Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Isolering af lipoprotein partikler fra hønseæg æggeblomme til undersøgelse af bakteriel Patogenchlorid fedtsyre inkorporering i membran Fosfolipids

Published: May 15, 2019 doi: 10.3791/59538
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University, 2Department of Physiology, Michigan State University

Summary

Denne metode giver en ramme for at studere inkorporering af eksogene fedtsyrer fra komplekse vært kilder i bakterielle membraner, især Staphylococcus aureus. For at opnå dette, protokoller for tilsætning af lipoprotein partikler fra hønseæg æggeblomme og efterfølgende fedtsyre profilering af bakterielle fosfolipider udnytter massespektrometri er beskrevet.

Abstract

Staphylococcus aureus og andre gram positive patogener inkorporerer fedtsyrer fra omgivelserne i membran Fosfolipiderne. Under infektion, de fleste af eksogene fedtsyrer er til stede i Host lipoprotein partikler. Der er fortsat usikkerhed med hensyn til reservoirer af værts fedtsyrer og de mekanismer, hvormed bakterier ekstrahere fedtsyrer fra lipoprotein partiklerne. I dette arbejde beskriver vi protokoller for berigelse af low-density lipoprotein (LDL) partikler fra hønseæg æggeblomme og afgøre, om LDLs fungere som fedtsyre reservoirer for S. aureus. Denne metode udnytter upartisk lipidomic analyse og kylling LDLs, en effektiv og økonomisk model for udforskning af interaktioner mellem LDLs og bakterier. Analysen af S. aureus integration af eksogene fedtsyrer fra LDLs udføres ved hjælp af høj opløsning/nøjagtig massespektrometri og tandem massespektrometri, der muliggør karakterisering af fedtsyre sammensætningen af bakterien membran og objektiv identifikation af nye kombinationer af fedtsyrer, som opstår i bakterielle membran lipider ved udsættelse for LDLs. Disse avancerede massespektrometri teknikker tilbyder en uovertruffen perspektiv af fedtsyre inkorporering ved at afsløre de specifikke eksogene fedtsyrer indarbejdet i Fosfolipiderne. De metoder, der er skitseret her, er tilpasningsdygtige til studiet af andre bakterielle patogener og alternative kilder til komplekse fedtsyrer.

Introduction

Methicillin-resistent S. aureus (MRSA) er den førende årsag til sundhedsrelateret infektion, og den associerede antibiotikaresistens er en betydelig klinisk udfordring1,2,3. Derfor er udviklingen af nye terapeutiske strategier en høj prioritet. En lovende behandlingsstrategi for gram-positive patogener hæmmer fedtsyre syntesen, et krav til membran fosfolipid produktion, der i S. aureus, omfatter phosphatidylglycerol (PG), lysyl-PG, og cardiolipin4. I bakterier, fedtsyre produktion sker via fedtsyre syntese II pathway (fasii)5, som er betydeligt forskellig fra eukaryote modstykke, gør fasii et attraktivt mål for antibiotika udvikling5,6 . FASII-hæmmere primært Target FabI, et enzym, der kræves for fedtsyre kulstofkæde forlængelse7. Fabi-hæmmeren triclosan anvendes i vid udstrækning i forbruger-og medicinalvarer8,9. Yderligere Fabi-hæmmere er ved at blive udviklet af flere farmaceutiske virksomheder til behandling af S. aureus infektion10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26. Men, mange gram-positive patogener, herunder S. aureus, er i stand til at scavenging eksogene fedtsyrer for phospholipid syntese, omgåelse fasii hæmning27,28,29. Således diskuteres det kliniske potentiale af fasii-hæmmere på grund af betydelige huller i vores viden om kilderne til vært fedtsyrer og de mekanismer, hvormed patogener ekstrakt fedtsyrer fra værten27,28. For at afhjælpe disse mangler, vi udviklet en objektiv lipidomisk analysemetode til at overvåge inkorporering af eksogene fedtsyrer fra lipoprotein partikler i membran fosfolipider af S. aureus.

Under sepsis, vært lipoprotein partikler repræsenterer en potentiel kilde til Host-afledte fedtsyrer i Vaskulaturen, som et flertal af vært fedtsyrer er forbundet med partiklerne30. Lipoproteiner består af en hydrofile Shell sammensat af phospholipider og proteiner, som vedlægger en hydrofobe kerne af triglycerider og kolesterol estere31. Fire store klasser af lipoproteiner--chylomicron, meget lav densitet lipoprotein, high-density lipoprotein, og low-density lipoprotein (LDL)-er produceret af værten og fungere som lipid transport køretøjer, leverer fedtsyrer og kolesterol til og fra Host celler via vasculature. LDLs er rigelige i esterificeret fedtsyre, herunder triglycerider og kolesterol estere31. Vi har tidligere påvist, at højt renset humane LDLs er en levedygtig kilde til eksogene fedtsyrer til PG syntese, hvilket giver en mekanisme for FASII-hæmmer bypass32. Rensning af humane ldl'er kan være teknisk udfordrende og tidskrævende, mens kommercielle kilder til rensede humane ldl'er er uoverkommeligt dyre at bruge rutinemæssigt eller til at udføre store bakterie skærme. For at løse disse begrænsninger, har vi ændret en procedure for berigelse af LDLs fra kylling æggeblomme, en rig kilde til lipoprotein partikler33. Vi har med succes brugt umålrettet, høj opløsning/nøjagtig massespektrometri og tandem massespektrometri til at overvåge inkorporering af humane LDL-afledte fedtsyrer i membranen af S. aureus32. I modsætning til tidligere rapporterede metoder, denne fremgangsmåde kan kvantificere individuelle fedtsyrer isomerer for hver af de tre store stafylokok phospholipid typer. Oliesyre (18:1) er en umættet fedtsyre til stede i alle Host lipoprotein partikler, der let inkorporeres i S. aureus fosfolipids29,30,32. S. aureus er ikke i stand til oliesyre syntese29; Derfor fastsætter mængden af phospholipid-indarbejdet oliesyre tilstedeværelsen af vært lipoprotein-afledte fedtsyrer i stafylokoken membran29. Disse phospholipid arter kan identificeres ved den state-of-the-art massespektrometri metode, der er beskrevet her, tilbyder hidtil uset opløsning af membranens sammensætning af S. aureus dyrket i nærværelse af en fedtsyre kilde det sandsynligt møder under infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: følgende protokol for tilsætning af LDL-partikler fra kyllingægge blomme er afledt af Moussa et al. 200233.

1. fremstilling af hønseæg æggeblomme til berigelse af LDL-partikler

  1. Sanitize to store hønseæg ved at vaske skaller med 70% ethanol opløsning og lad lufttørre.
  2. Sanitize ægge separatoren ved hjælp af 70% ethanol opløsning og lad lufttørre. Fastgør ægseparatoren på læben på et mellemstort bægerglas.
  3. Knæk hvert æg enkeltvis i ægseparatoren og lad albumen flyde ind i bægerglasset. Den intakte æggeblomme vil blive bevaret af separatoren.
  4. Æggeblomme vaskes to gange med 30 mL steril fosfat-bufferet saltvand (PBS) for at fjerne rester af albumen.
  5. Placer forsigtigt æggeblomme på filtrerpapir.
  6. Punktere vitellinmembranen med en steril pipettespids og dræne membranens indhold i et sterilt 50 mL konisk centrifugeglas. Kassér membranen og filtrerpapiret.

