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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Aislamiento de células mononucleares lamina Propria de Colon Murino usando colagenasa E

Published: September 26, 2019 doi: 10.3791/59821
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4,5
1Department of Pediatrics, Division of Hematology / Oncology and Bone Marrow Transplantation, University of Miami Miller School of Medicine, 2Batchelor Children's Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 3Department of Microbiology & Immunology, University of Miami Miller School of Medicine, 4Sylvester Comprehensive Cancer Center, University of Miami Miller School of Medicine, 5Holtz Children's Hospital, University of Miami Miller School of Medicine

Summary

El objetivo de este protocolo es aislar las células mononucleares que residen en la lámina propria del colon mediante la digestión enzimática del tejido utilizando la colagenasa. Este protocolo permite el aislamiento eficiente de las células mononucleares, lo que resulta en una suspensión de una sola célula que, a su vez, se puede utilizar para un inmunofenotipado robusto.

Abstract

El intestino es el hogar del mayor número de células inmunitarias en el cuerpo. Los sistemas inmunitarios intestinales pequeños y grandes controlan la exposición a antígenos exógenos y modulan las respuestas a potentes estímulos inmunes derivados microbianamente. Por esta razón, el intestino es un sitio objetivo importante de la desregulación inmune y la inflamación en muchas enfermedades, incluyendo pero, no limitado a enfermedades inflamatorias intestinales como la enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, enfermedad injerto-versus-huésped (GVHD) después de hueso hueso trasplante de médula (BMT), y muchas afecciones alérgicas e infecciosas. Los modelos murinos de inflamación gastrointestinal y colitis se utilizan en gran medida para estudiar las complicaciones gastrointestinales y para optimizar previamente las estrategias para la prevención y el tratamiento. Los datos obtenidos de estos modelos a través del aislamiento y el análisis fenotípico de las células inmunitarias del intestino son fundamentales para una mayor comprensión inmune que se puede aplicar para mejorar los trastornos inflamatorios gastrointestinales y sistémicos. Este informe describe un protocolo altamente eficaz para el aislamiento de células mononucleares (MNC) del colon utilizando una interfaz de gradiente de densidad basada en sílice mixta. Este método aísla reproduciblemente a un número significativo de leucocitos viables al tiempo que minimiza los desechos contaminantes, permitiendo el fenotipado inmune posterior por citometría de flujo u otros métodos.

Introduction

Aunque el tracto gastrointestinal (GI) se dedica principalmente al procesamiento y reabsorción de nutrientes de los alimentos, el tracto gastrointestinal también mantiene roles centrales en la integridad de los sistemas vascular, linfático y nervioso y de numerosos otros órganos a través de su sistema inmunológico mucoso y submucoso1. El sistema inmunitario GASTROINTESTINAL tiene un papel influyente en la salud gastrointestinal y sistémica debido a su exposición constante a antígenos extraños de alimentos, bacterias comensales o patógenos invasores1,2. Por lo tanto, el sistema inmunitario GI debe mantener un delicado equilibrio en el que tolera antígenos no patógenos, respondiendo adecuadamente a los antígenos patógenos1,2. Cuando se interrumpe el equilibrio de tolerancia y defensa, se puede localizar o sistémicamente la desregulación inmune y la inflamación, lo que resulta en una miríada de enfermedades1,2,3.

El intestino alberga al menos el 70% de todas las células linfoides del cuerpo4. La mayoría de las interacciones inmunológicas primarias involucran al menos una de las tres estaciones inmunitarias en el intestino: 1) Parches de Peyer, 2) linfocitos intraepiteliales (IEL) y 3) linfocitos de lamina propria (LPL). Cada uno de ellos se compone de una compleja red interconectada de células inmunitarias que responden rápidamente a los desafíos inmunes normales en el intestino5. Restringida al estroma por encima de las mucosas musculares, la lámina propria de estructura suelta es el tejido conectivo de la mucosa intestinal e incluye andamios para la vellosidad, la vasculatura, el drenaje linfático y el sistema nervioso de la mucosa, así como muchos innatos y subconjuntos inmunes adaptativos6,7,8,9. LPL se componen de células CD4+ y CD8+ T en una proporción aproximada de 2:1, células plasmáticas y células de linaje mieloides incluyendo, células dendríticas, células de mástil, eosinófilos y macrófagos6.

Hay un creciente interés en entender la desregulación inmune y la inflamación del intestino, ya que se refiere a varios estados de la enfermedad. Tales condiciones como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa todos manifiestan diferentes niveles de inflamación del colon10,11,12. Además, los pacientes con trastornos malignos o no malignos de la médula o del sistema inmunitario que se someten a un trasplante alogénico de médula ósea (alo-BMT) pueden desarrollar diversas formas de colitis, incluyendo 1) toxicidad directa por regímenes de acondicionamiento antes de BMT, 2) infecciones causadas por inmunosupresión después de la Enfermedad contra huésped de injerto contra huésped (EICH) impulsadapor por células T de tipo donante reaccionando a los antígenos alógenos de donantes en los tejidos después de BMT13,14,15. Todas estas complicaciones post-BMT resultan en alteraciones significativas en el ambiente inmune de los intestinos16,17,18. El método propuesto permite una evaluación fiable de la acumulación de células inmunitarias en el colon del ratón y, cuando se aplica a los receptores murinos después de la BMT, facilita un ensayo eficiente de las células inmunitarias de los donantes y receptores implicadas en la tolerancia al trasplante19 ,20. Otras causas de inflamación intestinal incluyen neoplasias malignas, alergias alimentarias o alteración del microbioma intestinal. Este protocolo permite el acceso de células mononucleares intestinales desde el colon y, con modificaciones, a leucocitos del intestino delgado en cualquiera de estos modelos murinos preclínicos.

Una búsqueda de PubMed utilizando los términos de búsqueda "intestino y aislamiento de células inmunitarias Y" revela más de 200 publicaciones que describen métodos para la digestión del intestino delgado para extraer células inmunitarias. Sin embargo, una búsqueda de literatura similar para el colon no produce protocolos bien delineados que especifican el aislamiento de las células inmunitarias del colon. Esto puede deberse a que el colon tiene más capas musculares e intersticiales, lo que hace más difícil digerir completamente que el intestino delgado. A diferencia de los protocolos existentes, este protocolo utiliza específicamente la colagenasa E de Clostridium histolyticum sin otras colagenasas bacterianas (Collagenasa D/Collagenasa I). Demostramos que, utilizando este protocolo, se puede lograr la digestión del tejido colonico preservando la calidad de las células inmunitarias mononucleares intestinales aisladas (MNC) sin la adición de reactivos anti-aglutinantes como el alfrente de sodio (EDTA), Dispase II, y desoxirribonuclea I (DNAse I)21,22,23. Este protocolo está optimizado para permitir la extracción robusta reproducible de MNC viable del colon murino para estudios más dirigidos y debe prestarse al estudio de la inmunología del colon o (con modificaciones) del intestino delgado24, 25.

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Protocol

Todos los estudios se llevaron a cabo bajo protocolos de investigación de roedores revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Escuela de Medicina Miller de la Universidad de Miami, que cumple con los estándares veterinarios establecidos por la Asociación Americana para Ciencias Animales de Laboratorio (AALAS).

1. Preparación de soluciones

  1. Como se describe en la Tabla 1, prepare el búfer de colon, los medios de separación de densidad basados en sílice 100%, los medios de separación de densidad basados en sílice 66%, los medios de separación de densidad basados en sílice 44%, el búfer de digestión de colagenasa E y el búfer FACS.
    1. Preparar el búfer de colon el día anterior al procedimiento y conservar durante la noche a 4oC.
    2. Preparar los medios de separación de densidad 100% basados en sílice el día anterior al procedimiento y almacenarse durante la noche a 4 oC, colocando a temperatura ambiente la mañana del procedimiento para descongelar.
    3. Preparar medios de separación basados en sílice 66% y 44% en la mañana del aislamiento, utilizando la temperatura ambiente 100% Medios de Separación de Densidad Basados en Sílice y Tampón de Colon.
    4. Mida la cantidad adecuada de Colágenoasa E derivada de Clostridium histolyticumy guárdela a -20 oC durante la noche antes del procedimiento. A la mañana siguiente, disolver en el volumen adecuado de Tampón de Colon para derivar búfer de digestión de colagenasa. Para todas las incubaciones con búfer de digestión de la colagenasa el día del procedimiento, precaliente las soluciones a 37oC.
  2. Para la totalidad de los pasos del protocolo, mantenga una centrífuga a 20oC y la velocidad de rotación de 859 x g,con frenos desactivados (0 desaceleración) para centrifugación de gradiente. Fije otro a 4 oC y velocidad de rotación de 859 x g,con la desaceleración estándar, para los pasos de lavado.

2. Cosecha del Colón

  1. Euthanizar el ratón a través de la asfixia CO2 seguido de método de confirmación aprobado por AALAC.
  2. Coloque el ratón en posición supina y rocíe el pelaje con un 70% de etanol. Usando tijeras de tejido grandes, haga una incisión vertical de línea media y exponga el peritoneo intacto.
  3. Con tijeras de disección fina, abra el peritoneo. Utilice fórceps para mover el intestino delgado hacia un lado y exponer el colon descendente. Tire ligeramente hacia arriba sobre el colon descendente para exponer al máximo la porción rectal del colon. Corta el recto distal profundo en la pelvis y disecciona y extrae todo el colon como una unidad, desde el recto distal hasta la tapa cecal.
  4. Transfiera el colon en 20 ml de tampón de colon refrigerado en un tubo de polipropileno de 50 ml.

3. Limpieza del Colon

  1. Coloque el colon sobre una toalla de papel humedecida y extraiga las heces sólidas aplicando una presión suave en la pared intestinal con el extremo romo de las tijeras o fórceps.
  2. Coloque el colon en una placa De Petri y enjuague el intestino con 10 ml de tampón de colon refrigerado con una jeringa de 10 ml con aguja de relleno romo de 18 G.
  3. Transfiera el colon a una toalla de papel humedecida de Colon Buffer y retire el mesentery y la grasa con el extremo afilado de las tijeras.
  4. Coloque el colon en un plato de Petri lleno de 5-10 ml de tampón de colon refrigerado agitando manualmente para lavar el contenido colono restante. Repita 2-3 veces.
  5. Cortar el colon longitudinalmente desde su extremo rectal más musculoso hasta el colon proximal (generando una sola pieza rectangular de colon abierto) en una placa De Petri llena de tampón de colon fresco frío. Deseche los medios existentes y rellene con el búfer de colon frío limpio.
  6. Lave el intestino 3 veces arremolinando vigorosamente en el plato petri y reemplazando los 5-10 ml de tampón de colon refrigerado después de cada lavado.
  7. Coloque el tejido rectangular del colon en una toalla de papel humedecida con Tampón de Colon y córtelo cortándolo horizontalmente y luego en pequeños fragmentos (secciones de 3 mm x 3 mm).
  8. Recoja los fragmentos de colon cuidadosamente utilizando fórceps finos en 20 ml de tampón de colon refrigerado en un tubo cónico de polipropileno de 50ml.
  9. Lavar los fragmentos de colon 3 veces, cada lavado en 20 ml Tampón Tampón, girando vigorosamente el tubo durante 30 s. Entre cada agitación, permitir que los fragmentos de tejido se asienten en la parte inferior del tubo. Decantar o aspirar al vacío aspirar el sobrenadante mientras se evita la pérdida de fragmentos de tejido en el proceso de aspiración entre cada lavado.
    NOTA: No es necesario cambiar el tubo después de cada lavado.

4. Digestión de la colagenasa 1

  1. Añadir 20 ml del búfer de digestión de la colagenasa a los fragmentos de colon lavados en el tubo cónico de polipropileno de 50 ml.
  2. Colocar el tubo cerrado de 50 ml a 37 oC en un agitador orbital incubado con la velocidad de rotación fijada a 2 x g durante 60 minutos. Asegúrese de que los fragmentos de tejido estén en constante movimiento durante la agitación; si es necesario, aumente la tasa de rotación incrementalmente para asegurarse de que no hay fragmentos de tejido se asienten en la parte inferior del tubo.

5. Preparar gradientes de medios de separación basados en sílice

  1. Preparar medios de separación de densidad basados en sílice de 66% y 44%, utilizando medios de separación de densidad 100% basados en sílice a 20 oC (temperatura ambiente) y tampón de colon.
  2. Vierta 5 ml de 66% de medios de separación de densidad basados en sílice en cada uno de 3 tubos de polipropileno separados de 15 ml. Prepare 3 tubos por colon. Esto forma la base de mayor densidad del procedimiento de aislamiento de degradado, sobre la que se superpondrán los medios de separación de menor densidad para crear el degradado de separación.
  3. Conservar a 20oC hasta su uso.

6. Colección de sobrenadant de la digestión 1

  1. Recoger sólo el sobrenadante utilizando una pipeta serológica de 25 ml y filtrar el sobrenadante a través de un colador de células de tejido de filtración de poros de 40 m colocado en un tubo cónico de polipropileno limpio de 50 ml, después de que se complete la digestión de la colagenasa 1. Tenga cuidado de no aspirar ningún fragmento de tejido existente.
    NOTA: Conservar los fragmentos de tejido visible restantes en el tubo. Estos se someterán a una segunda digestión de la colagenasa (paso 8).

7. Tampón de digestión de colagenasa quebrado

  1. Llene completamente el tubo de polipropileno de 50 ml con Tampón de colon refrigerado.
    NOTA: La colagenasa está activa a 37 oC; por lo tanto, el tampón refrigerado inactiva esta enzima.
  2. Centrifugar el tubo a 4oC a 800 x g durante 5 min.
    1. Deseche el sobrenadante a través de la aspiración al vacío. Lavar las células con 25 ml de tampón de colon fresco y centrífuga a 800 x g durante 5 min.
    2. Resuspenda el pellet en menos de 1 ml de tampón de colon recién refrigerado.
    3. Coloque el tubo cónico de polipropileno de 50 ml sobre hielo.

8. Digestión de la colagenasa 2

  1. Repita el paso 4 (Digestion 1) con los fragmentos de tejido restantes retenidos del paso 6.1.

9. Desagregación de tejidos después de la digestión 2

  1. Enjuague los fragmentos de tejido vigorosamente hacia adelante y hacia atrás entre el tubo y una jeringa de 10 ml a través de una aguja de extremo romo de 18 G.
  2. Repita este lavado para un mínimo de 7-8 pasajes completos, continuando hasta que no haya fragmentos de tejido bruto o escombros visibles.

10. Filtrar células

  1. Pasar la suspensión de desagregación de tejido a través de un colador de células de tejido de filtración de poros de 40 m en un tubo de polipropileno limpio de 50 ml.
  2. Lave el colador de células de tejido de filtración con 10 ml de búfer de colon refrigerado para recuperar las células atrapadas en el filtro.

11. Quenching Collagenase Digestion

  1. Llene el tubo cónico de polipropileno de 50 ml hasta la llanta con Trompa de colon refrigerado.
    NOTA: La temperatura del tampón de colon es fundamental para garantizar el enfriamiento de la actividad de la colagenasa.
  2. Girar a 4 oC y 800 x g durante 5 min.
  3. Deseche el sobrenadante a través de la aspiración al vacío.
  4. Lavar por resuspender en 25 ml de tampón de colon reciénrefrigerado, seguido de centrifugación a 4 oC, 800 x g durante 5 min.
  5. Deseche el sobrenadante a través de la aspiración al vacío.
  6. Aunar el pellet resuspendido de la digestión de la colagenasa 1 (paso 7) a su tubo correspondiente del paso 11.4.
  7. Repita el paso 11.4 (lavado y centrifugación).

12. Separación de Gradientes de Medios de Separación de Densidad basados en Sílice

NOTA: Realice los pasos 12-18 lo más rápido posible, para asegurar un enfriamiento rápido de la actividad de la colagenasa.

  1. Siguiendo el paso 11.7, resuspende cada pellet en un total de 24 ml de medios de separación de densidad basados en sílice 44% por colon.
  2. Capa lenta de 8 ml del medio del paso 12.1 en cada uno de los tres tubos preparados en el paso 5.2 (que contiene 66% de medios de separación de densidad basados en sílice), utilizando una pipeta serológica de 10 ml. Mantenga un flujo constante y lento de los medios de separación de densidad del 44% mientras coloca en capas el gradiente para evitar la interrupción de la interfaz.
  3. Equilibre cuidadosamente todos los tubos dentro de los cubos de centrífuga utilizando una báscula de pesaje o una balanza.
  4. Girar los tubos 20 min a 859 x g en una centrífuga sin freno a 20 oC. Permita que los rotores vengan a descansar antes de retirar los tubos, teniendo cuidado de no interrumpir las células en la interfaz de gradiente.

13. Recoger células mononucleares de la interfaz de gradiente

  1. Visualice la interfaz de gradiente (cerca de la marca de 5 ml), donde normalmente está presente una banda blanca de 1-2 mm de espesor (que contiene MNC).
    NOTA: Uno puede o no ver una banda blanca. Sin embargo, MNC estará en esta interfaz y debería nublar la claridad de la interfaz de gradiente.
  2. Aspirar y descartar los 7 ml superiores del gradiente superior para facilitar el acceso de las pipetas a la interfaz.
  3. Usando la succión manual continua y el movimiento constante de la muñeca giratoria, recoja la capa de interfaz de las células en un tubo cónico de polipropileno limpio de 50 ml. Recoja hasta que la interfaz entre los 2 gradientes sea clara y refractada (clara de celdas).
  4. Llene el tubo de recogida con 50 ml de búfer FACS refrigerado. Girar a 4 oC, 800 x g durante 5 min.
  5. Aspirar el sobrenadante a través de aspiración al vacío y resuspender el pellet en 1 ml de FACS Buffer.
  6. Cuente las células en un hemocitómetro en una dilución 1:2 utilizando métodos de exclusión de células muertas apropiados.
  7. Proceda a la tinción FACS u otros ensayos con MNC colónico recién aislado.

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Representative Results

Cuando se trabaja con modelos de enfermedad de colon murino, es útil ser capaz de cuantificar y evaluar cualitativamente, entre el MNC del colon, múltiples subconjuntos de células inmunitarias implicados en el proceso inflamatorio. La suspensión de una sola célula de MNC obtenida a través de la aplicación de este protocolo facilita dicha caracterización fenotípica de una manera robusta y reproducible. Como prueba de principio para la aplicación de este método de aislamiento bajo diversos ajustes experimentales, recuperamos MNC colonic usando este método y realizamos citometría de flujo multiparámetro en células aisladas de ratones con(Figura 1 y Figura 2 , Alogénico BMT) y sin(Figura 2A, BMT singénico)lesión colónica significativa mediada por el sistema inmunitario después de BMT.

Se realizaron análisis de datos y citometría de flujo para comparar las fracciones de linfocitos muertos apoptóticos y necróticos cuando se utiliza la colagenasa E o D para el aislamiento, con o sin tratamiento con DNase 1. La estrategia de gating utilizada durante la citometría de flujo se proporciona en la Figura 1A.  Después de la tinción de Annexin V (marcador de apoptosis) y de colorazul vivo/muerto fijable (marcador de necrosis) en suspensiones de una sola célula después de cada aislamiento, la colagenasa E sin DNAse mostró un porcentaje significativamente mayor de Células vivas liveLive/Dead Blue neg (mediana 43,3%, rango 26,5%-59,9%, n a 3) después del aislamiento en comparación con la colagenasa D sin DNAse (mediana 8,7%,rango 3,6%-10,2%, n a 3), incluso en comparación con la colagenasa E + DNAse (mediana 8,18%, rango 4,7%-20,4%, n a 3) o Colagenasa D + DNAse (mediana 15,10%, rango 9,9%-21,4%, n a 3). Además, identificamos las células necróticas Annexin VnegLive/Dead Blue+ en un porcentaje medio del 41,0% en el grupo De la Colagenasa (rango 37,1%-58,8%, n a 3) frente al 90,0% en el grupo De de la Colagenasa (rango 69,7%-95,5%, n a 3), 75,9% en la Colagenasa E + DNAse y el 80,3% en el grupo de la Colagenasa D + DNAse, respectivamente (rango 65,7%-79,5%, rango 54,9%-89,9%, n a 3). Las gráficas representativas de FACS de n 1 animal en cada grupo se muestran en la Figura 1B).

Como prueba más del principio de la consistencia y el rendimiento de la MNC viable utilizando este procedimiento en ratones enfermos, la citometría de flujo multiparamétrico se aplicó al MNC aislado de ratones receptores DE CD45.2 BALB/c el día 7 después de recibir BMT de cualquiera de los alogénicos (CD45.1 C57BL/6 donante) o sinénico (donante CD45.1 BALB/c) BMT. Utilizando números MNC absolutos multiplicados por el porcentaje de subconjuntos inmunes cerrados obtenidos por análisis de citometría de flujo, se podrían calcular y comparar números absolutos medios de células CD4+ y CD8+ T del receptor de BMT (n. 4 por grupo, Figura 2A). Dado que puede ser importante identificar y/o cuantificar poblaciones de células inmunitarias raras en estos modelos de ratón, evaluamos subconjuntos raros, incluyendo células reguladoras derivadas de donantes (CD45.1+) células reguladoras Foxp3+ T (Treg) en modelos BMT singéricos y alogénicos. Se muestra la estrategia de gating para llegar a las células Treg del donante (CD4+CD25+FoxP3+) desde la suspensión de una sola célula manchada de anticuerpos (secuenciade puertas delineadas por una flecha roja; Figura 2B). Usando este método, incluso se pudieron analizar subconjuntos raros como Treg colonico derivado del donante infiltrando los dos puntos del ratón del receptor después de BMT(Figura 2C, gráfica representativa; n a 1).

La Figura 3 muestra una aplicación extendida de este método en los datos históricos de nuestro grupo utilizando el protocolo presentado para comparar la acumulación de CD8+ inductor de La EICH frente a las células T derivadas de donantes CD4+ en el colon de ratones BALB/c protegidos o no protegidos o no protegidos de la EICH por el régimen de preparativos de tratamiento pre-BMT (acondicionamiento)20. Los regímenes preparativos probados incluían 800 cGy/mieloablative total body irradiación (TBI800) o TBI no mieloablativo (400TBI), así como el acondicionamiento no mieloablativo utilizando irradiación linfoide total (TLI) en la que la irradiación se entregó a la linfa ganglios, timo y bazo con protección del cráneo, pulmones, extremidades, pelvis y cola. Todo el acondicionamiento se combinó con suero anti-timocitos (ATS), un agente inmunomodulador. Ya en el día 6 después de BMT, este protocolo colonico de aislamiento MNC dio lugar a análisis citométricos de flujo robustos en comparación con análisis idénticos en órganos diana de la EICH enriquecidos con linfocitos, como el bazo y los ganglios linfáticos mesentéricos (MLN)(Figura 3A)20 . El aislamiento reproducible de la MNC colónica entre los receptores de BMT (n a 7-10 por grupo de tratamiento) permitió una comparación estadística robusta del número absoluto de células T DEL donante CD8+ efector entre diferentes grupos de tratamiento de acondicionamiento previo al trasplante ( Figura 3B),produciendo datos importantes sobre fenotipos inmunes que llevaron a estudios clave que revelaron los mecanismos inmunes innatos de la protección de la EICH de TLI en comparación con el acondicionamiento previo a La TBI. 20

Figure 1
Figura 1: Análisis citométrico de flujo de MNC colonico en el día 7 después de BMT en sistemas de modelos de ratón alogénicos cuando se aísla con Colagenasa E y D con y sin DNAse 1. Ratones de tipo salvaje (WT) (CD45.2+) BALB/c (H2Kd+) recibieron BMT de CD45 congenic (CD45.1+) ratones donantes C57BL/6 (BMT alogénico, n a 3 por grupo). WT (CD45.2+) Los ratones receptores de BALB/c se administraron 800cGy TBI (BALB/c) 1 día antes de BMT. En el día 7 después de BMT, se prepararon suspensiones de una sola célula del colon receptor siguiendo los métodos de este manuscrito con el uso de Collagenase E (100 U/mL), Collagenase E (100 U/mL) con DNAse 1 (500 g/ml), Collagenase D (500 g/ml) o Collagenase D (500 g/ml) con DNAse 1 (500 g/ml) (n a 3 por grupo). Las células se tiñieron con Live/dead-UV450 (Live/Dead Blue), Annexin V-APC, H-2Kd-PE, CD45.1-BV605, CD3-FITC, CD4-BV711, CD8-APC-Cy7, FoxP3-Pacific Blue y CD11b-PE-Cy7. (A) Estrategia de ampliación para análisis FACS. Puerta 0, dispersión hacia delante (FSC-A) y dispersión lateral (SSC-A) en la suspensión de una sola célula de MNC utilizada para identificar leucocitos; Puerta 1, exclusión de células no individuales que utilizan SSC-A; Puerta 2, exclusión de células no individuales que utilicen FSC-A; Puerta 3, identificación de Anexo en V positivo (apoptotico) y tinte de viabilidad fijable Colorante Vivo/Muerto-UV450+Subgñentes de célulasD- negativo (necrótico). (B) Parcelas FACS representativas de Annexin V y tinción fijable de tinte de viabilidad de leucocitos cerrados entre MNC para los 4 grupos experimentales. N 1 ratón representativo por grupo en grupos: Colagenasa E (100 U/ml), Colagenasa E (100 U/ml) + DNAse 1 (500 g/mL), Colagenasa D (500 g/ml) y Colagenasa D (500 g/ml) + DNAse 1(500 g/ml). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Caracterización citométrica de flujo de MNC colonico en el día 7 después de BMT en sistemas de modelos de ratón alogénicos y sinémicos. WT (CD45.2+) C57BL/6 (H2Kd-neg) y BALB/c (H2Kd+) ratones recibidos BMT de CD45-congenic (CD45.1+) C57BL/6 y balB/c ratones donantes (BMT singéneo o alogénico, n a 4 por grupo experimental). Los ratones receptores C57BL/6 y BALB/c recibieron regímenes de acondicionamiento preparativo de 950cGy (C57BL/6) y 800cGy (BALB/c) TBI mieloablativo, entregados un día antes de BMT. En el día 7 después de BMT, se prepararon suspensiones de una sola célula del MNC colónico receptor siguiendo los métodos de este manuscrito. Las células se teñían con anticuerpos Live-dead-BV510, H-2Kd-PE, CD45.1-BV605, CD4-FITC, CD8-APC-Cy7, CD25-PacificBlue, FoxP3-AF647 y CD11b-PE-Cy7, N 4 ratones por grupo. (A) Media - Número absoluto SEM (log 10) CD45.1+ H-2kd-neg o CD45.1+ H-2kd+ (tipo donante, en cada caso) CD11bnegCD4+ y CD8+ T células aisladas del colon receptor en el día 7 después del acondicionamiento y CD45.1 C57BL/6 (donante) - CD45.2 BALB/c (receptor) BMT. N 4 por grupo. (B) Estrategia de ampliación para análisis FACS. Puerta 0, dispersión hacia delante (FSC-A) y dispersión lateral (SSC-A) en la suspensión de una sola célula de MNC utilizada para identificar leucocitos; Puerta 1, exclusión de células no individuales que utilizan SSC-A; Puerta 2, exclusión de células no individuales que utilicen FSC-A; Puerta 3, selección de celda sin vida Puerta 4, separación de células hematopoyéticas del donante BMT frente al origen del receptor de BMT; Puerta 5, selección de células de linaje no mieloides de donantes; Puerta 6, gating selectivo de células CD4+ T; Puerta 7, gating separado de las células reguladoras CD4+CD25+FoxP3+ T (Treg). La flecha roja denota estrategia de desglose. (C) Parcelas FACS representativas de la tinción CD25 y FoxP3 utilizando la estrategia de gating en (B) en el día 7 después del acondicionamiento y BMT en el colon de un receptor de BALB/c de BMT alogénico (C57BL/6 a BALB/c). El porcentaje de celdas en cada puerta se da dentro de la puerta. WT - tipo salvaje; TBI - irradiación total del cuerpo; BM a 10 x 106 CD45.1+ células congénicas de médula ósea del donante C57BL/6 o BALB/c; Teff - Células efector T; Treg - Células reguladoras Foxp3+ T. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: La acumulación de células TLI/ATS no mieloablativas TLI/ATS pero no TBI/ATS disminuye la acumulación de células T del donante TCR+CD8+ del efector. (A) Gráficas FACS representativas de la tinción CD4 y CD8 de H-2Kb+TCR+ células del donante H-2Kb+ C57BL/6 en bazo (fila superior), ganglio linfático mesentérico (MLN) (fila media) y colon (fila inferior) de los receptores en el día 6 después del acondicionamiento y trasplante. El porcentaje de celdas en cada puerta se da por encima de la puerta. (B) Media - Número absoluto SEM (log 10) H-2Kb+TCR+CD8+ células en bazo (panel superior), MLN (panel medio) y dos puntos (panel inferior) de los destinatarios en el día 6 después del acondicionamiento y BMT. WT - tipo salvaje; TBI - irradiación total del cuerpo; TLI: irradiación linfoide total; ATS - suero anti-timocitos; BM a 50 x 106 WT C57BL/6 células de médula ósea del donante; SPL a 60 x 106 WT C57BL/6 células del bazo del donante; TBI800, TBI400 a dosis cGy de mieloablativo (TBI800) o TBI no mieloablativo (TBI400). *Esta cifra ha sido modificada de van der Merwe et al.20. Copyright 2013. La Asociación Americana de Inmunólogos, Inc. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

Solución Fórmula
Búfer de colón 500 mL RPMI + 10mM HEPES + 10% FBS (inactivado por calor a 56oC durante 60 minutos, pH ajustado a 7.3)
Medios de gradiente de densidad basados en sílice 100% (por colon) 22,5 mL de medios de gradiente de densidad basados en sílice + 2,5 mL de 10PBS.
Medios de gradiente de densidad basados en sílice 66% (por colon) 10.72 mL Derrelleno de Densidad Basado en Sílice Medios 100% + 5.28 mL Tampón
Medios de gradiente de densidad basados en sílice 44% (por dos puntos) 11 mL Derrelleno de Densidad Basado en Sílice Medios 100% + 14 mL Tampón
Búfer de digestión de la colagenasa (por colon) 100 U/ml de Colagenasa E de Clostridium histolyticum,disuelto en tampón de colon de 40 ml
Zona de influencia FACS 500 mL 1x PBS + 5 g BSA + 1 mm EDTA + 0,2 g de azida sódica

Tabla 1: Tabla de preparación de soluciones.

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Discussion

Este protocolo visual describe métodos bien tolerados para el aislamiento de células mononucleares colónicas, incluidos linfocitos de lamina propria (LPL). Dado que este protocolo se optimizó en la evaluación de modelos graves de colitis de ratón post-trasplante donde las citoquinas inflamatorias y las lesiones tisulares se prestan a la mala viabilidad de la MNC recuperada, anticipamos que estos métodos pueden traducirse a otros aplicaciones que requieren análisis fenotípicos del MNC colonico. Estos incluyen pero, no se limitan a evaluar la inflamación del colon en modelos de ratón de enfermedad inflamatoria intestinal, estudios de respuestas inmunitarias de tratamientos dirigidos a la colitis, y colitis producida por patógenos infecciosos. Además, nuestros datos utilizando aislamientos en ratones sanos (singéricos BMT) indican que el procedimiento de aislamiento no requiere infiltrado inflamatorio significativo para permitir la detección de células inmunitarias en los aislados de MNC. De hecho, se han obtenido datos similares utilizando ratones sanos no tratados (no BMT) (datos no mostrados).

Varios pasos clave de este protocolo lo diferencian de otros métodos publicados y contribuyen a un alto rendimiento y viabilidad. Por ejemplo, la optimización de la actividad de la colagenasa E derivada de Clostridium histolyticum(100 U/ml nivel de actividad final) permite cálculos consistentes para diferentes lotes de enzimas en experimentos de largo alcance26. Hay 28 miembros diferentes en la familia del colágeno, constituyendo juntos casi el 30% de todas las proteínas en el cuerpo de los mamíferos27. Además, diferentes tejidos tienen distribuciones distintas de subtipos de colágeno, cada uno requiriendo colágenos únicos para la digestión28. La colagenasa de C. histolyticum incluye 6 proteínas diferentes clasificadas en dos clases29,30. El tipo específico de colagenasa utilizado puede alterar la viabilidad y la calidad general de las células aisladas del colon31. Estudios anteriores han demostrado que la colagenasa tipo C-2139 (Colagenasa E) permite un alto rendimiento de linfocitos entre MNC aislados del intestino delgado25. Sin embargo, estos protocolos no abordaban la digestión del colon, un órgano mucho más musculoso con una composición de colágeno significativamente más compleja que el intestino delgado.

La adecuación y fiabilidad de la degradación del tejido enzimático es un factor establecido que influye en el rendimiento y la viabilidad celular general al minimizar la necesidad de una interrupción mecánica recurrente (que induce un aumento del trauma mecánico al tejido). Debido a la digestión enzimática adecuada del colágeno intersticial y mucoso utilizando un protocolo específico de la colagenasa E (en comparación con los protocolos de digestión mediados por La colagenasa D en uso estándar), este protocolo minimiza la cantidad de manipulación mecánica de los fragmentos de tejido necesarios para interrumpir el intersticio y liberar subconjuntos de células inmunitarias en suspensión. Esto mejora aún más la viabilidad de MNC aislado para ensayos posteriores. Como se muestra en los datos(Figura 1B),esto elimina la necesidad de DNAse y otras maniobras químicas o mecánicas anti-aglomeración más allá de la filtración estándar de una suspensión de una sola célula a través de un colador. Otros informes que describen el aislamiento de las células linfoides intestinales han utilizado ditiothreitol (TDT) y EDTA como agentes mucolíticos para mejorar tanto el rendimiento como la viabilidad de los leucocitos mononucleares aislados24.

Otro aspecto único de este protocolo que mejora el rendimiento celular es la aplicación de un gradiente de medios de separación de densidad basado en sílice afinado. Otros documentos de métodos de digestión publicados hasta la fecha no utilizan tal gradiente de separación de densidad21,31. Sin embargo, en la experiencia de los autores y la de los colaboradores que utilizan este protocolo para aislar células linfoides funcionalmente activas, la purificación del gradiente de densidad mejora tanto la viabilidad como la pureza de la MNC recuperada tras la digestión19 , 20 , 32.

Aunque no es un foco de este manuscrito, digno de mención para aquellos que trabajan con modelos de inflamación intestinal en ratones es que los métodos de este manuscrito se pueden modificar para permitir un aislamiento similar de alta calidad de MNC viable desde el intestino delgado. La modificación del protocolo colono primario necesario para lograr esto es el uso de una sola digestión de 90 minutos (en lugar de dos digestión de 60 minutos), con todos los demás pasos (incluyendo el nivel de actividad enzimática y los pasos de aplanación) idénticos a los mostrados. Esta modificación normalmente produce un rango de 0.8-4 x 106 MNC por intestino delgado sin o 1.5-2.5 x 106 MNC con la inclusión del íleon terminal incluyendo la tapa cecal rica en leucocitos. Por lo tanto, una novedad de este protocolo es que la aplicación del protocolo primario al colon y el protocolo modificado al intestino delgado, se podría aislar el MNC con alta reproducibilidad y buena viabilidad tanto del intestino delgado como del colon de la persona animales experimentales en el mismo experimento.

En resumen, el protocolo descrito permite el aislamiento eficiente y reproducible de las células mononucleares del colon o, con modificaciones, del intestino delgado. Con 2 operadores competentes trabajando juntos, hasta 10 colones separados pueden ser procesados y analizados en un solo día, y las suspensiones de una sola célula pueden estar listas para el análisis fenotípico y funcional posterior dentro de 6-8 h de la cosecha de tejido. La aplicación de este protocolo puede resultar valiosa para otros objetivos de investigación que necesitan una evaluación inmune de la inflamación colónica, permitiendo a otros investigadores caracterizar el sistema inmunológico del colon del ratón de una manera rigurosa y reproducible.

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Disclosures

Los autores no declaran intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones #1K08HL088260 y #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.), y la Fundación Batchelor para la Investigación Pediátrica (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). Los ratones C57BL/6 y BALB/c utilizados en este estudio fueron criados en nuestras instalaciones o proporcionados por Jackson Labs o Taconic.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60 mm Petri DIsh Thermo Scientific 150288
1x PBS Corning 21-040-CV
10x PBS Lonza BioWhittaker BW17-517Q
10 mL Disposable Serological Pipette Corning 4100
10 mL Syringe Becton Dickinson 302995
15 mL Non-Sterile Conical Tubes TruLine TR2002
18 G Blunt Needle Becton Dickinson 305180
25 mL Disposable Serological Pipette Corning 4250
40 μm pore size Cell Strainer Corning 352340
50 mL Falcon Tube Corning 21008-951
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A4503-1KG
Fixation Buffer Biolegend 420801
E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum Sigma C2139
EDTA, 0.5 M Sterile Solution Amresco E177-500ML
Fetal Bovine Serum Thermo /Fisher Scientific -HyCLone SV30014.03
HEPES GE Healthcare-HyClone SH30237.01
Percoll GE Healthcare-Life Sciences 1708901
RPMI Medium Corning 17-105-CV
Sodium Azide VWR Life Science Amresco 97064-646
Trypan Blue Lonza BioWhittaker 17-942E

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References

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Inmunología e infección número 151 linfocitos colon murina lamina propria colitis trasplante citometría de flujo digestión enzimática inflamación células mononucleares
Aislamiento de células mononucleares lamina Propria de Colon Murino usando colagenasa E
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McManus, D., Novaira, H. J., Hamers, A. A. J., Pillai, A. B. Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E. J. Vis. Exp. (151), e59821, doi:10.3791/59821 (2019).

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