Summary
Nós apresentamos uma estratégia RT-PCR-baseada circular combinando o RT-PCR circular, o RT-PCR quantitativo, o RNA 5 ' polyphosphatase-Treatment, e o borrão do Norte. Este protocolo inclui um passo de normalização para minimizar a influência do trifosfato 5 ' instável, e é adequado para discriminar e mapear as transcrições primárias e processadas estavelmente acumuladas em mitocódrias de milho.
Abstract
Em mitocôndria de plantas, alguns transcritos de estado estacionário têm 5 ' trifosfato derivado do início da transcrição (transcritos primários), enquanto os outros contêm 5 ' monofosfato gerado pós-transcripcionalmente (transcrições processadas). Para discriminar entre os dois tipos de transcrições, várias estratégias foram desenvolvidas, e a maioria deles depende da presença/ausência de 5 ' trifosfato. No entanto, o trifosfato na primária 5 ' Termini é instável, e dificulta uma clara discriminação dos dois tipos de transcrições. Para diferenciar e mapear sistematicamente as transcrições primárias e processadas estavelmente acumuladas em mitocídrias de milho, desenvolvemos uma estratégia circular RT-PCR (cRT-PCR), combinando cRT-PCR, tratamento com polifoshpatase de RNA 5, quantitativo RT-PCR (RT-qPCR), e Northern blot. Como uma melhoria, esta estratégia inclui uma etapa da normalização do RNA para minimizar a influência do triphosphate 5 ' instável.
Neste protocolo, o RNA mitochondrial enriquecido é pre-treated pelo RNA 5 ' polyphosphatase, que converte 5 ' triphsophate ao monofosfato. Após a circularização e a transcrição reversa, os dois cDNAs derivados de 5 ' RNAs polifosfatase-tratados e não-tratados são normalizados pelo milho 26S maduro rRNA, que tem um 5 ' final processado e é insensível a 5 ' polifosfatase. Após a normalização, as transcrições primárias e processadas são discriminadas comparando-se os produtos cRT-PCR e RT-qPCR obtidos a partir das RNAs tratadas e não tratadas. A transcrição Termini são determinados pela clonagem e sequenciamento dos produtos cRT-PCR e, em seguida, verificados pelo Northern blot.
Ao usar essa estratégia, a maioria dos transcritos de estado estacionário em mitocrídrias de milho foram determinados. Devido ao teste padrão complicado do Transcript de alguns genes mitochondrial, alguns transcritos do estacionário-estado não foram diferenciados e/ou mapeados, embora fossem detectados em um borrão do Norte. Não temos certeza se esta estratégia é adequada para discriminar e mapear as transcrições de estado estacionário em outras mitocôndrias de plantas ou em plastids.
Introduction
Nas mitocôndrias de plantas, muitos RNAs maduros e precursores são acumulados como múltiplas isoformas, e as transcrições de estado estacionário podem ser divididas em dois grupos com base na diferença em seus 5 ' fins1,2,3, a 4. Os transcritos preliminares têm 5 ' extremidades do trifosfato, que são derivadas da iniciação da transcrição. Por outro lado, as transcrições processadas têm 5 ' monofosfato gerados pelo processamento pós-transcripcional. A discriminação e o mapeamento dos dois tipos de transcrições são importantes para desvendar os mecanismos moleculares subjacentes à transcrição e à maturação final do transcrito.
Para distinguir entre as transcrições primárias e processadas em mitocrídrias vegetais, foram desenvolvidas quatro estratégias principais. A primeira estratégia é pré-tratar as RNAs mitocondriais com a pirofosfatase ácida do tabaco (TAP), que converte 5 ' trifosfato para monofosfato e permite que as transcrições primárias sejam circularizadas por RNA ligase. As abundâncias de transcrição de amostras de RNA tratadas com TAP e não tratadas são comparadas por amplificação rápida de extremidades de cDNA (raça) ou RT-PCR circular (cRT-PCR)2,3,4. Na segunda estratégia, as transcrições processadas são primeiramente esgotadas de RNAs mitocondriais usando o exterminador de terminação 5 '-fosfato-dependente (Tex), e as transcrições primárias deixadas são então mapeadas pela análise de extensão de primer5,6 . A terceira estratégia é a pré-tampão das transcrições primárias utilizando guanil transferase e, em seguida, a posição de trifosodiado 5 ' Termini é determinada pela extensão da cartilha, juntamente com ribonuclease ouS1 análise de proteção nuclease 7,8 ,9. Diferente daqueles dependendo da presença/ausência de 5 ' trifosfato, a quarta estratégia combina in vitro a transcrição, mutagenesis local-dirigido, e a análise da extensão da primeira demão para caracterizar os promotores putativo e para determinar a transcrição sites de iniciação8,10,11. Usando estas estratégias, muitos transcritos preliminares e processados foram determinados na mitocôndria da planta.
No entanto, vários estudos relataram que o 5 ' trifosfato de transcritos primários foram instáveis, e eles foram facilmente convertidos em monofosfato por motivo desconhecido2,4,12,13. Este problema dificulta uma discriminação clara dos dois tipos de transcrições, utilizando técnicas dependendo da presença/ausência de 5 ' trifosfato, e os esforços anteriores para discriminar sistematicamente entre as transcrições primárias e processadas em plantas a mitocôndria falhou2,12.
Neste protocolo, nós combinamos cRT-PCR, RNA 5 ' tratamento da polifosfatase, RT-qPCR, e o borrão do Norte para distinguir sistematicamente os transcritos preliminares e processados estàvel acumulados no milho (Zea Mays) mitodrion (Figura 1). cRT-PCR permite o mapeamento simultâneo de 5 ' e 3 ' extremidades de uma molécula de RNA, e geralmente é adaptado para mapear a transcrição Termini nas plantas2,12,14,15. O RNA 5 ' polyphosphatase poderia remover dois fosfatos do 5 ' Termini trifosodiado, que faz as transcrições preliminares disponíveis para o Self-Ligation pela ligase do RNA. Estudos prévios mostraram que o rRNA maduro de 26S no milho tinha processado 5 ' Terminus, e era insensível ao RNA 5 ' polyphosphatase1,16. Para minimizar a influência do trifosfato instável em 5 ' Termini preliminar, os 5 ' RNAs polyphosphatase-tratados e não-tratados são normalizados pelo rRNA 26S maduro, e os transcritos preliminares e processados são diferenciados então comparando o produtos de cRT-PCR obtidos a partir das duas amostras de RNA. Os resultados de mapeamento e discriminação de cRT-PCR são verificados por Northern blot e RT-qPCR, respectivamente. Finalmente, os primers alternativos são usados para amplificar aquelas transcrições detectadas no borrão do Norte mas não pelo cRT-PCR. Usando essa estratégia baseada em cRT-PCR, a maioria dos transcritos de estado estacionário em mitocrídrias de milho foram diferenciadas e mapeadas1.
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Protocol
1. projeto da primeira demão
- Projete primers gene-específicos para a transcrição reversa (RT) usando o software do projeto da primeira demão do PCR (tabela dos materiais) baseado nas réguas gerais do projeto17da primeira demão.
Nota: Os primers RT são altamente específicos para as transcrições de destino, e eles são geralmente ancorados na parte 5 ' de seqüências de codificação (mRNAs maduros e RNAs precursor), ou ~ 500 – 600 NT a jusante do antecipado 5 ' final (18S e 26S rRNAs). - Projete pares de primers divergentes para amplificar as transcrições circularizadas por cRT-PCR.
Nota: os primers divergentes pareados ladeiam a junção 5 '-3 ' das transcrições circularizadas, e suas posições variam entre os transcritos alvo analisados (Figura S1). Algumas transcrições têm UTRs longos; por exemplo, nad2-1 5 ' UTR e rps4-1 3 ' UTR são 1.985 e 1826/1834 NT, respectivamente1. Se ambos os primers estiverem ancorados na região de codificação, será difícil amplificar as transcrições de destino. Por outro lado, alguns UTRs são curtos; por exemplo, os 3 ' UTRs de nad2-1 e nad4-1 são 34/35 e 29 – 31 NT, respectivamente1. Se os primers emparelhados estiverem localizados longe das sequências de codificação, a PCR falhará. Geralmente, dois pares de primers divergentes são projetados para cada transcritos alvo, enquanto vários pares podem ser necessários para mapear aqueles cujos padrões de transcrição são complicados e/ou UTRs são muito longos. - Projete pares de primers convergentes para preparar pontas de prova do RNA para o borrão do Norte.
Nota: Os primers emparelhados estão localizados na região codificadora do gene alvo, e o tamanho do produto PCR deve estar na faixa de 100 a 1.000 BP. Cada iniciador dianteiro deve conter um local de enzima de restrição para minimizar sequências vetoriais nas sondas resultantes.
2. preparação de Mitocrídrias brutas de grãos em desenvolvimento de milho
- Esterilize pilões, argamassas, funis de vidro, tubos, e pontas pela autoclave, e seque-os no forno.
- Realize todos os procedimentos a 4 ° c ou no gelo, e pré-resfrie todas as soluções.
- Prepare 100 ml de tampão de extração (EB), composto de 0,3 M de sacarose, 5 mm de pirofosfato de tetrasódio, 10 mm KH2po4, 2 mm EDTA, 1% [w/v] polivinilpirrolidona 40, 1% [w/v] albumina sérica bovina, 5 mm L-cisteína e 20 mm de ácido as Ajustar a pH 7,3 com KOH e esterilizar por filtração.
- Prepare 100 mL de tampão de lavagem (WB) consistindo de 0,3 M de sacarose, 1 mM EGTA, e 10 mM MOPS (3-(N-morpholino) propanesulfonic ácido). Ajuste ao pH 7,2 com NaOH e esterilize pela filtração.
Nota: Sugere-se para preparar EB e WB usando DEPC-tratados deionizada H2O. - Colete 20 g desenvolvendo grãos em 11 – 20 dias após a polinização (DAP) para um tubo de 50 mL colocado no gelo e, em seguida, transfira os grãos para argamassas pré-resfriadas.
Nota: Use uma proporção de 100 mL de EB para 20 g de grãos de milho. - Adicione 10 – 20 mL de EB gelada a cada argamassa e moer os grãos completamente.
- Adicione mais EB, e filtre os tecidos terrestres através de duas camadas de pano de filtro (tabela de materiais).
- Centrifugue o filtrado em 8.000 x g por 10 min, e descarte o pellet.
- Transfira o sobrenadante para um novo tubo e Centrifugue-o a 20.000 x g durante 10 min.
- Despeje o sobrenadante, e ressuscita o pellet em 6 mL WB.
- Aliquot a suspensão a cinco 1,5 mL de tubos RNase-livres, e centrifugue-os em 14.000 x g por 5 minutos.
- Descarte o sobrenadante, congele a pelota mitocondrial em nitrogênio líquido e armazene a-80 ° c.
3. extração de RNA mitocondrial
- Extraia o RNA mitocondrial com um reagente comercial (tabela de materiais) de acordo com as instruções da manufatura.
Atenção: Este reagente contém fenol e isotiocianato de guanidina. Trabalhe com ele em uma capa de fumaça, e usar jaleco e luvas. - Dissolva o RNA mitocondrial isolado em H2O desionizado tratados com DEPC e estime a concentração e a pureza do RNA com um espectrofotômetro (tabela de materiais).
Nota: Geralmente, ~ 250 μg de RNA mitocondrial é obtido a partir de 20 g de 15-DAP grãos de milho. - Prepare um gel de agarose composto de 1x TAE buffer (40 mM Tris, 20 mM de ácido acético, 1mM EDTA), 1,5% agarose (tabela de materiais), e 1x mancha nuclear corante (tabela de materiais).
- Adicionar um volume apropriado de 10x buffer de carga (0,5% bromofenol azul, 0,5% xilol cianol FF, e 50% glicerol), e carga de RNA mitocondrial/carga tampão de mistura sobre o 1,5% gel de agarose.
- Executar o gel em 1x TAE buffer em 5 – 6 V/cm por 20 – 25 min, e avaliar a integridade do RNA mitocondrial por imagem o gel com um sistema de documentação de gel (tabela de materiais).
Nota: A presença de duas bandas distintas (~ 3.510 e ~ 1.970 NT para o milho mitocondrial 26S e 18S rRNAs, respectivamente) é um padrão aceitável para RNA mitocondrial intacto. Para excluir a possível degradação, a integridade do RNA deve ser investigada durante as múltiplas etapas da preparação do RNA circularizado (Figura 2).
4. RNA 5 ' Polifosfatase tratamento
- Configurar o tratamento de RNA 5 ' polifosfatase (tabela e materiais) (tabela 1) e incubar a 37 ° c durante 30 – 60 min.
- Recupere o RNA 5 ' polyphosphatase-tratado com um jogo da purificação do RNA (tabela dos materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
- Repita os passos 3,3 a 3,5.
5. circularização do RNA
- Prepare duas reações de circularização utilizando as mesmas quantidades de 5 ' RNAs mitocondriais tratadas com polifosfatase e não tratadas (tabela 2), e incubar ambas as reações a 16 ° c por 12 – 16 h.
- Recupere os dois conjuntos de RNAs autoligadas usando o mesmo kit que na etapa 4,2.
Nota: Deve-se notar que apenas uma fração do RNA mitocondrial será autoligada, e o RNA recuperado será uma mistura de transcritos lineares e circularizados. - Repita os passos 3,3 a 3,5.
6. transcrição reversa
- Sintetizar dois conjuntos de cDNAs a partir das mesmas quantidades de RNAs de 5 ' polifosfatase tratadas e não tratadas (200 ng) circularizadas.
- Prepare uma mistura de primer adicionando uma proporção igual de 26S-CRT e até 7 outros primers RT.
Nota: A concentração final da mistura de primer deve ser de 1 μM. - Prepare duas pré-misturas combinando os reagentes listados na tabela 3, incubar a 65 ° c por 5 min, e depois Chill no gelo por 2 min.
- Montar dois sistemas de reacção RT (tabela 4) e incubar-los a 42 ° c por 50 min.
- Aqueça as duas reacções RT a 70 ° c durante 5 min e, em seguida, Chill-los no gelo.
7. normalização
- Prepare duas reações de PCR adicionando o mesmo volume de cDNAs do modelo derivado de 5 ' RNAs polifosfatase-tratadas ou não-tratadas, os primers divergentes que flanqueam a junção 5 '-3 ' do rRNA de 26S molde (isto é 26S-CF1 e-o-de-2), etc. (tabela 5).
- Execute as duas reações em um termociclador (tabela de materiais) em condições descritas na tabela 6.
- Prepare um gel do agarose compor do amortecedor de 1x TAE, do agarose de 1,0%, e do corante de coloração nuclear 1x.
- Adicione 2 μL de tampão de carga 10x (0,5% de bromofenol azul, 0,5% de xileno cianol FF e 50% de glicerol) a cada um dos dois produtos de PCR e carregue-os no gel.
- Execute o gel em 1x TAE buffer em 5 – 6 V/cm por 30 – 40 min, e imagem-lo usando o mesmo gel sistema de documentação como etapa 3,5.
- Compare a abundância dos dois produtos do PCR usando o software de computador (tabela dos materiais, figura 4a), e aperfeiçoe a normalização mudando as quantidades de cDNAs do molde se necessário.
8. amplificação do PCR
- Prepare pares de reações do PCR adicionando o volume apropriado dos cDNAs normalizados e um par de primers divergentes que flanqueam a junção 5 '-3 ' das transcrições do alvo (tabela 7).
Nota: A quantidade de cDNAs do molde usada para a amplificação do PCR das transcrições do alvo é determinada pelos resultados da normalização do rRNA 26S. - Realize as reações de PCR de acordo com o programa descrito na tabela 8.
- Repita os passos 7,3 a 7,5.
- Mude aos primers divergentes aninhados, e verifique os primeiros resultados redondos do PCR repetindo etapas 8,1 e 8,2.
- Repita os passos 7,3 a 7,5.
- Recupere as bandas proeminentes que poderiam ser repetidas em duas rodadas de amplificação de PCR usando um kit de recuperação de DNA de gel (tabela de materiais).
9. determinação da transcrição Termini
- Clone os produtos gel-purified do PCR em um vetor da Blunt-extremidade (tabela dos materiais) usando técnicas padrão.
- Realize a PCR de colônia para selecionar clones positivos que contenham as inserções de destino e sequencia-as comercialmente.
Nota: Clones positivos contendo pastilhas com tamanho variável são geralmente detectados a partir de uma única banda recuperada, pois muitas transcrições de estado estacionário na planta mitocondrial têm heterogéneos 5 ' e/ou 3 ' extremidades1,12. - Alinhe os dados de sequenciamento com o genoma mitocondrial do milho usando a ferramenta básica de busca de alinhamento local (BLAST) do centro nacional de informação sobre biotecnologia (NCBI). Escolha o organismo "milho (taxid: 4577)", e banco de dados de pesquisa "nucleotide Collection (NR/NT)".
- Encontrar o 5 '-3 ' junção da transcrição molde, e determinar as posições de 5 ' e 3 ' transcrição Termini.
- Calcule o tamanho das transcrições de destino.
10. verificação dos resultados do mapeamento do cRT-PCR pela hibridação do borrão do gel do RNA
Nota: A hibridação do borrão do gel do RNA é executada usando um jogo comercial (tabela dos materiais), que contenha os reagentes para a transcrição-rotulagem do RNA com Digoxigenina (Dig) e o POLYMERASE do RNA T7, a hibridação, e a deteção imunológica. Refira por favor os protocolos fornecidos neste jogo para mais detalhes. Certifique-se de que somente o equipamento livre de RNase está usado para o procedimento inteiro.
- Amplificar o fragmento de DNA usado para preparar a sonda de RNA, e cloná-lo para o mesmo vetor como na etapa 9,1, que contém um promotor T7 17 BP a montante do local de inserção.
- Linearize a construção usando a enzima apropriada da limitação, recupera o plasmídeo linearizada por um jogo da purificação do ADN (tabela dos materiais), e dissolve-o no H2O deionizada DEPC-Tratado.
- Pontas de prova do RNA da etiqueta com DIG-11-UTP por um jogo comercial (tabela dos materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
- Prepare 500 mL de tampão MOPS 10x (0,2 M MOPS, acetato de sódio de 50 mM e EDTA de 10 mM) usando H2O desionizado tratado com DEPC. ajuste ao pH 7,0 por NaOH, e esterilize pela filtração.
- Adicione 2 – 3 volumes de tampão de carga (50% de formamida, 6,2% de formaldeído, 1x MOPS, 10% de glicerol e 0,1% de bromofenol azul) ao RNA mitocondrial preparado nas etapas 3.1 – 3.3.
- Denature a mistura do tampão da amostra/carregamento do RNA em 65 ° c por 10 minutos, e esfrie então no gelo por 1 minuto.
- Prepare um gel de agarose desnaturado (2% formaldeído, 1,2% agarose, e 1x MOPS), e carregar a amostra de RNA/carga tampão de mistura para o gel (1 – 2 μg de RNA mitocondrial por poço).
- Executar o gel em 1x MOPS em 3 – 4 V/cm para ~ 4 h.
- Prepare 2 L de 20x SSC (3 M NaCl, 0,3 M citrato de sódio, pH 7,0). Tratá-lo com 0,1% DEPC durante a noite, e esterilizar por autoclave.
- Enxague o gel duas vezes em 20x SSC (15 min cada vez), e transfira o RNA do gel a uma membrana de nylon (tabela dos materiais) pela transferência capilar com 20x SSC para 10 – 16 h.
- Fixar o RNA à membrana por cozimento a 120 ° c por 30 min.
- Realize a hibridação do RNA e a deteção imunológica com um jogo comercial (tabela dos materiais) de acordo com a instrução do fabricante.
11. discriminação das extremidades primárias e processadas 5 '
- Discriminar as extremidades primárias e processadas 5 ' comparando os produtos cRT-PCR obtidos a partir dos 5 ' normalizados polifosfatase-tratados e não tratados RNAs.
Nota: Para as transcrições primárias, a abundância de produtos de PCR de 5 ' RNA tratado com polifosfatase é muito maior do que a de contrapartes não tratadas (Figura 1, ' gene A ' e figura 4a). No entanto, para transcrições processadas, um nível comparável de produtos de PCR seria amplificado a partir dos dois conjuntos de RNAs mitocondrial (Figura 1, ' gene B '). - Projete os primers RT-qPCR baseados nos resultados do mapeamento cRT-PCR.
- Verifique os resultados da discriminação do cRT-PCR pelo RT-qPCR.
Nota: As duas amostras de cDNA derivadas de 5 ' RNAs polifosfatase-tratadas e não-tratadas são normalizadas pelos produtos de RT-qPCR de 26S amadurecem rRNA.
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Representative Results
Estimativa da eficiência da circularização do RNA mitocondrial
Em um estudo precedente, ambos os RNAs totais e mitochondrial foram usados para o mapeamento do cRT-PCR de Termini do transcrito mitochondrial em Arabidopsis (Arabidopsis thaliana de Arabidopsis), e os dois tipos de RNAs deram resultados similares do traço12. Inicialmente, utilizou-se também RNAs totais para o mapeamento cRT-PCR da transcrição mitocondrial Termini em milho. Depois de muitas provações, descobrimos que as transcrições de alvos eram difíceis de detectar. Como uma melhoria, nós enriqueceu o RNA mitochondrial dos kernels tornando-se do milho, e fêz a amplificação das transcrições molde do alvo em uma rodada do PCR possível.
Para explicar a fácil amplificação das transcrições alvo após o enriquecimento, estimamos a eficiência da circularização do RNA realizando RT-PCRs no gene mitocondrial representativo nad5 (Figura 3 e Figura S2). O gene nad5 do milho contem dois introns Trans-e dois cis-splicing. Após a auto-ligadura de RNAs totais e mitochondrial, os cDNAs da primeira vertente foram sintetizados independentemente usando nad5-rt1 e-rt2 primers. Os dois primers podem reverter o transcrito tanto linear quanto circularizado nad5 mRNAs (Figura S2). Quatro pares de primers convergentes são usados para a amplificação do PCR: sqF1 & sqR1 e sqF2 & sqR2 para o RT-PCR semiquantitativo (RT-sqPCR) e qF1 & qR1 e qF2 & qR2 para RT-qPCR. Para cDNAs transcritas por nad5-rt1, todos os quatro pares de primers detectaram ambos os mRNAs circularizados e lineares nad5 maduros; para a reação de transcrição reversa nad5-rt2, SqF2 & SqR2 e QF2 & qR2 pesquisaram ambas as formas de mRNA, enquanto os produtos SqF1 & SqR1 e QF1 & qR1 PCR foram derivados de nad5 circularizados apenas. Com base nessa análise, utilizamos os produtos de PCR sqF2 & sqR2 (para RT-sqPCR) e qF2 & qR2 (para RT-qPCR) para normalizar as reações de transcrição reversa nad5-rt1 e-rt2, e estimou a razão de nad5 circularizadas comparando o sqF1 & sqR1 (para RT-sqPCR) ou qF1 & qR1 (para RT-qPCR) produtos de PCR. Antes da autoligadura, as RNAs foram pré-tratadas pelo RNA 5 ' polifosfatase para fazer todas as transcrições disponíveis para a circularização por RNA ligase. A análise de RT-sqPCR mostrou uma fração muito pequena de nad5 mRNA circularizou quando o RNA total foi usado, mas a relação foi aumentada dramaticamente quando o RNA mitochondrial enriquecido foi usado (Figura 3B). Os resultados da RT-qPCR mostraram que a proporção de nad5 mRNA autoligada aumentou de 3,7% para 32% após o enriquecimento (Figura 3C). A análise de nad1 deu resultados semelhantes, e a eficiência de circularização do mRNA nad1 aumentou de 0,7% para 30% (Figura 3D-F).
Por essas análises, cerca de 30% das RNAs mitocondriais do milho foram autoligadas após a melhora, e a maior eficiência de circularização explica a fácil detecção das transcrições alvo por cRT-PCR.
Determinação do milho COX2 mRNA Termini usando a estratégia baseada em cRT-PCR
Utilizou-se o gene COX2 como exemplo para introduzir o mapeamento e a discriminação das transcrições mitocondriais do milho utilizando a estratégia baseada em CRT-PCR (Figura 4).
No início do mapeamento de COX2 mRNA, três primers voltados para o exterior CF1, CF2 e a-3 foram projetados na região codificadora de genes (Figura 4D). CF1 e CF2 foram iniciadores aninhados, e CF2 foi de 69 BP a jusante de CF1. Usando o modelo cDNAs sintetizado nas etapas 6.1 – 6.5 e normalizado nas etapas 7.1 – 7.6, o par de primers CF1 &-2 amplificou duas bandas proeminentes, e os resultados de amplificação foram repetidos por iniciadores aninhados CF2 & (figura 4a). Além disso, as duas bandas foram fortemente amplificadas a partir do 5 ' RNA tratado com poliphsophatase, enquanto eles eram difíceis de detectar na contraparte não tratada, sugerindo que eles são sensíveis ao RNA 5 ' poliphsophatase e têm primário 5 ' Termini.
As duas bandas candidatas foram denominadas COX2-1 e-2, e foram recuperadas independentemente do gel de agarose e clonadas em vetores. Os resultados da PCR da colônia mostraram que os clones positivos contêm inserções com tamanho variável, implicando 5 ' e/ou 3 ' Termini heterogêneos das transcrições (Figura 5). Os clones positivos foram sequenciados comercialmente e os dados de sequenciamento foram alinhados com o genoma mitocondrial do milho, conforme descrito na etapa 9,3.
Os resultados de sequenciamento e alinhamento mostraram que as duas transcrições foram idênticas a 3 ' extremidades, mas diferentes no comprimento de 5 ' UTRs (Figura 4D). As 5 ' extremidades de COX2-1 e-2 foram enriquecidas em 992-1030 e 1276-1283 NT upstream de agosto, respectivamente, quando sua extremidade 3 ' era 39 NT a jusante do Codon da parada. Deduzada dos resultados da cRT-PCR, os tamanhos calculados de COX2-1 e-2 foram de 1804 – 1832 e 2088 – 2095 NT, respectivamente.
Para verificar os resultados do mapeamento do cRT-PCR, a hibridação do borrão do gel do RNA foi executada usando a ponta de prova derivada da região da codificação do gene COX2 , e duas faixas principais com tamanho similar como COX2-1 e-2 foram detectadas (Figura 4C). Adicionalmente, duas faixas maiores sobre 2.500 e 2.800 NT foram detectadas no borrão do Norte, mas não foram amplificadas pelo cRT-PCR. As duas bandas maiores foram nomeadas como COX2-3 e-4, respectivamente. Para mapeá-los, outros dois primers voltados para o exterior (ou seja, CR2 e CF3), ancorados nos 5 ' e 3 ' UTRs de COX2-2, foram projetados, e suas posições estavam próximas às extremidades de transcrição esperadas de COX2-3 e-4. Usando o par da primeira demão CF3 & CR2, duas bandas principais foram amplificadas fortemente dos cDNAs derivados de 5 ' RNA polyphsophatase-Tratado mas não da contraparte não tratada (figura 4a). Os resultados de sequenciamento mostraram que tinham 5 ' Termini idênticos enquanto a variável 3 ' termina. O tamanho calculado das duas transcrições eram 2512/2513 e 2833 – 2835 NT, respectivamente, e eram próximos no tamanho com as duas faixas maiores detectadas no borrão do Norte. Além disso, os resultados de cRT-PCR sugeriram que cox2-3 e-4 têm 5 ' Termini preliminar.
Para confirmar os resultados da discriminação, cinco primers voltados para o exterior foram projetados de acordo com os resultados do mapeamento cRT-PCR, ou seja, qCF1, qCF2, qCR1, qCR2 e qCR3, e os pares de primer qCF1 & qCR1, qCF1 & qCR2, qCF1 & qCR3 e qCF2 & qCR3 foram usados para Análise de RT-qPCR de COX2-1,-2,-3, e-4, respectivamente. A abundância relativa de todos os quatro produtos de RT-qPCR em 5 ' a amostra polyphsophatase-tratada era muito mais elevada que aquelas na contraparte não tratada, que confirma os resultados da discriminação do cRT-PCR.
Em síntese, o padrão de transcrição do gene COX2 do milho é complicado, e a estratégia baseada em CRT-PCR efetivamente discrimina e mapeia as múltiplas isoformas de COX2 mRNA.
Figura 1: visão geral da estratégia baseada em cRT-PCR. Ilustração dos passos principais da estratégia baseada em cRT-PCR. 5 ' + e 5 '-= as duas amostras de RNA tratadas e não tratadas pelo RNA 5 ' polifosfatase, respectivamente. As duas amostras de cDNA derivadas de 5 ' RNAs polifosfatase-tratadas e não-tratadas são normalizadas por 26S amadurecem o rRNA no milho, e os transcritos preliminares e processados são discriminados comparando os produtos do cRT-PCR. Para o gene A, o RNA correspondente tem uma extremidade 5 ' preliminar porque a abundância do produto do PCR de 5 ' o RNA polyphosphatase-Tratado é muito mais elevada do que aquela da contraparte não tratada; para o gene B, os produtos do PCR dos dois jogos de RNAs mitochondrial são amplificados a nível comparável, implicando um 5 ' término processado do RNA correspondente. A região de codificação e as UTRs são representadas pela caixa cinzenta e linhas em negrito, respectivamente. CRT = primer para transcrição reversa; CF1, CF2,-3, e CR2 = primers do PCR que flanqueam a junção 5 '-três ' do transcrito molde; qCF e qCR = primers divergentes para RT-qPCR. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: avaliação da integridade do RNA mitocondrial por eletroforese em gel de agarose. (A) RNAs mitocondrial preparados a partir de grãos de milho 15-DAP. M = marcador molecular de DNA. (B) RNA mitocondrial do kernel após o tratamento por 5 ' polifosfatase e/ou circularização por T4 RNA ligase. 5 ' + = RNA mitocondrial após o tratamento por 5 ' polifosfatase; T4 & 5 ' + = RNA mitocondrial após o tratamento por 5 ' polifosfatase e circularização por T4 RNA ligase; T4 & 5 '-= RNA mitocondrial após circularização somente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: eficiência de circularização de mRNAs nad5 e NAD1 estimada pela RT-PCRs. (A) e (D) diagrama esquemático de genes nad5 e nad1 , respectivamente. Ex = eXoN. Os exons e os íntrons são mostrados como caixas cinzentas e linhas curvadas, respectivamente. A posição dos primers de transcrição reversa RT1 e RT2 é indicada por setas. Os pontos pretos indicam a posição de primers do PCR, e o tamanho previsto dos produtos do PCR é mostrado. sqF1, sqF2, sqR1 e sqR2 são primers para RT-sqPCR; qF1, qF2, qR1 e qR2 são primers para RT-qPCR. (B) e (e) RT-sqpcr análise da eficiência circularização de nad5 e nad1 mRNAs, respectivamente. M = marcador molecular de DNA. (C) e (F) RT-qPCR análise da eficiência de circularização de nad5 e nad1 mRNAs, respectivamente. As duas amostras de cDNA reversas transcritas pelos primers RT1 e RT2 são normalizadas por sqF2 & sqR2 (para RT-sqPCR) ou produtos de PCR qF2 & qR2 (para RT-qPCR). A eficiência da circularização de nad5 e nad1 mRNAs é estimada comparando-se os produtos de PCR de sqF1 & sqR1 (para RT-sqpcr) ou qF1 & qR1 (para RT-QPCR). circularized/(circularized + linear) = qF1 & qR1 sobre qF2 & qR2 em RT2 reação/qF1 & qR1 sobre qF2 & qR2 na reação RT1. Os valores são médias e SDs de três repetições biológicas. Para excluir a influência potencial por 5 ′ triphosphate, o RNAs foi tratado por 5 ′ polyphosphatase antes do self-ligation. Total e mito = RNAs total e mitocondrial, respectivamente. RT1 e RT2 = cDNAs reversa transcritos por primers RT1 e RT2, respectivamente, por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: mapeamento de COX2 maduro mRNA Termini usando a estratégia CRT-PCR-encaixotou. (A) separação do gel de produtos de COX2 cRT-PCR. + e-= cDNAs derivados de RNAs mitocondriais tratadas com polifosfatase 5 ′ e não tratadas, respetivamente. As duas amostras de cDNA foram normalizadas por amplificação de 26S cDNA (26S). Cinco primers são usados para a análise do cRT-PCR de COX2 mRNA molde: CF1, CF2, e CF3 são iniciadores aninhados, e CF2 e CF3 são 69 e 138 BP a jusante de CF1, respectivamente; Os iniciadores e o CR2 são os primers aninhados, e a 1.288 a montante da PB. As bandas indicadas por ' 1 ' e ' 2 ' foram amplificadas por CF1 & e CF2 &, enquanto as bandas ' 3 ' e ' 4 ' foram amplificadas por CF3 & CR2. Todas as quatro bandas foram seqüenciadas pela clonagem. As bandas marcadas por asteriscos não puderam ser repetidas, e foram excluídas dos resultados. M = marcador molecular de DNA. (B) análise de RT-qPCR da abundância relativa de mRNA molde de COX2 após o tratamento de 5 ' polyphosphatase. As duas amostras de cDNA foram sintetizadas por uma mistura de primer contendo 26S-CRT, COX2-CRT, nad5-CRT, nad6-CRT, nad7-CRT, nad9-CRT, Cob-CRT e cox1-CRT em proporção igual, e o cDNA derivado de 26S maduro rRNA foi usado para normalização. +/-= COX2 sobre 26S na amostra tratada/Cox2 sobre 26S na amostra não tratada. Os valores representam médias e DP de três repetições biológicas. Os primers usados para RT-qPCR são indicados. (C) análise do Northern blot de transcrições COX2 . 2 μg de RNA mitocondrial foi carregado. As bandas correspondentes a diferentes isoformas de COX2 maduro mRNA são marcadas. (D) transcrição Termini de COX2 mRNA Deduzada dos resultados da cRT-PCR. Os UTRs e os frames de leitura abertos são mostrados como linhas bold (realce) e caixas cinzentas, respectivamente. As posições de 5 ' e 3 ' Termini em relação a AUG (+ 1) e UAA (-1), e números de clones individuais sequenciados nessas posições são mostrados. As posições de transcrição reversa e primers de amplificação de PCR são mostradas como cabeças de seta fechadas e abertas, respectivamente. Os primers voltados para o exterior usados para RT-qPCR são mostrados como quadrados abertos, e a posição da sonda COX2 é a indicada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: seleção de clones positivos contendo COX2-4 inserções por PCR de colônia. (A) colônia PCR para tela clones únicos contendo inserções COX2-4. O tamanho da inserção COX2-4 é aproximadamente 1.165 BP, e aquele das seqüências do vetor é 100 BP. O tamanho calculado de produtos da PCR da colônia é aproximadamente 1.265 BP, e aqueles clones que contêm inserções pequenas do tamanho não foram sequenciados, isto é, números 11, 14, 22, e 23. (B) resultados de sequenciamento dos clones positivos selecionados em (a). 5 '/3 ' extremidades = as extremidades 5 ' e 3 ' em relação a AUG (+ 1) e UAA (-1), respectivamente. Os resultados de seqüenciamento dos números 12 e 20 foram excluídos por serem muito menores que os demais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Componente | Volume para 50 μL de reacção (μL) | Concentração final |
| 10x RNA 5 ' tampão de polifosfatase | 5 | 1x |
| Inibidor de RNase (40 U/μL) | 0,75 | 0,6 U/μL |
| RNA mitocondrial | X | 0,2 μg/μL |
| RNA 5 ' polifosfatase (20 U/μL) | 2,5 | 1 U/μL |
| DEPC-tratada H2O deionizada | a 50 μL | - |
Tabela 1: componentes de reação do RNA 5 ' tratamento da polifosfatase.
| Componente | Volume para uma reacção de 20 μL (μL) | Concentração final |
| 10x T4 RNA ligase I tampão | 2 | 1x |
| dATP (1 mM) | 1 | 50 μM |
| PEG8000 (50%) | 6 | 15 |
| Inibidor de RNA (40 U/μL) | 0,5 | 1 U/μL |
| 5 ' RNA mitocondrial polifosfatase tratada ou não tratada | X | 0,1 ~ 0,2 μg/μL |
| T4 RNA ligase I (30 U/μL) | 0,4 | 0,6 U/μL |
| H2O desionizado tratados com DEPC | a 20 μL | - |
Tabela 2: componentes de reação da circularização do RNA mitocondrial.
| Componente | Volume para 10 μL de pré-mistura (μL) |
| Mistura de primer (1 μM total)a | 2 |
| mistura dNTP (10 mM cada) | 1 |
| 5 ' polifosfatase-Tratado ou não-tratado mitochondrialb de circularized RNA | X |
| DEPC-tratada H2O deionizada | a 10 μL |
Tabela 3: pré-mistura para reação de transcrição reversa. um A mistura da primeira demão contem a relação igual de 26S-CRT e até 7 outros primers de RT, e a concentração final é 1 μm. bduas pré-misturas são preparadas lado a lado, e contêm a mesma quantidade (200 ng) de 5 ' polyphosphatase-tratados molde ou ARN mitocondrial não tratado.
| Componente | Volume para o sistema de reacção de 20 μL (μL) | Concentração final |
| Modelo RNA/primer/dNTP * | 10 | - |
| 5x buffer RTase | 4 | 1x |
| Inibidor de RNase (40 U/μL) | 0,5 | 1 U/μL |
| RTase (200 U/μL) | 1 | 10 U/μL |
| H2O desionizado tratados com DEPC | a 20 μL | - |
Tabela 4: componentes de reação de transcrição reversa. * O modelo RNA/primer/dNTP pré-misturas preparadas no passo 6,3.
| Componente | Volume para o sistema de reacção de 20 μL (μL) | Concentração final |
| H deionized2O | 7 | - |
| 2x tampão de reacção | 10 | 1x |
| mistura dNTP (10 mM cada) | 0,4 | 0,2 mM cada |
| 26S-CF1 (10 μM) | 0,8 | 0,4 milímetros |
| 26S-(10 μM) | 0,8 | 0,4 milímetros |
| Modelos cDNA derivados de RNAs de 5 ' polifosfatase tratadas ou não tratadas circularizadas * | 0,6 | - |
| DNA polimerase (1 U/μL) | 0,4 | 0, 2 U/μL |
Tabela 5: componentes de reação para amplificação de PCR de 26S cDNA. * Inicialmente, o volume igual do modelo cDNAs (0,6 μL) é usado para a normalização. Se necessário, mude as quantidades de cDNAs do molde para assegurar a mesma abundância de produtos do PCR 26S entre as duas reações do PCR.
| Passo | Temperatura | Tempo | Número do ciclo |
| Desnaturação inicial | 95 ° c | 3 minutos | 1 ciclo de |
| Desnaturação | 95 ° c | 15 seg. | 22 – 25 ciclos |
| Recozimento da primeira demão | 56 ° c | 15 seg. | |
| Extensão | 72 ° c | 30 seg. | |
| Extensão final | 72 ° c | 5 minutos | 1 ciclo de |
| Segurar | 4 ° c | ∞ | - |
Tabela 6: condições de PCR para amplificar 26S de cDNA para normalização.
| Componente | Volume para sistema de reacção de 20 μL (μL) | Concentração final |
| H2O deionizada | a 20 μL | - |
| 2x tampão de reacção | 10 | 1x |
| mistura dNTP (10 mM cada) | 0,4 | 0,2 mM cada |
| Primer-Forward divergente (10 μM) | 0,8 | 0,4 milímetros |
| Primer-reverso divergente (10 μM) | 0,8 | 0,4 milímetros |
| Modelo cDNA derivado das RNAs de 5 ' polifosfatase tratadas ou não tratadas circularizadas * | X | - |
| DNA polimerase (1 U/μL) | 0,4 | 0, 2 U/μL |
Tabela 7: componentes da reação para a amplificação do PCR dos transcritos molde do alvo. * O volume de cDNAs modelo utilizado nestas reacções são determinados pelos resultados de normalização 26S rRNA.
| Passo | Temperatura | Tempo | Número do ciclo |
| Desnaturação inicial | 95 ° c | 3 minutos | 1 ciclo de |
| Desnaturação | 95 ° c | 15 seg. | 22-40 ciclos c |
| Primer recozimento a | 50-65 ° c | 15 seg. | |
| Extenstion b | 72 ° c | 0.5-1 minuto | |
| Extensão finatl | 72 ° c | 5 minutos | 1 ciclo de |
| Segurar | 4 ° c | ∞ | - |
Tabela 8: condições de PCR para amplificar as transcrições alvo. um O recozimento exato temperado depende da temperatura de derretimento dos primers do PCR. b O tempo do alongamento depende do comprimento do alvo a ser amplificado. O tempo recomendado é 1 minuto por 1 KB do fragmento do PCR. c Em geral, 30 ~ 35 ciclos são suficientes para produzir uma quantidade adequada de produto de PCR. Para transcritos de baixa abundância, aumente o número de ciclos de até 40 ciclos.
Figura S1: posição dos primers para transcrições mitocondriais representativas do milho. CRT = primer de transcrição reversa; CF1, CF2, a-2, e CR2 = primers divergentes para amplificação de PCR; qCF e qCR = primers divergentes para RT-qPCR. A transcrição Termini do milho nad2-1, rps4-1 e nad4-1 foram determinadas previamente (Zhang et al., 20191). As posições de 5 '-e 3 '-extremidades relativas a agosto (+ 1) e o último nucleotide do Codon da parada (-1) são mostrados. As regiões de codificação e as UTRs são indicadas como caixas cinzentas e linhas em negrito, respectivamente. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
Figura S2: princípio para estimar a eficiência da circularização de nad5 mRNA em milho. Em uma reação da Self-ligadura, somente uma fração de RNAs mitochondrial é circularized. Para calcular a razão de nad5 mRNA molde, dois primers gene-específicos são usados para sintetizar a primeira vertente cDNAs, isto é, nad5-rt1 e-rt2. Na reação de transcrição reversa nad5-rt2 (RT), os produtos de PCR amplificados por SqF2 & sqR2 (para RT-sqpcr) e QF2 & qR2 (para RT-QPCR) são derivados de nad5 lineares e circularizados , enquanto o sqF1 & sqR1 (para RT-Sqpcr) e qF1 & qR1 (para RT-QPCR) os produtos do PCR são derivados do nad5 molde somente; na reação nad5-rt1, todos os quatro pares de primers do PCR podiam amplificar ambas as formas de nad5. Para calcular a razão de nad5 mRNA molde, as duas reações são normalizadas pelos produtos de sqF2 & sqR2 ou qF2 & qR2 PCR. Comparando a abundância de produtos sqF1 & sqR1 ou qF1 & qR1 PCR entre as duas reações de RT, a eficiência de circularização de nad5 mRNA é aproximadamente estimada. ex = eXoN. Os exons e os íntrons são mostrados como caixas cinzentas e linhas curvadas, respectivamente. As posições dos primers nad5-rt1 e-rt2 são indicadas por setas. Os pontos pretos indicam as posições de primers do PCR, e o tamanho previsto dos produtos do PCR é mostrado. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela S1: informações da cartilha. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Em estudo prévio, foram utilizados RNAs totais e mitocondriais da cultura de suspensão celular de Arabidopsis para mapear a transcrição mitocondrial Termini por CRT-PCR, e resultados semelhantes foram obtidos12. No entanto, apenas o RNA mitocondrial enriquecido foi utilizado para mapear a transcrição mitocondrial Termini em muitos outros estudos1,2,3,9. Nós encontramos que o enriquecimento do RNA mitochondrial é uma etapa importante para o traço do cRT-PCR do transcrito mitochondrial Termini no milho. Após esse enriquecimento, a razão entre o RNA mitocondrial circularizado é aumentada drasticamente de 0,3% – 3,7% para ~ 30% (Figura 3 e Figura S2), o que torna possível a amplificação de transcrições de alvos circularizados em uma rodada de PCR.
A eficiência da circularização do RNA mitocondrial foi estimada pela análise de RT-PCR sobre o milho nad1 e nad5, ambos divididos em precursores independentes por introns de emenda cis. Porque a influência potencial da presença de RNAs do precursor assim como a variação da eficiência de RT não poderia ser descartada, esta é somente uma estimativa áspera da eficiência mitochondrial real da circularização do RNA.
Nós alteramos as condições da Self-ligadura alterando a concentração do RNA mitochondrial e do PEG8000, assim como alongando o tempo da incubação, mas estas mudanças não pareceram afetar a eficiência mitochondrial do circularização do RNA. Embora não tenhamos certeza se a purificação do gradiente de Percoll poderia aumentar a eficiência da circularização, a qualidade da mitocôndria bruta preparada na seção 2 é suficientemente boa para o mapeamento cRT-PCR da transcrição mitocondrial Termini em milho. Desde que as rodadas múltiplas de PCRs podem causar resultados positivos falsos, a amplificação de transcritos do alvo em um PCR redondo faz os resultados do traço mais de confiança.
O 5 ' trifosfato de transcritos preliminares é instável, e poderia ser convertido a 5 ' monofosfato por razões desconhecidas. Esse problema dificulta uma clara diferenciação entre as transcrições primárias e processadas por meio de abordagens, dependendo da presença/ausência de 5 ' trifosfato1,2,4. A forma madura de milho 26S rRNA tem um monofosodiado 5 ' final, e é insensível ao RNA 5 ' polifosfatase. Para minimizar a influência do 5 ' triphospahte instável, o rRNA 26S maduro é usado para normalizar as duas amostras do RNA, tratadas e não tratadas por 5 ' polyphosphatase, e mostra-se ser uma etapa importante para diferenciar os dois tipos de transcritos no milho Mitochondrion. Após a normalização, as transcrições primárias e processadas podem ser discriminadas comparando-se os resultados de cRT-PCR e RT-qPCR obtidos a partir de 5 amostras de RNA tratadas com polifosfatase e não tratadas. Os transcritos preliminares são sensíveis a 5 ' polyphosphatase, e são amplificados fortemente da amostra 5 ' polyphosphatase-tratada mas não (ou em um nível muito baixo devido ao triphosphate 5 ' instável) da contraparte não tratada. Por outro lado, as transcrições processadas são detectadas em níveis comparáveis entre as duas amostras.
Nas plantas, os padrões de transcrição de muitos genes mitocondriais são bastante complicados1,2. Por exemplo, os genes nad6 e atp6 do milho são expressos como monocistrons e dicistrons, e nad6, Atp6, e atp6-na6 maduro mRNAs têm dois, três, e dois isoforms, respectivamente. Além disso, a população de transcrição de um gene mitocondrial é na verdade uma mistura de RNAs precursores, maduros e degradantes. Os PCRs são propensos a amplificar moléculas de tamanho pequeno, e é difícil detectar todas as isoformas de transcrição usando um par de primers. Conseqüentemente, a hibridação do borrão do gel do RNA é exigida para verificar os resultados do traço do CRT-PCR, e os primers alternativos podem ser necessários amplificar aqueles transcritos detectados no borrão do Norte mas não pela primeira vez CRT-PCR.
Este protocolo inclui uma etapa de RT-qPCR para verificar os resultados da discriminação do cRT-PCR. Porque as isoformas múltiplas de alguns mRNAs maduros são muito próximas no tamanho1, é impossível confirmar de todos os resultados da discriminação por RT-qPCR, e algumas transcrições do estado estacionário foram determinadas comparando os resultados do CRT-PCR entre o Tratado e RNAs não tratadas.
Neste protocolo, os 5 ' e 3 ' Termini das transcrições alvo foram mapeados pela clonagem e sequenciamento dos produtos cRT-PCR, e limita o número de clones individuais a serem sequenciados. Como um método alternativo, os produtos do cRT-PCR podiam ser sequenciados pelo sequenciamento da próxima geração, que sequencia milhares de moléculas para um conjunto de transcrições de estado estacionário, e os resultados do mapeamento seriam mais precisos.
Além da discriminação de 5 ' Termini primária e processada por cRT-PCR e RT-qPCR, o monofosfato 5 ' Termini poderia ser determinado pela identificação das estruturas secundárias do RNA circunvizinho1,12. É sabido que as estruturas secundárias do RNA tais como o tRNA e o t-elemento podiam mediar a formação mitochondrial da extremidade do Transcript dirigindo clivagens endonucleolítica de RNase P e/ou RNase Z12,18,19, vinteanos. Portanto, os 5 ' Termini adjacentes ao tRNA ou t-Element devem ser derivados do processamento pós-transcricional e conter monofosfatos.
Ao utilizar este protocolo, uma grande parte das transcrições de estado estacionário foi determinada nas mitocôndrias do milho1. No entanto, alguns não foram diferenciados e/ou mapeados por motivo desconhecido1. Além disso, pensamos que a posição de 5 ' transcrição Termini é melhor para ser confirmado pela análise de extensão de primer, embora seja incluído neste protocolo. Devido à falta de dados experimentais, não temos certeza se esta estratégia é adequada para outras espécies de plantas, como arroz (Oryza sativa) e Arabidopsis. Além das mitocôndrias vegetais, as transcrições primárias e processadas estão estavelmente acumuladas em plastídios21, e é incerto se essa estratégia poderia ser utilizada para mapear e discriminar transcritos plastid.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (Grant no. 31600250, Y.Z.), ciência e projetos de tecnologia da cidade de Guangzhou (subvenção n º 201804020015, H.N.), e do sistema de pesquisa agrícola da China (não conceder. CARROS-04-PS09, H.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Aladdin, China | A112880 | To prepare 1x TAE buffer |
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific, USA | 4359659 | Thermal cycler for PCR amplification |
| Ascorbic acid | Sigma-aldrich, USA | V900134 | For preparation of extraction buffer |
| Biowest Agarose | Biowest, Spain | 9012-36-6 | To resolve PCR products and RNAs |
| Bovine serum albumin | Sigma-aldrich, USA | A1933 | For preparation of extraction buffer |
| Bromophenol blue | Sigma-aldrich, USA | B8026 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot |
| DEPC | Sigma-aldrich, USA | V900882 | Deactivation of RNase |
| DIG Northern starter kit | Roche, USA | 12039672910 | For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection. |
| EDTA | Sigma-aldrich, USA | V900106 | For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer |
| EGTA | Sigma-aldrich, USA | E3889 | For preparation of wash buffer |
| Gel documentation system | Bio-Rad, USA | Gel Doc XR+ | To image the agarose gel |
| Glycerol | Sigma-aldrich, USA | G5516 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
| GoldView II (5,000x) | Solarbio,. China | G8142 | DNA staining |
| Hybond-N+, Nylon membrane | Amersham Biosciences, USA | RPN119 | For Northern blot |
| Image Lab | Bio-Rad, USA | Image Lab 3.0 | Image gel, and compare the abundance of PCR products. |
| KH2PO4 | Sigma-aldrich, USA | V900041 | For preparation of extraction buffer |
| KOH | Aladdin, China | P112284 | For preparation of extraction buffer |
| L-cysteine | Sigma-aldrich, USA | V900399 | For preparation of extraction buffer |
| Millex | Millipore, USA | SLHP033RB | To sterile extraction and wash buffers by filtration |
| Miracloth | Calbiochem, USA | 475855-1R | To filter the ground kernel tissues |
| MOPS | Sigma-aldrich, USA | V900306 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, USA | 2000C | For RNA concentration and purity assay |
| NaOH | Sigma-aldrich, USA | V900797 | For preparation of wash buffer |
| pEASY-Blunt simple cloning vector | TransGen Biotech, China | CB111 | Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site. |
| Phanta max super-fidelity DNA polymerase | Vazyme, China | P505 | DNA polymerase for PCR amplification |
| Polyvinylpyrrolidone 40 | Sigma-aldrich, USA | V900008 | For preparation of extraction buffer |
| Primer Premier 6.24 | PREMIER Biosoft, USA | Primer Premier 6.24 | To design primers for reverse transcription and PCR amplification |
| PrimeScript II reverse transcriptase | Takara, Japan | 2690 | To synthesize the first strand cDNA |
| PureLink RNA Mini kit | Thermo Fisher Scientific, USA | 12183025 | For RNA purificaion |
| RNA 5' polyphosphatase | Epicentre, USA | RP8092H | To convert 5' triphosphate to monophosphate |
| RNase inhibitor | New England Biolabs, UK | M0314 | A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase. |
| Sodium acetate | Sigma-aldrich, USA | V900212 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich, USA | V900058 | To prepare 20x SSC |
| SsoFas evaGreen supermixes | Bio-Rad, USA | 1725202 | For RT-qPCR |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs, UK | M0437 | For RNA circularization |
| Tetrasodium pyrophosphate | Sigma-aldrich, USA | 221368 | For preparation of extraction buffer |
| TIANgel midi purification kit | Tiangen Biotech, China | DP209 | To purify DNA fragments from agarose gel |
| Tris | Aladdin, China | T110601 | To prepare 1x TAE buffer |
| TRIzol reagent | Invitrogen, USA | 15596026 | To extract mitochondiral RNA. |
| Universal DNA purification kit | Tiangen Biotech, China | DP214 | To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction |
| Xylene cyanol FF | Sigma-aldrich, USA | X4126 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
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