Summary
אנו מציגים גישה כדי לטהר את הריבוכמה מאוגד-mRNA מתאי כלי הדם (ECs) ישירות במוח העכבר, הריאות ורקמות הלב באמצעות התגית הגנטית ספציפית EC של חלבון פלואורסצנטית ירוק משופר (EGFP) ב ריבוזומים בשילוב עם טיהור RNA .
Abstract
מחקרים רבים הוגבלה להשתמש באספלי הסלולר מבחנה ורקמות שלמות או בידוד של סוגי תאים ספציפיים מבעלי חיים עבור ניתוח מבחנה של טרנס וביטוי גנטי על ידי qPCR ו-RNA רצפי. ביטוי מקיף לניתוח והבעה גנים של סוגי תאים ספציפיים ברקמות מורכבות ואיברים יהיה קריטי להבין מנגנונים סלולריים ומולקולריים שבהם גנים מוסדרים והקשר שלהם עם הומאוסטזיס רקמות ואיבר פונקציות. במאמר זה, אנו מדגימים את המתודולוגיה עבור בידוד של הריבוכמה-RNA מאוגד ישירות בvivo ב אנדותאליה כלי הדם של הריאות בעלי חיים כדוגמה. החומרים וההליכים הספציפיים לעיבוד רקמות ו-RNA טיהור יהיה מתואר, כולל הערכה של איכות RNA ותשואה כמו גם qPCR בזמן אמת עבור גן העורקים העורקי. גישה זו, המכונה תרגום ריבוכמה אהדה (מלכודת) הטכניקה, יכול להיות מנוצל לאפיון של ביטוי גנים וניתוח הטרנססקריפט של סוגי תאים מסוימים ישירות בvivo בכל סוג ספציפי ברקמות מורכבות.
Introduction
ברקמות מורכבות כגון מוח היונקים, הלב והריאות, הרמות הגבוהות של טרוגניות הסלולר מסבכים את הניתוח של נתוני ביטוי הגנים הנגזרים מדגימות שלמות של רקמות. כדי להתבונן בפרופילי גנים ביטוי סוג תא מסוים ב vivo, מתודולוגיה חדשה פותחה לאחרונה, אשר מאפשר את החקירה של משלים mRNA המתורגם כולו של כל סוג תא מוגדר גנטית. מתודולוגיה זו ידועה בתור הריבוקכמה הזיקה לטיהור (מלכודת) בטכניקה1,2. זהו כלי שימושי לחקור ביולוגיה של תא אנדותל ואנגיוגנזה כאשר משולבים עם גנטית מניפולציה של גנים אחרים הקשורים לאנגיוגנזה בבעלי חיים.
הצגנו את העובדה ש-אנגיוגנטי pkd-1 מאותת ותמלול הCD36 של גנים מבוססי-אנגיוגנטית הם קריטיים עבור תא אנדותל (EC) בידול ואנגיוגנזה פונקציונלי3,4,5,6. כדי לקבוע מנגנונים מולקולריים של אנגיוגנטי ו איתות מטבולית בתמלול הגנים ובידול EC, יצרנו מהונדסים גנטית עכברים מלכודת עם גנים שנמחקו במיוחד אנגיוגנטי על בסיס של טכניקה מלכודת1 , 2. יתר על כן, בחיות המלכודת שלנו, לא רק שיש להם pkd-1 או cd36 gene חוסר בכלי הדם אנדותאליה או מחיקה גלובלית של cd36 gene, אבל חלבון משופר ירוק פלואורסצנטית (egfp) הוא גם מתויג גנטית על . EC מתרגם ריבוזומים המלכודת מאפשרת טיהור של אהדה של הריבוכמה מאוגד-mRNA ישירות מתוך כלי הדם של רקמות ממוקדות, המאפשר ניתוח של ביטוי גנים זיהוי של הטרנססקריפט החדש הקשורים בידול EC ו אנגיוגנזה ישירות תחת התנאים vivo. בנינו בהצלחה RNA ריבוכמה מאוגד מתוך אנדותליה בבעלי חיים אלה מהונדסים גנטית. ה-RNA הטהור יכול לשמש לאפיון נוסף של גנים של אנגיוגנטי או הריוגניים בוויסות הבידול והפונקציות של EC. פרוטוקול זה מספק מדריך צעד אחר צעד כדי ליישם את גישת המלכודת לבידוד של mRNA ב-ECs ישירות ב-vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
עבור ניסויים בבעלי חיים, כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשימוש במכללה הרפואית של ויסקונסין.
