Summary
NADH और fura-2 एनालॉग की उत्तेजना और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के वर्णक्रमीय ओवरलैपिंग के कारण, लाइव कोशिकाओं में दोनों रसायनों से संकेत हस्तक्षेप [Ca2 +] की मात्रात्मक माप के दौरान अपरिहार्य है। इस प्रकार, NADH संकेत हस्तक्षेप के एक उपन्यास ऑनलाइन सुधार विधि को मापने के लिए [Ca2 +] विकसित किया गया था.
Abstract
मापने के लिए [Ca2 +] मात्रात्मक, fura-2 एनालॉग, जो अनुपातमेट्रिक फ्लोरोप्रोब हैं, अक्सर उपयोग किया जाता है। हालांकि, डाई उपयोग आंतरिक रूप से autofluorscence हस्तक्षेप की वजह से जीना कोशिकाओं में सीमित है, मुख्य रूप से nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) से. अधिक विशेष रूप से, यह एक प्रमुख बाधा है जब mitochondrial को मापने [Ca2 +] मात्रात्मक रूप से fura-2 एनालॉग का उपयोग कर, क्योंकि NADH के बहुमत mitochondria में है. यदि फ्लोरोसेंट डाई एकाग्रता एक ही है, एक निश्चित उत्तेजना तीव्रता एक ही उत्सर्जन तीव्रता का उत्पादन करना चाहिए. अतः दो विभिन्न उत्तेजना तरंगदैर्ध्य का उत्सर्जन तीव्रता अनुपात स्थिर होना चाहिए। इस सिद्धांत के आधार पर, NADH संकेत हस्तक्षेप के एक उपन्यास ऑनलाइन सुधार विधि को मापने के लिए [Ca2 +] विकसित किया गया था, और NADH और fura-2 के वास्तविक संकेत तीव्रता प्राप्त किया जा सकता है. इसके अलावा, गणना करने के लिए एक उपन्यास समीकरण [Ca2 +] isosbestic उत्तेजना या 400 एनएम पर उत्तेजना के साथ विकसित किया गया था. इस विधि के साथ, माइटोकोंड्रियाल [सीए2+] में परिवर्तन सफलतापूर्वक मापा जा सकता है। इसके अलावा, उत्तेजना और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के एक अलग सेट के साथ, कई पैरामीटर, NADH सहित, [Ca2 +], और पीएच या mitochondrial झिल्ली क्षमता (जेडएम),एक साथ मापा जा सकता है. माइटोकोंड्रियाल [सीए2+] और जेडएम या पीएच को फ्यूरा-2-एफएफ और टेट्रामेथिलहोडामाइन एथिल एथिल एस्टर (टीएमआरई) या कार्बोक्सी-सेमीनाफ्होरफ्लोर-1 (कार्बोक्सी-स्नेफ-1) का उपयोग करके मापा गया था।
Introduction
इंट्रासेल्यूलर कै2+ की महत्वपूर्ण भूमिका व्यापक रूप से जानी जाती है1. कोशिकीय शारीरिक प्रकार्यों की प्रक्रियाओं को समझने के लिए [Ca2+] का परिमाणीकरण आवश्यक है। Fura-2 एनालॉग काफी उपयोगी हैं क्योंकि वे यूवी रेंज में उत्साहित हैं (lt;400 एनएम), और अनुपातमेट्रिक विधि मात्रात्मक माप के लिए लागू किया जा सकता है. इसलिए, इस तरह के पीएच के रूप में अन्य शारीरिक मापदंडों, झिल्ली क्षमता, आदि, अन्य फ्लोरोसेंट रंगों के साथ मापा जा सकता है. माइटोकोंड्रियाल कै2+ सांद्रता ([Ca2+]उ) श्रेणी कथित तौर पर 0.08$20 $M2,3,4,5. Fura-2 एनालॉग के अलावा, fura-2-FF [Ca2 +] की इस सीमा को मापने के लिए उपयुक्त है। हालांकि, जीवित कोशिकाओं दुर्भाग्य से उनके चयापचय प्रक्रियाओं के लिए NADH/NADPH होते हैं, और NADH fura-2 एनालॉग के साथ ओवरलैपिंग उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रम की वजह से संकेत हस्तक्षेप उत्पन्न करता है। यह हस्तक्षेप बहुत fura-2 एनालॉग के उपयोग को सीमित करता है। विशेष रूप से, यदि एनालॉग mitochondrial को मापने के लिए लागू किया जाता है [Ca2 +], इस हस्तक्षेप सबसे बड़ी बाधा है क्योंकि NADH की सबसे अधिक राशि mitochondria में है. यह नाडाड परिवर्तनों से और जटिल है जो माइटोकोंड्रियाल झिल्ली की क्षमता(ज )से संबंधित है और$m का परिवर्तन [Ca2+]m6,7,8 , 9.इसके अतिरिक्त, [Ca2+]m गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए, अन्य माइटोकोंड्रियाल पैरामीटरों की स्थिति जानना आवश्यक है, जैसे नाड, $एम, और पीएच।
353 एनएम, 361 एनएम, और 400 एनएम पर उत्तेजना के साथ 450 एनएम और 500 एनएम पर उत्सर्जन में नाडाह और फ्यूरा-2-एफएफ के संकेत होते हैं, और समीकरण इस प्रकार हैं। इसमें, 353 एनएम और 361 एनएम क्रमशः 450 एनएम और 500 एनएम पर उत्सर्जन के लिए फ्यूरा-2-एफएफ के आइसोबेस्टिक अंक हैं।
F361,450 ] F361,450,NADH + F361,450,Fura समीकरण 1
F353,500 ] F353,500,NADH + F353,500,Fura समीकरण 2
F400,500 ] F400,500,NADH + F400,500,Fura समीकरण 3
जहां एफएक्स, y द्वारा y-nm पर मापा उत्सर्जन तीव्रता है x-nm उत्तेजना, एफएक्स, y, NADH शुद्ध NADH-निर्भर उत्सर्जन तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है, और एफएक्स,y,Fura शुद्ध fura-2-FF-निर्भर उत्सर्जन तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है। फ्लोरोसेंट डाई की एक ही एकाग्रता के तहत, एक निश्चित उत्तेजना तीव्रता एक ही उत्सर्जन तीव्रता का उत्पादन करना चाहिए. अतः दो विभिन्न उत्तेजना तरंगदैर्ध्य का उत्सर्जन तीव्रता अनुपात स्थिर होना चाहिए। Ca2+ और fura-2 NADH फ्लोरोसेंट विशेषताओं को प्रभावित नहीं किया; अतः 450 दउ पर उत्सर्जन का अनुपात तथा 500 दउ नाडड किसी भी उत्तेजना तरंगदैर्ध्य पर स्थिर था। एक ही नियम fura-2-FF के लिए इस धारणा के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है कि NADH या [Ca2 +] fura-2-FF के उत्सर्जन और उत्तेजना स्पेक्ट्रम को प्रभावित नहीं करता है. हालांकि, Ca2 + fura-2-FF उत्सर्जन की एक वर्णक्रमीय बदलाव का कारण बना. इसलिए, Ca2 +के प्रभाव को दूर करने के लिए, isosbestic उत्तेजना, जो Ca2 +से स्वतंत्र है, का उपयोग करने की जरूरत है. प्रत्येक उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य (यानी, 450 एनएम और 500 एनएम) एक अलग isosbestic बिंदु है, और हमारे प्रयोगात्मक सेटअप से, 353 एनएम पर 500 एनएम और 361 एनएम पर 450 एनएम चुना गया. इन से, निम्नलिखित समीकरण मान्य हैं10.
आरएफ ] एफ361,450,Fura/F353,500,Fura समीकरण 4
आरएन 1 ] एफ400,500,NADH/F361,450,NADH समीकरण 5
आरएन 2 ] एफ353,500,NADH/F361,450,NADH समीकरण 6
इन स्थिरांकों के साथ, (समीकरण 1) (समीकरण 2) से निम्न समीकरण और (समीकरण 3) मान्य हैं।
F361,450 ] F361,450,NADH + Rf ] F353,500,Fura समीकरण 7
F353,450 ] RN2 ] F361,450,NADH + F353,500,Fura समीकरण 8
F400,500 ] RN1 ] F361,450,NADH + F400,500,Fura समीकरण 9
यदि तच,त्द1तथा त्द2 ज्ञात हों तो नाध तथा फरा-2 के शुद्ध संकेत निम्नानुसार प्राप्त किए जा सकते हैं।
F361,450,NADH ] (F361,450 - Rf ] F353,500)/
F353,500,Fura ] (RN2 ] F361,450 ] F353,500)/
F400,500,Fura ] F400,500 ] RN1 ] F361,450,NADH समीकरण 12
आरFura ] F353,500,Fura/ एफ400,500, Fura समीकरण 13
फरा-2-एफएफ का Ca2+-बाउंड रूप 400 एनएम उत्तेजना तरंगदैर्ध्य पर व्यावहारिक रूप से गैर-फ्लोरोसेंट था। इस गुण के आधार पर, निम्न नए अंशांकन समीकरण प्राप्त किया जा सकता है।
[Ca2+] Kd ] (F400,500,max/ F353,500,max) ] (RFura ] Rmin) समीकरण 14
जहां Kd एक वियोजन स्थिरांक है, F400,500, अधिकतम और F353,500, अधिकतम 400 एनएम और 353 एनएम पर उत्तेजना के साथ 500 एनएम पर उत्सर्जित संकेतों की अधिकतम मान रहे हैं, क्रमशः, और आरमिनट Ca 2 में न्यूनतम आरFura है +-मुक्त हालत। चूंकि isosbestic उत्तेजना का उपयोग किया गया था, समीकरण निम्नानुसार आगे सरल किया जा सकता है.
[Ca2+] Kd ] (1 / Rmin) ] (RFura ] Rmin) समीकरण 15
इसलिए, केवल Kd और Rमिनट मान [Ca2 +] की गणना करने के लिए आवश्यक हैं।
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Protocol
सभी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल स्थानीय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.
1. समाधान तैयारी
- एक ताजा अलग कार्डियक मायोसाइट्स11तैयार करें.
नोट: प्रत्येक प्रयोगशाला एक भिन्न कक्ष संग्रह समाधान हो सकता है। यहाँ, myocytes संस्कृति माध्यम (DMEM) में जमा हो जाती है. - 100 एमएल का2+मुक्त विलयन तैयार की (सारणी 1) ।
- 50 एमएल बीकर में संस्कृति माध्यम के 50 एमएल तैयार करें। अलीकोट 5 एमएल और यह 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में डाल दिया। शेष घोल को कमरे के तापमान पर रखें।
- 5 मिलीग्राम सैपोनिन को 50 एमएल सीए2+-मुक्त समाधान में जोड़कर सैपोनिन घोल के 50 एमएल तैयार करें।
नोट: Saponin हृदय मायोसाइट्स permeabilize करने के लिए प्रयोग किया जाता है, साइटोसोलिक डिब्बों को दूर करने के लिए, और केवल mitochondrial फ्लोरोसेंट कल्पना करने के लिए. - डाइमेथिल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में भंग 1 एमएम फ्यूरा-2-एफएफ-एएम के 16 डिग्री एल तैयार करें।
नोट: एक 2 एमएल ट्यूब में fura-2-FF-AM भंग DMSO और alicot 16 $L के 1 mM स्टॉक समाधान करें। उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर तब तक स्टोर करें जब तक कि उनका उपयोग न हो जाए. - 50 एमएल NADH-free Ca2+-free Solution (तालिका 1) और 50 एमएल नाड-मुक्त Ca2+-संतृप्त विलयन (तालिका 1) जब आइसोबेस्टिक अंकों को मापा जाना है। KOH के साथ 7.0 करने के लिए पीएच समायोजित करें।
नोट: NADH मुक्त Ca2 +मुक्त समाधान (तालिका 1) शामिल 10 $M FCCP और 100 डिग्री एम एडीपी किसी भी mitochondrial substrates के बिना mitochondria में NADH को कम करने के लिए. - के 0 50 एमएल का2+-मुक्त समाधान, 50 एमएल मैलेट विलयन, 50 एमएल पाइरुटेट विलयन, 50 एमएल माललेट-पिरुवट विलयन, और 50 एमएल रोटेनोन विलयन को नाड सुधार कारक माप के लिए उपयोग किया जाएगा (सारणी 1)।
2. Mitochondria में Fluorprobe लोड िंग प्रक्रिया
- 1 एम एम फरा-2-एफएफ-एएम के 16 डिग्री सेल्सियस तक संस्कृति माध्यम के 2 एमएल जोड़कर डाई-लोडिंग समाधान तैयार करें।
नोट: फ्लोरोसेंट डाई प्रकाश के तहत नाजुक है. उपयोग करने से ठीक पहले समाधान तैयार करें। एक अंधेरे जगह में फ्लोरोसेंट डाई युक्त समाधान रखें. फरा-2-एफएफ-एएम की अंतिम सांद्रता 8 डिग्री सेल्सियस है। यदि कार्बोक्सी-SNARF-1 का उपयोग किया गया था, तो डाई लोडिंग समाधान को 2 डिग्री सेल्सियस कार्बोक्सी-SNARF-1-AM के साथ तैयार करें। - पृथक कोशिकाओं के 2 एमएल लीजिए तथा एक 5 एमएल पराकाओं में एक ईमानदार स्थिति में रखें।
- मायोसाइट्स के लिए 15 मिनट प्रतीक्षा करें नीचे सिंक और supernatant को दूर करने के लिए।
नोट: supernatant सेल मलबे हो सकता है. कोशिका क्षति से बचने के लिए ट्यूब को अपकेंद्रण न करें। - डाई लोडिंग समाधान के 2 एमएल जोड़ें.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए कोशिकाओं के साथ डाई लोडिंग समाधान इनक्यूबेट करें।
- फिर, एक ईमानदार स्थिति में 30 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में टेस्ट ट्यूब डाल दिया।
- सुपरनेंट निकालें, और 37 डिग्री सेल्सियस के prewarmed संस्कृति माध्यम के 4 एमएल जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 60 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
- अंत में, supernatant निकालें, कमरे के तापमान पर संस्कृति माध्यम के 4 एमएल जोड़ें और कमरे के तापमान पर ट्यूब रखने के लिए.
3. बहुपारमितीय माप प्रणाली का परिचय
नोट: चित्र 1 संपूर्ण सिस्टम का आरेख दिखाता है.
- एक उत्तेजना प्रकाश स्रोत के लिए, एक तेजी से monochromator (पॉलीक्रोम द्वितीय) है कि 3 एमएस के भीतर प्रकाश बदल सकते हैं का उपयोग करें.
- संकेत की तीव्रता बढ़ाने के लिए एक उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ एक तेल विसर्जन लेंस (40x, एनए 1.3) का प्रयोग करें।
- फ्लोरोसेंट संकेत हस्तक्षेप के बिना वस्तु क्षेत्र की निगरानी करने के लिए एक के पास-infrared फिल्टर और एक प्रभारी-युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरा का प्रयोग करें।
- क्षेत्र प्राप्त करने के लिए ऑब्जेक्ट फ़ील्ड छवि कैप्चर करें.
- केवल पृष्ठभूमि को कम करने के लिए कक्ष दिखाने के लिए किसी फ़ील्ड डायाफ्राम के साथ मॉनिटर स्क्रीन में ऑब्जेक्ट फ़ील्ड समायोजित करें.
- फोटॉन गिनती विधि के साथ उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य का पता लगाने के लिए प्रत्येक बैंड-पास फिल्टर (450, 500, 590, और 640 एनएम) के साथ चार photopliplier ट्यूबों का प्रयोग करें। विभाजित करने के लिए और उत्सर्जन प्रकाश पुनर्निर्देशित करने के लिए उपयुक्त dichroic दर्पण का उपयोग करें।
नोट: उत्तेजना प्रकाश उत्सर्जन प्रकाश की तुलना में बहुत मजबूत है. इस प्रकार, पृष्ठभूमि को कम करने के लिए उच्चतम अवरुद्ध विशेषताओं के साथ बैंड-पास फ़िल्टर चुनें। एक फोटॉन गिनती प्रणाली पीएमटी, फोटॉन काउंटर इकाइयों, और एक उच्च गति काउंटर का एक संयोजन शामिल हैं। सिस्टम को नियंत्रित करने के लिए और डेटा का नमूना करने के लिए, एक कस्टम-निर्मित ड्राइविंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग किया गया था। अन्य प्रणालियों के साथ इस विधि को लागू करने के लिए एक रास्ता ढूँढना आवश्यक है.
4. एक multiparametric माप प्रणाली के साथ NADH सुधार विधियों
- सीटू में फ्यूरा-2-एफएफ के आइसोबेस्टिक बिंदुओं की पहचान।
नोट: कई रिपोर्टों में कहा गया है कि फ्लोरोसेंट विशेषताओं कोशिकाओं में बदल रहे हैं. इसलिए, situ में हस्तक्षेप को सही करने के लिए पैरामीटर प्राप्त करने के लिए सभी कार्यविधियाँ निष्पादित करें।- माइक्रोस्कोप पर डाई-लोडेड सेल को माउंट करें और कोशिकाओं को नीचे सिंक करने के लिए 3 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
नोट: 40x उद्देश्य लेंस के साथ एक उद्देश्य क्षेत्र प्रति एक सेल के आसपास देखने के लिए सेल नंबर समायोजित करें। - 37 डिग्री सेल्सियस पर NADH मुक्त Ca2 +मुक्त समाधान पर perfuse.
- कक्ष को लक्षित करने के बाद, कक्ष-मुक्त पृष्ठभूमि और कक्ष क्षेत्र मापें जैसा कि अनुभाग 4.1 में दिखाया गया है. कक्ष क्षेत्र से कक्ष पृष्ठभूमि परिकलित करें.
नोट: दोनों पृष्ठभूमि संकेतों को प्रत्येक प्रयोग में सही करने की आवश्यकता है. - 60 s के लिए saponin समाधान perfuse और NADH मुक्त Ca2 +मुक्त समाधान पर लौटने.
- उपाय Fura-2-FF-emitted संकेतों पर 450 एनएम और 500 एनएम एक साथ उत्तेजना स्कैन द्वारा 350 एनएम से 365 एनएम के साथ 0.1 एनएम कदम.
- NADH मुक्त Ca2 +-संतृप्त समाधान और दोहराने चरण 4.2.5.
- Ca2 +- मुक्त शर्तों में संकेतोंसे संकेतों को घटाना।
- अन्य एकल कार्डियक मायोसाइट्स के साथ 4.2.2 से 4.2.7 तक प्रक्रियाओं को दोहराएँ.
नोट: यदि सिग्नल की तीव्रता कमजोर हो जाती है, तो 4.2.1 से दोहराएँ. के लिए प्रक्रिया दोहराएँ, कम से कम, 5 विभिन्न कोशिकाओं. - सभी प्राप्त संकेतों से, प्रत्येक उत्तेजना पर उत्सर्जन के मानक विचलन की गणना करें और एक आइसोबेस्टिक बिंदु के रूप में न्यूनतम मानक विचलन (एसडी) मान को दर्शाने वाली उत्तेजना तरंगदैर्ध्य का चयन करें।
नोट: प्रतिनिधि आंकड़े चित्र 2में दिखाए गए हैं।
- माइक्रोस्कोप पर डाई-लोडेड सेल को माउंट करें और कोशिकाओं को नीचे सिंक करने के लिए 3 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
- पृष्ठभूमि संकेत का पता लगाने और सेल क्षेत्र के साथ सुधार के तरीके
नोट: पृष्ठभूमि के दो प्रकार हैं। एक कोशिकाओं से आता है और अन्य कवर पर्ची (सेल मुक्त पृष्ठभूमि) पर प्रतिबिंब से आता है. प्रत्येक प्रयोग में दोनों पृष्ठभूमि को सुधारने की आवश्यकता है।- माइक्रोस्कोप पर स्नान में डाई मुक्त कोशिकाओं माउंट और नीचे करने के लिए कोशिकाओं सिंक करने के लिए 3 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें। लगभग 5 मिनट के लिए NaDH मुक्त Ca2 +मुक्त समाधान परफ्यूस NADH मुक्त।
नोट: सभी विलयन परफ्यूजन दर 37 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 एमएल/मिनट है।
नोट: 40x उद्देश्य लेंस के साथ एक उद्देश्य क्षेत्र प्रति एक सेल के आसपास देखने के लिए सेल नंबर समायोजित करें। - लक्षित कक्ष को कवर करने के लिए ऑब्जेक्ट फ़ील्ड सेट करें.
- कक्ष को फ़ील्ड से बाहर ले जाने के बाद, कक्ष-मुक्त विंडो के पृष्ठभूमि संकेतों को मापें और उन्हें ऑफ़सेट के रूप में सेट करें.
नोट: संकेत फोटॉन गिनती प्रणाली में पता लगाया जा करने के लिए प्रकाश संकेत का मतलब है। - कक्ष को प्रारंभिक स्थिति पर वापस करें और कक्ष पृष्ठभूमि संकेतों और कक्ष क्षेत्र को मापें.
नोट: उत्तेजना प्रकाश bandpass फिल्टर के साथ फ़िल्टर किया जाता है, भले ही यह अभी भी फ़िल्टर किए गए प्रकाश की काफी बड़ी राशि शामिल है. इस प्रकाश जब कोशिकाओं से टकराने और फोटॉन गिनती प्रणाली अत्यधिक संवेदनशील है एक काफी पृष्ठभूमि संकेत का कारण बनता है बिखरे हुए है. इसे ठीक किए जाने की आवश्यकता है।
नोट: सेल क्षेत्र पर कब्जा कर लिया सेल छवि और एक उपलब्ध इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ गणना की जा सकती है. सेल क्षेत्र की इकाई पिक्सेल गिनती सहित किसी भी इकाई हो सकता है. बस मानकीकरण आवश्यक है. - सेल क्षेत्र और सेल पृष्ठभूमि संकेतों के बीच संबंध प्राप्त करने के लिए 10 बार 4.1.1 से 4.1.4 तक दोहराएँ.
नोट: बाद में, कक्ष पृष्ठभूमि संकेतों की गणना संबंध से कक्ष क्षेत्र से की जा सकती है. के बाद से उत्तेजना प्रकाश बल्ब उम्र बढ़ने हो, इस प्रक्रिया को दोहराया जाना चाहिए, कम से कम, हर महीने.
- माइक्रोस्कोप पर स्नान में डाई मुक्त कोशिकाओं माउंट और नीचे करने के लिए कोशिकाओं सिंक करने के लिए 3 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें। लगभग 5 मिनट के लिए NaDH मुक्त Ca2 +मुक्त समाधान परफ्यूस NADH मुक्त।
- आर कारकों का मापन
- खंड 4ण्2 में प्राप्त संकेतों से समीकरण 4 के साथ Rf परिकलित कीजिए।
- माइक्रोस्कोप पर डाई मुक्त कोशिकाओं माउंट और Ca2 +मुक्त समाधान perfuse.
- एफ361, 450, नाडा, एफ400, 500, नाडीह, एफ361, 450, नाड, और एफ353, 500, एनएएचडीजैसे संकेतों को मापें .
- मैलेट समाधान को उपयोग करें और 4.3.3 दोहराएँ। और संकेतों को मापने.
- पाइरुवेट विलयन को प्रतिस्पर्धित करें तथा 4.3.3 दोहराएँ. और संकेतों को मापने.
- मलेट-पिरुवेट विलयन को उपयोग करें और 4.3.3 दोहराएँ। और संकेतों को मापने.
- रोटेनोन समाधान को उपयोग करें और 4.3.3 दोहराएँ. और संकेतों को मापने.
नोट: 5 एमएम पाइरुटेट, 5 एमएम मैलेट प्लस 5 एमएम पाइरुटेट पर दर्ज NADH संकेत का उदाहरण, और 10 डिग्री एम रोटेनोन इसके अतिरिक्त चित्र 3में दिखाया गया है। - एफ361, 450, नाडाड बनाम एफ400, 500, नाडी और एफ361, 450, एनएडीएच बनाम एफ353, 500, नाडीहके प्रत्येक ढलान की गणना करें . जैसा कि चित्र 3में दिखाया गया है। प्रत्येक ढाल RN1 और RN2इंगित करता है।
5. उत्तेजना और TMRE या carboxy-SNARF-1 के लिए उत्सर्जन प्रकाश का चयन
- यदि Mitochondrial क्षमता को मापने के लिए TMRE इसके अलावा में इस्तेमाल किया गया था, 530 एनएम उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और 590 एनएम उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य का उपयोग करें.
- यदि माइटोकोंड्रियाल क्षमता को मापने के लिए कार्बोक्सी-एसएआरएफ-1 का उपयोग इसके अतिरिक्त किया गया था, तो 540 एनएम की उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और 590 एनएम और 640 एनएम12की उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य का उपयोग करें।
6. फरा-2-एफएफ के केडी मान का चयन
- पीएच के परिवर्तन के लिए Kd मूल्यों को प्रभावित कर सकते हैं Ca2 + fura-2-FF10पर बाध्यकारी . माइटोकोंड्रिया के लिए पीएच 7.5 पर 5.28 केK d मान का उपयोग करें।
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Representative Results
Mitochondrial Ca2 + सुधार के कारण परिवर्तन10
चित्र 4 में सुधार से पहले और बाद में [Ca2+]उ में परिवर्तन दिखाई देते हैं। परिणामों में स्पष्ट रूप से [Ca2+] m में महत्वपूर्ण परिवर्तन दिखाईदिए। माइटोकोंड्रियाल बिना साइटोसोलिक कै2+ ([Ca2+]ग) के बिना कैल्शियम एकाग्रता आराम कर रहा था 1.03 ] 0.13 $M (मतलब ] S.E., n ] 32), और अधिकतम [Ca2+]m पर 1-M [Ca2+]c था 29.6 ] 1.61 $M ( माध्य - एस.ई., द र् 33 ) (चित्र 5)।
NADH की एक साथ माप, [Ca2 +], और $m10
धनावेशित टीएमआरई को झिल्ली क्षमता-निर्भर तरीके से वितरित किया जा सकता है। झिल्ली क्षमता प्रत्येक डिब्बे में एकाग्रता के साथ नेर्नस्ट समीकरण का उपयोग कर गणना की जा सकती है। माइटोकोंड्रियाल टीएमआरए की निगरानी 2-एनएम टीएमआरई के भ्रम के साथ की गई थी। प्रारंभिक ख्10मीटर को माना जाता था और इसके आधार पर $m के परिवर्तन की गणना की गई थी। कक2+ के अनुप्रयोग में नाध में कमीआई थी परंतु प्रभावित ंह ः े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े
माइटोकोंड्रियाल पीएच में परिवर्तन से परिवर्तन [Ca2+]m10
कार्बोक्सी-SNARF-1 की अतिरिक्त लोडिंग के साथ माइटोकोंड्रियाल पीएच की निगरानी कै2+ परिवर्तनों के बाद की गई थी (चित्र 7)। माइटोकोंड्रियाल पीएच [सीए2+]उमें वृद्धि से प्रभावित नहीं हुआ था। आराम करने वाले माइटोकोंड्रियाल पीएच 7.504 - 0ण्047 (मतलब ] एस.ई., द ] 13) था। इन परिणामों से, 5.28 डिग्री सेल्सियस पीएच 7.5 पर fura-2-FF के Kd मान चुना गया था।
चित्र 1: बहुपारमितीय मापन के लिए एक माइक्रोफ्लोरोरोमी प्रणाली
माइक्रोफ्लोरोरोमेट्री प्रणाली का योजनाबद्ध आरेख दिखाया गया था। घुड़सवार कोशिकाओं एक सीसीडी कैमरे के माध्यम से कल्पना की गई. एक फोटॉन गिनती प्रणाली के माध्यम से चार पीएमटी के साथ चार अलग-अलग उत्सर्जन रोशनी का पता लगाया गया। यह आंकड़ा कोरिया जर्नल ऑफ फिजियोलॉजी एंड फार्माकोलॉजी10की अनुमति से पुनरुत्पादित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: आइसोबेस्टिक बिंदुओं की पहचान
(ए) लाल तीर 450 दउ उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य पर आइसोबेस्टिक बिंदु की ओर इंगित करता है। गैर-सीमा राज्य में Fura-2 एफएफ एक डॉटेड लाइन के साथ और एक ठोस लाइन के साथ Ca2 + बाध्य राज्य में दिखाया गया है। (ख) लाल तीर को 500 दउ उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य पर आइसोबेस्टिक बिंदु की ओर इंगित किया गया है। (ग)Ca 2+ मुक्त स्थितियों में Ca2+मुक्त स्थितियों में 450 एनएम पर संकेत के घटाया डेटा दिखाया गया है-मुक्त संतृप्त शर्तों दिखाया गया है. (घ)Ca2+-मुक्त स्थितियों में 500 एनएम पर सिग्नल का घटा हुआ डेटा Ca2+ -मुक्तसंतृप्त स्थितियों से दिखाया गया है। (ई) ग्राफ ़ से मानक विचलन आंकड़े दिखाए जाते हैं। (च)ग्राफ D से मानक विचलन डेटा दिखाया गया है। यह आंकड़ा कोरिया जर्नल ऑफ फिजियोलॉजी एंड फार्माकोलॉजी10की अनुमति से पुनरुत्पादित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: RN कारकों का मापन।
(क) विभिन्न माइटोकोंड्रियाल सब्स्ट्ररेट्स को लागू करके फ्लोरोसेंट डाई के बिना नाडीएच संकेत में परिवर्तन 361 एनएम उत्तेजना और 450 एनएम उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य पर मापा गया था। (बी)फरा-2-एफएफ सिग्नलों, एफ400,500 (जेड) औरएफ 353,500 (जेड) में नाडीह हस्तक्षेप की एक साथ निगरानी की गई थी। (ग)एफ361,450,नड और एफ400,500, नाडी (जेड) और एफ361,450,नाडीह और एफ353,500,NADH ($) के बीच संबंध दिखाए गए हैं। प्राप् त ढलानों को क्रमशः तद1 तथा त्द2के रूप में निरूपित किया जाता है। यह आंकड़ा कोरिया जर्नल ऑफ फिजियोलॉजी एंड फार्माकोलॉजी10की अनुमति से पुनरुत्पादित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र ाा्वकुलः नाध और फ्यूरा-२-एफएफ हस्तक्षेप सुधार के परिणाम
सुधार से पहले संकेतों का परिवर्तन (बाएं पैनलों में दिखाया गया है) सुधार के बाद (दाएं पैनल में दिखाया गया है)। (ए) 450 द.उ. उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य पर नाडाह संकेत। (ख) फ्यूरा-2-एफएफ 500 एनएम उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य पर संकेत देता है। यह आंकड़ा F400,500 ($), F353,500 (----), और fura-2-FF ($) का अनुपात दिखाता है। (सी)माइटोकोंड्रियाल कैल्शियम एकाग्रता। लाल डॉटेड रेखा शून्य को इंगित करती है. यह आंकड़ा कोरिया जर्नल ऑफ फिजियोलॉजी एंड फार्माकोलॉजी10की अनुमति से पुनरुत्पादित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5: शेष [Ca2+]मी बिना साइटोसोलिक Ca2+ और अधिकतम स्थिर अवस्था [Ca2+]m at 1 ]M cytosolic Ca2+
माइटोकोंड्रिया को मैलेट-पिरुवेट विलयन के भ्रम के साथ सक्रिय किया गया था। स्थिर अवस्था [Ca2+]उ एक Ca2+-मुक्त परिस्थितियों में और 1 $M Ca2+ स्थितियों में दिखाया गया. 5 एमएम ना+ के अलावा NADH बरामद और कम [Ca2 +]मीटर आधार रेखा के लिए. यह आंकड़ा कोरिया जर्नल ऑफ फिजियोलॉजी एंड फार्माकोलॉजी10की अनुमति से पुनरुत्पादित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 6: नाध का एक साथ माप, [Ca2+]m, और $m
माइटोकोंड्रिया को मैलेट-पिरुवेट विलयन के भ्रम के साथ सक्रिय किया गया था। NAHD के परिवर्तन, [Ca2+]m और $m दिखाए गए थे। 1 [M Ca2+ के अलावा NAHD में कमी आई और वृद्धि हुई [Ca2 +]उ लेकिन $m काफी नहीं बदला गया था. यह आंकड़ा कोरिया जर्नल ऑफ फिजियोलॉजी एंड फार्माकोलॉजी10की अनुमति से पुनरुत्पादित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 7: नाध का एक साथ माप, [Ca2+]m, और pH
Ca2+ का बार-बार उपयोग नग की कमी और [Ca2+]उ की वृद्धि को प्रेरित कर सकता है लेकिन माइटोकोंड्रियाल पीएच Ca2+के अनुप्रयोग से प्रभावित नहीं हुआ था। ना+ के योग से नाध और [Ca2+]m को आधार रेखा पर वापस आ सकता है। यह आंकड़ा कोरिया जर्नल ऑफ फिजियोलॉजी एंड फार्माकोलॉजी10की अनुमति से पुनरुत्पादित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| समाधान का नाम | एकाग्रता (एमएम) | |||||||||
| केसीएल | HEPES | ईजीटीए | CaCl2 | एम | पी | आर | एफसीसीपी | Adp | सैपोनिन | |
| Ca2+-मुक्त | 150 | 10 | 1 | |||||||
| NADH मुक्त | 150 | 10 | 1 | 0.01 | 0.1 | |||||
| Ca2+-मुक्त | ||||||||||
| NADH मुक्त | 135 | 10 | 1 | 0.01 | 0.1 | |||||
| Ca2+-संतृप्त | ||||||||||
| सैपोनिन | 150 | 10 | 1 | 0.1mg/एमएल | ||||||
| मलेट | 145 | 10 | 1 | 5 | ||||||
| पायरूवट | 145 | 10 | 1 | 5 | ||||||
| मलेट-पिरुवेटेट | 140 | 10 | 1 | 5 | 5 | |||||
| रोटेनोन | 140 | 10 | 1 | 5 | 5 | 0.01 | ||||
| संस्कृति माध्यम | Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) | |||||||||
| डाई-लोडिंग | संस्कृति माध्यम (2 एमएल) में एक 1mM Fura-2-FF-AM स्टॉक (16 एमएल) जोड़ें | |||||||||
तालिका 1: समाधान
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Discussion
हस्तक्षेप सुधार विधि सफलतापूर्वक NADH और fura-2 एनालॉग के संकेतों को मापने के लिए विकसित किया गया था। सटीक सुधार के लिए संकेतों का सटीक माप आवश्यक है। हालांकि, फ्लोरोसेंट डिवाइस की अंतर्निहित प्रकृति एक पृष्ठभूमि संकेत fura-2 के NADH के लिए असंबंधित पैदा करता है. उच्चतम गुणवत्ता बैंड-पास फिल्टर केवल प्रकाश की अवांछित तरंगदैर्ध्य के 10डिग्री 8 तक ही गुजर सकता है। हालांकि, एक एकल सेल से फ्लोरोसेंट संकेत बहुत छोटा है, और बैंड-पास फिल्टर के बाद उत्तेजना प्रकाश का प्रतिबिंब अभी भी वास्तविक फ्लोरोसेंट संकेतों को दूषित करने के लिए काफी मजबूत है। इसलिए, पृष्ठभूमि संकेत के सावधान सुधार आवश्यक है।
Fura-2 mitochondrial Ca2 +को मापने के लिए एक लोडिंग समस्या है। सबसे पहले, यह विशेष रूप से mitochondria में डाई लोड करने के लिए आसान नहीं है, और एक और organelle में nonspecific लोड हो रहा है गलत हो सकता है. Mitochondrial Ca2 + एकाग्रता आम तौर पर cytosol की तुलना में अधिक है, और एक उच्च Kडी मूल्य के साथ फरा-2-FF का उपयोग साइटोसोलिक Ca2 + परिवर्तन के संदूषण से बच सकता है। अन्य समस्याग्रस्त आर्गेन्सेल सार्कोप्लाज्मिक रेटिकुलम (एसआर) है। हालांकि, वितरण मात्रा मतभेद (एसआर 3.5% बनाम mitochondria 34% चूहे वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स में 36%)13,14 और प्रयोगों में एटीपी को हटाने एसआर से संदूषण के लिए क्षतिपूर्ति कर सकता है.
हमारे अंशांकन समीकरण (समीकरण 14 और 15) Grynkiewicz समीकरण पर कई लाभप्रद विशेषताओं है15 इस प्रकार है:
1) यह केवल तीन मापदंडों की आवश्यकता है: केडी, एफ400,500, अधिकतम/ एफ353,500, अधिकतम,और आरमिनट।
2) एक स्थिर पीएच पर Ca2 + एकाग्रता के अनुपात मान की रैखिकता है।
3) F400,500,max/F353,500,max में एक सापेक्ष त्रुटि मुक्त पैरामीटरहै Sf2/
4) समीकरण 15 में, केवल Kd और Rमिनट की आवश्यकता होती है अगर isosbestic उत्तेजना का उपयोग किया जाता है.
5) पैरामीटर प्राप्त करने के लिए अंशांकन प्रक्रिया समीकरण 15 के साथ बहुत सरल है.
हालांकि, वहाँ एक सीमा है क्योंकि Ca2 +-संतृप्त fura-2-FF एक बहुत छोटे उत्सर्जन उत्पन्न करता है. यह एक त्रुटि होती है। नया समीकरण [Ca2+] सांद्रता के लिए लागू किया जा सकता है 50x कि Kdके.
अंत में, एक प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक NADH और fura-2-FF हस्तक्षेप की मौजूदा समस्या को हल करने के लिए विकसित किया गया था. इस विधि Ca2 + गतिशीलता अधिक सही उपाय कर सकते हैं. बहुपारमितीय माप प्रणाली, विशेष रूप से माइटोकोंड्रिया में, मात्रात्मक तरीके से माइटोकोंड्रियाल शरीर क्रिया विज्ञान को समझने में मदद करेगी।
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Disclosures
लेखकों के हित का कोई संघर्ष नहीं है खुलासा करने के लिए.
Acknowledgments
विज्ञान, आईसीटी और भविष्य की योजना (NRF-2016M3C1A69606) के विज्ञान मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित कोरिया के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (एनआरएफ) के माध्यम से इस काम को आंशिक रूप से बुनियादी विज्ञान अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था और व्यापार, उद्योग और ऊर्जा मंत्रालय (10068076) द्वारा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL eppendorf tube | Axygen | MCT-200-C | 2 mL Tube |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | Equipment |
| ADP, Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate | Sigma-aldrich | A5285 | Chemicals |
| Band pass filter | Ealing Electro-Optics, Inc | 35-3920 | Equipment, 640±11nm |
| Band pass filter | Omega Optical | 690-9823 | Equipment, 590±15nm |
| Band pass filter | Omega Optical | 500DF20-9916 | Equipment, 500±20nm |
| Band pass filter | Chroma Technology Corp. | 60685 | Equipment, 450±30nm |
| Calcium chloride solution | Sigma-aldrich | 21114 | Chemicals |
| carboxy-SNARF-1(AM) | Invitrogen | C1272 | Chemicals |
| Charge-coupled device (CCD) camera | Philips | FTM1800NH/HGI | Equipment |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 86009 | Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <400nm, 490±10, 560±10, Transmission : 460±15, 510±20, >580nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 567DCXRU | Equipment, Reflection : <560nm, Transmission : > 580 nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 480dclp | Equipment, Reflection : <470nm, Transmission : > 490 nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 20728 | Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <405nm, 470±30, Transmission : 430nm~520nm, > 640 nm |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-aldrich | 154938 | Chemicals |
| DMEM, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Sigma-aldrich | D5030 | Chemicals |
| EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid | Sigma-aldrich | E4378 | Chemicals |
| FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone | Sigma-aldrich | 21857 | Chemicals |
| field diaphragm | Nikon | 86506 | Equipment |
| Fura-2-FF(AM) | TEFLABS | 137 | chemicals |
| Green tube | DWM | test tube | |
| HEPES, 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma-aldrich | H3375 | Chemicals |
| High-speed counter | National Instruments | NI-6022 | Equipment |
| Hot mirror | Chroma Technology Corp. | 21002 | Equipment, 50:50 |
| Inverted microscope | Nikon | TE-300 | Equipment |
| Malate | Sigma-aldrich | 27606 | Chemicals |
| Near infrared filter | Chroma Technology Corp. | D750/100X | Equipment, 750±100nm |
| Oil immersion lens | Nikon | MRF01400 | 40x, NA 1.3; Equipment |
| Photon counter unit | Hamamatsu | C3866 | Equipment |
| Photon multiplier tube | Hamamatsu | R2949 | Equipment |
| Polychrome II | Till Photonics | SA3/MG04 | Equipment |
| Potassium chloride | Merck | 1.04936 | Chemicals |
| Potassium hydroxide solution | Sigma-aldrich | P4494 | Chemicals |
| Pyruvate | Sigma-aldrich | 107360 | Chemicals |
| Rotenone | Sigma-aldrich | R8875 | Chemicals |
| Saponin | Sigma-aldrich | S4521 | Chemicals |
| TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester | Molecular probes | T669 | Chemicals |
References
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