2. fraktionering af LDL-holdige plasma fra hønseæg æggeblomme

  1. Tilsæt ca. to bind på 0,17 M NaCl ved pH 7,0 til æggeblomme og bland kraftigt. Bland derefter denne opløsning ved 4 °C i 60 min.
  2. Der centrifugeres æggeblomme fortynding ved 10 °C ved 10.000 x g i 45 min. Fjern plasma fraktionen (supernatanten) fra den granulerede fraktion (pellet) til et sterilt 50 ml konisk rør.
  3. Gentag trin 2,2.

3. isolering af LDL-partikler fra plasma

  1. Bland plasma fraktionen med 40% ammoniumsulfat (w/v) ved 4 °C i 60 min.
  2. Juster pH-værdien af plasma fraktionen med en 420 mM NaOH-opløsning til 8,7.
  3. Der centrifugeres æggeblomme fortynding ved 4 °C ved 10.000 x g i en periode på 45 min. Fjern den øvre halvfaste gule fraktion til 7 kDa porestørrelse dialyse slange. Give plads i slangen til at give mulighed for at svulme.
  4. Dialyze natten over ved 4 °c i 3 liter ultrarent vand for at fjerne ammoniumsulfat. Forsigtigt omrystes vandet ved hjælp af en Stir bar.
  5. Overføres dialyseret opløsning til et sterilt 50 mL konisk centrifugeglas.
  6. Opløsningen centrifugeres ved 4 °C ved 10.000 x g i en periode på 45 min. Fjern forsigtigt den øvre halvfaste gule fraktion til et sterilt rør, og opbevar den ved 4 °c.

4. vurdering af kyllinge LDLs som en kilde til fedtsyrer

  1. Subculture S. aureus celler til 5 ml fedtsyrefri 1% tryptonbouillon og Inkuber natten over ved 37 °c med omrystning (225 rpm). For fedtsyre auxotrophs, supplere kulturer med en kilde til fedtsyrer.
  2. Fortynd overnight kulturer til en optisk tæthed (OD) ved 600 nm (OD600) af 0,1 i 1% trypton bouillon. Der afpipetteres 50 μL af cellesuspensionen i hver brønd med en rund bund 96-brønd plade.
    Bemærk: når du arbejder med fedtsyre-auxotrophs, skal du vaske overnight kulturer i to volumener af tryptonbouillon og resuspendere i 5 ml trypton bouillon for at begrænse overførsel af fedtsyrer, før du afgør kulturens OD.
  3. For brønde, der indeholder ubehandlet kontrol, tilsættes 50 μL 1% tryptonbouillon pr. brønd.
  4. Til brøndene, der indeholder de eksperimentelle celle suspensioner, tilsættes 50 μL af 1% tryptonbouillon suppleret med 10% æggeblomme afledt LDL, 2 μM triclosan, eller en blanding af 10% æggeblomme afledte LDL og 2 μM triclosan.
    Bemærk: på dette tidspunkt vil hver brønd indeholde 100 μL, og den endelige koncentration af æggeblomme afledt LDL og triclosan pr. brønd vil være henholdsvis 5% og 1 μM.
  5. Mål OD600 over tid ved hjælp af en mikropladen læser sat til 37 °c med kontinuerlig, lineær rystning for at overvåge væksten.

5. inkubation af S. aureus med Ldl'er til analyse af membran lipid.

  1. Kultur en isoleret koloni i 5 mL fedtsyrefri 1% tryptonbouillon og Inkuber natten over ved 37 °C med omrystning (225 rpm).
  2. Fortyndet overnight kulturer 1:100 i en steril 250 mL forvirret kolbe indeholdende 50 mL 1% tryptonbouillon. Inkuber til mid-log-fasen (ca. 4 timer) ved 37 °C ved omrystning.
  3. 25 mL af kulturen overføres til et sterilt 50 mL centrifugeglas, og cellerne pellet. Supernatanten fjernes, og celle pellet opslæmmes i 750 μL 1% tryptonbouillon.
  4. Kombinér de opslæmmede celler og alikvot 300 μL af cellesuspensionen til et sterilt 1,5 mL centrifugeglas.
  5. Den ønskede slutkoncentration tilsættes LDLs og inkubates ved 37 °C med omrystning (225 rpm) i 4 timer.
  6. Der centrifugeres kulturerne ved 4 °C ved 16.000 x g i en varighed på 2 minutter, og celle pillerne vaskes i to volumener af sterile PBS, hvorefter de gentages.
  7. Optag vægten af hver våd celle pellet. Snap-frysecelle pellets på tøris eller i flydende nitrogen og opbevares ved-80 °C eller gå direkte til punkt 6.

6. ekstraktion af S. aureus membran lipiderne

  1. Placer frosne S. aureus celle piller på tøris. Tilsæt 0,5 mm zirconium oxid perler på toppen af hver celle pellet, ved hjælp af en volumen af perler omtrent lig med mængden af celle pellet.
    Bemærk: som et alternativ til denne metode til lipid ekstraktion, kan forskerne bruge de veletablerede Bligh og Dyer eller Folch metoder til krævende lipider fra bakterieceller34.
  2. Tilsæt 740 μL 75% methanol (HPLC-kvalitet) kølet til-80 °C direkte til celle pillerne.
  3. Tilsæt 2 μL 50 μM dimyristoyl phosphatidylcholin (tilberedt i methanol) pr. 1 mg celler som en intern standard. Prøverøret lukkes, og 1,5 mL-centrifuge rørene, der indeholder hver prøve, placeres i en tilgængelig port i en Kugleblender. Prøverne homogeniseres ved lav hastighed, indstilling 2-3, i 3 min.
  4. Inspicer prøverne visuelt for homogenitet. Hvis klumper af celler er synlige, Fortsæt homogenisering i kugle blenderen i 2 minutters intervaller.
  5. Fjern prøverne fra bullet blender og Overfør til en kemisk røg hætte.
  6. Tilsæt 270 μL chloroform til hvert prøveglas. Vortex prøverne kraftigt i 30 min.
    Forsigtig: chloroform er et muligt kræftfremkaldende stof.
  7. Prøverne centrifugeres i en stationære centrifuge i op til 30 minutter ved et minimum 2.000 x g. Der kan anvendes hurtigere hastigheder med kompatible centrifugerør, og Centrifugerings varigheden kan afkortes til 10 min.
  8. I en kemisk røg hætte, indsamle monokhasic supernatanten og overførsel til en ny test tube, mens omhyggeligt undgå protein pellet i bunden af ekstraktions røret.
  9. Der tilsættes 740 μL 75% methanol (HPLC-kvalitet) og 270 μL chloroform til protein pellet, og hver prøve udtages igen som beskrevet i trin 6.6-6.8 ovenfor. Supernatanten kombineres fra den anden ekstraktion med den tidligere indsamlede supernatanten for hver prøve.
  10. Ekstraktionsmidlerne fordamper under en strøm af inert gas såsom nitrogen eller argon eller under vakuum ved hjælp af en centrifuge koncentrator (tabel over materialer).
  11. Vask tørrede lipid ekstrakter tre gange med 1,0 mL vandig 10 mM ammoniumbicarbonat opløsning og re-tørre prøverne som i trin 6,10.
  12. De tørrede lipid-ekstrakter opslæmmes i et egnet ikke-polært opløsningsmiddel såsom isopropanol. Resuspendering af prøver med 20 μL pr. 1 mg frisk celle vægt bestemt i trin 5,7 Alternativt, hvis vægten af celle pellets er ukendt, skal du resuspendere prøverne i 200 μL isopropanol og fortsætte til afsnit 7.

7. analyse af S. aureus lipid profiler ved hjælp af høj opløsning/nøjagtig massespektrometri

  1. Før du foretager en fuldstændig lipid-analyse, skal du vælge repræsentative testprøver fra forsøgsgruppen (erne) og analysere dem over en række prøve fortyndingsfaktorer for at bestemme prøve fortyndings intervaller, hvor de totale lipid-koncentrationer falder inden for den lineære interval af detektorrespons for massespektrometer, som tidligere beskrevet35.
  2. Aliquoter af hver prøve lipid-ekstrakt fordamper til at blive underkastet lipid-analyse ved tørring af aliquoterne under inert gas eller under vakuum i en centrifuge koncentrator (tabel over materialer).
  3. Resuspension hver tørret lipid ekstrakt i væskekromatografi – massespektrometri (LC-MS) grad isopropanol: methanol (2:1, v:v) indeholdende 20 mM ammonium formate, ved hjælp af mængder svarende til en optimal prøve fortyndingsfaktor som bestemt i trin 7,1.
  4. For en umålrettet lipid analyse, kan prøverne indføres direkte til den høje opløsning/nøjagtige massespektrometri platform uden brug af kromatografi ved flow injektion eller direkte infusion af ekstrakter35,36. De fortyndede lipidekstrakter, som er fremstillet i trin 7,3, overføres til et passende Autosampler-hætteglas eller 96-brønd plade.
  5. Ved flow injektion-baseret analyse placeres Autosampler-hætteglassene i en temperaturkontrolleret (15 °C) Autosampler af et HPLC-system, der kan kapillar/low flow applikationer, såsom en HPLC (tabel over materialer) udstyret med et elektronisk flow doserings-og strømnings overvågningssystem.
  6. Fyld HPLC-opløsningsmiddel reservoirer med LC-MS-grad isopropanol: methanol (2:1, v:v) indeholdende 20 mM ammonium format.
  7. Ved hjælp af Agilent Chemstation software, programmere HPLC Autosampler til at udføre 5 μL prøve injektioner. Vælg Konfigurer injektori menuen instrument , og Skriv 5,0 i feltet Injektionsvolumen. Enhederne er givet som mikroliter. Sørg for, at HPLC er indstillet til isokratisk strøm ved 1 μL pr. minut af 2:1 (v:v) isopropanol: methanol, der indeholder 20 mM ammonium format.
  8. Fra menuen Chemstation instrument skal du vælge Konfigurer pumpe... og derefter vælge kontakten Micro flow mode.
  9. I feltet tidsplan skal du indtaste: tid 0,00, 100% B, flow 1,0. Tryk på Enter , og Opret en anden række i tids planen ved at angive tid 10,0, 100% B, flow 1,0. Vælg knappen OK nederst i menuen Konfigurer pumpe . Disse indstillinger vil muliggøre 10 analytiske kørsler med en strømningshastighed på 1,0 μL pr. minut.
  10. Indfør eluatet fra HPLC-overførsels ledningen til massespektrometer ved hjælp af en elektro spray ioniserings kilde, der er udstyret med en low-flow (34 G) metal nål.
  11. Ved hjælp af Thermo tune plus instrument styringssoftware skal du vælge opsætnings menuen og vælge opvarmet ESI-kilde. Indstil ioniserings spændingen til 4000 V og kappe gas til 5 (vilkårlige enheder) ved at indtaste disse værdier i de tilsvarende felter i dialogboksen. Tilsvarende, sæt kapillær Temp til 150 °C og S-linsen til 50%.
    Bemærk: disse værdier skal optimeres for hver massespektrometri-platform.
  12. For umålrettet lipid analyse, bruge en høj opløsning/nøjagtig masse MS platform (tabel over materialer) som detektoren.
  13. Ved hjælp af Thermo tune plus-softwaren skal du klikke på knappen Definer scanning og vælge FTMsi analysator menuen. Indstil feltet masse område til normal , og vælg 100.000i feltet opløsning . Kontroller, at Scanningstypen er indstillet til fuld. I menuen scanningsområder skal du indtaste 200 i feltet første masse (m/z) og indtaste 2000 i feltet sidste masse (m/z).
  14. Sørg for, at negativ polaritet udnyttes til at opdage de mest rigelige S. aureus lipider.
  15. Gentag prøven analyse ved hjælp af ion mapping tandem massespektrometri (MS/MS) fragmentering af alle lipidioner inden for en spektral region af interesse for at bekræfte lipid strukturer og fedtsyrer bestanddele. Alternativt kan udvalgte lipidoner af interesse underkastes MS/MS-analyse, efter at de første lipididentifikationer er blevet tildelt i afsnit 8.

8. database søgning for at identificere endogene S. aureus og EKSOGENE LDL-afledte lipiderne