1. הכן ריאגנטים
- הכנת מאגר לפירוק לריכוזים של 10 מ"מ HEPES, pH 7.4, 150 mM KCl, 5 מ"מ MgCl2, 0.5 מ"מ dtt, 100 Mg/mL cycloheximide מעכבי פרוטאז, ו רקומביננטי RNase מעכבי לריכוזים כפי שמתואר להלן.
- הוסף ריאגנטים הבאים כדי 500 מ ל של RNase-חופשי מים מוכי: 1.19 g של HEPES, 5.59 g של KCl, 0.24 g של MgCl2, 35 MG של dtt, 0.5 mL של cycloheximide ו naoh לפי הצורך עד pH 7.4, edta-מעכבי פרוטאז חינם (מיני לוח אחד לכל 10 mL) ו-RNase מעכבי (1 0 μL/mL).
- חנות במקרר של 4 ° c עד חודש אחד.
- להכין הרבה מלח גבוה polysome מאגר לשטוף לריכוזים של 10 מ"מ HEPES, pH 7.4, 350 mM KCl, 5 מ"מ MgCl2, 1% vol/vol CA-630, 0.5 MM dtt, ו 100 Mg/mL cycloheximide.
- הוסף ריאגנטים הבאים כדי 500 mL של RNase-חינם מים מאוהים: 1.19 g של HEPES, 13.05 g של KCl, 0.24 g של MgCl2, 5 מ ל של nonionic, ללא הסרת כביסה, 5 של 7.7 mg צינורות של dtt, ו 0.5 mL של cycloheximide ו naoh לפי הצורך עד pH 7.4
- חנות במקרר של 4 ° c עד חודש אחד.
- אגד נוגדן אנטי-GFP לחרוזים מגנטיים של חלבון G לפני תחילת הניסוי.
- הוסף 10 מ"ג של נוגדן anti-GFP מדולל ב 200 mL של PBS ל-G חרוזי חלבון.
- מודטה עם סיום הסיבוב בסוף 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- הניחו את החרוזים על מתלה מגנטי והסירו את הסופרנטאנט.
- השהה את החרוזים ב-200 mL של PBS ואחסן במקרר של 4 ° c עד שבוע אחד.
- הכינו את הקרח קר PBS עם 100 mg/mL cycloheximide.
- להוסיף נפח 1 של פתרון cycloheximide (100 mg/mL) כדי 99 כרכים של קרח קר PBS.
2. לבודד לlyse הרקמות הרצויות
- המתת חסד על ידי הזרקת IP של קטמין (500 mg/ק"ג/משקל הגוף) ו xylazine (10 מ"ג/ק"ג/משקל הגוף) ולבודד את הרקמות הרצויות (כלומר, הלב, הריאות). המשך מיד לשלב הבא.
- מניחים את הרקמות הרצויות לתוך 500 mL של הקרח קר PBS עם 100 mg/mL לבין.
- האוהב רקמות לתוך הבולם הנייד עם מנוע מונחה מוטורי או הומוגניצר זכוכית בעלת סיווג קטן. אם באמצעות מנוע הומוגניצר ממונע, להגביל את המגון לפחות 1 דקה בתדר נמוך (< 15000 Hz) כדי למנוע את ה-RNA דנטורציה.
- להשעות את הגלולה תא ב 200 mL של מאגר לליזה ידי ליטוף ולצייר מחדש את המאגר מספר פעמים. עוד המגון להתאים הבולם התא עם 10 משיכות הומוגניצר זכוכית בעלת סיווג קטן או עבור 15 שניות בתדר נמוך (< 15000 Hz) ב הומוגניצר מנוע מונחה.
- צנטריפוגה הומוטים עבור 10 דקות ב 2,000 x g ב 4 ° c כדי גרעיני גלולה ופסולת תא גדול, ולשמור על supernatant.
- הוסף nonionic, ללא הדדקות ניקוי כדי 1% vol/vol ו DHPC ל 30 מ"מ כדי supernatant. מודקון על הקרח עבור 5 דקות.
