Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

عزل جزيئات البروتين الدهني من صفار بيض الدجاج لدراسة دمج الأحماض الدهنية المسببة للأمراض البكتيرية في الدهون الفوسفاتية الغشاء

Published: May 15, 2019 doi: 10.3791/59538
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University, 2Department of Physiology, Michigan State University

Summary

توفر هذه الطريقة إطارا لدراسة دمج الأحماض الدهنية الخارجية من المصادر المضيفة المعقدة في الأغشية البكتيرية ، وخاصة المكوراتالعنقودية العضوية . ولتحقيق ذلك، يتم وصف بروتوكولات لإثراء جزيئات البروتين الدهني من صفار بيض الدجاج وتوصيف الأحماض الدهنية اللاحقة للفوسفوليبيدات البكتيرية باستخدام قياس الطيف الكتلي.

Abstract

المكورات العنقودية أوريوس وغيرها من مسببات الأمراض إيجابية الجرام دمج الأحماض الدهنية من البيئة في فوسفوليبيدات الغشاء. خلال العدوى ، توجد غالبية الأحماض الدهنية الخارجية داخل جزيئات البروتين الدهني المضيف. ولا يزال عدم اليقين قائما فيما يتعلق بخزانات الأحماض الدهنية المضيفة والآليات التي تستخرج بها البكتيريا الأحماض الدهنية من جزيئات البروتين الدهني. في هذا العمل، ونحن نصف بروتوكولات لإثراء البروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL) جزيئات من صفار البيض الدجاج وتحديد ما إذا كانت LDLs بمثابة خزانات الأحماض الدهنية لS. aureus. هذا الأسلوب يستغل تحليل الدهون غير متحيزة وLDLs الدجاج، وهو نموذج فعال واقتصادي لاستكشاف التفاعلات بين LDLs والبكتيريا. يتم إجراء تحليل S. aureus التكامل من الأحماض الدهنية الخارجية من LDLs باستخدام عالية الدقة / قياس الطيف الكتلي الدقيق والقياس الطيفي الكتلي جنبا إلى جنب، مما يتيح توصيف تكوين الأحماض الدهنية للبكتيريا غشاء وتحديد غير متحيزة من تركيبات جديدة من الأحماض الدهنية التي تنشأ في الدهون الغشاء البكتيري عند التعرض لLDLs. تقدم هذه التقنيات المتقدمة لقياس الطيف الكتلي منظورًا لا مثيل له لدمج الأحماض الدهنية الدهنية من خلال الكشف عن الأحماض الدهنية الخارجية المحددة المدمجة في الدهون الفوسفاتية. الطرق المبينة هنا قابلة للتكيف مع دراسة مسببات الأمراض البكتيرية الأخرى والمصادر البديلة للأحماض الدهنية المعقدة.

Introduction

Methicillin مقاومة S. aureus (MRSA) هو السبب الرئيسي للعدوى المرتبطة بالرعاية الصحية ومقاومة المضادات الحيوية المرتبطة بها هو تحد سريري كبير1،2،3. ولذلك، فإن وضع استراتيجيات علاجية جديدة هو أولوية عالية. استراتيجية العلاج واعدة لمسببات الأمراض إيجابية الجرام هو تثبيط تخليق الأحماض الدهنية، وهو شرط لإنتاج الدهون الفوسفاتية الغشاء الذي، في S. أوريوس،ويشمل فوسفاتيديلغليسيرول (PG)، ليسل-PG، وcardiolipin4. في البكتيريا، يحدث إنتاج الأحماض الدهنية عن طريق التخليق الأحماض الدهنية الثاني المسار (FASII)5، والذي يختلف اختلافا كبيرا عن نظيره eukaryotic، مما يجعل FASII هدفا جذابا لتطوير المضادات الحيوية5،6 . مثبطات FASII تستهدف في المقام الأول FabI، وهوإنزيم مطلوب لاستطالة سلسلة الكربون الأحماض الدهنية 7. يستخدم على نطاق واسع مثبطات فابي التريكلوسان في السلع الاستهلاكية والطبية8،9. ويجري تطوير مثبطات FabI إضافية من قبل العديد من شركات الأدوية لعلاج عدوى S. aureus 10،11،12،13،14 ،15،16،17،18،19،20،21،22،23 ،24،25،26. ومع ذلك، العديد من مسببات الأمراض إيجابية غرام، بما في ذلك S. aureus،قادرة على مسح الأحماض الدهنية الخارجية لتخليق الدهون الفوسفاتية، وتجاوز تثبيط FASII27،28،29. وهكذا، يتم مناقشة الإمكانات السريرية لمثبطات FASII بسبب وجود ثغرات كبيرة في معرفتنا بمصادر الأحماض الدهنية المضيفة والآليات التي تقوم بها مسببات الأمراض باستخراج الأحماض الدهنية من المضيف27،28. لمعالجة هذه الثغرات، قمنا بتطوير طريقة تحليل الدهون غير متحيزة لرصد دمج الأحماض الدهنية الخارجية من جزيئات البروتين الدهني في فوسفوليبيدات الغشاء من S. aureus.

أثناء الإنتان ، تمثل جزيئات البروتين الدهني المضيف مصدرا محتملا للأحماض الدهنية المشتقة من المضيف داخل الأوعية الدموية ، حيث ترتبط غالبية الأحماض الدهنية المضيفة بالجسيمات30. تتكون البروتينات الدهنية من قشرة مائية تتكون من الدهون الفوسفاتية والبروتينات التي تحيط بجوهر الكاره للماء من الدهون الثلاثية واسترات الكوليسترول31. يتم إنتاج أربع فئات رئيسية من البروتينات الدهنية - الهيلوميكرون، والبروتين الدهني منخفض الكثافة، والبروتين الدهني عالي الكثافة، والبروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL) - من قبل المضيف وتعمل كمركبات نقل للدهون، وتقديم الأحماض الدهنية والكوليسترول من وإلى الخلايا المضيفة عبر الأوعية الدموية. LDLs وفيرة في الأحماض الدهنية استيريفيد بما في ذلك الدهون الثلاثية واسترات الكوليسترول31. لقد أثبتنا في السابق أن LDLs البشرية عالية النقاء هي مصدر قابل للحياة من الأحماض الدهنية الخارجية لتخليق PG، وبالتالي توفير آلية لمثبطات FASII الالتفافية32. يمكن أن يكون تنقية LDLs البشرية صعبة من الناحية الفنية وتستغرق وقتاً طويلاً في حين أن المصادر التجارية لـ LDLs البشرية النقية مكلفة للغاية للاستخدام على أساس روتيني أو لأداء شاشات بكتيرية واسعة النطاق. لمعالجة هذه القيود، قمنا بتعديل إجراء لإثراء LDLs من صفار البيض الدجاج، وهو مصدر غني من جزيئات البروتين الدهني33. لقد استخدمنا بنجاح غير مستهدفة، عالية الدقة / قياس الطيف الكتلي الدقيق والقياس الطيفي الكتلي جنبا إلى جنب لرصد دمج الأحماض الدهنية المستمدة من LDL الإنسان في غشاء S. aureus32. على عكس الأساليب التي تم الإبلاغ عنها سابقا، يمكن لهذا النهج تحديد أيزومرات الأحماض الدهنية الفردية لكل من أنواع فوسفوليبيد المكورات العنقودية الرئيسية الثلاثة. حمض الأوليك (18:1) هو حمض دهني غير مشبع موجود داخل جميع جزيئات البروتين الدهني المضيف التي يتم دمجها بسهولة في S. aureus phospholipids29،30،32. S. aureus ليست قادرة على توليف حمض الأوليك29; ولذلك، فإن كمية حمض الأوليك المدرجة فوسفوليبيد يثبت وجود الأحماض الدهنية المشتقة من البروتين الدهني المضيف داخل غشاء المكورات العنقودية29. ويمكن تحديد هذه الأنواع الفوسفاتية من خلال أحدث طريقة قياس الطيف الكتلي الموصوفة هنا، وتقدم دقة غير مسبوقة لتكوين غشاء S. aureus المستزرعة في وجود مصدر الأحماض الدهنية فمن المرجح المواجهات أثناء العدوى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: البروتوكول التالي لإثراء جزيئات LDL من صفار بيض الدجاج مشتق من موسى وآخرون 200233.