  1. Brug Thermo Xcalibur-softwaren til yderligere at finjustere den observerede masse nøjagtighed. I Xcalibur skal du vælge genkalibrer offlinei menuen funktioner . Når vinduet Rekalibrate offline åbnes, skal du indlæse den massespektrumfil, som skal rekalibreres, ved at vælge menuen filer og vælge indstillingen Åbn .
  2. Åbn filen med interesse, Skift knappen Indsæt række øverst i visningsvinduet for at få vist det totale ion-KROMATOGRAM for MS-kørslen. Gennemsnit de erhvervede MS-signaler ved at venstre klikke på computermusen på den ene kant af den observerede signal spids i det totale ion-kromatogram og trække musen hen over den bredeste del af toppen.
  3. Under menuen scannings filter skal du vælge det filter, som svarer til Full Scan MS data. Indlæs en referencefil, der indeholder de teoretiske monoisotopic masser af mindst tre kendte S. aureus endogene lipider ved at vælge knappen Indlæs Ref... og vælge referencefilen. Kontroller Brug boksen ved siden af hver lipid monoisotopic masse.
  4. Klik på knappen Søg nederst i visningsvinduet. Re-gennemsnittet MS signal på tværs af signalet Peak i total ion kromatogrammet som gjort tidligere.
  5. Klik på knappen Konverter nederst i visningsvinduet. Når dialogboksen Konverter åbnes, skal du klikke på OK. Udelad dette trin, hvis data blev indsamlet på massespektrometriske platforme fra andre leverandører end Thermo Scientific.
  6. Ved hjælp af Xcalibur-software skal du eksportere de rekalibrerede nøjagtige massespidslister for hver ubehandlet eller LDL-behandlet prøve til separate regneark i en Excel-fil. Vælg ikonet qual browser . Åbn den rekalibrerede fil af interesse ved at vælge menuen filer og vælge indstillingen Åbn... .
  7. Gennemsnitligt signalet på tværs af den brede top i det totale ionkromatogram som beskrevet i trin 8,2.
  8. Højreklik på tegnestift ikonet i Mass Spectrum visning vindue og vælg View | Frekvens liste. Fra den samme menu, skal du vælge display Options og derefter alle toppe Toggle boks i displayet menuen. Klik på knappen OK for at lukke visningsvinduet.
  9. Højreklik på tegnestift ikonet i Mass Spectrum visning vinduet igen og vælg eksport | Udklipsholderen (eksakt masse). Indsæt den eksporterede datacelle a1 i det første regneark i et nyt Excel-regneark.
  10. Slet de første 8 rækker med tekst i den eksporterede datafil, så celle a1 i Excel-regnearket indeholder det første masse datapunkt fra masse spektret. Gentag eksporten af hver genkalibreret MS-fil ved hjælp af et nyt regneark i Excel-filen for hver eksporteret spids liste.
  11. Ved hjælp af lipid Mass Spectral Analysis (LIMSA) software37 add-in til Excel, konstruere en database, der indeholder molekylære formler af kendte S. aureus lipid arter som beskrevet af Hewelt-Belka et al. 201438, samt formler, der repræsenterer lipid arter, som hypotetisk kunne være til stede i LDL.
    Bemærk: Derudover bør der udvises forsigtighed for at inkludere potentielle molekylære formler i databasen for hypotetiske bakterielle lipider, som har indarbejdet store LDL-fedtsyrer, såsom oliesyre (18:1) og linolsyre (18:2) fedtsyrer32.
  12. Hvis du vil konstruere databasen, skal du åbne et tomt Excel-regneark. I celle a1 i det første regneark skal du skrive den teoretiske/beregnede monoisotopic masse af lipidarterne, som skal føjes til databasen, svarende til massen af lipidarterne i ionstaten observeret i massespektrometer. Indtast et navn for lipidarterne i celle B1, f. eks.
  13. I celle C1 indtastes den molekylære formel for lipidarterne, svarende til den ioniske tilstand af lipid observeret i massespektrometer. I celle D1 indtastes afgiften af lipidarter som observeret i massespektrometer. Flyt til celle a2 for at starte en ny post for de næste lipidarter, der skal indtastes i den søgbare database.
  14. Gentag trinene 8,12 og 8,13, indtil alle ønskede lipidarter er indtastet i databasen. Gem databasefilen, og lad den være åben i Excel.
  15. I Excel skal du vælge menuen tilføjelsesprogrammer i. Vælg limsa for at starte limsa-softwaren. Klik på knappen sammensat bibliotek... i hovedmenuen. Klik på Importer forbindelseri det nye vindue, der vises. Dette vil uploade den sammensatte database til brug for LIMSA software.
  16. Udfør nøjagtige masse baserede lipid-identifikationer på alle MS Spectra ved hjælp af LIMSA software add-in til Excel i henhold til leverandørens anvisninger35. Vælg peak List i menuen Spectrum type i limsa-hovedmenuen. Vælg positiv tilstand eller negativ tilstand for at svare til den POLARITET, som MS-dataene blev indsamlet i.
  17. I vinduet peak FWHM (m/z) skal du indtaste det ønskede vindue til masse søgning for at finde Peak. En masse tolerance søgning vindue af 0,003-0,005 m/z anbefales til høj opløsning/nøjagtige masse MS data.
  18. I vinduet følsomhed skal du angive den ønskede afskærings linje (f. eks. 0,01% relativ overflod). I menuen isotop korrektion skal du vælge lineær tilpasning eller subtrahere algoritmer, som begge kan bruges med peak List data.
  19. Fremhæv lipid forbindelser til at omfatte i databasen søgning ved at klikke på ønskede lipid arter i de tilgængelige forbindelser vindue. Klik på knappen Tilføj for at tilføje fremhævet lipid arter til søge gruppen.
  20. Definer interne standarder ved at klikke på tilføjede forbindelser, og skift derefter koncentrations vinduet til den tilsvarende koncentration af den valgte interne standard.
  21. Sørg for, at den interne standard og udvalgte lipidarter, der skal kvantiteres, tilhører samme klassenavn ved at vælge hver tilsat lipidarter og intern standard og skrive et klassenavn (f. eks. PG eller lipid) i klasse feltet.
  22. Hvis du vil gemme den søgbare gruppe af lipidforbindelser til fremtidig brug, skal du klikke på knappen Gem ved siden af menuen grupper .
  23. Sørg for, at Excel-filen, der indeholder alle eksporterede MS peak-lister, er åben for det ark, der svarer til den første S. aureus MS-kørsel, og klik derefter på knappen Søg fra limsa-hovedmenuen.
    Bemærk: outputtet fra LIMSA-database søgningen vil omfatte en liste over massespektral funktioner, der er afstemt med lipider, der findes i databasen, og som er konstrueret i trin 8.12-8.13, samt koncentrationer for hver matchet funktion efter normalisering til en eller flere udvalgte interne standarder.
  24. Brug Xcalibur software til at undersøge nøjagtig masse MS/MS Spectra for m/z svarende til lipidoner af interesse for at bekræfte fedtsyrer bestanddele til stede i hver identificeret lipid molekylære arter. Vælg ikonet qual browser . Åbn MS/MS-filen af interesse ved at vælge filrulle menuen og vælge indstillingen Åbn... .
  25. Vælg scannings filteret svarende til MS/MS analyse af en lipid m/z af interesse ved højre museklik på tegnestift ikonet i Mass Spectrum visning vinduet og vælg intervaller fra menuen. I det nye vindue, der vises, skal du vælge menuen filter for at vælge scanningen.
  26. Gennemsnitligt signalet på tværs af det totale ionkromatogram som beskrevet i trin 8,2. Brug MetaboAnalyst (www.metaboanalyst.ca) software til at udføre relevante statistiske tests. Vurder statistisk signifikant forskel i S. aureus lipid sammensætning ved at sammenligne normaliserede lipid rigeligt på tværs af ubehandlet og LDL-behandlede betingelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen for tilsætning af LDL fra kyllingægge blomme er illustreret i figur 1. Denne proces begynder ved at fortynde hele æggeblomme med saltvand og adskille æggeblomme tørstof benævnt granulat fra den opløselige eller plasma fraktion indeholdende Ldl'er (figur 1)33. LDL-indholdet i plasma fraktionen er yderligere beriget ved udfældning af ~ 30-40 kDa β-livetiner (figur 2)33. Tilstedeværelsen af protein bånd på 140, 80, 65, 60 og 15 kDa korrelerer med apoproteiner af LDLs (figur 2)33,39. Behandling med triclosan hæmmer væksten af S. aureus i fedtsyrefri medier32. Vi har tidligere påvist, at supplere kulturer med æggeblomme plasma eller renset humane Ldl'er som eksogene fedtsyre kilder overvinder triclosan-induceret væksthæmning (figur 3)32. Tilsvarende, tilskud af triclosan-behandlede kulturer med beriget æggeblomme LDL genskaber vækst (figur 3). Yderligere, tilsætning af æggeblomme LDLs støtte væksten af en tidligere karakteriseret S. aureus fedtsyre auxotroph (figur 4)32. For at opnå den mest nøjagtige massespektrometri-baserede profilering af S. aureus indarbejdelse af eksogene fedtsyrer, er det vigtigt at begrænse tilstedeværelsen af frie fedtsyrer i vækstmediet. Den frie fedtsyresammensætning på 1% tryptonbouillon og kyllinge æggeblomme LDLs fortyndet i tryptonbouillon blev bestemt ved at anvende flow injektion med høj opløsning/nøjagtig massespektrometri og fandt minimale mængder af fri fedtsyre (figur 5). Den samme umålrettede massespektrometri analyse blev udført for at bestemme fedtsyren sammensætningen af S. aureus fosfolipider efter udsættelse for kylling æggeblomme LDLs. orthogonal diskriminant-analyse af delvise mindste kvadrater (OPLS-DA)40 af rigelige S. aureus membran fosfolipider demonstreret klar klasse adskillelse af ubehandlet og kylling æggeblomme LDL-behandlede betingelser, som vist i OPLS-da scores plot (figur 6a). Opls-da belastninger plot indikerede talrige phosphatidylglycerolarter som vigtige variabler i pls-da-modellen. Især phospholipider indeholdende umættede fedtsyrer, en molekyl markør for eksogene fedtsyre inkorporering, er beriget i LDL suppleret kulturer sammenlignet med celler inkuberet i fravær af LDLs (figur 6b). Tidligere undersøgelser har fundet, at hønseæg æggeblommer er en rig kilde til umættede fedtsyrer med oliesyre (18:1) er den mest rigelige41,42. I forståelse med disse observationer, vi fandt oliesyre at være den mest almindelige umættede fedtsyrer anvendes til fosfolipid syntese når S. aureus kulturer blev suppleret med kylling æggeblomme LDLs (figur 6c). Tabel 1 illustrerer yderligere, at fedtsyre profilerne for membran fosfolipider ændres, når S. aureus dyrkes i nærværelse af æggeblomme LDL.

Figure 1
Figur 1: en illustration af LDL berigelse fra kylling æggeblomme udnytter centrifugering og ammoniak sulfat nedbør. A) de reagenser, der er nødvendige for tilsætning af LDL fra hønseæg æggeblomme. (B) flowdiagrammet skildrer de væsentlige trin i LDL-berigelses processen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: protein profil af kylling æggeblomme før og efter tilsætning til LDL. Protein lysater blev tilberedt ved hjælp af Ripa buffer. Protein lysat (15 μg) blev indlæst i en 8% akrylamid SDS-side gel. Gels blev plettet natten over med Bio Rad protein reagens. Molekylvægten i kDa af LDL-associerede proteiner er angivet langs højre side af billedet. M: protein markør, Y: kylling æggeblomme, og LDL: kylling æggeblomme LDL berigelse venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: æggeblomme afledte Ldl'er beskytter S. aureus mod triclosan-INDUCERET fasii-hæmning. Væksten af S. aureus blev overvåget med tiden via måling af OD600 i 1% tryptonbouillon under følgende forhold: 1% TRYPTONBOUILLON (TB), 1 μm triclosan (TCS), 1 μm triclosan med 1% æggeblomme plasma (TCS + EYP), 5% æggeblomme LDL (LDL) eller 1 μm Triclosan med 5% æggeblomme LDL (TCS + LDL). Middelværdien fra tre uafhængige eksperimenter vises. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelsen for middelværdien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: vækst i et S. aureus fedtsyre auxotroph understøttes af æggeblomme afledte LDL. Væksten af en fedtsyre auxotroph i 1% trypton bouillon (TB) med eller uden 5% æggeblomme LDL (LDL) tilskud blev kontrolleret over tid via måling af OD600. Middelværdien fra tre uafhængige eksperimenter vises. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelsen for middelværdien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: frit fedtsyreindhold målt i 1% tryptonbouillon eller kyllinge æggeblomme LDL. Frie fedtsyrer blev detekteret ved flow injektion høj opløsning/nøjagtig massespektrometri og tandem massespektrometri. Normaliseret antal ioner pr. mg protein blev bestemt for 1% tryptonbouillon og 1% tryptonbouillon suppleret med 5% kyllinge æggeblomme LDLs. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: hønseæg æggeblomme low-density lipoproteiner er et reservoir af eksogene fedtsyrer til syntese af S. aureus phosphatidylglycerol. (A) scorer plot af ortogonale delvis mindste kvadrater diskriminant analyse af kylling æggeblomme LDL-behandlede og ubehandlet S. aureus membran fosfolipider identificeret ved hjælp af høj opløsning/nøjagtig massespektrometri. B) procentdel af umættet phosphatidylglycerol (upg) sammenlignet med den totale membran PG af S. aureus , der DYRKES i fravær (WT) eller tilstedeværelse (WT + LDL) af kyllinge æggeblomme LDLs. (C) umættet fedtsyre (UFA) profil af membran PG af S. aureus dyrket uden (WT) eller med (WT + LDL) kylling æggeblomme LDLs graferet som en procentdel af mængden af samlede PG fedtsyrer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

WT kultiveret i trypton bouillon WT kultiveret i trypton bouillon suppleret med LDLs
Phosphatidyl glycerol (TC: TDB)a Normaliseret iontæthed/mg protein Sd Fedtsyrerc Normaliseret iontæthed/mg protein Sd Fedtsyrerc
24:0 0 0 NDb 0,052031116 0,02677 Nd
26:0 0 0 Nd 0,009539117 0,00362 Nd
28:0 0,127937113 0,04528 15:0_13:0 0,167643281 0,02392 15:0_13:0
28:1 0,006765427 0,00157 Nd 0,002776821 0,00372 15:0_13:1
30:0 8,680180809 2,68375 15:0_15:0 14,04873592 2,4531 15:0_15:0
30:1 0 0 Nd 0,010152161 0,00449 15:1_15:0, 13:1_17:0
31:0 4,150511117 1,31658 16:0_15:0, 14:0_17:0 10,17590926 1,88431 16:0_15:0, 14:0_17:0, 18:0_13:0
31:1 0,016156004 0,01216 13:1_15:0, 12:1_19:0 0,473478683 0,09063 13:1_15:0, 18:1_13:0, 12:1_19:0
32:0 29,29259262 8,82993 15:0_17:0 48,24342037 8,95664 15:0_17:0, 16:0_16:0
32:1 0,02074815 0,00941 Nd 0,307044942 0,07305 18:1_14:0, 16:1_16:0
33:0 9,000460122 2,78194 18:0_15:0, 16:0_17:0 15,4531776 2,98171 18:0_15:0, 16:0_17:0
33:1 0,162934812 0,04796 Nd 2,921832928 0,30851 18:1_15:0
33:2 0 0 Nd 0,167492702 0,03211 18:1_15:1, 18:2_15:0
34:0 12,3064043 3,70242 19:0_15:0, 17:0_17:0 18,40129157 3,21385 19:0_15:0, 17:0_17:0
34:1 0 0 Nd 1,423605186 0,20066 18:1_16:0
34:2 0,000470922 0,00082 Nd 0,156133734 0,03929 18:2_16:0
35:0 5,727462455 1,74583 20:0_15:0, 18:0_17:0 7,771538992 1,28515 20:0_15:0, 16:0_19:0, 18:0_17:0
35:1 0,17337586 0,05727 20:1_15:0 0,772202525 0,08526 20:1_15:0, 18:1_17:0
35:2 0 0 Nd 0,038758757 0,01481 18:2_17:0, 18:1_17:1
36:0 0,671004303 0,2116 21:0_15:0, 19:0_17:0 0,967295024 0,2572 21:0_15:0, 20:0_16:0, 19:0_17:0, 22:0_14:0
36:2 0 0 Nd 0,495485065 0,04473 18:1_18:1, 18:2_18:0
36:3 0 0 Nd 0,059268233 0,02291 18:2_18:1, 20:3_16:0, 20:2_16:1
37:0 0,060466411 0,01961 22:0_15:0, 20:0_17:0 0,114526894 0,01852 22:0_15:0, 20:0_17:0, 18:0_19:0
38:2 0 0 Nd 0,079469521 0,02872 18:2_20:0, 16:1_20:1
en stor Detekteres som [M-H]- ioner. TC, total kædens længde; TDB, samlet antal dobbelte obligationer.
b ND, ikke bestemt
c Fedtsyrer er opført i rækkefølgen af isomer overflod. En understregning mellem fedtsyre betegnelser indikerer, at hver fedtsyre kan være til stede i enten SN1 eller SN2 position, da tandem massespektrometri alene ikke kan udelukke muligheden for, at lipid arter findes som en blanding af positionelle isomerer.

Tabel 1: fedtsyreprofilen for S. aureus dyrket i nærværelse af kyllinge æggeblomme LDLs. Vi brugte en objektiv lipidomisk analyse udnytter høj opløsning/nøjagtig MS og MS/MS til at bestemme fedtsyreprofilen af S. aureus PG. S. aureus blev inkuberet i nærværelse af eller fravær af kylling æggeblomme LDLS, og PG profil af disse celler blev sammenlignet med celler, der dyrkes i 1% tryptonbouillon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

S. aureus inkorporerer eksogene fedtsyrer i dets membran fosfolipider27,32,43. Fosfolipid syntese ved hjælp af eksogene fedtsyrer omgår fasii hæmning, men også ændrer de biofysiske egenskaber af membranen27,32,44. Mens inkorporering af eksogene fedtsyrer i phospholipider af gram-positive patogener er veldokumenteret, mangler der mellemrum i identiteten af vært fedtsyre reservoirer og de strukturelle ændringer til hver af de tre store stafylokok phospholipid typer som følge af eksogene fedtsyre inkorporering. Her beskriver vi protokoller, der kan anvendes til: i) berige LDL-partikler fra hønseæg æggeblomme, en kilde til fedtsyrer, II) bestemme virkningerne af eksogene fedtsyrer på væksten af S. aureus, og III) udnytte en objektiv lipidomisk analyse for overvågning af eksogene fedtsyre inkorporering i membran Fosfolipiderne af S. aureus. Den avancerede massespektrometri metode, der er fastsat i denne undersøgelse tilbyder et ekstraordinært perspektiv af membranens sammensætning af S. aureus dyrket i nærværelse af eksogene fedtsyrer.

Flere gram-positive patogener udnytter eksogene fedtsyrer til membran syntese og, som med S. aureus, de mulige kilder til eksogene fedtsyrer under infektion er dårligt forstået27,43. Den vækst analyse, der er beskrevet her, kan ændres for at evaluere spredningen af andre gram positive patogener i tilstedeværelse af lipoproteiner, hvis der tages hensyn til hvert patogen vækst kinetik. Derudover kan andre komplekse værts kilder for eksogene fedtsyrer testes ved hjælp af denne protokol, hvis de potentielle virkninger af fedtsyre kilden på baggrunds optisk tæthed styres. Desuden er den beskrevne massespektrometri metode til analyse af bakterielle lipider tilstrækkelig fleksibel til at muliggøre lipidome evaluering fra stort set alle bakteriearter. Som lipid nøjagtige masse data indsamles i ' Full Scan ' MS mode, lidt a priori viden om lipid indholdet af de bakterielle arter af interesse er påkrævet, i modsætning til målrettede analytiske metoder baseret på kendte fragmentering mønstre af specifikke lipider 32 , 45 , 46. i den "umålrettede" analytiske arbejdsproces, som vi beskriver, er downstream-dataanalysen, og især søgningen af nøjagtige masse Toplister mod en lipid-database, vigtige skridt, der er meget tilpasningsdygtige og kan understøtte en bred vifte af bakterie arter og eksperimentelle behandlinger. Ved opførelse eller valg af en søgbar database for at muliggøre identifikation af lipidarter, skal forskerne overveje en bred vifte af hypotetiske endogene lipidarter, samtidig med at det giver mulighed for påvisning af nye eller uforudsete eksogene lipider afledt fra den eksperimentelle behandling.

I nærværende undersøgelse blev der anvendt en høj opløsning/nøjagtig massespektrometer (tabel over materialer) på grund af dets ultra-høje opløsning/nøjagtige masse kapaciteter. Alternativt, talrige andre høj opløsning/nøjagtige massespektrometri platforme kunne gennemføres med succes til at udføre umålrettet lipid analyse. Tilsvarende, en bred vifte af prøve indledning metoder, herunder direkte infusion, desorption elektro spray ionisering, eller matrix-assisteret Laser Desorption ionisering, der muliggør direkte analyse af lipid ekstrakter, kunne udnyttes til hurtigt at indsamle umålrettede lipidomiske data. Medtagelse af væskekromatografi forud for prøve indføring, når det anvendes i kombination med høj opløsning/nøjagtig massespektrometri, kan tillade opløsning af nogle isobariske lipid arter under Full-Scan MS dataindsamling. Imidlertid nødvendiggør optagelsen af kromatografi at sikre, at den kromatografiske metode er alsidig nok til at muliggøre adskillelse og påvisning af uventede eller nye lipidarter, der kan være til stede efter eksperimentelle behandlinger. Database søgning for at identificere lipider til stede i datasættet kan udføres ved hjælp af enhver offentligt tilgængelig søgbar database. Mens LIMSA software muliggør facile udvikling af brugerdefinerede databaser af titusinder af hypotetiske lipid arter, talrige andre muligheder findes for at identificere lipider fra høj opløsning/nøjagtige masse MS peak lister. Den LIPID MAPS Consortium (www.lipidmaps.org) giver værktøjer til at søge beregningsmæssige og eksperimentelle databaser af hypotetiske lipider ved hjælp af høj opløsning/præcise MS-genererede peak lister inden for en brugerdefineret masse tolerance, og mange software leverandører tilbyder deres egne løsninger til analyse af lipidomics-data.

Vellykket vækstkurve og eksogene fedtsyre analyse er afhængig af flere faktorer, herunder LDL renhed og begrænsende baggrunds fedtsyre niveauer. Korrekt identifikation af den LDL-holdige fraktion er afgørende. Ovennævnte protokol og figur 1 illustrerer den korrekte fraktion, som skal bevares for hvert trin i berigningsprocessen. Vi har haft succes med brugen af 40% ammoniumsulfat (renhed ≥ 99,5%) til udfældning og efterfølgende fjernelse af β-livetiner. Men, andre har rapporteret, at renhed og koncentration af ammoniak sulfat føjet til æggeblomme plasma kan betydeligt påvirke dette trin47. Begrænsning af ammoniumsulfat forurening i LDL berigelse er vigtigt for LDL forberedelse til at blive anvendt i bakterielle assays, som høje koncentrationer af ammoniumsulfat kan begrænse vækst48. Under dialyse skal der være rigelig ledig plads i dialyse slangen for at muliggøre diffusion og fjernelse af ammoniumsulfat. Yderligere optimering af dialyse processen kan omfatte yderligere vand ændringer i løbet af natten inkubation. Vi har fundet en dag i dialyse for at give de bedste resultater, selv om Moussa et al. rapport dialyse på 6 timer er tilstrækkelig. Det er afgørende, at startkoncentrationen af celler i vækstkurverne holdes konsistent mellem forsøgene. For S. aureus har fortynder cellerne til en oprindelig OD600 af 0,05 givet de mest konsistente resultater. Desuden kan høje koncentrationer af FASII-hæmmere resultere i ikke-specifikke virkninger på bakterieceller. For eksempel, Triclosan koncentrationer over 7 μM inducerer cytoplasmiske membran skader i S. aureus, derfor er det nødvendigt, at koncentrationen af dette stof forbliver under dette niveau49. Vi har fundet en endelig triclosan koncentration på 1 μM resulterer i reproducerbare vækst assays. Ved vurdering af en potentiel kilde til eksogene fedtsyrer for bakteriel phospholipid syntese, er det vigtigt at minimere fedtsyre bidraget fra kulturmediet. I ovennævnte assays understøtter kulturmediet på 1% trypton tilstrækkelig vækst i S. aureus og har minimal fedtsyre forurening29,32.