- צנטריפוגה ליפוסט עבור 10 דקות ב 16,000 x g כדי החומר גלולה מסיסים. העבר ושמור 15% של ליפוסט ברור כקלט עבור שלבים עתידיים.
3. בודד מכלולי ריבוחלק/mRNA
- הוסף 50 mL של חרוזים מאוגד נוגדן לתא-ליפוסט supernatant ו-דגירה התערובת ב 4 ° צ' עם סיבוב מעבר לקצה עבור 30 דקות. זה המקום שבו נוגדנים anti-GFP יהיה לאגד את הריבוזומים GFP מתויג, המאפשר לנו לבודד את ה-RNA מן הריבוזומים אלה.
- לאסוף חרוזים על מתלה מגנטי ולשטוף 5 פעמים עם רב מלח polysome מאגר לשטוף.
- לצייר ולמחוק נוזל פעם חרוזים נאספו בצד של הצינור. ואז לנקות את הצנרת 200 מ ל של מאגר כביסה של המלח גבוהה מספר פעמים. חזור על שלב זה 5 פעמים והשמט את כל המאגר לאחר החזרה הסופית. המשך מיד לשלב הבא.
4. לבודד את mRNA
- מניחים חרוזים במאגר RLT. השלבים הבאים נלקחים ישירות מפרוטוקול מיני ערכת RNeasy ולא הורחב בכל דרך.
התראה: RLT מאגר מכיל מלחי גואנידין; אין לערבב עם אקונומיקה. - צנטריפוגה למטה עבור 3 דקות במהירות מלאה 13,000 rpm או 16,000 g ב 4 ° c. הסר בזהירות את סופרנטאנט של 350 mL על ידי ליטוף ולהעביר אותו צינור microfuge חדש. השתמש רק על הסופרנט (ליפוסט) בשלבים הבאים.
- הוסף נפח שווה של 70% אתנול לתוך צינור microfuge.
- העבר עד 700 mL של המדגם, כולל מזרז שעשוי להיווצר, לטור ספין הממוקם בצינור אוסף של 2 מ ל. סגור את המכסה בעדינות ואת צנטריפוגה עבור 15 s ב ≥ 8,000 x g כדי לשטוף את קרום טור ספין. התעלם מהזרימה.
- הוסף 350 mL של מאגר RW1 לעמודת הספין. סגור את המכסה בעדינות ואת צנטריפוגה עבור 15 s ב ≥ 8,000 x g כדי לשטוף את קרום טור ספין. השמט את הזרימה והשתמש שוב בשפופרת האוסף בשלב הבא.
התראה: מאגר RW1 מכיל מלחי גואנידין; אין לערבב עם אקונומיקה. - הוסף 350 mL של מאגר RW1 לעמודת הספין. סגור את המכסה בעדינות ואת צנטריפוגה עבור 15 s ב ≥ 8,000 x g. התעלם מהזרימה.
- הוסף 500 mL של מאגר RPE לעמודת הטווח. סגור את המכסה בעדינות ואת צנטריפוגה עבור 15 s ב ≥ 8,000 x g כדי לשטוף את קרום טור ספין. התעלם מהזרימה.
- הוסף 500 mL של מאגר RPE לעמודת הטווח. סגור את המכסה בעדינות ואת צנטריפוגה עבור 2 דקות ב ≥ 8,000 x g כדי לשטוף את קרום טור ספין. לאחר מכן הסר בזהירות את עמודת הספין מצינור האיסוף, וודא שהעמודה אינה מפנה לזרימה.
- מקם את עמודת הספין בצינור אוסף חדש של 2 מ ל והשמט את השפופרת הישנה עם הזרימה. סגור את המכסה בעדינות וצנטריפוגה במהירות מלאה עבור 1 דקות כדי להסיר מאגר שיורית.
- מקם את עמודת הספין בשפופרת אוסף חדשה של 1.5 mL. הוסף 30-50 מ ל של RNase-מים חינם ישירות קרום טור ספין. סגור את המכסה בעדינות ואת צנטריפוגה עבור 1 דקות ב ≥ 8,000 x g כדי ELUTE RNA.
- אם צפוי תשואה RNA הוא > 30 מ"ג, חזור על שלב 4.10 עם עוד 30-50 mL של מים חינם RNase, או באמצעות elute משלב 4.10 (אם הוא גבוה [RNA] נדרש). שימוש חוזר בצינור הגבייה משלב 4.10.
- השתמש ב-RNA מטוהרים עבור ניתוח במורד הזרם כולל RNA-רצפי או בזמן אמת כמותי PCR או לאחסן RNA מומס RNase-H ללא תשלום2O ב-80 ° c עבור עד 1 שנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המחקרים הקודמים שלנו4,7 מראים כי CD36 עשוי לתפקד כבורר עבור arteriolar הבדלה והעורקי נימי באמצעות lpa/pkd-1 מסלול איתות. כדי ללמוד אם הציר LPA/PKD-1-CD36 איתות חיוני עבור הריוגנזה ב vivo, הקמנו את הספר שורות המלכודת כי לא רק מחסור בCD36 הכללית או אנדותל ספציפי, CD36 או pkd-1-מחסור, אלא גם לאפשר בידוד סלקטיבי של רנ א מאוגד-RNA מן היצור-מסומן בתאי תאים באמצעות GFP, ושימושיים ככתבת פלורסנט מופעלת-יצורים2.
על-ידי ביצוע ה-גנוטיפים, הבחנו כי גן cd36 נמחק באופן גלובלי או באמצעות כלי דם אנדותאליה ספציפי לאנדותל cd36 מסוימים עכברים (נתונים לא מוצגים), ו pkd-1 גן נמחק גם ב אנדותאליה כלי הדם. איור 1 הוא תוצאה מייצגת המציגה את קו העכבר הcd36 הגלובלי הנוצר ממלכודת או מלכודת pkd-1. באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence הדגמנו כי GFP משופרת הוא מתויג גנטית על הריבוזומים של תאי האנדותל בvivo (איור 2). לאחר מכן בודדנו הריבוכמה מאוגד mRNA ישירות ב vivo בהצלחה השיגה RNA איכות כפי שמוצג על ידי מדידה של היחס של 260 ננומטר ו 230 nm (איור 3). ניתוח נוסף באמצעות qPCR בזמן אמת הראה כי הביטוי של גנים מסוימים הריוגניים היו upregulated הריאה אנדותליה של cd36 null עכברים (איור 4), המציין כי RNA מבודדים ישירות בvivo של כלי הדם אנדותאליה באמצעות המלכודת טכנולוגיה מוסמכת ללימודי במורד הזרם. מחקרים אלה כוללים ניתוח של ביטוי גנטי ברמות mRNA וזיהוי של הטרנססקריפט הרומן בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים, אשר חיוניים להבנת הוויסות של בידול תא כלי דם אנדותל ואנגיוגנזה פונקציונלי.
איור 1: דוגמה של הגנוטיפים עבור עכברים מלכודות מהונדסים גנטית. תוצאות הנציג של הגנוזה של כללי cd36 null של עכברים השמנה או רקמת מותנה ספציפיים לרקמות pkd-1 null עכברים. העכברים הטרנסגניים של Vec- הrecombinase לבטא את היצור מתחת לשליטה של יזם Cdh5 B6; 129-Tg (Cdh5-יצור) 1Spe/J עכברים היו לחם עם B 6.129 S4-Gt (רוזה) 26Sor tm1(הקאג-egfp/Rpl10a,-בירה) wtp/j, ועוד עם b 6.129 s1tm1Mfe-cd36 /j או pkd-1loxp/loxp. כפול המוטציה cd36 Trap (A) ו PKD-1 השמנה (ב) עכברים הושגו, שבו gfp משופרת הוא מתויג אל L10a של הריבוחלק בתאי כלי דם אנדותל, ו cd36 gene נמחק באופן גלובלי ו pkd-1 גן במיוחד בתוך כלי הדם אנדותליה. זנבות עכבר נאספו עבור הפקת DNA באמצעות ערכת ומבוסס על ההוראה מן היצרן, ו-DNA בכל הדגימות היה מוגבר על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR), ולאחר מכן הוערך על ידי 1-2% agarose-ג'ל אלקטרופורזה. תמונות הן התמונה ג'ל agarose מראה את התוצאות של הגברה של cd36 או pkd-1 מוטציות עם/בלי השמנה או סוג פראי (WT) עכברים. גנוטיפ של העכבר הפאנל A: ליין 1, cd36-/-; השמנה+/-; ליין 2, השמנה+/+; ליין 3, cd36-/-; השמנה+/+; Cdh5+/-; ליין 4, השמנה+/+; Cdh5+/-; ליין 5, cd36-/-; השמנה+/+; Cdh5+/-; ליין 6, cd36-/-; השמנה+/-; Cdh5+/-; ליין 7, השמנה+/+; Cdh5+/-; ליין 8, השמנה+/-; . ליין 9, סולם דנ א גנוטיפ עכבר פאנל B: ליין 1, pkd-1fl/-; השמנה+/-; Cdh5+/-; ליין 2, pkd-1fl/fl; השמנה+/+; Cdh5+/-; ליין 3, pkd-1fl/-; השמנה +/+; ליין 4, pkd-1fl/fl; השמנה +/+; Cdh5+/-; ליין 5, pkd-1fl/fl; השמנה+/+; Cdh5+/-; ליין 6, pkd-1fl/-; . ליין 7, סולם דנ א אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: דוגמה לביטוי GFP ספציפי משופר באמצעות שיפור במיקרוסקופ פלואורסצנטית. כלי דם אנדותליה ברקמות הריאות של תקליטור36 מלכודת הסתרה עכברים היו egfp חיובי (צבע ירוק, הפאנל העליון) תחת מיקרוסקופ immunofluorescence. חסר נוגדן GFP העיקרי שימש שליטה שלילית (הפאנל התחתון). רקמות העכבר היו שיתוף מוכתם באמצעות נוגדנים GFP ו CD31 עם נוגדנים משניים המתאים פלואורסצנטית (צבע אדום). תמונות מייצגות שנרכשו באמצעות מערכת הדמיה מיקרוסקופית פלואורסצנטית. בר = 200 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: האיכות והכמות של mRNA המאוגד מאוגד של תאים אנדותל מטוהרים ומופק ישירות מרקמות של עכברים מלכודת. דוגמה לאיכות וריכוז של רנ א מטוהרים מרקמות הריאות ב cd36 להפיל את העכבר המלכודת. ספקטרוסקופיה שימש להערכת כמות וטוהר של RNA שחולצו. כפי שמוצג באיור זה, הריכוז של RNA הוא 51.2 ng/μL. היחס של ספיגת ב260 nm ו 280 nm הוא 1.87 ואילו היחס של 260 nm ו-230 nm הוא 2.40, המציין את הטוהר של דגימות ה-RNA שחולצו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: דוגמה של ביטוי של גנים אנגיוגנטיים ומדרגה ברנ א של הריבוחלק-RNA של תאי האנדותל בזמן אמת של qPCR assays. Mrna מבודדת מן הריבותל האנדוקכמה של הריאה בפקד trap ו-EC ספציפי cd36 מלכודות עכברים היה נתון qpcr בזמן אמת, באמצעות תחל לרכוש מחברת ביוטכנולוגיה כולל Hey2, אפרם B2, דלתא כמו ליגנד 4 (DLL4). הבית שמירה על הגנים PPIA שימש לנורמליזציה. מבחן ה- tהסטודנט שימש לניתוח סטטיסטי. *P < 0.05; * *P < 0.01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנגיוגנזה הוא תהליך רב-שלבים מורכב, בו תמלול וביטוי של גנים בעלי מפרט EC-אנגיוגנטי ממלאים תפקיד חיוני ב-EC בידול ו-אנגיוגנטי מתכנות3,4. כדי להתגבר על המחסומים מן הגיוון הסלולר והמורכבות האדריכלית להבנת טוב יותר את התפקוד של מערכת כלי הדם של היונקים ברמה המולקולרית ב-vivo, יצרנו את העכברים הספציפיים ל-EC, המלווים בcd36-EC ספציפי , EC-ספציפי pkd-1 מחסור או הכללית cd36 מחסור באמצעות מודל רב תכליתי מלכודת העכבר או egfp-השמנה שנוצר במעבדה פו2 בשילוב עם קווי עכבר אחרים מהונדסים גנטית. זה יאפשר את הבדיקה של ההשלמה mRNA מתורגם כולו של ECs כלי דם מרקמות שלמות ב vivo תחת EC ספציפי ב pkd-1 או הכללית מחסור ב cd36 gene ביטוי8, אשר קריטי לחקירה לתוך תעתיק גנטי הקשור לאנגיוגנזה הפיזיולוגי והפתולוגי4,7,9,10. עקבי למחקרים אחרים1,2, הגישה שלנו לבידוד mrna ספציפי אינו זקוק לקיבוע רקמות, דיסוציאציה של רקמות, או בידוד של תאים בודדים מרקמות וכך מונע את החפצים הפוטנציאליים ש תוצאה מטיפולים אלה. היינו גם מסוגלים לבצע את הפורינות מלכודת ולחלץ באיכות הריבוכמה-מאוגד-mRNA מן הרקמות הקפואות. בנוסף, מה היה מטוהר הוא תוכן mRNA מתורגם של ECs ישירות ב vivo, אשר יהיה טוב יותר לייצג את תוכן החלבון בהשוואה לשימוש RNA הכולל עבור פרופיל ביטוי גנטי. יתר על כן, המלכודת החוצה גנטית מתייג את ECs עם EGFP, גם מאפשר לא רק לחילוץ של הריבוחלק מאוגד mRNA אלא גם עבור הדמיה במחקרים אימונוהיסטוכימיה או אלקטרופיזיולוגיה.
עם זאת, הגישה הראה התשואות נמוכות של RNA, במיוחד עם mRNA מטוהרים מרקמות הלב או מרקמות קפואות בעבר. לכן אנו צריכים למטב את התנאים כדי להגדיל את התשואות. עם זאת, הבחנו בעכברים cd36 חסרים EC-ספציפי, רמות של אפרם B2 ו DLL4 גדלו באופן משמעותי בשתי הריאות (איור 4) ואת הלב (נתונים לא מוצגים) אנדותאליה כאשר לעומת השליטה. תוצאות אלה היו עקביים עם הקודם שלנו במחקרים מבחנה3,4, אשר מציע כי איכות RNA מספיקה לניתוח במורד הזרם. התשואה נמוכה ככל הנראה עקב התנאים המחמירים. כדי להתגבר על מגבלה זו ולשפר את התשואה, זה קריטי כדי להגדיר אזור עבודה בחינם RNase ו טהרים משטחי עבודה וציוד שעשוי לקבל מזוהם עם RNase ולשנות כפפות לעתים קרובות כדי לחלץ איכות RNA. זה גם קריטי למצוא ריכוזים מתאימים של נוגדנים GFP במטריקס זיקה ולהשתמש בריכוזים מתאים של מעכב RNase במאגר לפירוק רקמות. שימוש RNase-כלי פלסטיק חינם וריאגנטים מועיל לחילוץ RNA מ הריבוזומים אנדותל של רקמות ממוקדות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין להם ניגוד אינטרסים.
Acknowledgments
עבודתו של ד ר רן נתמכת על ידי איגוד הלב האמריקני (13SDG14800019; BR), קרן התקווה של אן (FP00011709; BR), האגודה האמריקנית לסרטן (86-004-26; מרכז הסרטן MCW ל BR), ואת המכון הלאומי לבריאות (HL136423; BR); ירדן פאלמר נתמך על ידי 2018 MCW CTSI 500 תוכנית ההתמחות כוכבים; פ. מורן נתמך על ידי מענק להכשרת מחקר מוסדיים מ-NHLBI (5T35 HL072483-34).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips | Agilent | G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513 | |
| Cell scrapers | Sarstedt | 83.1832 | |
| Homogenizers | Fisher Scientific | K8855100020 | |
| Magnet (Dynamag-2) | Invitrogen | 123-21D | Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2 |
| Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| NanoDrop 2000C spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5430R | with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes |
| RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes | Applied Biosystems | AM12450 | |
| Rnase-free 50-mL conical tubes | Applied Biosystems | AM12501 | |
| RNase-free 1000-μl filter tips | Rainin | RT-1000F | |
| RNase-free 200-μl filter tips | Rainin | RT-200F | |
| RNase-free 20-μl filter tips | Rainin | RT-20F | |
| Rotor for homogenizers | Yamato | LT-400D | |
| Tube rotator, Labquake brand | Thermo Fisher | 13-687-12Q |
References
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).
- Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
- Best, B., Moran, P., Ren, B. VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan. Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).
- Ren, B., et al. LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming. Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).
- Ren, B. Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37 (2016).
- Ren, B. FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis? Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).
- Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model. Nucleic Acids Research. 42, e14 (2014).
- Dong, L., et al. Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling. Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).
- Ren, B., et al. ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).
- Skuli, N., et al. Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes. Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).