1. إعداد صفار البيض الدجاج لإثراء جزيئات LDL

  1. قم بتعقيم بيضتي دجاج كبيرتين عن طريق غسل الأصداف بمحلول الإيثانول بنسبة 70% والسماح بتجفيف الهواء.
  2. قم بتعقيم فاصل البيض باستخدام محلول الإيثانول بنسبة 70% والسماح بتجفيف الهواء. يُرفق فاصل البيض على شفة كوب متوسط الحجم.
  3. الكراك كل بيضة على حدة في فاصل البيض والسماح للألبومين لتدفق إلى الكأس. سيتم الاحتفاظ صفار البيض سليمة من قبل فاصل.
  4. اغسل صفار البيض مرتين مع 30 مل من محلول ملحي معقم بالفوسفات (PBS) لإزالة الزلال المتبقي.
  5. وضع صفار البيض بلطف على ورقة التصفية.
  6. ثقب غشاء vitelline مع طرف ماصة معقمة واستنزاف محتويات الغشاء في أنبوب الطرد المركزي مخروطي معقمة 50 مل. تجاهل الغشاء وورقة التصفية.

2. تجزئة البلازما التي تحتوي على LDL من صفار البيض الدجاج

  1. إضافة ما يقرب من مجلدين من 0.17 M NaCl في الحموضة 7.0 إلى صفار البيض وتخلط بقوة. ثم خلط هذا الحل في 4 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
  2. طرد مركزي تخفيف صفار البيض في 10 درجة مئوية في 10،000 × ز لمدة 45 دقيقة.
  3. كرر الخطوة 2.2.

3. عزل جزيئات LDL من البلازما

  1. اخلط جزء البلازما مع كبريتات الأمونيوم 40% (ث/v) عند 4 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
  2. ضبط الحموضة من كسر البلازما مع حل هيدروكسيد الصوديوم 420 MM إلى 8.7.
  3. طرد مركزي تخفيف صفار البيض في 4 درجة مئوية في 10،000 × ز لمدة 45 دقيقة. توفير غرفة في الأنابيب للسماح لها أن تنتفخ.
  4. Dialyze بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في 3 لتر من الماء النقي جدا لإزالة كبريتات الأمونيوم. تحريك الماء بلطف باستخدام شريط تحريك.
  5. نقل حل dialyzed في أنبوب الطرد المركزي مخروطي معقمة 50 مل.
  6. طرد مركزي الحل في 4 درجة مئوية في 10،000 × ز لمدة 45 دقيقة.

4. تقييم LDLs الدجاج كمصدر للأحماض الدهنية

  1. Subculture S. الخلايا الأوريوس في 5 مل من الأحماض الدهنية خالية 1٪ مرق التربتون وحضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع هز (225 دورة في الدقيقة). للأوكسوتروفات الأحماض الدهنية, الثقافات الملحق مع مصدر من الأحماض الدهنية.
  2. تخفيف الثقافات بين عشية وضحاها إلى كثافة بصرية (OD) في 600 نانومتر (OD600)من 0.1 في 1٪ مرق التربتون. ماصة 50 درجة مئوية من تعليق الخلية في كل بئر من لوحة مستديرة القاع 96 جيدا.
    ملاحظة: عند العمل مع auxotrophs الأحماض الدهنية، وغسل الثقافات بين عشية وضحاها في مجلدين من مرق التربتون وإعادة تعليق في 5 مل من مرق التربتون للحد من ترحيل الأحماض الدهنية قبل تحديد OD للثقافة.
  3. بالنسبة للآبار التي تحتوي على عناصر تحكم غير معالجة، أضف 50 ميكرولتر من مرق التربتون بنسبة 1% لكل بئر.
  4. إلى الآبار التي تحتوي على تعليق الخلايا التجريبية، إضافة 50 درجة مئوية من مرق التربتون 1٪ تكملها 10٪ صفار البيض المستمدة LDL، 2 μM التريكلوسان، أو خليط من 10٪ صفار البيض المستمدة LDL و 2 μM تريكلوسان.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، كل بئر سوف تحتوي على 100 درجة مئوية والتركيز النهائي من صفار البيض المستمدة LDL وtriclosan لكل بئر سيكون 5٪ و 1 ميكرومتر، على التوالي.
  5. قياس OD600 مع مرور الوقت، وذلك باستخدام قارئ لوحة صغيرة تعيين في 37 درجة مئوية مع المستمر، والهز الخطي لمراقبة النمو.

5. حضانة S. aureus مع LDLs لتحليل الدهون الغشاء.

  1. ثقافة مستعمرة معزولة في 5 مل من الأحماض الدهنية خالية من مرق التربتون 1٪ وحضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع هز (225 دورة في الدقيقة).
  2. تمييع الثقافات بين عشية وضحاها 1:100 في قارورة معقمة 250 مل حيرة تحتوي على 50 مل من مرق التربتون 1٪. حضانة إلى مرحلة منتصف السجل (حوالي 4 ح) في 37 درجة مئوية مع الهز.
  3. نقل 25 مل من الثقافة إلى أنبوب الطرد المركزي معقمة 50 مل وبيليه الخلايا. إزالة supernatant وإعادة تعليق بيليه الخلية في 750 درجة مئوية من مرق التربتون 1٪.
  4. الجمع بين الخلايا المعلقة وaliquot 300 درجة مئوية من تعليق الخلية في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل معقمة.
  5. إضافة LDLs إلى التركيز النهائي المطلوب وحضانة في 37 درجة مئوية مع هز (225 دورة في الدقيقة) لمدة 4 ساعة.
  6. طرد مركزي الثقافات في 4 درجة مئوية في 16،000 × ز لمدة 2 دقيقة وغسل الكريات الخلية في مجلدين من PBS معقمة ثم كرر.
  7. تسجيل وزن كل بيليه الخلية الرطبة. قم بتجميد كريات الخلايا على الجليد الجاف أو في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية أو انتقل مباشرة إلى القسم 6.

6. استخراج الدهون غشاء الأوروس S.

  1. وضع الكريات الخلية المجمدة S. aureus على الجليد الجاف. إضافة حبات أكسيد الزركونيوم 0.5 ملم على رأس كل بيليه الخلية، وذلك باستخدام حجم من الخرز يساوي تقريبا حجم بيليه الخلية.
    ملاحظة: كبديل لهذه الطريقة لاستخراج الدهون، يمكن للباحثين استخدام أساليب Bligh وDyer أو Folch راسخة لتشفير الدهون من الخلايا البكتيرية34.
  2. إضافة 740 درجة مئوية من الميثانول 75٪ (HPLC الصف) المبردة إلى -80 درجة مئوية مباشرة إلى الكريات الخلية.
  3. إضافة 2 درجة مئوية من 50 μM ديميريستيل فوسفاتيديلكولين (أعدت في الميثانول) لكل 1 ملغ من الخلايا كمعيار داخلي. أغلق أنبوب الاختبار وضع أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل التي تحتوي على كل عينة في منفذ متاح في المجانسة الأنسجة خلاط رصاصة. تجانس العينات على سرعة منخفضة، ووضع 2-3، لمدة 3 دقائق.
  4. فحص بصريا العينات للتجانس. إذا كانت كتل من الخلايا مرئية، استمر في التجانس في خلاط رصاصة في زيادات 2 دقيقة.
  5. إزالة العينات من خلاط رصاصة ونقلها إلى غطاء الدخان الكيميائية.
  6. إضافة 270 درجة مئوية من الكلوروفورم إلى كل أنبوب عينة. دوامة العينات بقوة لمدة 30 دقيقة.
    تحذير: الكلوروفورم مسرطن محتمل.
  7. الطرد المركزي العينات في جهاز طرد مركزي على سطح الظهر لمدة تصل إلى 30 دقيقة في الحد الأدنى 2000 × ز. ويمكن استخدام سرعات أسرع مع أنابيب الطرد المركزي المتوافقة ويمكن تقصير مدة الطرد المركزي إلى 10 دقائق.
  8. في غطاء الدخان الكيميائي، وجمع supernatant أحادية الطور ونقل إلى أنبوب اختبار جديد، في حين تجنب بعناية بيليه البروتين في الجزء السفلي من أنبوب استخراج.
  9. إضافة 740 درجة مئوية من الميثانول 75٪ (HPLC الصف) و 270 درجة مئوية من الكلوروفورم إلى بيليه البروتين، وإعادة استخراج كل عينة على النحو المبين في الخطوات 6.6-6.8 أعلاه. الجمع بين supernatant من استخراج الثاني مع supernatant التي تم جمعها سابقا لكل عينة.
  10. تبخر المذيبات استخراج تحت تيار من الغاز الخامل مثل النيتروجين أو الأرجون، أوتحت فراغ باستخدام مركز الطرد المركزي (جدول المواد).
  11. غسل مقتطفات الدهون المجففة ثلاث مرات مع 1.0 مل من محلول بيكربونات الأمونيوم 10 مم وإعادة تجفيف العينات كما هو الحال في الخطوة 6.10.
  12. إعادة تعليق مقتطفات الدهون المجففة في مذيب غير القطبية مناسبة مثل إيزوبروبانول. إعادة تعليق العينات باستخدام 20 ميكرولتر لكل 1 ملغ من وزن الخلية الطازجة المحددة في الخطوة 5.7 بدلاً من ذلك، إذا كان وزن الكريات الخلية غير معروف، إعادة تعليق العينات في 200 درجة مئوية من isopropanol والمضي قدماإلى القسم 7.

7. تحليل ملامح الدهون S. aureus باستخدام دقة عالية / قياس الطيف الكتلي الدقيق

  1. قبل إجراء تحليل كامل للدهون، حدد عينات اختبار تمثيلية من المجموعة (المجموعات) التجريبية وحللها على مجموعة من عوامل تخفيف العينات لتحديد نطاقات تخفيف العينات التي تقع فيها تركيزات الدهون الإجمالية ضمن التركيزات الخطية مجموعة من استجابة كاشف لمطياف الكتلة، كما سبق وصفه35.
  2. يتبخر aliquots من كل عينة استخراج الدهون أن تخضع لتحليل الدهون، عن طريق تجفيف aliquots تحتالغاز الخامل أو تحت فراغ في مركز الطرد المركزي (جدول المواد).
  3. إعادة تعليق كل مستخلص للدهون المجففة في قياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS) من الإيزوبروبانول: الميثانول (2:1، v:v) الذي يحتوي على 20 مليون متر من فورمات الأمونيوم، وذلك باستخدام كميات تعادل عامل تخفيف العينة الأمثل على النحو المحدد في الخطوة 7-1.
  4. لتحليل الدهون غير المستهدفة، يمكن إدخال العينات مباشرة إلى منصة قياس الطيف الكتلي عالية الدقة / دقيقة دون استخدام الكروماتوغرافيا عن طريق حقن التدفق أو التسريب المباشر للمستخلصات35و36. نقل مقتطفات الدهون المخففة المعدة في الخطوة 7.3 إلى قارورة autosampler المناسبة أو لوحة 96 جيدا.
  5. للتحليل القائم على حقن التدفق، ضع قارورة العينات التلقائية في عينة تلقائية (15 درجة مئوية) يتم التحكم فيها بدرجة الحرارة لنظامHPLC قادر على تطبيقات الشعيرات الدموية/التدفق المنخفض، مثل HPLC (جدول المواد) المجهزبة بتدفق إلكتروني نظام مراقبة التناسب والتدفق.
  6. ملء خزانات المذيبات HPLC مع LC-MS الصف isopropanol: الميثانول (2:1، v:v) التي تحتوي على 20 MM فورميوم الأمونيوم.
  7. باستخدام برنامج Agilent Chemstation، برنامج HPLC autosampler لإجراء حقن عينة 5 ميكرولتر. من القائمة أداة، حدد إعداد حاقن، واكتب 5.0 في حقل حجم حجم الحقن. وتعطى الوحدات كميكرولتر. تأكد من أن HPLC يتم تعيين إلى تدفق isocratic في 1 ميكرولتر في الدقيقة من 2:1 (V:v) isopropanol: الميثانول التي تحتوي على 20 MM فورمات الأمونيوم.
  8. من القائمة أداة Chemstation، حدد إعداد مضخة...
  9. في حقول الجدول الزمني، أدخل: الوقت 0.00، 100٪ B، تدفق 1.0. ضرب أدخل وإنشاء صف ثان في الجدول الزمني عن طريق إدخال الوقت 10.0، 100٪ B، تدفق 1.0. حدد الزر موافق في أسفل قائمة إعداد المضخة. هذه الإعدادات سوف تمكن 10 تشغيل التحليلية بمعدل تدفق 1.0 درجة مئوية في الدقيقة الواحدة.
  10. إدخال eluate من خط نقل HPLC إلى مطياف الكتلة باستخدام مصدر التأين الكهربائي مزودة بإبرة معدنية منخفضة التدفق (34 G).
  11. باستخدام برنامج التحكم في الآلات الحرارية Tune Plus، حدد قائمة الإعداد وحدد مصدر ESI المدفأ. تعيين الجهد التأين إلى 4000 V وغاز غمد إلى 5 (وحدات التعسفي) عن طريق كتابة هذه القيم في المجالات المقابلة من مربع الحوار. وبالمثل، تعيين درجة الحرارة الشعرية إلى 150 درجة مئوية وعدسة S إلى 50٪.
    ملاحظة: هذه القيم تحتاج إلى تحسين لكل منصة قياس الطيف الكتلي.
  12. لتحليل الدهون غير المستهدفة، استخدم منصة عاليةالدقة / دقيقة كتلة MS (جدول المواد) ككاشف.
  13. باستخدام برنامج Thermo Tune Plus، انقر فوق الزر تعريف المسح الضوئي، وفي قائمة محلل حدد FTMS. قم بتعيين حقل النطاق الكتلي إلى عادي وفي الحقل "دقة" حدد 100,000. تأكد من تعيين نوع المسح الضوئي إلى كامل. ضمن القائمة نطاقات المسح الضوئي، أدخل 200 في حقل الكتلة الأولى (م/ض)، وأدخل عام 2000 في الحقل الكتلة الأخيرة (م/ض).
  14. تأكد من استخدام القطبية السلبية للكشف عن الدهون S. aureus الأكثر وفرة.
  15. كرر تحليل العينة باستخدام رسم خرائط أيون جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي (MS/MS) تجزئة جميع أيونات الدهون داخل منطقة الطيفية ذات الأهمية من أجل تأكيد هياكل الدهون ومكونات الأحماض الدهنية. وبدلاً من ذلك، قد تخضع أيونات الدهون المختارة ذات الأهمية لتحليل التصلب المتعدد/التصلب المتعدد بعد تحديد العوامل الأولية للدهون في القسم 8.

8. قاعدة بيانات البحث لتحديد S. aureus الذاتية والدهون الخارجية المستمدة من LDL

  1. استخدام برنامج Thermo Xcalibur لزيادة صقل دقة الكتلة الملاحظة. في Xcalibur، ضمن القائمة أدوات، حدد إعادة معايرة دون اتصال. بعد فتح إطار إعادة المعايرة دون اتصال، قم بتحميل ملف الطيف الكتلي لإعادة تقويمه عن طريق تحديد قائمة الملف وتحديد الخيار فتح.
  2. افتح ملف الفائدة، قم بتبديل الزر إدراج صف في أعلى إطار العرض، لعرض مخطط الألوان أيون الكلي لتشغيل MS. متوسط إشارات التصلب المتعدد المكتسبة عن طريق النقر بزر الماوس الأيسر على حافة واحدة من ذروة الإشارة الملاحظة في مجموع اللوني أيون وسحب الماوس عبر الجزء الأوسع من الذروة.
  3. ضمن القائمة تصفية المسح الضوئي، حدد عامل التصفية المطابق لبيانات MS المسح الضوئي الكامل. تحميل ملف مرجعي يحتوي على كتل أحادية الاضوجي النظرية من ثلاثة على الأقل من الدهون الذاتية المعروفة S. aureus عن طريق تحديد الزر تحميل المرجع ... حدد المربع استخدام بجوار كل كتلة أحادية النظائر الدهون.
  4. انقر فوق الزر بحث في أسفل إطار العرض. إعادة متوسط إشارة MS عبر ذروة الإشارة في مجموع الكروماتوغرام أيون كما فعلت سابقا.
  5. انقر فوق الزر تحويل بالقرب من أسفل إطار العرض. عند فتح مربع الحوار تحويل، انقر فوق موافق. حذف هذه الخطوة إذا تم جمع البيانات على منصات قياس الطيف الكتلي من البائعين غير الحرارية العلمية.
  6. باستخدام برنامج Xcalibur، قم بتصدير قوائم الذروة الجماهيرية الدقيقة المعاد معالجتها لكل عينة غير معالجة أو معالجة LDL إلى أوراق عمل منفصلة لملف Excel. حدد رمز متصفح Qual. افتح ملف الفائدة المعاد معايرة عن طريق تحديد القائمة ملف وتحديد الخيار فتح...
  7. متوسط الإشارة عبر الذروة العريضة في مجموع الكروماتوغرام الأيونكما هو موضح في الخطوة 8.2.
  8. انقر بزر الماوس الأيمن فوق رمز thumbtack في نافذة عرض الطيف الشامل وحدد عرض | قائمة الطيف. من نفس القائمة، حدد خيارات العرض ثم مربع تبديل كافة القمم في القائمة عرض. انقر فوق الزر موافق لإغلاق إطار العرض.
  9. انقر بزر الماوس الأيمن فوق رمز thumbtack في نافذة عرض الطيف الكتلي مرة أخرى وحدد تصدير | الحافظة (الكتلة الدقيقة). قم بلصق خلية البيانات المصدرة A1 من ورقة العمل الأولى في جدول بيانات Excel جديد.
  10. حذف الصفوف الثمانية الأولى من النص في ملف البيانات التي تم تصديرها، بحيث تحتوي الخلية A1 من جدول بيانات Excel على نقطة البيانات الجماعية الأولى من الطيف الكتلي. كرر تصدير كل ملف MS المعاد معايرة باستخدام ورقة عمل جديدة في ملف Excel لكل قائمة الذروة التي تم تصديرها.
  11. باستخدام برنامج التحليل الطيفي الشامل للدهون (LIMSA)37 الوظيفة الإضافية لـ Excel، قم بإنشاء قاعدة بيانات تحتوي على صيغ جزيئية لأنواع الدهون المعروفة S. aureus كما هو موضح من قبل Hewelt-Belka et al. الصيغ التي تمثل الأنواع الدهنية التي يمكن أن تكون موجودة افتراضيا في LDL.
    ملاحظة: بالإضافة إلى ذلك، ينبغي الحرص على إدراج الصيغ الجزيئية المحتملة في قاعدة البيانات للدهون البكتيرية الافتراضية التي أدرجت الأحماض الدهنية LDL الرئيسية، مثل الأوليك (18:1) واللينوليك (18:2) الأحماض الدهنية32.
  12. لإنشاء قاعدة البيانات، افتح جدول بيانات Excel فارغ. في الخلية A1 من ورقة العمل الأولى، اكتب الكتلة التوحيدية النظرية/المحسوبة من أنواع الدهون التي سيتم إضافتها إلى قاعدة البيانات، المقابلة لكتلة أنواع الدهون في الحالة الأيونية التي لوحظت في مطياف الكتلة. في الخلية B1، أدخل اسمًا لأنواع الدهون، مثل PG(34:0).
  13. في الخلية C1، أدخل الصيغة الجزيئية لأنواع الدهون، المقابلة للحالة الأيونية للدهون التي لوحظت في مطياف الكتلة. في الخلية D1، أدخل تهمة الأنواع الدهنية كما لوحظ في مطياف الكتلة. الانتقال إلى الخلية A2 لبدء إدخال جديد لأنواع الدهون التالية التي سيتم إدخالها في قاعدة البيانات القابلة للبحث.
  14. كرر الخطوتين 8.12 و8.13 حتى يتم إدخال كافة أنواع الدهون المطلوبة في قاعدة البيانات. حفظ ملف قاعدة البيانات وتركه مفتوحا في إكسيل.
  15. في Excel، حدد القائمة الوظائف الإضافية في. حدد LIMSA لبدء تشغيل برنامج LIMSA. من القائمة الرئيسية، انقر فوق الزر مكتبة مجمع... في الإطار الجديد الذي يظهر، انقر فوق استيراد المركبات. سيؤدي ذلك إلى تحميل قاعدة البيانات المركبة لاستخدامها من قبل برنامج LIMSA.
  16. إجراء تحديد الدهون على أساس كتلة دقيقة على جميع أطياف MS باستخدام برنامج LIMSA الوظيفة الإضافية لإكسيل وفقا لتعليمات البائع35. من القائمة الرئيسية LIMSA، حدد قائمة الذروة ضمن قائمة نوع الطيف. حدد الوضع الإيجابي أو الوضع السالب لتتوافق مع القطبية التي تم الحصول على بيانات MS.
  17. في نافذة Peak fwhm (m/z)، أدخل إطار البحث الجماعي المطلوب للحصول على نتيجة الذروة. يوصى بإطار بحث عن التسامح الجماعي من 0.003-0.005 م/ض للحصول على بيانات عالية الدقة/دقيقة عن كتلة MS.
  18. في إطار الحساسية، أدخل قطع الأساس المطلوب (على سبيل المثال، 0.01% وفرة نسبية). في قائمة تصحيح النظائر، حدد الملاءمة الخطية أو خوارزميات الطرح، والتي يمكن استخدام هاذا الخوارزمية مع بيانات قائمة الذروة.
  19. تسليط الضوء على مركبات الدهون لإدراجها في البحث قاعدة البيانات عن طريق النقر على الأنواع الدهون المطلوبة داخل نافذة المركبات المتاحة. انقر فوق الزر إضافة لإضافة أنواع الدهون المميزة إلى مجموعة البحث.
  20. تحديد المعايير الداخلية عن طريق النقر على المركبات المضافة، ثم تغيير نافذة التركيز إلى التركيز المقابل للمعيار الداخلي المحدد.
  21. تأكد من أن المعيار الداخلي وأنواع الدهون المختارة التي سيتم تحديدها تنتمي إلى نفس اسم الفئة عن طريق اختيار كل أنواع الدهون المضافة والمعايير الداخلية وكتابة اسم فئة (مثل PG أو Lipid) في حقل الفئة.
  22. لحفظ مجموعة مركبات الدهون القابلة للبحث لاستخدامها في المستقبل، انقر فوق الزر حفظ بجوار قائمة المجموعات.
  23. تأكد من أن ملف Excel الذي يحتوي على كافة قوائم ذروة MS المصدرة مفتوح على الورقة المقابلة لتشغيل MS S. aureus الأول ثم انقر فوق الزر بحث من القائمة الرئيسية LIMSA.
    ملاحظة: سيتضمن ناتج البحث في قاعدة بيانات LIMSA قائمة بالسمات الطيفية الكتلية المتطابقة مع الدهون الموجودة في قاعدة البيانات الموجودة في الخطوات 8-12-8.13، فضلاً عن التركيزات لكل سمة متطابقة بعد التطبيع إلى واحد أو أكثر من السمات المختارة المعايير الداخلية.
  24. استخدام برنامج Xcalibur لفحص كتلة دقيقة MS / MS الأطياف لm / z المقابلة لأيونات الدهون ذات الأهمية من أجل تأكيد مكونات الأحماض الدهنية الموجودة في كل الأنواع الجزيئية الدهون المحددة. حدد رمز متصفح Qual. افتح ملف MS/MS ذو الفائدة عن طريق تحديد القائمة المنسدلة ملف وتحديد الخيار فتح...
  25. حدد مرشح المسح الضوئي المقابل لتحليل MS/MS للدهون m/z ذات الأهمية عن طريق النقر بالماوس الأيمن على رمز thumbtack في نافذة عرض الطيف الكتلي وحدد نطاقات من القائمة. في الإطار الجديد الذي يظهر، حدد القائمة تصفية لتحديد الفحص.
  26. متوسط الإشارة عبر مجموع اللوني أيون كما هو موضح في الخطوة 8.2. استخدم برنامج MetaboAnalyst (www.metaboanalyst.ca) لإجراء الاختبارات الإحصائية المناسبة. تقييم الفرق الكبير إحصائيا في تكوين الدهون S. aureus عن طريق مقارنة وفرة الدهون الطبيعية عبر الظروف غير المعالجة وLDL المعالجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويتضح بروتوكول إثراء LDL من صفار البيض الدجاج في الشكل 1. تبدأ هذه العملية بتخفيف صفار البيض الكامل مع المالحة وفصل المواد الصلبة صفار البيض المشار إليها كحبيبات منالكسر القابل للذوبان أو البلازما التي تحتوي على LDLs (الشكل 1)33. يتم إثراء محتوى LDL من جزء البلازما من خلال هطول الأمطار من ~ 30-40 kDa β-livetins (الشكل 2)33. وجود نطاقات البروتين في 140، 80، 65، 60 و 15 kDa ترتبط مع البروتينات من LDLs (الشكل2)33،39. العلاج مع التريكلوسان يمنع نمو S. aureus في وسائل الإعلام الخالية من الأحماض الدهنية32. لقد أثبتنا من قبل أن الثقافات المكملة مع البلازما صفار البيض أو LDLs الإنسان النقي كما مصادر الأحماض الدهنية الخارجية يتغلب على تثبيط النمو الناجم عن التريكلوسان (الشكل 3)32. وبالمثل، فإن مكملات الثقافات المعالجة بالتريكلوسان مع صفارالبيض المخصب LDL يعيد النمو (الشكل 3). وعلاوة على ذلك، إضافة LDLs صفار البيض دعم نمو S. aureus الأحماض الدهنية أوكسوتروف (الشكل 4)32. للحصول على التنميط الأكثر دقة الطيفية المستندة إلى S. aureus دمج الأحماض الدهنية الخارجية، من المهم للحد من وجود الأحماض الدهنية الحرة في وسط النمو. تم تحديد تكوين الأحماض الدهنية الحرة من مرق التربتون 1٪ وصفار البيض الدجاج LDLs المخففة في مرق التربتون عن طريقاستخدام تدفق حقن عالية الدقة / قياس الطيف الكتلي الدقيق ووجدت كميات ضئيلة من الأحماض الدهنية الحرة (الشكل 5). وقد أُجري نفس التحليل غير المستهدف لقياس الطيف الكتلي لتحديد تكوين الأحماض الدهنية للفوسفوليبيدات الفوسفية S. aureus بعد التعرض لـ LDLs لصفار البيض. من الدهون الفوسفاتية غشاء الأوريوس S. aureus أظهرت فصل فئة واضحة من الظروف غير المعالجة والدجاج صفار البيض LDL المعالجة، كما هو مبين في مؤامرة درجات OPLS-DA (الشكل6A). وأشارت مؤامرة تحميل OPLS-DA العديد من الأنواع فوسفاتيديلغليسيرول كمتغيرات هامة في نموذج الثابتة والمتنقلة-DA. وتجدر الإشارة إلى أن الدهون الفوسفاتية التي تحتوي على الأحماض الدهنية غير المشبعة، وهي علامة جزيئية لدمج الأحماض الدهنية الخارجية، يتم إثراؤها في الثقافات التكميلية LDL مقارنة بالخلايا الحاضنة في غياب LDLs (الشكل6B). وقد وجدت الدراسات السابقة أن صفار البيض الدجاج هي مصدر غني من الأحماض الدهنية غير المشبعة مع حمض الأوليك (18:1) كونها الأكثر وفرة41،42. وبالاتفاق مع هذه الملاحظات، وجدنا حمض الأوليك هو الأحماض الدهنية غير المشبعة الأكثر شيوعا ً المستخدمة في تركيب الدهون الفوسفاتية عندما تم استكمال ثقافات S. aureus بصفار البيض (الشكل6C). ويوضح الجدول 1 كذلك أن ملامح الأحماض الدهنية من الدهون الفوسفاتية الغشاء يتم تغييرها عندما يزرع S. aureus في وجود صفار البيض LDL.

Figure 1
الشكل 1: توضيح لإثراء LDL من صفار بيض الدجاج باستخدام الطرد المركزي وهطول أمطار كبريتات الأمونيا. (أ) الكواشف اللازمة لإثراء LDL من صفار البيض الدجاج. (ب) مخطط التدفق يصور الخطوات الهامة لعملية تخصيب LDL. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: ملف البروتين من صفار البيض الدجاج قبل وبعد الإثراء لLDL. تم إعداد lysates البروتين باستخدام العازلة RIPA. تم تحميل lysate البروتين (15 ميكروغرام) في هلام أكريلاميد SDS-PAGE 8٪. كانت ملطخة هلام بين عشية وضحاها مع الكاشف بروتين الراد بيو. يتم الإشارة إلى الأوزان الجزيئية في kDa من البروتينات المرتبطة LDL على طول الجانب الأيمن من الصورة. M: علامة البروتين، Y: صفار البيض الدجاج، وLDL: صفار البيض الدجاج إثراء LDL الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحمي الـ LDLs المشتقة من صفار البيض S. aureus من تثبيط FASII الناجم عن التريكلوسان. تم رصد نمو S. aureus مع مرور الوقت عن طريق قياس OD600 في 1٪ مرق التربتون في الظروف التالية: 1٪ مرق التربتون (السل)، 1 μM تريكلوسان (TCS)، 1 μM triclosan مع 1٪ بياض البيض البلازما (TCS + EYP)، 5٪ صفار البيض LDL (LDL)، أو 1 μM التريكلوسان مع 5٪ صفار البيض LDL (TCS + LDL). يظهر ال [منس] من ثلاثة تجارب مستقلّة. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري للمتوسط. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: نمو S. يتم دعم الأحماض الدهنية أوكوتروف من قبل صفار البيض المستمدة من LDL. تم رصد نمو الأوكسوتروف الأحماض الدهنية في 1٪ مرق التربتون (السل) مع أو بدون 5٪ صفار البيض LDL (LDL) مكملات مع مرور الوقت عن طريق قياس OD600. يظهر ال [منس] من ثلاثة تجارب مستقلّة. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري للمتوسط. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: محتوى الأحماض الدهنية الحرة تقاس في 1٪ مرق التربتون أو صفار البيض الدجاج LDL. تم الكشف عن الأحماض الدهنية الحرة عن طريق حقن تدفق عالية الدقة / قياس الطيف الكتلي الدقيق والقياس الطيفي الكتلي جنبا إلى جنب. تم تحديد الأعداد الطبيعية من الأيونات لكل ملغ من البروتين لمرق التربتون بنسبة 1٪ ومرق التربتون بنسبة 1٪ مع 5٪ من صفار البيض الدجاج LDLs. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: البروتينات الدهنية منخفضة الكثافة صفار البيض الدجاج هي خزان من الأحماض الدهنية الخارجية لتركيب S. aureus فوسفاتيديلغليسيرول. (أ) عشرات مؤامرة من متعامد الجزئي أقل المربعات تحليل تمييزي من صفار البيض الدجاج LDL المعالجة وغير المعالجة S. الأوريوس غشاء فوسفوليبيدات التي تم تحديدها باستخدام دقة عالية / قياس الطيف الكتلي الدقيق. (ب) النسبة المئوية من الفوسفاتيديلغليسرول غير المشبعة (UPG) مقارنة مع مجموع غشاء PG من S. aureus نمت في غياب (WT) أو وجود (WT + LDL) من صفار البيض الدجاج LDLs. (C) الأحماض الدهنية غير المشبعة (UFA) الشخصي للغشاء PG من S. aureus نمت دون (WT) أو مع (WT + LDL) صفار البيض الدجاج LDLs رسمها كنسبة مئوية من كمية الأحماض الدهنية PG الإجمالية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

WT مثقف في مرق التربتون WT مثقف في مرق التربتون تكملها LDLs
فوسفاتيديل غليسيرول (TC:TDB)أ وفرة أيون طبيعية / ملغ من البروتين Sd الأحماض الدهنيةج وفرة أيون طبيعية / ملغ من البروتين Sd الأحماض الدهنيةج
24:0 صفر صفر NDb 0.052031116 0.02677 Nd
26:0 صفر صفر Nd 0.009539117 0.00362 Nd
28:0 0.127937113 0.04528 15:0_13:0 0.167643281 0.02392 15:0_13:0
28:1 0.006665427 0.00157 Nd 0.002776821 0.00372 15:0_13:1
19:00 8.680180809 2.68375 15:0_15:0 14.04873592 2.4531 15:0_15:0
30:1 صفر صفر Nd 0.010152161 0.00449 15:1_15:0, 13:1_17:0
رقم 31:0 4.150511117 1.31658 16:0_15:0, 14:0_17:0 10.17590926 1.88431 16:0_15:0, 14:0_17:0, 18:0_13:0
31:1 0.016156004 0.01216 13:1_15:0, 12:1_19:0 0.473478683 0.09063 13:1_15:0, 18:1_13:0, 12:1_19:0
عدد الزيارات 12:0 29.29259262 8.82993 15:0_17:0 48.24342037 8.95664 15:0_17:0, 16:0_16:0
32:1 0.02074815 0.00941 Nd 0.307044942 0.07305 18:1_14:0, 16:1_16:0
33:0 9.000460122 2.78194 18:0_15:0, 16:0_17:0 1,4531776 , 100.000 2.98171 18:0_15:0, 16:0_17:0
33:1 0.162934812 0.04796 Nd 2.921832928 0.30851 18:1_15:0
33:2 صفر صفر Nd 0.167492702 0.03211 18:1_15:1, 18:2_15:0
34:0 12.3064043 3.70242 19:0_15:0, 17:0_17:0 18.40129157 3.21385 19:0_15:0, 17:0_17:0
34:1 صفر صفر Nd 1.423605186 0.20066 18:1_16:0
34:2 0.000470922 0.00082 Nd 0.156133734 0.03929 18:2_16:0
35:0 5.727462455 1.74583 20:0_15:0, 18:0_17:0 7.771538992 1.28515 20:0_15:0, 16:0_19:0, 18:0_17:0
35:1 0.17337586 0.05727 20:1_15:0 0.772202525 0.08526 20:1_15:0, 18:1_17:0
35:2 صفر صفر Nd 0.038758757 0.01481 18:2_17:0, 18:1_17:1
36:0 0.671004303 0.2116 21:0_15:0, 19:0_17:0 0.967295024 0.2572 21:0_15:0, 20:0_16:0, 19:0_17:0, 22:0_14:0
36:2 صفر صفر Nd 0.495485065 0.04473 18:1_18:1, 18:2_18:0
36:3 صفر صفر Nd 0.059268233 0.02291 18:2_18:1, 20:3_16:0, 20:2_16:1
37:0 0.060466411 0.01961 22:0_15:0, 20:0_17:0 0.114526894 0.01852 22:0_15:0, 20:0_17:0, 18:0_19:0
38:2 صفر صفر Nd 0.079469521 0.02872 18:2_20:0, 16:1_20:1
(أ) تم الكشف عنها على أنها [M-H]- الأيونات. TC، إجمالي طول السلسلة؛ TDB، العدد الإجمالي للسندات المزدوجة.
(ب) ND، لم يتم تحديدها
(ج) يتم سرد الأحماض الدهنية في ترتيب وفرة أيزومر. يشير التأكيد بين تعيينات الأحماض الدهنية إلى أن كل حمض دهني قد يكون موجوداً إما في وضع SN1 أو SN2، حيث أن قياس الطيف الكتلي جنباً إلى جنب وحده لا يمكن أن يستبعد إمكانية وجود أنواع الدهون كخليط من أيزومرات الموضعية.

الجدول 1: ملف الأحماض الدهنية من S. aureus المستزرعة في وجود LDLs صفار البيض الدجاج. استخدمنا تحليل الدهون غير متحيزة باستخدام عالية الدقة / دقيقة MS و MS / MS لتحديد ملف الأحماض الدهنية من S. aureus PG. S. تم احتضان aureus في وجود أو عدم وجود LDLs صفار البيض الدجاج، وملف PG من هذه تمت مقارنة الخلايا مع الخلايا المستزرعة في مرق التربتون 1٪.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

S. aureus يدمج الأحماض الدهنية الخارجية في الدهون الفوسفاتية غشاء27،32،43. تركيب فوسفوليبيد باستخدام الأحماض الدهنية الخارجية يتجاوز تثبيط FASII ولكن أيضا يغير الخصائص البيوفيزيائية للغشاء27،32،44. في حين أن دمج الأحماض الدهنية الخارجية في الدهون الفوسفاتية من مسببات الأمراض إيجابية الجرام موثقة بشكل جيد، لا تزال هناك ثغرات في هوية خزانات الأحماض الدهنية المضيفة والتعديلات الهيكلية لكل من أنواع المكورات العنقودية الرئيسية الثلاثة التي تنتج عن دمج الأحماض الدهنية الخارجية. هنا، ونحن نصف البروتوكولات التي يمكن استخدامها ل: '1' إثراء جزيئات LDL من صفار البيض الدجاج، مصدر من الأحماض الدهنية، 2) تحديد آثار الأحماض الدهنية الخارجية على نمو S. aureus، و 3) استخدام تحليل الدهون غير متحيزة ل رصد دمج الأحماض الدهنية الخارجية في الدهون الفوسفاتية غشاء S. aureus. طريقة قياس الطيف الكتلي المتقدمة المنصوص عليها في هذه الدراسة تقدم منظورا غير عادي لتكوين غشاء S. aureus نمت في وجود الأحماض الدهنية الخارجية.

العديد من مسببات الأمراض إيجابية الجرام استخدام الأحماض الدهنية الخارجية لتخليق الغشاء، وكما هو الحال مع S. aureus، والمصادر المحتملة للأحماض الدهنية الخارجية أثناء العدوى غير مفهومة جيدا27،43. تحليل النمو الموصوف هنا يمكن تعديلها لتقييم انتشار مسببات الأمراض الإيجابية الجرام الأخرى في وجود البروتينات الدهنية إذا تم النظر في حركية النمو من كل ممرض. بالإضافة إلى ذلك، يمكن اختبار مصادر المضيف المعقدة الأخرى من الأحماض الدهنية الخارجية باستخدام هذا البروتوكول إذا تم التحكم في الآثار المحتملة لمصدر الأحماض الدهنية على الكثافة البصرية الخلفية. وعلاوة على ذلك، فإن طريقة قياس الطيف الكتلي الموصوفة لتحليل الدهون البكتيرية مرنة بما فيه الكفاية لتمكين تقييم الدهون من أي نوع بكتيري تقريبا. كما يتم جمع البيانات الشاملة الدهون دقيقة في وضع "المسح الكامل" MS، مطلوب القليل من المعرفة المسبقة من محتوى الدهون من الأنواع البكتيرية ذات الأهمية، على عكس الأساليب التحليلية المستهدفة على أساس أنماط التجزئة المعروفة من الدهون محددة 32 , 45 , 46.في سير العمل التحليلي "غير المستهدف" الذي نصفه، تحليل البيانات النهائية، ولا سيما البحث عن قوائم دقيقة للذروة الجماعية مقابل قاعدة بيانات الدهون، هي خطوات رئيسية قابلة للتكيف للغاية وقد تدعم مجموعة واسعة من البكتيرية الأنواع والعلاجات التجريبية. عند بناء أو اختيار قاعدة بيانات قابلة للبحث للتمكين من تحديد أنواع الدهون، يجب على الباحثين النظر في مجموعة واسعة من أنواع الدهون الذاتية الافتراضية، مع السماح أيضا للكشف عن الدهون الخارجية الجديدة أو غير المتوقعة المشتقة من العلاج التجريبي.

في هذه الدراسة، تم استخدام مطيافكتلة عالية الدقة / دقيقة (جدول المواد) بسبب الدقة العالية جدا / قدرات الكتلة دقيقة. وبدلاً من ذلك، يمكن تنفيذ العديد من المنصات الأخرى العالية الاستبانة/الدقيقة لقياس الطيف الكتلي بنجاح لإجراء تحليل غير مستهدف للدهون. وبالمثل، يمكن استخدام مجموعة واسعة من أساليب إدخال العينات بما في ذلك التسريب المباشر، أو تأين الرذاذ الكهربائي، أو تأين الليزر بمساعدة المصفوفة، التي تمكن من التحليل المباشر لمستخلصات الدهون، لجمع بسرعة بيانات الدهون غير المستهدفة. وقد يسمح إدراج الكروماتوغرافيا السائلة قبل إدخال العينات، عند استخدامها بالاقتران مع قياس الطيف الكتلي العالي الاستبانة/الدقيقة، بحل بعض أنواع الدهون المتساويية خلال جمع بيانات التصلب المتعدد المسح الكامل. ومع ذلك، فإن إدراج اللونية يتطلب ضمان أن تكون الطريقة اللونية المفضلة متعددة الاستخدامات بما يكفي للتمكين من فصل وكشف أنواع الدهون غير المتوقعة أو الجديدة التي قد تكون موجودة بعد العلاجات التجريبية. ويمكن إجراء البحث في قاعدة البيانات لتحديد الدهون الموجودة في مجموعة البيانات باستخدام أي قاعدة بيانات متاحة للجمهور يمكن البحث فيها. في حين أن برنامج LIMSA يتيح تطوير سهل لقواعد البيانات المحددة من قبل المستخدم لعشرات الآلاف من أنواع الدهون الافتراضية، توجد خيارات أخرى عديدة لتحديد الدهون من قوائم ذروة MS عالية الدقة/دقيقة. يوفر اتحاد خرائط LIPID (www.lipidmaps.org) أدوات للبحث في قواعد البيانات الحسابية والتجريبية للدهون الافتراضية باستخدام قوائم الذروة عالية الدقة/الدقيقة التي تم إنشاؤها بواسطة MS ضمن تفاوت جماعي محدد من قبل المستخدم، والعديد من البرامج البائعين تقديم الحلول الخاصة بهم لتحليل البيانات lipidomics.

منحنى النمو الناجح وتحليل الأحماض الدهنية الخارجية يعتمد على عدة عوامل بما في ذلك نقاء LDL والحد من مستويات الأحماض الدهنية الخلفية. ومن الأهمية بمكان تحديد الكسر الذي يحتوي على LDL بشكل صحيح. ويوضح البروتوكول المذكور أعلاه والشكل 1 الكسر الصحيح الذي ينبغي الاحتفاظ به لكل خطوة من خطوات عملية التخصيب. لقد نجحنا في استخدام كبريتات الأمونيوم بنسبة 40٪ (نقاء ≥ 99.5٪) لهطول الأمطار وإزالة لاحقة من β-livetins. ومع ذلك، ذكرت دول أخرى أن نقاء وتركيز كبريتات الأمونيا المضافة إلى بلازما صفار البيض يمكن أن تؤثر بشكل كبير على هذه الخطوة47. الحد من تلوث كبريتات الأمونيوم في إثراء LDL مهم لإعداد LDL لاستخدامها في الاختبارات البكتيرية، كما تركيزات عالية من كبريتات الأمونيوم يمكن أن تحد من النمو48. خلال غسيل الكلى، يجب توفير مساحة حرة واسعة في أنابيب غسيل الكلى للسماح بنشر وإزالة كبريتات الأمونيوم. قد يشمل المزيد من التحسين في عملية غسيل الكلى تغييرات إضافية في المياه أثناء الحضانة الليلية. لقد وجدنا غسيل الكلى بين عشية وضحاها لتقديم أفضل النتائج، على الرغم من أن موسى وآخرون تقرير غسيل الكلى من 6 ح كافية. ومن الأهمية بمكان أن يتم الاحتفاظ بالتركيز الأولي للخلايا في منحنيات النمو متسقة بين التجارب. بالنسبة لـ S. aureus، فإن تمييع الخلايا إلىOD الأولي 600 من 0.05 قد وفر النتائج الأكثر اتساقا. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تؤدي تركيزات عالية من مثبطات FASII في آثار غير محددة على الخلايا البكتيرية. على سبيل المثال، تركيزات التريكلوسان فوق 7 μM التسبب في تلف الغشاء السيتوبلازمي في S. aureus، وبالتالي فمن الضروري أن تركيز هذا المركب لا تزال أقل من هذا المستوى49. لقد وجدنا تركيز التريكلوسان النهائي من 1 نتائج ميكرومتر في تجارب النمو القابلة للاستنساخ. عند تقييم مصدر محتمل للأحماض الدهنية الخارجية لتخليق الدهون الفوسفاتية البكتيرية، من المهم تقليل مساهمة الأحماض الدهنية في وسط الثقافة. في الاختبارات المذكورة أعلاه، والمتوسط الثقافي من 1٪ تريبتون يدعم النمو الكافي من S. aureus ويحتوي على الحد الأدنى من التلوث بالأحماض الدهنية29،32.

الحد من مستويات الأحماض الدهنية الخلفية مهم بشكل خاص لتوصيف الأحماض الدهنية القائمة على الطيف الكتلي في المصب. وقد أبلغ آخرون عن كمية الأحماض الدهنية الحرة في صفار البيض الدجاجهو بطبيعة الحال منخفضة41 وتحليلنا يدعم هذا الاستنتاج (الشكل 5). استخدام مرق التربتون وغسل الخلايا جيدا مع PBS بعد الحضانة ضرورية. بالإضافة إلى ذلك، من المهم النظر في مرحلة نمو الخلايا. اخترنا خلايا المرحلة المتوسطة لضمان تخليق فوسفوليبيد اتفير جرثومي وافر. ويمكن إدخال مصادر ملوثة محتملة أخرى للأحماض الدهنية الخارجية بعد النمو البكتيري، مثل أثناء خطوات استخراج الدهون أو إعداد العينات اللاحقة قبل تحليل قياس الطيف الكتلي50. يمكن الكشف عن الأحماض الدهنية الخارجية التي أدخلت في أي خطوة من إعداد العينة كأحماض دهنية مجانية أثناء تحليل قياس الطيف الكتلي. الأواني الزجاجية مختبر الخبز في فرن درجة حرارة عالية (على الأقل 180 درجة مئوية) بين عشية وضحاها يمكن إزالة الأحماض الدهنية الخارجية من أنابيب الاختبار المستخدمة لاستخراج الدهون وتخزين الدهون. بالإضافة إلى ذلك، يمكن شطف اللوازم المختبرية بما في ذلك البلاستيك مع الميثانول للحد من خلفية الأحماض الدهنية50. كما أن الأحماض الدهنية المتبقية من التحليلات السابقة قد تلوث الأسطح الداخلية لمطياف الكتلة نفسه. ولذلك ينصح بشدة إدراج الفراغات التحليلية أثناء تحليل قياس الطيف الكتلي لتحديد مستويات الخلفية من الأحماض الدهنية الحرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ أي كشف.

Acknowledgments

نشكر أعضاء مختبر هامر على تقييمهم النقدي للمخطوطة ودعمهم لهذا العمل. الدكتور أليكس هورسويل من كلية الطب بجامعة كولورادو يرجى تقديم AH1263. قدم الدكتور كريس ووترز مختبر في جامعة ولاية ميشيغان الكواشف. وقد تم دعم هذا العمل من قبل جمعية القلب الأمريكية منحة 16SDG30170026 والأموال الناشئة التي تقدمها جامعة ولاية ميشيغان.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium sulfate Fisher BP212R-1 ≥99.5% pure
Cell culture incubator Thermo MaxQ 6000
Centrafuge Thermo 75-217-420 Sorvall Legen XTR, rotor F14-6x250 LE
Costar assay plate Corning 3788 96 well
Filter paper Schleicher & Schuell 597
Large chicken egg N/A N/A Common store bought egg
Microplate spectrophotometer BioTek Epoch 2
NaCl Sigma S9625
S. aureus strain AH1263 N/A N/A Provided by Alex Horswill of the University of Colorado
Dialysis tubing Pierce 68700 7,000 MWCO
Tryptone Becton, Dickison and Company 211705
0.5 mm zirconium oxide beads Next Advance ZROB05
Bullet Blender Next Advance BBX24B
Methanol (LC-MS grade) Fisher A4561
Chloroform (reagent grade) Fisher MCX10559
Isopropanol (LC-MS grade) Fisher A4611
Dimyristoyl phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 850345C-25mg
Ammonium bicarbonate Sigma 9830 ≥99.5% pure
Ammonium formate Sigma 70221-25G-F
Xcalibur software Thermo Scientific OPTON-30801
LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer Thermo Scientific high resolution/accurate mass MS
Agilent 1260 capillary HPLC Agilent
SpeedVac Vacuum Concentrators Thermo Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Noskin, G. A., et al. National trends in Staphylococcus aureus infection rates: impact on economic burden and mortality over a 6-year period (1998-2003). Clinical Infectious Diseases. 45 (9), 1132-1140 (2007).
  2. Noskin, G. A., et al. The burden of Staphylococcus aureus infections on hospitals in the United States: an analysis of the 2000 and 2001 Nationwide Inpatient Sample Database. Archives of Internal Medicine. 165 (15), 1756-1761 (2005).
  3. Laible, B. R. Antimicrobial resistance: CDC releases report prioritizing current threats. South Dakota medicine. 67 (1), 30-31 (2014).
  4. Zhang, Y. M., Rock, C. O. Membrane lipid homeostasis in bacteria. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 222-233 (2008).
  5. Zhang, Y. M., White, S. W., Rock, C. O. Inhibiting bacterial fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 281 (26), 17541-17544 (2006).
  6. Sohlenkamp, C., Geiger, O. Bacterial membrane lipids: diversity in structures and pathways. FEMS Microbiology Reviews. 40 (1), 133-159 (2016).
  7. Schiebel, J., et al. Staphylococcus aureus FabI: inhibition, substrate recognition, and potential implications for in vivo essentiality. Structure. 20 (5), 802-813 (2012).
  8. Heath, R. J., Li, J., Roland, G. E., Rock, C. O. Inhibition of the Staphylococcus aureus NADPH-dependent enoyl-acyl carrier protein reductase by triclosan and hexachlorophene. Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4654-4659 (2000).
  9. Heath, R. J., Yu, Y. T., Shapiro, M. A., Olson, E., Rock, C. O. Broad spectrum antimicrobial biocides target the FabI component of fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30316-30320 (1998).
  10. Park, H. S., et al. Antistaphylococcal activities of CG400549, a new bacterial enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI) inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (3), 568-574 (2007).
  11. Schiebel, J., et al. Rational design of broad spectrum antibacterial activity based on a clinically relevant enoyl-acyl carrier protein (ACP) reductase inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 289 (23), 15987-16005 (2014).
  12. Yum, J. H., et al. In vitro activities of CG400549, a novel FabI inhibitor, against recently isolated clinical staphylococcal strains in Korea. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (7), 2591-2593 (2007).
  13. Kaplan, N., et al. Mode of action, in vitro activity, and in vivo efficacy of AFN-1252, a selective antistaphylococcal FabI inhibitor. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (11), 5865-5874 (2012).
  14. Karlowsky, J. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Hoban, D. J., Zhanel, G. G. AFN-1252, a FabI inhibitor, demonstrates a Staphylococcus-specific spectrum of activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (8), 3544-3548 (2009).
  15. Ross, J. E., Flamm, R. K., Jones, R. N. Initial broth microdilution quality control guidelines for Debio 1452, a FabI inhibitor antimicrobial agent. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (11), 7151-7152 (2015).
  16. Hunt, T., Kaplan, N., Hafkin, B. Safety, tolerability and pharmacokinetics of multiple oral doses of AFN-1252 administered as immediate release (IR) tablets in healthy subjects. Journal of Chemotherapy. 28 (3), 164-171 (2016).
  17. Hafkin, B., Kaplan, N., Hunt, T. L. Safety, tolerability and pharmacokinetics of AFN-1252 administered as immediate release tablets in healthy subjects. Future Microbiology. 10 (11), 1805-1813 (2015).
  18. Flamm, R. K., Rhomberg, P. R., Kaplan, N., Jones, R. N., Farrell, D. J. Activity of Debio1452, a FabI inhibitor with potent activity against Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococcus spp., including multidrug-resistant strains. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (5), 2583-2587 (2015).
  19. Yao, J., Maxwell, J. B., Rock, C. O. Resistance to AFN-1252 arises from missense mutations in Staphylococcus aureus enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI). Journal of Biological Chemistry. 288 (51), 36261-36271 (2013).
  20. Tsuji, B. T., Harigaya, Y., Lesse, A. J., Forrest, A., Ngo, D. Activity of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, against Staphylococcus aureus in an in vitro pharmacodynamic model simulating human pharmacokinetics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 32-35 (2013).
  21. Parsons, J. B., et al. Perturbation of Staphylococcus aureus gene expression by the enoyl-acyl carrier protein reductase inhibitor AFN-1252. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (5), 2182-2190 (2013).
  22. Kaplan, N., et al. In vitro activity (MICs and rate of kill) of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, in the presence of serum and in combination with other antibiotics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 18-25 (2013).
  23. Kaplan, N., Garner, C., Hafkin, B. AFN-1252 in vitro absorption studies and pharmacokinetics following microdosing in healthy subjects. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (3-4), 440-446 (2013).
  24. Banevicius, M. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Nicolau, D. P. Pharmacokinetics, pharmacodynamics and efficacy of novel FabI inhibitor AFN-1252 against MSSA and MRSA in the murine thigh infection model. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 26-31 (2013).
  25. Karlowsky, J. A., et al. In vitro activity of API-1252, a novel FabI inhibitor, against clinical isolates of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (4), 1580-1581 (2007).
  26. Yao, J., et al. A Pathogen-Selective Antibiotic Minimizes Disturbance to the Microbiome. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (7), 4264-4273 (2016).
  27. Brinster, S., et al. Type II fatty acid synthesis is not a suitable antibiotic target for Gram-positive pathogens. Nature. 458 (7234), 83-86 (2009).
  28. Balemans, W., et al. Essentiality of FASII pathway for Staphylococcus aureus. Nature. 463 (7279), E3-E4 (2010).
  29. Parsons, J. B., Frank, M. W., Subramanian, C., Saenkham, P., Rock, C. O. Metabolic basis for the differential susceptibility of Gram-positive pathogens to fatty acid synthesis inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15378-15383 (2011).
  30. Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), e0116195 (2015).
  31. Feingold, K. R., Grunfeld, C. Introduction to Lipids and Lipoproteins. Endotext. , (2000).
  32. Delekta, P. C., Shook, J. C., Lydic, T. A., Mulks, M. H., Hammer, N. D. Staphylococcus aureus utilizes host-derived lipoprotein particles as sources of exogenous fatty acids. Journal of Bacteriology. 200 (11), (2018).
  33. Moussa, M., Marinet, V., Trimeche, A., Tainturier, D., Anton, M. Low density lipoproteins extracted from hen egg yolk by an easy method: cryoprotective effect on frozen-thawed bull semen. Theriogenology. 57 (6), 1695-1706 (2002).
  34. Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. Bligh and Dyer and Folch Methods for Solid-Liquid-Liquid Extraction of Lipids from Microorganisms. Comprehension of Solvatation Mechanisms and towards Substitution with Alternative Solvents. International journal of molecular sciences. 18 (4), (2017).
  35. Lydic, T. A., Busik, J. V., Reid, G. E. A monophasic extraction strategy for the simultaneous lipidome analysis of polar and nonpolar retina lipids. Journal of Lipid Research. 55 (8), 1797-1809 (2014).
  36. Bowden, J. A., Bangma, J. T., Kucklick, J. R. Development of an automated multi-injection shotgun lipidomics approach using a triple quadrupole mass spectrometer. Lipids. 49 (6), 609-619 (2014).
  37. Haimi, P., Uphoff, A., Hermansson, M., Somerharju, P. Software tools for analysis of mass spectrometric lipidome data. Analytical Chemistry. 78 (24), 8324-8331 (2006).
  38. Hewelt-Belka, W., et al. Comprehensive methodology for Staphylococcus aureus lipidomics by liquid chromatography and quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1362, 62-74 (2014).
  39. Jolivet, P., Boulard, C., Beaumal, V., Chardot, T., Anton, M. Protein components of low-density lipoproteins purified from hen egg yolk. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (12), 4424-4429 (2006).
  40. Bylesjö, M., et al. OPLS discriminant analysis: combining the strengths of PLS-DA and SIMCA classification. Journal of Chemometrics. 20 (8-10), 341-351 (2006).
  41. Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Progress in Lipid Research. 29 (2), 107-140 (1990).
  42. Cherian, G., Holsonbake, T. B., Goeger, M. P. Fatty acid composition and egg components of specialty eggs. Poultry Science. 81 (1), 30-33 (2002).
  43. Parsons, J. B., Frank, M. W., Rosch, J. W., Rock, C. O. Staphylococcus aureus Fatty Acid Auxotrophs Do Not Proliferate in Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (11), 5729-5732 (2013).
  44. Sen, S., et al. Growth-Environment Dependent Modulation of Staphylococcus aureus Branched-Chain to Straight-Chain Fatty Acid Ratio and Incorporation of Unsaturated Fatty Acids. PLoS One. 11 (10), e0165300 (2016).
  45. Wang, M., Huang, Y., Han, X. Accurate mass searching of individual lipid species candidates from high-resolution mass spectra for shotgun lipidomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 28 (20), 2201-2210 (2014).
  46. Peti, A. P. F., Locachevic, G. A., Prado, M. K. B., de Moraes, L. A. B., Faccioli, L. H. High-resolution multiple reaction monitoring method for quantification of steroidal hormones in plasma. Journal of Mass Spectrometry. 53 (5), 423-431 (2018).
  47. Neves, M. M., Heneine, L. G. D., Henry, M. Cryoprotection effectiveness of low concentrations of natural and lyophilized LDL (low density lipoproteins) on canine spermatozoa. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaria e Zootecnia. 66 (3), 769-777 (2014).
  48. Liu, P. V., Hsieh, H. C. Inhibition of Protease Production of Various Bacteria by Ammonium Salts - Its Effect on Toxin Production and Virulence. Journal of Bacteriology. 99 (2), 406 (1969).
  49. Suller, M. T., Russell, A. D. Triclosan and antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 46 (1), 11-18 (2000).
  50. Yao, C. H., Liu, G. Y., Yang, K., Gross, R. W., Patti, G. J. Inaccurate quantitation of palmitate in metabolomics and isotope tracer studies due to plastics. Metabolomics. 12, (2016).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 147، المكوراتالعنقودية أوريوس، الأحماض الدهنية، البروتين الدهني، قياس الطيف الكتلي، فوسفوليبيد، صفار البيض، الدهون
عزل جزيئات البروتين الدهني من صفار بيض الدجاج لدراسة دمج الأحماض الدهنية المسببة للأمراض البكتيرية في الدهون الفوسفاتية الغشاء
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Delekta, P. C., Lydic, T. A.,… More

Delekta, P. C., Lydic, T. A., Hammer, N. D. Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids. J. Vis. Exp. (147), e59538, doi:10.3791/59538 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter