 3-4 kvinnelige jomfru voksne fluer holdes med 2-3 mannlige voksne fluer i en 4 cm diameter, 15 cm høyt hetteglass leveres med fersk mat. Maten oppskriften kan variere (f. eks, høy fett diett, normal diett, høy sukker diett), avhengig av eksperimentell design. To dager senere, er foreldrenes generasjon av fluer overført til et nytt hetteglass med fersk mat. Omsorg for Larvene klekket ut i maten inkluderer å tilsette litt vann om nødvendig. Når den filial generasjonen av fluer begynner å klekkes, blir hetteglassene snudd hver 24 h, fluene av de ønskede genotype er samlet i et nytt hetteglass for eksperimentet, og luken datoen for fluene er merket på hvert hetteglass. Omtrent 20-30 samlet fluer av samme genotype, kjønn og alder oppbevares i et hetteglass med mat. De innsamlede fluene må overføres til ferske hetteglass med riktig mat annenhver dag til forsøkene er utført. For å unngå effekten av alder på citrate syntase aktivitet, fluene av de ulike gruppene testet bør Luke på samme dag. I tillegg bør kjønnet på fluene matches. Vanligvis kroppen størrelsen på kvinner er større enn for menn, og dermed proteinkonsentrasjon av kvinnelige organer er høyere enn for mannlige organer.
Den citrate syntase aktivitet analysen kan også brukes for å måle citrate syntase aktivitet i larver. For dette formål, kan hver prøve bestå av fem vandrende tredje skikkelsen larver. Den tredje skikkelsen larver kan skilles med en mørk oransje ring på tuppen av deres bakre trakeer, som mangler eller svakt til stede i den andre skikkelsen larver.
I trinn 6 kan fortynnings forholdene for prøver variere for ulike prøver. For prøvene som først måles, flere fortynning prosenter må være forsøkt å finne en passende fortynning ratio å etablere en lineær enzymatisk rate i analysen. Den totale måle tiden for maksimal enzym aktivitet som etablerer en lineær enzymatisk rate i analysen varierer avhengig av enzymet-substrat ratio. Hvis underlaget er svært overdose i forhold til enzymet, deretter enzymet aktivitet eller reaksjonshastigheten når maksimal, som tillater etablering av en lineær enzymatisk rate i analysen. Som reaksjonen går på, mengden av underlaget avtar, og enzymet aktivitet eller reaksjonshastigheten bremser ned. Hvis en lineær enzymatisk hastighet ikke kan tegnes, noe som betyr at underlaget ikke er overdose i forhold til enzymet, ytterligere fortynne vevet homogenater med reaksjons løsning eller forkorte intervalltiden for 412 NM opplesninger til en lineær enzymatisk rate tomten er Etablert. Intervalltiden for 412 NM lesing bør ikke være mer enn 30 s. Varigheten på 412 NM lesing er basert på reaksjonshastighet og tid. Spektrofotometer avlesningen skal stoppe når det ikke er observert flere fargeendringer for alle reaksjoner.
Den citrate syntase aktivitet kan bli normalisert av prøven proteinkonsentrasjon, prøve frisk vekt, eller celle nummer. Prøve frisk vekt kan måles før homogenisere som i trinn 3. Celle nummeret kan også brukes til å normalisere lysat av kulturperler celler, men cellene må være helt lysert. DNA-innhold er ikke et godt alternativ for en intern kontroll, da DNA-ekstraksjon prosedyren kan innføre variasjoner i prøvene, spesielt for prøver som inneholder en liten mengde av DNA.
Hvis ingen fargeendring er observert etter reaksjonen, kan det tas flere forskjellige feilsøkingstrinn:
1. Sjekk prøven forberedelse trinnet, og pass på å håndtere prøvene riktig, holde prøvene på isen, og unngå flere fryse-tine sykluser.
2. Prøv å bruke en høyere proteinkonsentrasjon, fordi noen prøver kan ha mye lavere uttrykk nivåer av citrate syntase som er undetectable av citrate syntase aktivitet analysen.
3. Merk at noen kommersielt tilgjengelige kits for citrate syntase aktivitet analysen ikke kan brukes for Drosophila, fordi disse kits bestemme mitokondrie citrate syntase aktivitet basert på immunocapture av pattedyr citrate syntase og pattedyr citrate syntase antistoff kan ikke anerkjenne Drosophila citrate syntase.
Likeledes, hvis det er en uoverensstemmelse mellom prøvene:
1. Kontroller at det ikke er noen bobler i brønnene.
2. Undersøk om dette er forårsaket av dårlig pipettering teknikk.
I motsetning til å måle citrate syntase aktivitet ved et fargemetrisk analysen i renset mitokondrier, som krever nesten 200 fluer for rensing av mitokondrier av hver genotype19, presenterer vi en protokoll for en rask og enkel analyse for måling av citrate syntase aktivitet av et fargemetrisk metode i vev homogenate eller i hele celle ekstrakter16. For hver prøve, bare ti fluer klekket på samme dag er nødvendig; for tre eksemplarer prøver av hver genotype, er 30 fluer nødvendig. Protokollen beskrevet gjelder ikke bare for Drosophila , men også til andre systemer, slik som kulturperler celler og pattedyr vev.
I tillegg til citrate syntase aktivitet analysen, kan andre metoder brukes til å kvantifisere mitokondrie masse. Sammenlignet med andre ofte brukte kvantitative metoder for mitokondrier, slik som måling av mitokondrie DNA innhold av qPCR og kvantifisering av mitokondrie proteiner av vestlige blotting, som oppdager alle mitokondrier uavhengig av deres funksjon, er citrate syntase aktivitet analysen brukes til å kvantifisere tilstedeværelsen av intakt mitokondrie masse. I motsetning til mitokondrie åndedrett analysen, som trenger mitokondrie rensing og spesialiserte analysen utstyr16, den citrate syntase aktivitet analysen tillater forskere å utføre raske målinger av Spektrofotometri med enkle prøve forberedelser, for eksempel hele celle ekstrakt eller vev homogenate, og ikke behov for mitokondrie isolasjon. Dermed er citrate syntase aktivitet analysen en rask og økonomisk analysen for kvantifisering av intakt mitokondrie masse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation i Kina (31401013 og 31471010), Science and Technology Commission of Shanghai kommune, Shanghai Pujiang program (14PJ1405900), og Natural Science Foundation of Shanghai (19ZR1446400).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Pellet pestle | Sangon | F619072 | |
| Pellet pestle motor | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Plate reader | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Assay kit | Beyotime | P0010S | |
| Scissors | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
References
- Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans. Cell. 157 (4), 897-909 (2014).
- Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (4), 1453-1466 (2015).
- Oxenoid, K., et al.
- Hekimi, S., Wang, Y., Noe, A. Mitochondrial ROS and the Effectors of the Intrinsic Apoptotic Pathway in Aging Cells: The Discerning Killers! Frontiers in Genetics. 7, 161 (2016).
- Kim, H. E., et al. Lipid Biosynthesis Coordinates a Mitochondrial-to-Cytosolic Stress Response. Cell. 166 (6), 1539-1552 (2016).
- Wang, Y., Hekimi, S. Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot. Science. 350 (6265), 1204-1207 (2015).
- Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson's model. Cell Death & Disease. 5, e984 (2014).
- Tronstad, K. J., et al. Regulation and quantification of cellular mitochondrial morphology and content. Current Pharmaceutical Design. 20 (35), 5634-5652 (2014).
- Wiegand, G., Remington, S. J. Citrate synthase: structure, control, and mechanism. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).
- Lopez-Lluch, G., et al. Calorie restriction induces mitochondrial biogenesis and bioenergetic efficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (6), 1768-1773 (2006).
- MacInnis, M. J., et al. Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work. Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).
- Gillen, J. B., et al. Twelve Weeks of Sprint Interval Training Improves Indices of Cardiometabolic Health Similar to Traditional Endurance Training despite a Five-Fold Lower Exercise Volume and Time Commitment. PLoS One. 11 (4), e0154075 (2016).
- Mukherjee, S., Basar, M. A., Davis, C., Duttaroy, A. Emerging functional similarities and divergences between Drosophila Spargel/dPGC-1 and mammalian PGC-1 protein. Frontiers in Genetics. 5, 216 (2014).
- Mukherjee, S., Duttaroy, A. Spargel/dPGC-1 is a new downstream effector in the insulin-TOR signaling pathway in Drosophila. Genetics. 195 (2), 433-441 (2013).
- Diop, S. B., et al. PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase. Cell Reports. 10 (9), 1572-1584 (2015).
- Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).
- Wei, P., et al. RNF34 modulates the mitochondrial biogenesis and exercise capacity in muscle and lipid metabolism through ubiquitination of PGC-1 in Drosophila. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50 (10), 1038-1046 (2018).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Bosco, G., et al. Effects of oxygen concentration and pressure on Drosophila melanogaster: oxidative stress, mitochondrial activity, and survivorship. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 88 (4), 222-234 (2015).
