Summary
Målet med detta protokoll är att isolera mononukleära celler som bor i lamina propria av tjocktarmen genom enzymatisk nedbrytning av vävnaden med hjälp av kollagenase. Detta protokoll möjliggör en effektiv isolering av mononukleära celler vilket resulterar i en enda cellsuspension som i sin tur kan användas för robust immunophenotyping.
Abstract
Tarmen är hem till det största antalet immunceller i kroppen. De små och stora tarm immunsystem polisen exponering för exogena antigener och modulera svar på potenta mikrobiellt härledda immun stimuli. Av denna anledning, tarmen är en viktig mål plats för immun dysreglering och inflammation i många sjukdomar, inklusive men, inte begränsat till inflammatoriska tarmsjukdomar såsom Crohns sjukdom och ulcerös kolit, graft-versus-host sjukdom (GVHD) efter ben benmärgstransplantation (BMT), och många allergiska och infektiösa tillstånd. Murina modeller av gastrointestinal inflammation och kolit är tungt används för att studera GI komplikationer och att pre-kliniskt optimera strategier för förebyggande och behandling. Data som samlats in från dessa modeller via isolering och fenotypisk analys av immunceller från tarmen är avgörande för ytterligare immun förståelse som kan tillämpas för att lindra gastrointestinala och systemiska inflammatoriska sjukdomar. Denna rapport beskriver ett mycket effektivt protokoll för isolering av mononukleära celler (MNC) från tjocktarmen med hjälp av en blandad kiseldioxid-baserade densitet gradient gränssnitt. Denna metod isolerar reproducerbart ett betydande antal livskraftiga leukocyter samtidigt minimera förorenande skräp, vilket möjliggör efterföljande immun fenotypning av flödescytometri eller andra metoder.
Introduction
Även om den gastrointestinala (GI) tarmkanalen är främst tillägnad bearbetning och reabsorption av näringsämnen från mat, magtarmkanalen upprätthåller också centrala roller i integriteten av den vaskulära, lymfatiska, och nervsystemet och många andra organ genom dess slemhinnor och submukosala immunförsvar1. GI immunsystemet har en inflytelserik roll i både gastrointestinal och systemisk hälsa på grund av dess ständiga exponering för främmande antigener från livsmedel, kommensaler bakterier, eller invaderande patogener1,2. Således, GI immunsystemet måste upprätthålla en känslig balans där den tolererar icke-patogena antigener samtidigt reagera på lämpligt sätt att patogena antigener1,2. När balansen mellan tolerans och försvar störs, kan lokaliserad eller systemisk immun dysreglering och inflammation inträffa vilket resulterar i en myriad av sjukdomar1,2,3.
Tarmen hamnar minst 70% av alla lymfoida celler i kroppen4. De flesta primära immunologiska interaktioner involverar minst en av tre immun stationer i tarmen: 1) Peyers plåster, 2) intraepitelial lymfocyter (IEL) och 3) lamina propria lymfocyter (LPL). Var och en av dessa består av ett komplext sammanlänkat nätverk av immunceller som snabbt reagerar på normala immun utmaningar i tarmen5. Begränsad till stroma ovanför muscularis hinna mucosae, den löst strukturerade lamina propria är bindväv i tarmslemhinnan och inkluderar byggnadsställningar för villus, vasculature, lymfdränage, och slemhinnor nervsystemet, liksom många medfödda och adaptiva immunsubsets6,7,8,9. LPL består av CD4+ och CD8+ T celler i ett ungefärligt förhållande av 2:1, plasmaceller och myeloida Lineage celler inklusive, dendritiska celler, mastceller, eosinofiler och makrofager6.
Det finns ett växande intresse för att förstå immun dysreglering och inflammation i tarmen som den avser olika sjukdomstillstånd. Sådana tillstånd som Crohns sjukdom och ulcerös kolit alla manifestera varierande nivåer av kolon inflammation10,11,12. Dessutom, patienter med maligna eller icke-maligna sjukdomar i benmärgen eller immunsystemet som genomgår en allogen benmärgstransplantation (allo-BMT) kan utveckla olika former av kolit inklusive 1) direkt toxicitet från konditioneringsregimer före BMT, 2) infektioner orsakade av immunsuppression efter BMT och 3) transplantat-kontra-värd sjukdom (GVHD) driven av givare-typ T-celler reagerar på givare allo-antigener i vävnaderna efter BMT13,14,15. Alla dessa komplikationer efter BMT resultera i betydande förändringar i immun miljön i tarmarna16,17,18. Den föreslagna metoden möjliggör en tillförlitlig bedömning av immuncellernas ackumulering i musens kolon och, när den appliceras på murina mottagare efter BMT, underlättar en effektiv analys av både givar-och mottagar immunceller involverade i transplantations tolerans19 ,20. Ytterligare orsaker till Gut inflammation inkluderar maligniteter, födoämnesallergier, eller störningar i tarmen microbiome. Detta protokoll ger tillgång till Gut mononukleära celler från tjocktarmen och, med modifieringar, till leukocyter i tunntarmen i någon av dessa prekliniska murina modeller.
En PubMed sökning med hjälp av söktermerna "tarm och immun cell och isolering" avslöjar över 200 publikationer som beskriver metoder för tunntarmen nedbrytning för att extrahera immunceller. En liknande litteratursökning efter kolon ger dock inga väl avgränsade protokoll som specificerar isolering av immunceller från tjocktarmen. Detta kan bero på att tjocktarmen har mer muskulös och interstitiell lager, vilket gör det svårare att helt smälta än tunntarmen. Till skillnad från befintliga protokoll använder detta protokoll specifikt Kollagenase E från Clostridium histolyticum utan andra bakteriella kollagenaser (Kollagenase D/kollagenas I). Vi visar att med hjälp av detta protokoll, kan nedbrytning av kolon vävnad uppnås samtidigt som kvaliteten på isolerade Gut mononukleära immunceller (MNC) utan tillsats av anti-clumping reagenser såsom natrium Versenate (EDTA), Dispase II, och deoxyribonuclease i (DNase i)21,22,23. Detta protokoll är optimerat för att möjliggöra reproducerbar robust utvinning av livskraftiga MNC från murina kolon för vidare riktade studier och bör låna sig till studiet av immunologi i tjocktarmen eller (med modifieringar) tunntarmen24, 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla studier utfördes under gnagare forskningsprotokoll granskas och godkännas av den institutionella Animal Care and use Committee (IACUC) vid University of Miami Miller School of Medicine, som uppfyller de veterinära standarder som fastställts av American Association för laboratoriedjur vetenskap (AALAS).
1. beredning av lösningar
-
Som beskrivs i tabell 1, förbereda kolon buffert, kiseldioxid-baserade densitet separation Media 100%, kiseldioxid-baserade densitet separation Media 66%, kiseldioxid-baserade densitet separation Media 44%, Kollagenase E uppslutning buffert, och FACS buffert.
- Förbered kolon bufferten dagen före ingreppet och lagra över natten vid 4 ° c.
- Förbered 100% kiselbaserade densitet separations medier dagen före ingreppet och lagras över natten vid 4 ° c, placering i rumstemperatur på morgonen av förfarandet för att Tina.
- Förbered 66% och 44% Silica-baserade separations medier på morgonen av isoleringen, med rumstemperatur 100% kiseldioxid-baserade densitet separation media och kolon buffert.
- Mät lämplig mängd av Clostridium histolyticum-derived kollagenas E och förvara vid-20 ° c över natten före ingreppet. Följande morgon, lös i lämplig mängd kolon buffert för att härleda Kollagenase rötnings buffert. För alla inkuberingar med Kollagenase Digestionsbuffert på dagen av förfarandet, pre-Värm lösningarna till 37 ° c.
- För hela protokollets steg, Behåll en centrifug vid 20 ° c och rotationshastigheten 859 x g, med avaktiverade bromsar (0 retardation) för gradientcentrifugering. Ställ in en annan till 4 ° c och rotationshastighet på 859 x g, med standard retardation, för tvättsteg.
2. skörd av tjocktarmen
- Euthanize musen via CO2 kvävning följt av aalac-godkänd bekräftande metod.
- Placera musen i liggande läge och spraya pälsen med 70% etanol. Använda stora vävnad sax, göra en vertikal mittlinjen snitt och exponera intakt peritoneum.
- Använd fin dissekera sax, öppna peritoneum. Använd pincett för att flytta tunntarm till ena sidan och exponera fallande kolon. Något dra uppåt på fallande kolon att maximalt exponera den rektala delen av tjocktarmen. Skär den distala ändtarmen djupt i bäckenet och dissekera och ta bort hela tjocktarmen som en enhet, från distala ändtarmen till cecal Cap.
- Överför tjocktarmen i 20 mL kyld kolon buffert i en 50 mL Polypropenrör.
3. rengöra tjocktarmen
- Placera tjocktarmen på en fuktad pappershandduk och extrahera den fasta pallen genom att tillämpa milt tryck på tarmväggen med den trubbiga änden av sax eller pincett.
- Placera tjocktarmen i en petriskål och spola tarmen med 10 mL kyld kolon buffert med hjälp av en 10 mL spruta med 18 G trubbig fyllning nål.
- Överför tjocktarmen till en kolon buffert fuktad pappershandduk och ta bort mesenteri och fett med den vassa änden av saxen.
- Placera tjocktarmen i en petriskål fylld med 5-10 mL kyld kolon buffert agitera manuellt för att tvätta återstående kolon innehåll. Upprepa 2-3 gånger.
- Skär tjocktarmen longitudinellt från dess mer muskulös rektal till proximala kolon (generera en enda rektangulär öppen kolon pjäs) i en petriskål fylld med färska kylda kolon buffert. Kassera befintliga medier och fyll på med ren kyld kolon buffert.
- Tvätta tarmen 3 gånger genom att kraftigt snurra den i petriskål och ersätta 5-10 mL kyld kolon buffert efter med varje tvätt.
- Placera den rektangulära kolon vävnad på en pappershandduk fuktad med kolon buffert och skär den genom att skära den horisontellt och sedan i små fragment (3 mm x 3 mm sektioner).
- Samla kolon fragment försiktigt med fina pincett i 20 mL kyld kolon buffert i en 50 mL polypropen koniskt rör.
- Tvätta tjocktarmen fragment 3 gånger, varje tvätta i 20 mL kolon buffert, genom att kraftigt snurra röret för 30 s. mellan varje agitation, låta vävnaden fragment att bosätta sig på botten av röret. Dekantera eller vakuum Aspirera supernatanten samtidigt förhindra vävnads fragment förlust i aspiration processen mellan varje tvätt.
Anmärkning: Det finns ingen anledning att byta röret efter varje tvätt.
4. kollagenas matsmältning 1
- Tillsätt 20 mL av Kollagenasäckningsbufferten till de tvättade kolonfragmenten i 50 mL konisk tub av polypropen.
- Placera det stängda 50 mL-röret vid 37 ° c i en inkuberad orbitalskak med rotationshastigheten inställd på 2 x g för 60 min. se till att vävnads fragmenten är i ständig rörelse under omrörning. om det behövs, öka rotationshastigheten stegvis för att säkerställa att inga vävnads fragment nöja sig med röret botten.
5. Förbered kvarts-baserade separering Media gradienter
- Förbered 66% och 44% kiseldioxid-baserade densitet separations medier, med hjälp av 100% kiseldioxid-baserade densitet separations medier vid 20 ° c (rumstemperatur) och kolon buffert.
- Häll 5 mL 66% kiselbaserade separations medier i vardera 3 separata 15 mL Polypropenrör. Förbered 3 rör per kolon. Detta bildar den högre densiteten basen av gradienten isolerings förfarandet, på vilken lägre densitet separation media kommer att vara lager för att skapa separationgradienten.
- Förvaras vid 20 ° c fram till användning.
6. insamling av supernatanten från matsmältningen 1
- Samla endast supernatanten med hjälp av en 25 ml serologiska pipett och filtrera supernatanten genom en 40 μm pore filtrering tyg cell SIL placeras i en ren 50 ml polypropen koniskt rör, efter kollagenase nedbrytning 1 är avslutad. Var noga med att inte aspirera några befintliga vävnads fragment.
Anmärkning: Behåll kvarvarande synliga vävnads fragment i röret. Dessa kommer att genomgå andra kollagenas matsmältning (steg 8).
7. kylning av Kollagenasäckningsbuffert
- Fyll 50 mL polypropenröret helt med kyld kolon buffert.
Anmärkning: Kollagenase är verksamt vid 37 ° c; därav kyld buffert inaktiverar detta enzym. - Centrifugera röret vid 4 ° c vid 800 x g i 5 min.
- Kassera supernatanten via vakuum aspiration. Tvätta celler med 25 mL färsk kolon buffert och centrifugera vid 800 x g i 5 min.
- Omsuspendera pelleten i mindre än 1 mL färsk kyld Kolonbuffert.
- Placera 50 mL propen koniskt rör på is.
8. kollagenas matsmältning 2
- Upprepa steg 4 (uppslutning 1) med de kvarvarande vävnads fragmenten som behålls från steg 6,1.
9. vävnads Disaggregation efter matsmältningen 2
- Spola vävnads fragmenten kraftigt fram och tillbaka mellan röret och en 10 mL spruta genom en 18 G Blunt-slut nål.
- Upprepa denna Flush för minst 7-8 kompletta passager, fortsätter tills inga grova vävnads fragment eller skräp är synliga.
10. filtrera celler
- Passera vävnad uppdelning suspensionen genom en 40 μm-pore filtrering tyg cell SIL i en ren 50 ml Polypropenrör.
- Tvätta filtrerings Fabric cell SIL med 10 mL kyld kolon buffert för att återvinna alla celler insnärjas i filtret.
11. kylning av kollagenas matsmältning
- Fyll 50 mL polypropen koniskt rör till fälgen med kyld kolon buffert.
Anmärkning: Temperaturen på kolon buffert är avgörande för att säkerställa kylning av kollagenase aktivitet. - Snurra vid 4 ° c och 800 x g i 5 min.
- Kassera supernatanten via vakuum aspiration.
- Tvätta genom att omlägga 25 mL färsk kyld Kolonbuffert, följt av centrifugering vid 4 ° c, 800 x g i 5 min.
- Kassera supernatanten via vakuum aspiration.
- Samla upp den återsuspenderade pelleten från Kollagenase nedbrytning 1 (steg 7) till motsvarande rör från steg 11,4.
- Upprepa steg 11,4 (tvätta och centrifugering).
12. kiselbaserade densitet separation Media gradient separation
Anmärkning: Utför steg 12-18 så snabbt som möjligt, för att säkerställa snabb kylning av kollagenasaktivitet.
- Efter steg 11,7, Omsuspendera varje pellet i 24 mL totalt 44% kiseldioxid-baserade densitet separation Media per kolon.
- Sakta lager 8 ml av medierna från steg 12,1 till var och en av tre rör beredda i steg 5,2 (innehåller 66% kiseldioxid-baserade densitet separations medier), med hjälp av en 10 ml serologiska pipett. Upprätthålla ett stadigt och långsamt flöde av 44% densitet separations mediet medan skiktning gradienten för att undvika störningar i gränssnittet.
- Balansera noggrant alla rör i centrifugrhinkarna med en väga skala eller en balans.
- Snurra rören 20 min vid 859 x g i en centrifug utan broms vid 20 ° c. Låt rotorerna att komma för att slutföra vila innan du tar bort rören, noga med att inte störa cellerna vid gradienten gränssnittet.
13. samla mononukleära celler från Övertoningsgränssnittet
- Visualisera övertoningsgränssnittet (nära 5 mL-märket), där vanligtvis ett 1-2 mm tjockt vitt band (innehållande MNC) finns.
Anmärkning: En kanske eller kanske inte ser ett vitt band. Men MNC kommer att vara på detta gränssnitt och bör moln tydligheten i gradienten gränssnittet. - Vakuum aspirera och kassera de översta 7 mL av den övre gradienten för att underlätta pipettåtkomst till gränssnittet.
- Med hjälp av kontinuerlig manuell sugning och stadig roterande handled rörelse, samla gränssnitts lagret av celler i en ren 50 mL polypropen koniskt rör. Samla in tills gränssnittet mellan de 2 gradienter är klar och refractile (klart av celler).
- Fyll Samlingsröret med 50 mL kyld FACS buffert. Snurra vid 4 ° c, 800 x g i 5 min.
- Aspirera supernatanten via vakuum aspiration och Omsuspendera pelleten i 1 mL FACS-buffert.
- Räkna cellerna på en hemocytometern vid en 1:2 utspädning med hjälp av lämpliga döda celler uteslutnings metoder.
- Fortsätt till FACS färgning eller andra analyser med nyligen isolerade kolon MNC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
När du arbetar med murina kolon sjukdom modeller, det är bra att kunna både kvantifiera och kvalitativt bedöma, bland MNC i tjocktarmen, flera immunceller flera grupper inblandade i den inflammatoriska processen. Encellig suspension av MNC som erhålls genom tillämpning av detta protokoll underlättar sådan fenotypisk karakterisering på ett robust och reproducerbart sätt. Som ett bevis på princip för tillämpningen av denna isoleringsmetod under olika experimentella inställningar, vi hämtade kolon MNC med denna metod och utförde multiparameterflödescytometri på celler isolerade från möss med (figur 1 och Figur 2 , allogeneisk BMT) och utan (figur 2A, uterustransplantat BMT) signifikant immunmedierad kolon skada efter BMT.
Flödescytometri och dataanalyser utfördes för att jämföra fraktioner av apoptotiska och nekrotiska döda lymfocyter vid användning av antingen kollagenas E eller D för isolering, med eller utan DNase 1 behandling. Den gating-strategi som används under flödescytometri finns i figur 1a. Efter en bilaga V (apoptos-markör) och fixerbar levande/död blått färgämne (nekros markör) på encelliga suspensioner efter varje isolering uppvisade Kollagenase E utan DNase en signifikant högre andel av Annexin Vneg Levande/döda blåneg levande celler (median 43,3%, intervall 26,5%-59,9%, n = 3) efter isolering jämfört med Kollagenase D utan DNase (median 8,7%, intervall 3,6%-10,2%, n = 3), även i jämförelse med kollagenas E + DNase (median 8,18%, intervall 4,7%-20,4%, n = 3) eller Kollagenase D + DNAse (median 15.10%, intervall 9,9%-21,4%, n = 3). Dessutom identifierade vi Annexin VnegLive/Dead Blue + nekrotisk cells vid en median procentsats av 41,0% i collagenase e-gruppen (Range 37,1%-58,8%, n = 3) jämfört med 90,0% i kollagenase D-gruppen (intervall 69,7%-95,5%, n = 3), 75,9% i kollagenase e + DNase 80,3% i Kollagenase D + DNAse-gruppen, respektive (intervall 65.7%-79,5%, intervall 54.9%-89,9%, n = 3). Representativa FACS tomter från n = 1 djur i varje grupp visas figur 1b).
Som ytterligare bevis på principen om konsekvens och avkastning av livskraftiga MNC med detta förfarande i sjuka möss, multi-parametriska flödescytometri tillämpades på MNC isolerade från CD 45,2 BALB/c mottagare möss på dag 7 efter att ha fått BMT av antingen allogen (CD 45,1 C57BL/6 givare) eller uterustransplantat (CD 45,1 Balb/c givare) BMT-modeller. Med hjälp av absoluta MNC-nummer multiplicerat med procentandel gated immunsubsets erhålls genom flödescytometri analyser, medelvärdet absoluta antalet givare CD4+ och CD8+ T celler extraheras från BMT mottagarens kolon kan beräknas och jämföras (n = 4 per grupp, figur 2A). Eftersom det kan vara viktigt att identifiera och/eller kvantifiera sällsynta immun cells populationer i sådana musmodeller har vi bedömt sällsynta delmängder inklusive donator (CD 45,1+) Foxp3+ T reglerande celler (Treg) i både uterustransplantat och allogena BMT-modeller. Den gating strategi för att nå givare Treg celler (CD4+CD25+FoxP3+) från antikropp-färgade enda cellsuspensionen visas (sekvens av grindar avgränsade med en röd pil; Figur 2b). Med denna metod, även sällsynta undergrupper såsom givare härledda kolon Treg infiltrerande mottagare mus kolon efter BMT kunde analyseras (figur 2C, representativ tomt; n = 1).
Figur 3 visar en utökad tillämpning av denna metod i historiska data från vår grupp med hjälp av det presenterade protokollet för att jämföra ackumulering av GvHD-INDUCERANDE CD8 + kontra CD4 + givare härledda T-celler i tjocktarmen av Balb/c möss antingen skyddade eller inte skyddade från GvHD av pre-BMT behandling förberedande (konditionering) regim20. De testade preparativa behandlingsregimer inkluderade 800 cGy/myeloablativ total kropps bestrålning (TBI800) eller icke-myeloablativ TBI (400TBI), samt nonmyeloablativ konditionering med hjälp av total lymfoid bestrålning (TLI) där bestrålning levererades till lymfa noder, bräss och mjälte med avskärmning av skalle, lungor, armar och ben, bäckenet och svans. Alla konditioneringen kombinerades med anti-thymocyte serum (ATS), ett immunmodulerande medel. Så tidigt som dag 6 efter BMT resulterade detta kolon MNC-isolerings protokoll i robusta flödescytometriska analyser jämfört med identiska analyser på fler lymfocytberikade GvHD-målorgan såsom mjälte och mesenteriska lymfkörtlar (MLN) (figur 3a)20 . Reproducerbar isolering av kolon MNC över BMT-mottagare (n = 7-10 per behandlingsgrupp) tillåtna för en robust statistisk jämförelse av absoluta tal av givare CD8+ effektor T celler mellan olika pre-transplantation Conditioning behandlingsgrupper ( Figur 3b), vilket ger viktiga data om immun fenotyper som ledde till viktiga studier som avslöjade de medfödda immunmekanismerna för GvHD-skydd från TLI i motsats till TBI pre-BMT-konditionering. 20
Figur 1: flödescytometrisk analys av kolon MNC på dag 7 efter BMT i allogena musmodell system när isolerade med kollagenas E och D med och utan DNase 1. Wild-Type (WT) (CD 45,2+) Balb/c (H2Kd +) möss fick BMT från CD45 congenic (CD 45,1+) C57BL/6 GIVARMÖSS (allogen BMT, n = 3 per grupp). WT (CD 45,2+) Balb/c mottagare möss administrerades 800cGy TBI (Balb/c) 1 dag före BMT. Dag 7 efter BMT, encellig suspensioner av mottagare kolon bereddes enligt metoderna i detta manuskript med användning av kollagenas E (100 U/mL), kollagenas E (100 U/mL) med DNAse 1 (500 μg/mL), Kollagenase D (500 μg/mL), eller Kollagenase D (500μg/mL) med DNAse 1 (500μg/mL) (n = 3 per grupp). Celler färgas med Live/Dead-UV450 (Live/Dead Blue), Annexin V-APC, H-2Kd-PE, CD 45,1-BV605, CD3-FITC, CD4-BV711, CD8-APC-Cy7, FoxP3-Pacific Blue, och CD11B-PE-Cy7 antikroppar. A) strategi för FACS-analyser. Gate 0, forward scatter (FSC-a) och Side scatter (SSC-a) på encellig suspension av MNC används för att identifiera leukocyter; Gate 1, uteslutning av icke-enskilda celler med hjälp av SSC-A; Gate 2, uteslutning av icke-enskilda celler med FSC-A; Utfärda utegångsförbud för 3, ID av Annexin v-realitet (apoptotic) och fastställbara livsdugligt färga levande/Dead-UV450+Annexin v-negation (necrotic) cell deluppsättningar. Brepresentativa FACS-tomter av Annexin V och fastställbar livskraft färgning av gated leukocyter bland MNC för de fyra experimentella grupperna. N = 1 representativ mus per grupp i grupper: kollagenas E (100 U/mL), kollagenas E (100 U/mL) + DNAse 1 (500 μg/mL), Kollagenase D (500 μg/mL) och Kollagenase D (500 μg/mL) + DNAse 1 (500 μg/mL). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: flödescytometrisk karakterisering av kolon MNC dag 7 efter BMT i allogena och uterustransplantat musmodell system. WT (CD 45,2+) C57BL/6 (H2Kd-neg) och BALB/c (H2Kd +) möss fick BMT från CD45-congenic (CD 45,1+) C57BL/6 och BALB/c givare möss (syngeneic eller allogen BMT, n = 4 per experimentell grupp). C57BL/6 och BALB/c mottagare möss fick förberedande konditioneringsregimer av 950cgy (C57BL/6) och 800cgy (Balb/c) myeloablativ följd TBI, levererade en dag före BMT. Dag 7 efter BMT, var encellig suspensioner av mottagaren kolon MNC beredda enligt metoderna i detta manuskript. Celler färgas med Live-Dead-BV510, H-2Kd-PE, CD 45,1-BV605, CD4-FITC, CD8-APC-CY7, CD25-PacificBlue, FOXP3-AF647, och CD11B-PE-Cy7 antikroppar, N = 4 möss per grupp. (A) medelvärde ± SEM absoluta tal (log 10) CD 45,1+ h-2kd-neg eller CD 45,1+ h-2kd + (givare-typ, i varje fall) CD11bnegCD4+ och CD8+ T celler isolerade från mottagaren kolon på dag 7 efter konditionering och CD 45,1 C57BL/6 (givare) → CD 45,2 BALB/c (mottagare) BMT. N = 4 per grupp. B) gating strategi för FACS analyser. Gate 0, forward scatter (FSC-a) och Side scatter (SSC-a) på encellig suspension av MNC används för att identifiera leukocyter; Gate 1, uteslutning av icke-enskilda celler med hjälp av SSC-A; Gate 2, uteslutning av icke-enskilda celler med FSC-A; Gate 3, Live cell Selection Gate 4, separation av hematopoietiska celler av BMT givare kontra BMT mottagarens ursprung; Gate 5, val av givare icke-myeloida härstamning celler; Gate 6, selektiv gating av CD4+ T-celler; Gate 7, separat gating av CD4+CD25+FoxP3+ T reglerande (Treg) celler. Den röda pilen betecknar nedrullningsstrategi. Crepresentativa FACS-tomter med CD25 och FoxP3 färgning med hjälp av den gating strategi i B dag 7 efter konditionering och BMT i tjocktarmen av en Balb/C mottagare av ALLOGEN BMT (C57BL/6 → Balb/c). Procentandel celler i varje grind anges i grinden. WT = vildtyp; TBI = total bestrålning av kroppen; BM = 10 x 106 CD 45,1+ congenic C57BL/6 eller Balb/c donator benmärgsceller; Teff = T effektorceller; Treg = Foxp3+ T reglerande celler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: icke-myeloablativ TLI/ATS men inte TBI/ATS konditionering minskar givaren TCRαβ+CD8+ effektor T cell ackumulering. (A) representativa FACS tomter av CD4 och CD8 färgning av gated h-2kb +tcrαβ+ celler från givare h-2kb + C57BL/6 möss i mjälten (översta raden), mesenterisk lymfkörtel (MLN) (mellersta raden), och kolon (nedersta raden) av mottagare på dag 6 efter konditionering och transplantation. Procent av cellerna i varje grind ges ovanför grinden. (B) medelvärde ± SEM absoluta tal (log 10) H-2kB +tcrαβ+CD8+ celler i mjälte (övre panelen), MLN (mitten panelen), och kolon (nedre panelen) av mottagare på dag 6 efter konditionering och BMT. WT = Wild-typ; TBI = total bestrålning av kroppen; TLI =: totalt lymfoida bestrålning; ATS = anti-thymocyte serum; BM = 50 x 106 WT C57BL/6 givare benmärgsceller; SPL = 60 x 106 WT C57BL/6 givare mjälte celler; TBI800, TBI400 = cGy doser av myeloablativ (TBI800) eller icke-myeloablativ (TBI400) TBI. * Denna siffra har modifierats från van der Merwe et al.20. Copyright 2013. American Association of Immunologer, Inc. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Lösning | Formel |
| Kolon buffert | 500 mL RPMI + 10mM HEPES + 10% FBS (Värmeinaktiverade vid 56oC för 60 minuter, pH justerat till 7,3) |
| Kiselbaserade densitet gradient Media 100% (per kolon) | 22,5 mL kiselbaserad densitet gradient Media + 2,5 ml 10X PBS. |
| Kiselbaserade densitet gradient Media 66% (per kolon) | 10,72 mL kvarts-baserad densitet gradient Media 100% + 5,28 ml kolon buffert |
| Kiselbaserade densitet gradient Media 44% (per kolon) | 11 mL kvarts-baserad densitet gradient Media 100% + 14 ml kolon buffert |
| Kollagenas rötnings buffert (per kolon) | 100 U/mL kollagenas E från Clostridium histolyticum, upplöst i 40 ml kolon buffert |
| FACS buffert | 500 mL 1x PBS + 5 g BSA + 1 mm EDTA + 0,2 g natriumazid |
Tabell 1: förberedelse tabell för lösning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta visuella protokoll beskriver väl tolererade metoder för isolering av kolon mononukleära celler inklusive lamina propria lymfocyter (LPL). Med tanke på att detta protokoll var optimerat för att utvärdera svår efter transplantation mus kolit modeller där inflammatoriska cytokiner och vävnadsskada lämpar sig för dålig lönsamhet av återvunna MNC, vi räknar med att dessa metoder kan översättas till andra tillämpningar som kräver fenotypisk analys av kolon MNC. Dessa inkluderar, men, är inte begränsade till att bedöma kolon inflammation i musmodeller av inflammatorisk tarmsjukdom, studier av immunsvar av kolit riktade behandlingar, och kolit som produceras av infektiösa patogener. Dessutom indikerar våra data med isoleringar hos friska (syngeneic BMT) möss att isolerings proceduren inte kräver signifikanta inflammatoriska infiltrat för att möjliggöra immun cells detektering i MNC-isolat. Liknande data har faktiskt erhållits med obehandlade friska (icke-BMT) möss (data visas inte).
Flera viktiga steg i detta protokoll skiljer den från andra publicerade metoder och bidrar till hög avkastning och lönsamhet. Till exempel, optimering av Clostridium histolyticum-derived kollagenase E aktivitet (100 U/ml slutlig aktivitet nivå) möjliggör konsekventa beräkningar för olika partier av enzym över långväga experiment26. Det finns 28 olika medlemmar i kollagen familjen, tillsammans utgör nästan 30% av alla proteiner i däggdjurs kroppen27. Dessutom, olika vävnader har distinkta distributioner av kollagen subtyper, var och en kräver unika kollagenaser för matsmältningen28. Kollagenase från C. histolyticum innehåller 6 olika proteiner klassificerade i två klasser29,30. Den specifika typen av kollagenas som används kan förändra lönsamheten och den övergripande kvaliteten på de celler som isolerats från tjocktarmen31. Tidigare studier har visat att kollagenas typ C-2139 (Kollagenase E) tillåter en hög avkastning av lymfocyter bland MNC isolerade från tunntarmen25. Emellertid, dessa protokoll inte behandla nedbrytning av kolon, en mycket mer muskulös organ med betydligt mer komplex kollagen sammansättning än tunntarmen.
Tillräcklighet och pålitlighet av enzymatisk vävnadsnedbrytning är en etablerad faktor som påverkar den totala cell avkastningen och lönsamheten genom att minimera behovet av återkommande mekaniska störningar (som inducerar ökat mekaniskt trauma mot vävnaden). På grund av adekvat enzymatisk nedbrytning av interstitiell och mukosala kollagen med hjälp av ett E-specifikt protokoll för kollagenase (jämfört med kollagenase D-medierad digestionsprotokoll vid standard användning) minimerar detta protokoll mängden mekanisk manipulation av de vävnads fragment som krävs för att störa interstitiets och frigöra immun cells undergrupper i suspensionen. Detta ökar ytterligare lönsamheten för isolerade MNC för efterföljande analyser. Som framgår av data (figur 1b) eliminerar detta behovet av DNase och andra kemiska eller mekaniska anti-clumping manövrer bortom standard filtrering av en enda cellsuspension genom en sil. Andra rapporter som beskriver isoleringen av intestinala lymfoida celler har använt Ditiotreitol (dTT) och EDTA som Mukolytiska agenter för att förbättra både avkastning och lönsamhet av isolerade mononukleära leukocyter24.
En annan unik aspekt av detta protokoll som förbättrar cell utbytet är tillämpningen av en finjusterad kiselbaserade densitet separation Media gradient. Andra rötnings metoder papper publicerade hittills inte använda en sådan densitet separation gradient21,31. Men i författarnas erfarenhet och de medarbetare som utnyttjar detta protokoll för att isolera funktionellt aktiva lymfoida celler, densitet gradient rening förbättrar både lönsamheten och renhet av MNC återvinns efter matsmältningen19 , 20 , 32.
Även om inte ett fokus för detta manuskript, värt att nämna för dem som arbetar med intestinal inflammation modeller i möss är att metoderna i detta manuskript kan modifieras för att tillåta liknande högkvalitativ isolering av livskraftiga MNC från tunntarmen. Ändringen av det primära kolon protokollet som krävs för att uppnå detta är användningen av en enda 90-min matsmältning (snarare än 2 60-min digestions), med alla andra steg (inklusive enzym aktivitetsnivå och släcka steg) identiska med de som visas. Denna modifiering ger vanligtvis ett intervall på 0,8-4 x 106 MNC per tunntarm utan eller 1.5-2.5 x 106 MNC med införandet av terminalen ileum inklusive den leukocyt-rika cecal Cap. Därför är en nyhet i detta protokoll att tillämpa det primära protokollet till tjocktarmen och det modifierade protokollet till tunntarmen, kan man isolera MNC med hög reproducerbarhet och god lönsamhet från både tunntarm och kolon av enskilda försöksdjur i samma experiment.
Sammanfattnings, det protokoll som beskrivs tillåter effektiv och reproducerbar isolering av mononukleära celler från tjocktarmen eller, med modifieringar, tunntarmen. Med 2 skickliga aktörer som arbetar tillsammans, så många som 10 separata kolon kan bearbetas och analyseras på en enda dag, och encelliga suspensioner kan vara redo för efterföljande fenotypisk och funktionell analys inom 6-8 h från vävnad skörd. Tillämpningen av detta protokoll kan visa sig värdefullt för andra forskningsändamål som behöver immun bedömning av kolon inflammation, vilket gör att andra utredare att karakterisera immunsystemet i musens kolon på ett rigoröst och reproducerbart sätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag #1K08HL088260 och #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.), och Batchelor Stiftelsen för pediatrisk forskning (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). C57BL/6 och BALB/c möss som används i denna studie var antingen uppvuxna i vår anläggning eller tillhandahålls av Jackson Labs eller Taconic.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm Petri DIsh | Thermo Scientific | 150288 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 10x PBS | Lonza BioWhittaker | BW17-517Q | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4100 | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 302995 | |
| 15 mL Non-Sterile Conical Tubes | TruLine | TR2002 | |
| 18 G Blunt Needle | Becton Dickinson | 305180 | |
| 25 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4250 | |
| 40 μm pore size Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning | 21008-951 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503-1KG | |
| Fixation Buffer | Biolegend | 420801 | |
| E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum | Sigma | C2139 | |
| EDTA, 0.5 M Sterile Solution | Amresco | E177-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo /Fisher Scientific -HyCLone | SV30014.03 | |
| HEPES | GE Healthcare-HyClone | SH30237.01 | |
| Percoll | GE Healthcare-Life Sciences | 1708901 | |
| RPMI Medium | Corning | 17-105-CV | |
| Sodium Azide | VWR Life Science Amresco | 97064-646 | |
| Trypan Blue | Lonza BioWhittaker | 17-942E |
References
- Schneeman, B.
- Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract. Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).
- Blumberg, R. S. Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment. Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).
- Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut. Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).
- Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N. Isolation of T Cells from the Gut. T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Waisman, A., Becher, B. , Humana Press. New York, NY. 21-25 (2014).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional Specialization within the Intestinal Immune System. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).
- Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria. Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).
- Mowat, A. M., Viney, J. L. The anatomical basis of intestinal immunity. Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).
- Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J.
- Harb, W. J. Crohn's Disease of the Colon, Rectum, and Anus. Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).
- Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F.
- Mohty, B., Mohty, M. Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update. Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).
- Hatzimichael, E., Tuthill, M.
- Hernandez-Margo, P. M., et al. Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation. Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).
- Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).
- Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children. Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).
- Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management. Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).
- Shuyu, E., et al. Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine β-thalassemia. Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).
- van der Merwe, M., et al. Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation. Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (111), e54114 (2016).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
- Weigmann, B. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue. Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).
- Bull, D. M., Bookman, M. A. Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells. Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).
- Davies, M. D., Parrott, D. M. Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine. Gut. 22, 481-488 (1981).
- Carrasco, A., et al. Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa. Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
- Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).
- Harrington, D. J. Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease. Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).
- Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases - A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).
- Autengruber, A., et al. Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function. European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
- van der Heijden, P. j, Stok, W. Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine. Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).