Begrænsning af baggrunds fedtsyre niveauer er særlig vigtig for downstream-massespektrometri-baserede fedtsyre profilering. Andre har rapporteret mængden af frie fedtsyrer i kylling æggeblomme er naturligvis lav41 og vores analyse støtter denne konklusion (figur 5). Brug af trypton bouillon og grundigt vaske celler med PBS efter inkubation er afgørende. Desuden er det vigtigt at overveje vækstfase af cellerne. Vi valgte Mid-log fase celler for at sikre rigelig bakteriel phospholipid syntese. Andre potentielle kontaminerende kilder til eksogene fedtsyrer kan indføres efter bakteriel vækst, såsom under lipid ekstraktion trin eller efterfølgende prøveforberedelse forud for massespektrometri analyse50. Eksogene fedtsyrer introduceret på ethvert trin af prøve præparatet kunne påvises som frie fedtsyrer under massespektrometri analyse. Bage laboratorium glas i en høj temperatur ovn (mindst 180 °C) natten over kan fjerne eksogene fedtsyrer fra reagensglas, der anvendes til lipid ekstraktion og Lipid opbevaring. Desuden kan laboratorie forsyninger, herunder plast, skylles med methanol for at reducere fedtsyre baggrunden50. Rest fedtsyrer fra tidligere analyser kan også kontaminere selve massespektrometrets indvendige overflader. Inkludering af analytiske emner under massespektrometri-analyse til bestemmelse af baggrundsniveauer af frie fedtsyrer tilrådes derfor kraftigt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen oplysninger.

Acknowledgments

Vi takker medlemmerne af hammer laboratoriet for deres kritiske evaluering af manuskriptet og støtte til dette arbejde. Dr. Alex Horswill fra University of Colorado School of Medicine venligt forudsat AH1263. Dr. Chris Waters laboratorium på Michigan State University leverede reagenser. Dette arbejde blev støttet af American Heart Association Grant 16SDG30170026 og start-up midler fra Michigan State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium sulfate Fisher BP212R-1 ≥99.5% pure
Cell culture incubator Thermo MaxQ 6000
Centrafuge Thermo 75-217-420 Sorvall Legen XTR, rotor F14-6x250 LE
Costar assay plate Corning 3788 96 well
Filter paper Schleicher & Schuell 597
Large chicken egg N/A N/A Common store bought egg
Microplate spectrophotometer BioTek Epoch 2
NaCl Sigma S9625
S. aureus strain AH1263 N/A N/A Provided by Alex Horswill of the University of Colorado
Dialysis tubing Pierce 68700 7,000 MWCO
Tryptone Becton, Dickison and Company 211705
0.5 mm zirconium oxide beads Next Advance ZROB05
Bullet Blender Next Advance BBX24B
Methanol (LC-MS grade) Fisher A4561
Chloroform (reagent grade) Fisher MCX10559
Isopropanol (LC-MS grade) Fisher A4611
Dimyristoyl phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 850345C-25mg
Ammonium bicarbonate Sigma 9830 ≥99.5% pure
Ammonium formate Sigma 70221-25G-F
Xcalibur software Thermo Scientific OPTON-30801
LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer Thermo Scientific high resolution/accurate mass MS
Agilent 1260 capillary HPLC Agilent
SpeedVac Vacuum Concentrators Thermo Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Noskin, G. A., et al. National trends in Staphylococcus aureus infection rates: impact on economic burden and mortality over a 6-year period (1998-2003). Clinical Infectious Diseases. 45 (9), 1132-1140 (2007).
  2. Noskin, G. A., et al. The burden of Staphylococcus aureus infections on hospitals in the United States: an analysis of the 2000 and 2001 Nationwide Inpatient Sample Database. Archives of Internal Medicine. 165 (15), 1756-1761 (2005).
  3. Laible, B. R. Antimicrobial resistance: CDC releases report prioritizing current threats. South Dakota medicine. 67 (1), 30-31 (2014).
  4. Zhang, Y. M., Rock, C. O. Membrane lipid homeostasis in bacteria. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 222-233 (2008).
  5. Zhang, Y. M., White, S. W., Rock, C. O. Inhibiting bacterial fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 281 (26), 17541-17544 (2006).
  6. Sohlenkamp, C., Geiger, O. Bacterial membrane lipids: diversity in structures and pathways. FEMS Microbiology Reviews. 40 (1), 133-159 (2016).
  7. Schiebel, J., et al. Staphylococcus aureus FabI: inhibition, substrate recognition, and potential implications for in vivo essentiality. Structure. 20 (5), 802-813 (2012).
  8. Heath, R. J., Li, J., Roland, G. E., Rock, C. O. Inhibition of the Staphylococcus aureus NADPH-dependent enoyl-acyl carrier protein reductase by triclosan and hexachlorophene. Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4654-4659 (2000).
  9. Heath, R. J., Yu, Y. T., Shapiro, M. A., Olson, E., Rock, C. O. Broad spectrum antimicrobial biocides target the FabI component of fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30316-30320 (1998).
  10. Park, H. S., et al. Antistaphylococcal activities of CG400549, a new bacterial enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI) inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (3), 568-574 (2007).
  11. Schiebel, J., et al. Rational design of broad spectrum antibacterial activity based on a clinically relevant enoyl-acyl carrier protein (ACP) reductase inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 289 (23), 15987-16005 (2014).
  12. Yum, J. H., et al. In vitro activities of CG400549, a novel FabI inhibitor, against recently isolated clinical staphylococcal strains in Korea. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (7), 2591-2593 (2007).
  13. Kaplan, N., et al. Mode of action, in vitro activity, and in vivo efficacy of AFN-1252, a selective antistaphylococcal FabI inhibitor. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (11), 5865-5874 (2012).
  14. Karlowsky, J. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Hoban, D. J., Zhanel, G. G. AFN-1252, a FabI inhibitor, demonstrates a Staphylococcus-specific spectrum of activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (8), 3544-3548 (2009).
  15. Ross, J. E., Flamm, R. K., Jones, R. N. Initial broth microdilution quality control guidelines for Debio 1452, a FabI inhibitor antimicrobial agent. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (11), 7151-7152 (2015).
  16. Hunt, T., Kaplan, N., Hafkin, B. Safety, tolerability and pharmacokinetics of multiple oral doses of AFN-1252 administered as immediate release (IR) tablets in healthy subjects. Journal of Chemotherapy. 28 (3), 164-171 (2016).
  17. Hafkin, B., Kaplan, N., Hunt, T. L. Safety, tolerability and pharmacokinetics of AFN-1252 administered as immediate release tablets in healthy subjects. Future Microbiology. 10 (11), 1805-1813 (2015).
  18. Flamm, R. K., Rhomberg, P. R., Kaplan, N., Jones, R. N., Farrell, D. J. Activity of Debio1452, a FabI inhibitor with potent activity against Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococcus spp., including multidrug-resistant strains. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (5), 2583-2587 (2015).
  19. Yao, J., Maxwell, J. B., Rock, C. O. Resistance to AFN-1252 arises from missense mutations in Staphylococcus aureus enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI). Journal of Biological Chemistry. 288 (51), 36261-36271 (2013).
  20. Tsuji, B. T., Harigaya, Y., Lesse, A. J., Forrest, A., Ngo, D. Activity of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, against Staphylococcus aureus in an in vitro pharmacodynamic model simulating human pharmacokinetics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 32-35 (2013).
  21. Parsons, J. B., et al. Perturbation of Staphylococcus aureus gene expression by the enoyl-acyl carrier protein reductase inhibitor AFN-1252. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (5), 2182-2190 (2013).
  22. Kaplan, N., et al. In vitro activity (MICs and rate of kill) of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, in the presence of serum and in combination with other antibiotics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 18-25 (2013).
  23. Kaplan, N., Garner, C., Hafkin, B. AFN-1252 in vitro absorption studies and pharmacokinetics following microdosing in healthy subjects. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (3-4), 440-446 (2013).
  24. Banevicius, M. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Nicolau, D. P. Pharmacokinetics, pharmacodynamics and efficacy of novel FabI inhibitor AFN-1252 against MSSA and MRSA in the murine thigh infection model. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 26-31 (2013).
  25. Karlowsky, J. A., et al. In vitro activity of API-1252, a novel FabI inhibitor, against clinical isolates of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (4), 1580-1581 (2007).
  26. Yao, J., et al. A Pathogen-Selective Antibiotic Minimizes Disturbance to the Microbiome. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (7), 4264-4273 (2016).
  27. Brinster, S., et al. Type II fatty acid synthesis is not a suitable antibiotic target for Gram-positive pathogens. Nature. 458 (7234), 83-86 (2009).
  28. Balemans, W., et al. Essentiality of FASII pathway for Staphylococcus aureus. Nature. 463 (7279), E3-E4 (2010).
  29. Parsons, J. B., Frank, M. W., Subramanian, C., Saenkham, P., Rock, C. O. Metabolic basis for the differential susceptibility of Gram-positive pathogens to fatty acid synthesis inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15378-15383 (2011).
  30. Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), e0116195 (2015).
  31. Feingold, K. R., Grunfeld, C. Introduction to Lipids and Lipoproteins. Endotext. , (2000).
  32. Delekta, P. C., Shook, J. C., Lydic, T. A., Mulks, M. H., Hammer, N. D. Staphylococcus aureus utilizes host-derived lipoprotein particles as sources of exogenous fatty acids. Journal of Bacteriology. 200 (11), (2018).
  33. Moussa, M., Marinet, V., Trimeche, A., Tainturier, D., Anton, M. Low density lipoproteins extracted from hen egg yolk by an easy method: cryoprotective effect on frozen-thawed bull semen. Theriogenology. 57 (6), 1695-1706 (2002).
  34. Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. Bligh and Dyer and Folch Methods for Solid-Liquid-Liquid Extraction of Lipids from Microorganisms. Comprehension of Solvatation Mechanisms and towards Substitution with Alternative Solvents. International journal of molecular sciences. 18 (4), (2017).
  35. Lydic, T. A., Busik, J. V., Reid, G. E. A monophasic extraction strategy for the simultaneous lipidome analysis of polar and nonpolar retina lipids. Journal of Lipid Research. 55 (8), 1797-1809 (2014).
  36. Bowden, J. A., Bangma, J. T., Kucklick, J. R. Development of an automated multi-injection shotgun lipidomics approach using a triple quadrupole mass spectrometer. Lipids. 49 (6), 609-619 (2014).
  37. Haimi, P., Uphoff, A., Hermansson, M., Somerharju, P. Software tools for analysis of mass spectrometric lipidome data. Analytical Chemistry. 78 (24), 8324-8331 (2006).
  38. Hewelt-Belka, W., et al. Comprehensive methodology for Staphylococcus aureus lipidomics by liquid chromatography and quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1362, 62-74 (2014).
  39. Jolivet, P., Boulard, C., Beaumal, V., Chardot, T., Anton, M. Protein components of low-density lipoproteins purified from hen egg yolk. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (12), 4424-4429 (2006).
  40. Bylesjö, M., et al. OPLS discriminant analysis: combining the strengths of PLS-DA and SIMCA classification. Journal of Chemometrics. 20 (8-10), 341-351 (2006).
  41. Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Progress in Lipid Research. 29 (2), 107-140 (1990).
  42. Cherian, G., Holsonbake, T. B., Goeger, M. P. Fatty acid composition and egg components of specialty eggs. Poultry Science. 81 (1), 30-33 (2002).
  43. Parsons, J. B., Frank, M. W., Rosch, J. W., Rock, C. O. Staphylococcus aureus Fatty Acid Auxotrophs Do Not Proliferate in Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (11), 5729-5732 (2013).
  44. Sen, S., et al. Growth-Environment Dependent Modulation of Staphylococcus aureus Branched-Chain to Straight-Chain Fatty Acid Ratio and Incorporation of Unsaturated Fatty Acids. PLoS One. 11 (10), e0165300 (2016).
  45. Wang, M., Huang, Y., Han, X. Accurate mass searching of individual lipid species candidates from high-resolution mass spectra for shotgun lipidomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 28 (20), 2201-2210 (2014).
  46. Peti, A. P. F., Locachevic, G. A., Prado, M. K. B., de Moraes, L. A. B., Faccioli, L. H. High-resolution multiple reaction monitoring method for quantification of steroidal hormones in plasma. Journal of Mass Spectrometry. 53 (5), 423-431 (2018).
  47. Neves, M. M., Heneine, L. G. D., Henry, M. Cryoprotection effectiveness of low concentrations of natural and lyophilized LDL (low density lipoproteins) on canine spermatozoa. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaria e Zootecnia. 66 (3), 769-777 (2014).
  48. Liu, P. V., Hsieh, H. C. Inhibition of Protease Production of Various Bacteria by Ammonium Salts - Its Effect on Toxin Production and Virulence. Journal of Bacteriology. 99 (2), 406 (1969).
  49. Suller, M. T., Russell, A. D. Triclosan and antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 46 (1), 11-18 (2000).
  50. Yao, C. H., Liu, G. Y., Yang, K., Gross, R. W., Patti, G. J. Inaccurate quantitation of palmitate in metabolomics and isotope tracer studies due to plastics. Metabolomics. 12, (2016).

Tags

Biokemi Staphylococcus aureus fedtsyre lipoprotein massespektrometri phospholipid æggeblomme lipidomics
Isolering af lipoprotein partikler fra hønseæg æggeblomme til undersøgelse af bakteriel Patogenchlorid fedtsyre inkorporering i membran Fosfolipids
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Delekta, P. C., Lydic, T. A.,… More

Delekta, P. C., Lydic, T. A., Hammer, N. D. Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids. J. Vis. Exp. (147), e59538, doi:10.3791/59538 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter