Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Дискриминация и картирование первичных и обработанных стенограмм в митохондрии кукурузы с использованием круговой стратегии на основе РТ-ПЦР

Published: July 29, 2019 doi: 10.3791/60019
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2, 2, 1,2, 1,2, 1,2
1State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources, South China Agricultural University, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Molecular Breeding, College of Agriculture, South China Agricultural University

Summary

Мы представляем круговую стратегию на основе РТ-ПЦР путем объединения круговой РТ-ПЦР, количественного RT-PCR, полифосфатазы РНК 5 и Северной подья. Этот протокол включает в себя шаг нормализации, чтобы свести к минимуму влияние нестабильной 5' трифосфат, и он подходит для распознавания и отображения первичных и обработанных стенограмм стабильно накопленных в митохондрии кукурузы.

Abstract

В митохондриях растений, некоторые устойчивые состояния стенограммы имеют 5' трифосфат, полученный из транскрипции инициации (первичные транскрипты), в то время как другие содержат 5' монофосфата, генерируемого посттранскриптионно (обработанные транскрипты). Для разлиения между этими двумя типами стенограмм было разработано несколько стратегий, и большинство из них зависит от наличия/отсутствия 5' трифосфата. Тем не менее, трифосфат на первичном 5 ' termini нестабилен, и это препятствует явной дискриминации двух типов стенограмм. Для систематического дифференцировать и картировать первичные и обработанные транскрипты, старично накопленные в митохондрии кукурузы, мы разработали круговую стратегию на основе RT-PCR (cRT-PCR) путем объединения cRT-PCR, лечения полифошпатазы RNA 5, количественной РТ-ПЦР (РТ-кПкР) и Северная поместье. В качестве улучшения, эта стратегия включает в себя шаг нормализации РНК, чтобы свести к минимуму влияние нестабильной 5' трифосфата.

В этом протоколе обогащенная митохондриальная РНК предварительно обрабатывается полифосфатами РНК 5, которая преобразует 5' трифофат в монофосфат. После круговой и обратной транскрипции, два cDNAs, полученных из 5' полифосфатазы и необработанных РНК нормализуются кукурузой 26S зрелой rRNA, которая имеет обработанный 5 ' конец и нечувствительна к 5' полифосфаза. После нормализации первичные и обработанные транскрипты дискриминируются путем сравнения продуктов cRT-PCR и RT-qPCR, полученных из обработанных и необработанных РНК. Транскрипт термини определяются путем клонирования и секвенирования продуктов CRT-PCR, а затем проверяются Северной подись.

С помощью этой стратегии, наиболее устойчивый состояние стенограммы в митохондрии кукурузы были определены. Из-за сложной схемы транскрипта некоторых митохондриальных генов, несколько транскриптов устойчивого состояния не были дифференцированы и/или отображены, хотя они были обнаружены в северной погредете. Мы не уверены, подходит ли эта стратегия для дискриминации и картирования стабильного состояния стенограммы в других митохондриях растений или в пластидов.

Introduction

В митохондриях растений, многие зрелые и предшественники РНК накапливаются как несколько изоформ, и устойчивый состояние стенограммы могут быть разделены на две группы на основе разницы в их 5 'концы1,2,3, 4. Первичные транскрипты имеют 5' трифосфатных концов, которые получены от инициации транскрипции. В отличие от этого, обработанные транскрипты имеют 5' монофосфат, генерируемый посттранскрипционной обработкой. Дискриминация и картирование двух типов транскриптов имеют важное значение для разгадки молекулярных механизмов, лежащих в основе транскрипции и транскрипта конца созревания.

Для проведения различия между первичными и обработанными транскриптами в митохондрии растений были разработаны четыре основные стратегии. Первая стратегия заключается в предварительной обработке митохондриальных РНК с табачной кислотой пирофосфаза (TAP), которая преобразует 5' трифосфат в монофосфат и позволяет первичных транскриптов быть циркуляризированы РНК лигазы. Стенограмма обилия TAP-обработанных и необработанных образцов РНК затем сравниваются путем быстрого усиления концов кДНК (RACE) или круговой RT-PCR (cRT-PCR)2,3,4. Во второй стратегии, обработанные стенограммы сначала истощаются из митохондриальных РНК с использованием терминатора 5'-фосфат-зависимых экзонуклеизы (TEX), и первичные стенограммы слева затем отображаются грунтового анализа расширения5,6 . Третья стратегия заключается в предварительной крышкой первичных стенограмм с использованием guanylyl transferase, а затем положение triphosphated 5 ' termini определяется грунтовка расширение вместе с ribonuclease или S1 нуклеаза анализ защиты7,8 ,9. В отличие от тех, в зависимости от наличия / отсутствия 5' трифосфата, четвертая стратегия сочетает в себе в пробирке транскрипции, сайт-направленный мутагенез, и анализ расширения грунтовки, чтобы охарактеризовать предполагаемых промоутеров и определить транскрипцию сайтыпосвящения 8,10,11. С помощью этих стратегий, многие первичные и обработанные стенограммы были определены в митохондриях растений.

Тем не менее, несколько исследований сообщили, что 5' трифосфат первичных стенограмм были нестабильны, и они были легко преобразованы в монофосфат по неизвестной причине2,4,12,13. Эта проблема препятствует явной дискриминации двух типов стенограмм с помощью методов в зависимости от наличия/отсутствия 5' трифосфата, а также предыдущих попыток систематически различать первичные и обработанные транскрипты на заводе митохондрий не удалось2,12.

В этом протоколе мы объединяем cRT-PCR, лечение полифосфатазы РНК 5, RT-qPCR и Северный пятно, чтобы систематически различать первичные и обработанные транскрипты, стабилизированные в кукурузе(Цеа май)митохондрион (рисунок1). cRT-PCR позволяет одновременное отображение 5' и 3' конечностей молекулы РНК, и это обычно адаптированы для карты транскрипт термини в растениях2,12,14,15. ПОЛифосфатаза РНК 5'может удалить два фосфата из трифосфатных 5' termini, что делает первичные транскрипты доступны для самостоятельной лигиции РНК лигаза. Предыдущие исследования показали, что зрелые 26S rRNA в кукурузе были обработаны 5 ' терминов, и он был нечувствительным к РНК 5' полифосфатаза1,16. Чтобы свести к минимуму влияние нестабильного трифосфата на первичные 5' термини, 5' полифосфатазно-обработанные и необработанные РНК нормализуются зрелыми 26S rRNA, а первичные и обработанные транскрипты затем дифференцированы путем сравнения продукты cRT-PCR, полученные из двух образцов РНК. Результаты картирования и дискриминации cRT-PCR проверяются соответственно "Северным пятном" и РТ-кПкР. Наконец, альтернативные праймеры используются для усиления этих транскриптов, обнаруженных в Северном пятно, но не cRT-PCR. С помощью этой стратегии на основе cRT-PCR, наиболее устойчивый состояние стенограммы в митохондрии кукурузы были дифференцированы и отображены1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Праймер Дизайн

  1. Дизайн генных праймеров для обратной транскрипции (RT) с использованием ПЦР праймер дизайн программного обеспечения (Таблица материалов) на основе общих правил грунтовки дизайн17.
    ПРИМЕЧАНИЕ: RT праймеры очень специфичны для целевых стенограмм, и они, как правило, закреплены на 5 ' часть последовательности кодирования (зрелые мРНК и прекурсор РНК), или 500-600 nt вниз по течению ожидаемого 5 ' конец (18S и 26S rRNAs).
  2. Дизайн пары расходящихся грунтовки для усиления циркулярных стенограмм по cRT-PCR.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Парные расходящихся грунтовки фланг 5'-3 'стыковка круговых стенограмм, и их позиции варьируются между целевой стенограммы проанализированы (Рисунок S1). Некоторые стенограммы имеют длинные UTRs; например, nad2-1 5' UTR и rps4-1 3' UTR 1,985 и 1,826/1,834 nt, соответственно1. Если оба грунтовки закреплены на области кодирования, будет трудно усилить целевые транскрипты. В отличие от этого, некоторые UTRs являются короткими; например, 3' UTRs nad2-1 и nad4-1 являются 34/35 и 29-31 nt, соответственно1. Если парные грунтовки расположены далеко от последовательностей кодирования, ПЦР выйдет из строя. Как правило, две пары расходящихся праймеров предназначены для каждой целевой стенограммы, в то время как несколько пар могут быть необходимы для картирования тех, чьи модели стенограммы являются сложными и / или UTRs очень долго.
  3. Дизайн пары конвергентных грунтовки для подготовки РНК зондов для Северной подьеносец.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Парные грунтовки расположены на области кодирования целевого гена, а размер продукта ПЦР должен находиться в диапазоне от 100 до 1000 б.п. Каждый передний грунтовка должен содержать место фермента ограничения, чтобы свести к минимуму векторные последовательности в результирующих зондах.

2. Подготовка сырой митохондрии из кукурузы развивающихся ядер

  1. Стерилизовать пестики, растворы, стеклянные воронки, трубки, и советы автоклава, и высушить их в духовке.
  2. Выполняйте все процедуры при 4 градусах Цельсия или на льду, и предварительно охладить все растворы.
  3. Подготовка 100 мл буфера извлечения (EB), состоящий из 0,3 М сахарозы, 5 мМ тетранадия пирофосфат, 10 мМ KH2PO4, 2 мМ EDTA, 1% "W / V" polyvinylpyrrolidone 40, 1% "W / V" сывороточной сыворотки, 5 мМ L-цистеин, и 20 м. Отрегулируйте к pH 7.3 с KOH и стерилизовать фильтрацией.
  4. Приготовьте 100 мл буфера для мытья (WB), состоящего из 0,3 М сахарозы, 1 мМ EGTA и 10 мМ MOPS (3-(N-morpholino)пропанесульфоновая кислота). Отрегулируйте к pH 7.2 с NaOH и стерилизовать фильтрацией.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предлагается подготовить EB и WB с использованием DEPC-обработанных деионизированных H2O.
  5. Соберите 20 г развивающихся ядер через 11–20 дней после опыления (DAP) в трубку 50 мл, размещенную на льду, а затем перенесите ядра в предварительно охлажденные минометы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте соотношение 100 мл EB до 20 г ядер кукурузы.
  6. Добавьте 10-20 мл ледяного EB к каждому раствору и полностью измельчите ядра.
  7. Добавить больше EB, и фильтровать землю тканей через два слоя фильтра ткани (Таблица материалов).
  8. Centrifuge фильтрата на 8000 х г в течение 10 минут, и отбросить гранулы.
  9. Перенесите супернатант на новую трубку и центрифугиего на 20000 х г в течение 10 минут.
  10. Налейте супернатант, и resuspend гранулы в 6 мл ВБ.
  11. Aliquot подвески до пяти 1,5 мл RNase-бесплатных труб, и центрифуга их на 14000 х г в течение 5 минут.
  12. Откажитесь от супернатанта, заморозьте митохондриальные гранулы в жидком азоте и храните при -80 градусах Цельсия.

3. Извлечение митохондриальной РНК

  1. Извлекайте митохондриальную РНК с помощью коммерческого реагента(Таблицаматериалов) в соответствии с инструкциями производства.
    ПРЕДЕКТО: Этот реагент содержит фенол и гуанидин изотиоцианат. Работайте с ним в дымовом капюшоне, и носите лабораторное пальто и перчатки.
  2. Растворите изолированную митохондриальную РНК в DEPC-обработанной деионизированной H2O, и оцените концентрацию РНК и чистоту с помощью спектрофотометра (Таблицаматериалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, митохондриальная РНК в размере 250 евро получается из 20 г ядер кукурузы 15-DAP.
  3. Приготовьте один агарозный гель, состоящий из 1x буфера TAE (40 мм Tris, 20 мм уксусной кислоты, 1мМ EDTA), 1,5% агарозы(Таблицаматериалов), и 1x ядерного окрашивания красителя (Таблицаматериалов).
  4. Добавьте соответствующий объем 10-кратного буфера загрузки (0,5% бромофенола синего, 0,5% ксилена цианола FF и 50% глицерола) и загрузите митохондриальную РНК/загрузку буферной смеси на 1,5% геля агарозы.
  5. Запустите гель в буфере 1x TAE на 5-6 V/cm в течение 20-25 мин, и оценить целостность митохондриальной РНК путем визуализации геля с системой документации геля(Таблица материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие двух различных полос (3 510 евро и 1 970 nt для митохондриальных 26S и 18S rRNA, соответственно) является приемлемым стандартом для нетронутой митохондриальной РНК. Чтобы исключить возможную деградацию, целостность РНК должна быть исследована в течение нескольких этапов круговой подготовки РНК(рисунок 2).

4. РНК 5' Полифосфатаза Лечение

  1. Настройте полифосфатазу РНК 5'(Таблица и материалы)лечение (таблица1),и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 30-60 мин.
  2. Восстановите 5' полифосфатазы обработанных РНК с РНК очистки комплекта (Таблица материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
  3. Повторите шаги от 3,3 до 3,5.

5. Рнка Круговая

  1. Подготовьте две реакции круговой циркуляции, используя те же количества 5' полифосфатазы и необработанных митохондриальных РНК(Таблица 2), и инкубировать обе реакции при 16 градусов по Цельсию в течение 12-16 ч.
  2. Восстановить два набора самолигированных РНК с помощью того же комплекта, что и в шаге 4.2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует отметить, что только часть митохондриальной РНК будет самолигитированной, а восстановленная РНК будет смесью линейных и круговых транскриптов.
  3. Повторите шаги от 3,3 до 3,5.

6. Обратная транскрипция

  1. Синтезировать два набора кДНС из одного и того же количества циркулярных 5' полифосфатазных и необработанных РНК (200 нг).
  2. Подготовьте грунтовую смесь, добавив равное соотношение 26S-CRT и до 7 других праймеров RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация грунтовой смеси должна сосуться 1 км.
  3. Подготовка двух предварительной смеси путем объединения реагентов, перечисленных в таблице 3, инкубировать при 65 градусов по Цельсию в течение 5 минут, а затем охладить на льду в течение 2 мин.
  4. Соберите две системы реакции RT(таблица4), и инкубировать их при 42 градусах по Цельсию в течение 50 минут.
  5. Нагрейте обе реакции RT при температуре 70 градусов по Цельсию в течение 5 минут, а затем охладите их на льду.

7. Нормализация

  1. Подготовьте две реакции ПЦР, добавив тот же объем шаблона cDNAs, полученных из 5' полифосфатазы или необработанных РНК, расходящихся грунтовки, фланговые 5'-3 'соединения круговой 26S rRNA (т.е. 26S-CF1 и -CR1), и т.д. (Таблица 5).
  2. Выполнить две реакции в тепловой циклатор (Таблица материалов) в условиях, описанных в таблице 6.
  3. Приготовьте один агарозный гель, состоящий из буфера 1x TAE, 1,0% агарозы и 1x ядерного окрашивания красителя.
  4. Добавьте 2 буфера загрузки 10x (0,5% бромофенол синий, 0,5% ксилена цианола FF, и 50% глицерола) к каждому из двух продуктов ПЦР, и загрузить их на гель.
  5. Запустите гель в буфере 1x TAE на 5-6 V/cm в течение 30-40 мин, и изображение его с помощью той же системы документации геля, как шаг 3.5.
  6. Сравните обилие двух продуктов PCR с помощью компьютерного программного обеспечения(Таблица материалов, Рисунок 4A),и оптимизировать нормализацию путем изменения количества шаблонов cDNAs при необходимости.

8. Усиление ПЦР

  1. Подготовьте пары реакций ПЦР, добавив соответствующий объем нормализованных cDNA и пару дивергентных грунтовок фланговых 5'-3'соединения целевых транскриптов(Таблица 7).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество шаблонов cDNA, используемых для pcR-усиления целевых транскриптов, определяется результатами нормализации 26S rRNA.
  2. Выполните реакции ПЦР в соответствии с программой, описанной в таблице 8.
  3. Повторите шаги от 7,3 до 7,5.
  4. Изменение вложенных дивергентных праймеров и проверка результатов ПЦР в первом раунде, повторяя шаги 8.1 и 8.2.
  5. Повторите шаги от 7,3 до 7,5.
  6. Восстановить видные полосы, которые могут быть повторены в двух раундах pcR усиления с помощью комплекта гель ДНК восстановления(Таблица материалов).

9. Определение Стенограммы Термини

  1. Клонировать гель-очищенные продукты ПЦР в тупой вектор(Таблица материалов) с использованием стандартных методов.
  2. Выполните колонии PCR, чтобы выбрать положительные клоны, содержащие целевые вставки, и последовательности их коммерчески.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Положительные клоны, содержащие вставки с переменным размером, как правило, обнаруживаются из одной восстановленной полосы, потому что многие устойчивые состояния стенограммы в митохондриальной растении имеют неоднородные 5' и / или 3' концы1,12.
  3. Выравнивание данных по секвенированию с митохондриальным геномом кукурузы с помощью базового инструмента локального поиска выравнивания (BLAST) национального центра биотехнологической информации (NCBI). Выберите организм "кукуруза (такси:4577)", а также поисковую базу данных "Нуклеотидная коллекция (nr/nt)".
  4. Найдите 5'-3' соединение круговой стенограммы, и определить позиции 5' и 3' транскрипт termini.
  5. Рассчитайте размер целевых транскриптов.

10. Проверка результатов картирования cRT-PCR с помощью гибридизации РНК Гель Блот

ПРИМЕЧАНИЕ: Гибридизация РНК-гель-помарки осуществляется с помощью коммерческого комплекта(Таблицаматериалов), который содержит реагенты для транскрипции маркировки РНК с дигоксигенином (DIG) и Полимеразой РНК T7, гибридизацией и иммунологическим обнаружением. Для более подробной информации о протоколах, представленных в этом комплекте, обратитесь. Убедитесь, что только RNase бесплатное оборудование используется для всей процедуры.

  1. Усильте фрагмент ДНК, используемый для подготовки РНК-зонда, и клоните его до того же вектора, что и в шаге 9.1, который содержит промоутер T7 17 bp вверх по течению от места вставки.
  2. Линейная конструкция с использованием надлежащего фермента ограничения, восстановить линейной плазмиды с помощью комплекта очистки ДНК(Таблицаматериалов), и растворить его в DEPC-обработанных деионизированных H2O.
  3. Этикетка РНК зондов с DIG-11-UTP по коммерческому комплекту (Таблица материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
  4. Подготовка 500 мл 10x MOPS буфера (0,2 M MOPS, 50 мм ацетат ацетат ацетат ацетата натрия, и 10 мм EDTA) с помощью DEPC-обработанных деионизированных H2O. Отрегулируйте pH 7.0 на NAOH, и стерилизовать путем фильтрации.
  5. Добавьте 2-3 тома погрузочного буфера (50% формамида, 6,2% формальдегида, 1x MOPS, 10% глицерола и 0,1% бромфенола синего) к митохондриальной РНК, подготовленной шагами 3,1-3,3.
  6. Денатурная образец РНК/загрузка буферной смеси при 65 градусах по Цельсию в течение 10 мин, а затем охладите на льду в течение 1 мин.
  7. Приготовьте денатурированный гель агарозы (2% формальдегида, 1,2% агарозы и 1x MOPS) и загрузите образец РНК/Загрузка буферной смеси на гель (1-2 мкг митохондриальной РНК на скважину).
  8. Выполнить гель в 1x MOPS на 3-4 V /cm для 4 ч.
  9. Подготовка 2 L из 20x SSC (3 M NaCl, 0,3 М цитрат натрия, рН 7,0). Лечить его с 0,1% DEPC ночь, и стерилизовать автоклавом.
  10. Промыть гель дважды в 20x SSC (15 минут каждый раз), и передать гель РНК нейлоновой мембраны (Таблица материалов) капиллярной передачи с 20x SSC для 10-16 ч.
  11. Зафиксировать РНК в мембрану, выпекая при 120 градусах По Цельсия в течение 30 мин.
  12. Выполните гибридизацию РНК и иммунологическое обнаружение с помощью коммерческого комплекта(Таблица материалов) в соответствии с инструкцией производителя.

11. Дискриминация первичных и обработанных 5' концов

  1. Различать первичные и обработанные 5', сравнивая продукты cRT-PCR, полученные из нормализованных 5' полифосфатазных и необработанных РНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для первичных стенограмм, обилие ПЦР продуктов из 5 'полифосфатазы обработанных РНК гораздо выше, чем от необработанных аналогов(Рисунок 1, "Гена А", и Рисунок 4A). Однако, к обработанным транскриптам, соответствующий уровень продуктов PCR был бы усилен от 2 комплектов митохондриальных RNAs(рисунок1, 'Gene B').
  2. Дизайн праймеров RT-qPCR на основе результатов картирования cRT-PCR.
  3. Проверить результаты дискриминации cRT-PCR по RT-qPCR.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Два образца кДНК, полученные из 5' полифосфатазных и необработанных РНК, нормализованы продуктами РТ-кПЦР 26S зрелой рРНК.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Оценка эффективности циркуляризации митохондриальной РНК

В предыдущем исследовании, как общий и митохондриальной РНК были использованы для cRT-PCR картирования митохондриальной транскрипт термини в Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), и два типа РНК дал аналогичные результаты картирования12. Первоначально мы также использовали общие РНК для cRT-PCR картирования митохондриального транскрипта термини в кукурузе. После многих испытаний, мы обнаружили, что целевые стенограммы было трудно обнаружить. В качестве улучшения мы обогатили митохондриальную РНК из кукурузных развивающихся ядер, и это сделало возможным усиление циркулярных целевых транскриптов в одном раунде ПЦР.

Чтобы объяснить легкое усиление целевых транскриптов после обогащения, мы оценили эффективность РНК-круговой, выполняя RT-PCRs на представительном митохондриальном гене nad5 (рисунок 3 и рисунок S2). Ген кукурузы nad5 содержит два транс-и два цис-сплайсинга интронов. После самолиги общего и митохондриальных РНК, первые нити cDNAs были самостоятельно синтезированы с помощью nad5-RT1 и -RT2 праймеров. Два грунтовки могут обратить вспять транскрибные как линейные, так и круговые nad5 mRNAs(рисунок S2). Для усиления ПЦР используются четыре пары конвергентных праймеров: sqF1 и sqR1 и sqF2 и sqR2 для полуколичественного RT-PCR (RT-sqPCR) и qF1 и qR1 и qF2 и qR2 для RT-qPCR. Для cDNAs транскрибируется nad5-RT1, все четыре пары грунтов к обнаружены как круговые и линейные nad5 зрелых мРНК; для реакции обратной транскрипции nad5-RT2, sqF2 и sqR2 и qF2 и qR2 обследовали обе формы мРНК, в то время как продукты sqF1 и sqR1 и qF1 и qR1 PCR были получены только из циркулярных продуктов nad5. Основываясь на этом анализе, мы использовали sqF2 и sqR2 (для RT-sqPCR) и qF2 и qR2 (для RT-qPCR) ПЦР продуктов для нормализации nad5-RT1 и -RT2 обратной транскрипции реакции, и оценил соотношение круговой nad5, сравнивая sqF1 и sqR1 (для RT-sqPCR) или qF1 и qR1 (для продуктов RT-qPCR) PCR. До самолиги, РНК были предварительно обработаны РНК 5'полифосфатаза, чтобы сделать все транскрипты доступны для круговой РНК лигаза. Анализ RT-sqPCR показал, что очень небольшая доля nad5 mRNA была циркуляризирована, когда использовалась общая РНК, но соотношение резко возросло, когда была использована обогащенная митохондриальная РНК(рисунок 3B). Результаты RT-qPCR показали, что соотношение самолигированных nad5 mRNA увеличилось с 3,7% до 32% после обогащения(рисунок 3C). Анализ nad1 дал аналогичные результаты, а эффективность круговой циркуляции nad1 mRNA увеличилась с 0,7% до 30%(рисунок 3D-F).

За эти анализы, около 30% кукурузы митохондриальных РНК были самолигированные после улучшения, и повышение эффективности круговой объясняет легкое обнаружение целевых стенограмм cRT-PCR.

Определение кукурузы cox2 мРНК термини с использованием стратегии на основе cRT-PCR

Мы использовали ген cox2 в качестве примера для внедрения картирования и дискриминации митохондриальных стенограмм кукурузы с помощью стратегии на основе cRT-PCR(рисунок 4).

В начале картографирования cox2 mRNA, три наружу грунтовки CF1, CF2, и CR1 были разработаны на области кодирования генов(рисунок 4D). CF1 и CF2 были вложены грунтовки, и CF2 был 69 bp вниз по течению CF1. Используя шаблон cDNAs синтезируется в шагах 6.1-6.5 и нормализуется на шагах 7.1-7.6, пара праймерОВ CF1 и CR1 усилилась две видные полосы, и результаты усиления были повторены вложенными грунтовками CF2 и CR1(рисунок 4A). Кроме того, две полосы были сильно усилены от 5' полифсофатазы обработанных РНК, в то время как они были трудно обнаружить в необработанных коллег, предполагая, что они чувствительны к РНК 5' полифсофатаза и имеют первичные 5' термини.

Две группы кандидатов были названы cox2-1 и -2, и они были восстановлены независимо от геля агарозы и клонированы в векторы. Результаты Колонии ПЦР показали, что положительные клоны содержат вставки с переменным размером, подразумевая неоднородные 5' и/или 3' термини стенограммы(рисунок5). Положительные клоны были секвенированы на коммерческой уровне, а данные о секвенировании были выровнены с митохондриальным геномом кукурузы, как описано в шаге 9.3.

Результаты секвенирования и выравнивания показали, что две стенограммы были идентичны на 3'концах, но отличаются по длине 5' UTRs(рисунок 4D). 5 ' концы cox2-1 и -2 были обогащены на 992-1,030 и 1,276-1,283 nt вверх по течению AUG, соответственно, в то время как их 3 ' конец был 39 nt вниз по течению от остановки Кодон. Выведенные из результатов cRT-PCR, расчетные размеры cox2-1 и -2 составили 1 804-1 832 и 2088-2,095 nt, соответственно.

Для проверки результатов отображения cRT-PCR была проведена гибридизация РНК-гель-блота с помощью зонда, полученного из области кодирования генов cox2, и были обнаружены две основные полосы с аналогичным размером, как cox2-1 и -2 (Рисунок4C). Кроме того, в Северной понке были обнаружены две более крупные полосы размером около 2500 и 2800 nt, но они не были усилены cRT-PCR. Две большие полосы были названы как cox2-3 и -4, соответственно. Для их картирования были разработаны еще два наружу грунтовки (т.е. CR2 и CF3), закрепленные на 5' и 3' UTRs cox2-2, и их позиции были близки к ожидаемым концам стенограммы cox2-3 и -4. Используя грунтовую пару CF3 и CR2, две основные полосы были сильно усилены из cDNAs, полученных из 5' полифсофатазной РНК, но не от необработанной аналогов (Рисунок 4A). Результаты секвенирования показали, что они имели идентичные 5'termini в то время как переменные 3' концы. Расчетный размер двух стенограмм составлял 2512/2 513 и 2833-2835 nt, соответственно, и они были близки по размеру с двумя более крупными полосами, обнаруженными в Северной погреде. Кроме того, результаты cRT-PCR показали, что кокс2-3 и -4 имеют первичные 5' termini.

Для подтверждения результатов дискриминации пять праймеров, обращенных к внешним сторонам, были разработаны в соответствии с результатами отображения cRT-PCR, т.е. qCF1, qCF2, qCR1, qCR2 и qCR3, а также грунтовые пары qCF1 и qCR1, qCF1 и qCR2, qCF1 и qCR3, Анализ RT-qPCR кокс2-1, -2, -3 и -4 соответственно. Относительное изобилие всех четырех продуктов РТ-кПЦР в 5' полифсофатазной выборке было намного выше, чем в необработанном аналоге, что подтверждает результаты дискриминации cRT-PCR.

Таким образом, транскрипт шаблон гена кукурузы cox2 является сложным, и cRT-PCR основе стратегии эффективно дискриминирует и карты множественных изоформ cox2 mRNA.

Figure 1
Рисунок 1: Обзор стратегии на основе CRT-PCR. Иллюстрация основных этапов стратегии на основе ЦРТ-ПЦР. 5'и 5'- - два образца РНК обработаны и не обработаны РНК 5' полифосфатаза, соответственно. Два образца кДНК, полученные из 5' полифосфатазных и необработанных РНК, нормализованы 26S зрелой rRNA в кукурузе, а первичные и обработанные транскрипты дискриминируются путем сравнения продуктов cRT-PCR. Для гена А соответствующая РНК имеет первичный 5', потому что избыток пЦР-продукта от 5' полифосфатазной РНК намного выше, чем у необработанной аналогов; для гена В, ПЦР продукты из двух наборов митохондриальных РНК усиливаются на сопоставимом уровне, подразумевая обработанные 5' конечной соответствующей РНК. Область кодирования и UTRs представлены серыми коробками и смелыми линиями, соответственно. CRT - грунт для обратной транскрипции; CF1, CF2, CR1, и CR2 - ПЦР грунтовки фланговых 5'-3 'стыковка круговой стенограммы; qCF и qCR - расходящиеся грунтовки для RT-qPCR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Оценка целостности митохондриальной РНК с помощью электрофореза агарозного геля. (A) Митохондриальные РНК, приготовленные из 15-DAP кукурузных ядер. М и молекулярный маркер ДНК. (B) Митохондриальная РНК ядра после лечения 5' полифосфатазы и / или круговой T4 РНК лигазы. 5'' митохондриальной РНК после лечения 5' полифосфаза; T4 и 5'- митохондриальная РНК после лечения 5' полифосфатазы и круговой t4 РНК лигаза; T4 и 5'- митохондриальная РНК после круговой только. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Эффективность циркуляризации nad5 и nad1 mRNA, оцениваемых РТ-ПКР. (A) и (D) Схемаическая диаграмма генов nad5 и nad1, соответственно. Ex и экзон. Экзоны и интроны показаны как серые коробки и изогнутые линии, соответственно. Положение реверсивных транскрипционных праймеров RT1 и RT2 указывается стрелками. Черные точки указывают на положение праймеров ПЦР, и показан прогнозируемый размер продуктов ПЦР. sqF1, sqF2, sqR1 и sqR2 являются праймерами для RT-sqPCR; qF1, qF2, qR1 и qR2 являются праймерами для RT-qPCR. (B) и (E) RT-sqPCR анализ эффективности круговой циркуляции nad5 и nad1 mRNAs, соответственно. М и молекулярный маркер ДНК. (C) и (( F) RT-qPCR анализ эффективности круговой над5 и nad1 mRNAs, соответственно. Два образца cDNA реверсивных транскрибированных RT1 и RT2 праймеры нормализуются sqF2 и sqR2 (для RT-sqPCR) или qF2 и qR2 (для RT-qPCR) ПЦР. Эффективность циркуляризации nad5 и nad1 mRNA оценивается путем сравнения продуктов ПЦР sqF1 и sqR1 (для РТ-кв.р)) или qF1 и qR1 (для RT-qPCR). циркуляризированные /((круговые/линейные) qF1 и qR1 над qF2 и qR2 в реакции RT2/qF1 и qR1 над qF2 и qR2 в реакции RT1. Значения являются средствами и SD трех биологических репликатов. Чтобы исключить потенциальное влияние 5 "трифосфата, РНК были обработаны 5 "полифосфатаза до самолиги. Итого и Мито - всего и митохондриальные РНК, соответственно. RT1 и RT2 cDNAs обратной транскрибируется RT1 и RT2 грунтовки, соответственно, пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Картирование cox2 зрелых терминов мРНК с помощью стратегии cRT-PCR. (A) Гель разделение cox2 cRT-PCR продуктов. - cDNA, полученные из 5 "полифосфатазы и необработанных митохондриальных РНК, соответственно. Два образца кДНК были нормализованы путем усиления 26S кДНК(26S). Пять праймеров используются для анализа cRT-PCR циркулярных cox2 mRNA: CF1, CF2 и CF3 являются вложенными праймерами, а CF2 и CF3 являются 69 и 138 bp вниз по течению CF1, соответственно; CR1 и CR2 являются вложенными грунтовки, и CR2 составляет 1288 bp вверх по течению от CR1. Полосы, указанные «1» и «2», были усилены как CF1, так и CR1 и CF2 и CR1, в то время как полосы «3» и «4» были усилены CF3 и CR2. Все четыре полосы были секвенированы путем клонирования. Полосы, отмеченные звездочками, не могли быть повторены, и они были исключены из результатов. М и молекулярный маркер ДНК. (B) RT-qPCR анализ относительного изобилия циркулярных cox2 мРНК после 5' полифосфатазы лечения. Два образца кДНК были синтезированы грунтовой смесью, содержащей 26S-CRT, cox2-CRT, nad5-CRT, nad6-CRT, nad7-CRT, nad9-CRT, cob-CRT и cox1-CRT в равном соотношении, а cDNA, полученный из 26S зрелой rRNA, использовался для нормальной нормы. Кокс2 свыше 26С в обработанном образце/cox2 над 26S в необработанной выборке. Значения представляют собой средства и SD трех биологических репликатов. Указаны праймеры, используемые для RT-qPCR. (C) Северный анализ поблучивой cox2 стенограмм. 2 мкг митохондриальной РНК был загружен. Отмечены полосы, соответствующие различным изоформам cox2 зрелых мРНК. (D) Стенограмма термини cox2 mRNA выведены из результатов cRT-PCR. UTRs и открытые кадры чтения отображаются как смелые линии и серые коробки, соответственно. Показаны позиции 5' и 3' termini относительно AUG (No1) и UAA (-1), а также количество одиночных клонов, секвенированных на этих позициях. Позиции реверсивной транскрипции и праймеров усиления ПЦР отображаются как закрытые и открытые головки стрелок соответственно. Внешние грунтовки, используемые для RT-qPCR, отображаются в виде открытых квадратов, и положение зонда cox2, как указано. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Выбор положительных клонов, содержащих cox2-4 вставки колонии ПЦР. (A) Колония PCR для экрана одного клона, содержащего cox2-4 вставки. Размер вставки cox2-4 составляет около 1165 б.п., а векторных последовательностей - 100 б.п. Расчетный размер продуктов колонии ПЦР составляет около 1265 б.п., и те клоны, содержащие небольшие вставки размера, не секвенировались, т.е. цифры 11, 14, 22 и 23. (B) Секвенирование результатов положительных клонов, отсеянных в (A). 5'/3' концы - 5' и 3' концы относительно AUG (No1) и UAA (-1), соответственно. Результаты последовательности чисел 12 и 20 были исключены, поскольку они были гораздо меньше, чем другие. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Компонент Объем для реакции 50 л (КЛ) Окончательная концентрация
10x РНК 5' полифосфатазный буфер 5 1x
Ингибитор RNase (40 U/L) 0,75 0,6 U/Лл
Митохондриальная РНК X 0,2 мкг/л
РНК 5' полифосфатаза (20 U / Л) 2,5 1 U/l
DEPC-обработанный деионизированный H2O до 50 л -

Таблица 1: Реакционные компоненты лечения полифосфатазы РНК 5.

Компонент Объем реакции на 20 л (КЛ) Окончательная концентрация
10x T4 РНК лигаза I буфер 2 1x
dATP (1 мМ) 1 50 км
PEG8000 (50%) 6 15%
Ингибитор РНК (40 U/Л) 0,5 1 U/l
5' полифосфатазно-обработанная или необработанная митохондриальная РНК X 0,1 х 0,2 мкг/л
T4 РНК лигаза I (30 U / Л) 0,4 0,6 U/Лл
DEPC-обработанный деионизированный H2O до 20 зл -

Таблица 2: Реакционные компоненты митохондриальной РНК-циркуляризации.

Компонент Объем для пре-смеси 10 л (Зл)
Прайм-смесь (1 мкм всего)a 2
смесь dNTP (10 мМ каждая) 1
Круговой 5' полифосфаза-обработанные или необработанные митохондриальной РНКb X
DEPC-обработанный деионизированный H2O до 10 зл

Таблица 3: Предварительная смесь для обратной реакции транскрипции. a Первичная смесь содержит равное соотношение 26S-CRT и до 7 других RT праймеров, а конечная концентрация составляет 1 мкм. b2 предварительносных смеси готовятся бок о бок, и они содержат одинаковое количество (200 нг) круговой 5' полифосфатазы или необработанных митохондриальной РНК.

Компонент Объем для реакционной системы 20 л (Зл) Окончательная концентрация
Шаблон РНК/праймер/dNTP 10 Лет -
5x rTase буфер 4 1x
Ингибитор RNase (40 U/L) 0,5 1 U/l
RTase (200 U/L) 1 10 U/L
DEPC-обработанный деионизированный H2O до 20 зл -

Таблица 4: Компоненты реакции обратной транскрипции. «Шаблон RNA/primer/dNTP pre-mixtures подготовлен на шаге 6.3.

Компонент Объем для реакционной системы 20 л (Зл) Окончательная концентрация
Дейонизированный H2O 7 (г. -
2x буфер реакции 10 Лет 1x
смесь dNTP (10 мМ каждая) 0,4 0,2 мМ каждый
26S-CF1 (10 мкм) 0,8 0,4 мМ
26S-CR1 (10 мкм) 0,8 0,4 мМ
Шаблоны cDNA, полученные из циркуляризированных 5' полифосфатазы-обработанных или необработанных РНК 0,6 -
Полимераза ДНК (1 U/L) 0,4 0,02 U/Лл

Таблица 5: Компоненты реакции для усиления ПЦР 26S cDNA. «Первоначально для нормализации используются равные объемы шаблонов cDNA (0,6 л). При необходимости измените количество шаблонов cDNAs, чтобы обеспечить такое же изобилие 26S ПЦР-продуктов между двумя реакциями ПЦР.

Шаг Температура Время Номер цикла
Первоначальная денатурация 95 кв. c 3 мин. 1 цикл
Денатурация 95 кв. c 15 сек 22–25 циклов
Праймер аннеалинг 56 кк с 15 сек
Расширение 72 кк с 30 сек
Окончательное расширение 72 кк с 5 мин. 1 цикл
Держать 4 кк с ∞ -

Таблица 6: Условия ПЦР для усиления 26S cDNA для нормализации.

Компонент Объем для реакционной системы 20-Л (Зл) Окончательная концентрация
Дейонизированный H2O до 20 зл -
2x буфер реакции 10 Лет 1x
смесь dNTP (10 мМ каждая) 0,4 0,2 мМ каждый
Дивергентная грунтовка-форвард (10 мкм) 0,8 0,4 мМ
Дивергентная грунтовка-реверс (10 мкм) 0,8 0,4 мМ
Шаблон cDNA, полученный из циркуляризированных 5' полифосфатазы-обработанных или необработанных РНК X -
Полимераза ДНК (1 U/L) 0,4 0,02 U/Лл

Таблица 7: Компоненты реакции для усиления ПЦР циркулярных целевых транскриптов. «Объем шаблона cDNA, используемых в этих реакциях, определяется результатами нормализации 26S rRNA.

Шаг Температура Время Номер цикла
Первоначальная денатурация 95 кв. c 3 мин. 1 цикл
Денатурация 95 кв. c 15 сек 22-40 циклов c
Праймер аннеалинг 50-65 кв. 15 сек
Расширяете b 72 кк с 0,5-1 мин.
Расширение Finatl 72 кк с 5 мин. 1 цикл
Держать 4 кк с ∞ -

Таблица 8: Условия ПЦР для усиления целевых транскриптов. a Точное аннулирование умеренности зависит от температуры плавления праймеров ПЦР. b Время удлинения зависит от длины цели, которая должна быть усилена. Рекомендуемое время 1 мин на 1 кб фрагмента ПЦР. c В целом, 30-35 циклов достаточно, чтобы произвести достаточное количество ПЦР продукта. Для низких обильных стенограмм, увеличить количество циклов до 40 циклов.

Рисунок S1: Позиция грунтовок для репрезентативных митохондриальных транскриптов кукурузы. CRT - обратная транскрипция грунтовка; CF1, CF2, CR1 и CR2 - расходящиеся грунтовки для усиления ПЦР; qCF и qCR - расходящиеся грунтовки для RT-qPCR. Стенограмма термини йозе nad2-1, rps4-1, и nad4-1 были определены ранее (Чжан и др., 20191). Показаны позиции 5'- и 3'-ends относительно AUG (No1) и последнего нуклеотида стоп-кодона (-1). Области кодирования и UTRs обозначены как серые ящики и смелые линии, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Рисунок S2: Принцип оценки эффективности кругового обзора nad5 mRNA в кукурузе. В реакции самоликации, только часть митохондриальных РНК циркуляризовано. Для расчета соотношения циркулярных nad5 mRNA для синтеза первой нити cDNA используются два геноспецифических праймера, т.е. nad5-RT1 и -RT2. В реакции на обратную транскрипцию nad5-RT2 (RT) продукты ПЦР, усиленные sqF2 и sqR2 (для RT-sqPCR) и qF2 и qR2 (для RT-qPCR), являются производными как от линейной, так и от круговой nad5, в то время как sqF1 и sqR1 (для RT-sqPCR) и qF1 Продукты ПЦР и qR1 (для РТ-кПкР) получены только из циркулярных nad5; в nad5-RT1 реакции, все четыре пары ПЦР праймеры могут усилить обе формы nad5. Для расчета соотношения циркулярных продуктов nad5 mRNA эти две реакции нормализуются продуктами sqF2 и sqR2 или qF2 и qR2 PCR. Сравнивая обилие продуктов sqF1 и sqR1 или qF1 и qR1 PCR между двумя реакциями RT, эффективность круговой циркуляции nad5 mRNA примерно оценивается. ex и экзон. Экзоны и интроны показаны как серые коробки и изогнутые линии, соответственно. Позиции праймеров nad5-RT1 и -RT2 указаны стрелками. Черные точки указывают на положение праймеров ПЦР, и показан прогнозируемый размер продуктов ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Таблица S1: Информация о праймере. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В предыдущем исследовании, всего и митохондриальных РНК из клеточной культуры подвески Arabidopsis были использованы для картирования митохондриальной транскрипт термини cRT-PCR, и аналогичные результаты были получены12. Однако, только обогащенная митохондриальная РНК была использована длякартирования митохондриальных транскрипт термини во многих других исследованиях 1,2,3,9. Мы обнаружили, что обогащение митохондриальной РНК является важным шагом для cRT-PCR картирования митохондриальной транскрипт термини в кукурузе. После этого обогащения, соотношение круговой митохондриальной РНК резко увеличивается с 0,3%-3,7% до 30%(Рисунок 3 и Рисунок S2), что делает усиление циркулярных целевых транскриптов возможным в одном раунде ПЦР.

Эффективность циркуляризации митохондриальной РНК была оценена rt-PCR анализом на кукурузу nad1 и nad5, оба из которых делятся на независимые прекурсоры по цис-сплайсинг интроны. Поскольку потенциальное влияние от присутствия прекурсоров РНК, а также изменение эффективности РТ не может быть исключено, это лишь приблизительная оценка реальной эффективности круговой округов митохондриальной РНК.

Мы изменили условия самолиги, изменив концентрацию митохондриальной РНК и PEG8000, а также удлинив время инкубации, но эти изменения, похоже, не повлияли на эффективность круговой циркуляции митохондриальной РНК. Хотя мы не уверены в том, что дальнейшее очищение градиента Percoll может повысить эффективность круговой очистки, качество сырого митохондриона, подготовленного в разделе 2, достаточно хорошо для cRT-PCR картирования митохондриальных транскриптных термини в качестве мейз. Поскольку несколько раундов ПХР могут привести к ложноположительным результатам, усиление целевых транскриптов в одном раунде ПЦР делает результаты отображения более надежными.

5' трифосфат первичных транскриптов нестабилен, и он может быть преобразован в 5' монофосфат по неизвестным причинам. Эта проблема препятствует четкой дифференциации между первичными и обработанными транскриптами с помощьюподходов в зависимости от наличия/отсутствия 5' трифосфата 1,2,4. Зрелая форма кукурузы 26S rRNA имеет монофосфатный 5' конец, и она нечувствительна к полифосфатазе РНК 5. Чтобы свести к минимуму влияние нестабильной 5' тримоспахта, зрелые 26S rRNA используется для нормализации двух образцов РНК, обработанных и необработанных 5' полифосфатазы, и это показано, чтобы быть важным шагом, чтобы дифференцировать два типа стенограмм в кукурузе митохондрион. После нормализации первичные и обработанные транскрипты могут быть дискриминированы путем сравнения результатов cRT-PCR и RT-qPCR, полученных из 5' полифосфатазных и необработанных образцов РНК. Первичные транскрипты чувствительны к 5' полифосфатаза, и они сильно усилены из 5' полифосфатазы обработанный образец, но не (или на очень низком уровне из-за нестабильной 5' трифосфат) от необработанных коллег. В отличие от этого, обработанные транскрипты обнаруживаются на сопоставимых уровнях между двумя образцами.

В растениях транскриптовые модели многих митохондриальных генов довольно сложны1,2. Например, гены кукурузы nad6 и atp6 выражены как моноцистроны и дикстроны, так и nad6, atp6,и atp6-na6 зрелые мРНК имеют два, три и две изоформы соответственно. Кроме того, транскрипт населения одного митохондриального гена на самом деле смесь прекурсоров, зрелых и деградации РНК. ПЦР склонны к усилению молекул небольшого размера, и трудно обнаружить все изоформы транскрипта с помощью одной пары грунтовок. Таким образом, РНК гель пятно гибридизации требуется для проверки cRT-PCR картирования результатов, и альтернативные грунтовки могут быть необходимы для усиления этих стенограмм, обнаруженных в Северной пятно, но не в первый раз cRT-PCR.

Этот протокол включает в себя шаг RT-qPCR для проверки результатов дискриминации cRT-PCR. Поскольку множественные изоформы некоторых зрелых мРНК очень близки по размеру1,невозможно подтвердить все результаты дискриминации RT-qPCR, и некоторые стенограммы стабильного состояния были определены путем сравнения результатов cRT-PCR между обработанными и только необработанные РНК.

В этом протоколе термины 5' и 3' целевых транскриптов были отображены путем клонирования и секвенирования продуктов cRT-PCR и ограничивают количество одиночных клонов, которые должны быть секвенированы. В качестве альтернативного метода, cRT-PCR продукты могут быть секвенированы следующего поколения секвенирования, который последовательности тысяч молекул для одного набора стабильного состояния стенограммы, и результаты картирования будет более точным.

Помимо дискриминации первичных и обработанных 5' термини по cRT-PCR и RT-qPCR, монофосфат 5' термини может быть определен путем идентификации окружающих РНК вторичных структур1,12. Хорошо известно, что РНК вторичных структур, таких как tRNA и t-элемент может посредничать митохондриальной стенограммы конца формирования, направляя эндонуклеолитические расщепления RNase P и / или RNaseNo 12,18,19, 20. Таким образом, эти 5 ' termini, примыкающие к tRNA или t-элемент, должны быть получены из посттранскрипционной обработки и содержать монофосфаты.

С помощью этого протокола, большая часть стабильного состояния стенограммы были определены в митохондрии кукурузы1. Тем не менее, некоторые из них не были дифференцированы и / или отображены по неизвестной причине1. Кроме того, мы считаем, что позиция 5' транскрипт termini лучше быть подтверждены анализом расширения праймера, хотя она включена в этот протокол. Из-за отсутствия экспериментальных данных, мы не уверены, что эта стратегия подходит для других видов растений, таких как рис(Oryza sativa) и Arabidopsis. Кроме того, митохондрии растений, как первичные, так и обработанные стенограммы стабильно накапливаются в пластидах21,и неясно, может ли эта стратегия быть использована для картирования и дискриминации пластидных транскриптов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (грант No 31600250, Y.З.), Научно-технические проекты города Гуанчжоу (грант No 201804020015, H.N.), и Китайской системой сельскохозяйственных исследований (грант No). КАРС-04-PS09, H.N.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Aladdin, China A112880 To prepare 1x TAE buffer
Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific, USA 4359659 Thermal cycler for PCR amplification
Ascorbic acid Sigma-aldrich, USA V900134 For preparation of extraction buffer
Biowest Agarose Biowest, Spain 9012-36-6 To resolve PCR products and RNAs
Bovine serum albumin Sigma-aldrich, USA A1933 For preparation of extraction buffer
Bromophenol blue Sigma-aldrich, USA B8026 For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot
DEPC Sigma-aldrich, USA V900882 Deactivation of RNase
DIG Northern starter kit Roche, USA 12039672910 For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection.
EDTA Sigma-aldrich, USA V900106 For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer
EGTA Sigma-aldrich, USA E3889 For preparation of wash buffer
Gel documentation system Bio-Rad, USA Gel Doc XR+ To image the agarose gel
Glycerol Sigma-aldrich, USA G5516 For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis
GoldView II (5,000x) Solarbio,. China G8142 DNA staining
Hybond-N+, Nylon membrane Amersham Biosciences, USA RPN119 For Northern blot
Image Lab Bio-Rad, USA Image Lab 3.0 Image gel, and compare the abundance of PCR products.
KH2PO4 Sigma-aldrich, USA V900041 For preparation of extraction buffer
KOH Aladdin, China P112284 For preparation of extraction buffer
L-cysteine Sigma-aldrich, USA V900399 For preparation of extraction buffer
Millex Millipore, USA SLHP033RB To sterile extraction and wash buffers by filtration
Miracloth Calbiochem, USA 475855-1R To filter the ground kernel tissues
MOPS Sigma-aldrich, USA V900306 For preparation of running buffer for Northern blot
NanoDrop Thermo Fisher Scientific, USA 2000C For RNA concentration and purity assay
NaOH Sigma-aldrich, USA V900797 For preparation of wash buffer
pEASY-Blunt simple cloning vector TransGen Biotech, China CB111 Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site.
Phanta max super-fidelity DNA polymerase Vazyme, China P505 DNA polymerase for PCR amplification
Polyvinylpyrrolidone 40 Sigma-aldrich, USA V900008 For preparation of extraction buffer
Primer Premier 6.24 PREMIER Biosoft, USA Primer Premier 6.24 To design primers for reverse transcription and PCR amplification
PrimeScript II reverse transcriptase Takara, Japan 2690 To synthesize the first strand cDNA
PureLink RNA Mini kit Thermo Fisher Scientific, USA 12183025 For RNA purificaion
RNA 5' polyphosphatase Epicentre, USA RP8092H To convert 5' triphosphate to monophosphate
RNase inhibitor New England Biolabs, UK M0314 A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase.
Sodium acetate Sigma-aldrich, USA V900212 For preparation of running buffer for Northern blot
Sodium chloride Sigma-aldrich, USA V900058 To prepare 20x SSC
SsoFas evaGreen supermixes Bio-Rad, USA 1725202 For RT-qPCR
T4 RNA Ligase 1 New England Biolabs, UK M0437 For RNA circularization
Tetrasodium pyrophosphate Sigma-aldrich, USA 221368 For preparation of extraction buffer
TIANgel midi purification kit Tiangen Biotech, China DP209 To purify DNA fragments from agarose gel
Tris Aladdin, China T110601 To prepare 1x TAE buffer
TRIzol reagent Invitrogen, USA 15596026 To extract mitochondiral RNA.
Universal DNA purification kit Tiangen Biotech, China DP214 To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction
Xylene cyanol FF Sigma-aldrich, USA X4126 For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, Y., et al. Major contribution of transcription initiation to 5'-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize. RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).
  2. Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants. Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).
  3. Calixte, S., Bonen, L. Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria. Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).
  4. Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis. Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).
  5. Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5' end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana. ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).
  6. Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).
  7. Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).
  8. Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units. Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).
  9. Yan, B., Pring, D. R. Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features. Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).
  10. Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).
  11. Rapp, W. D., Stern, D. B. A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene. The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).
  12. Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5' and 3' end formation. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).
  13. Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. Maturation of 5' ends of plant mitochondrial RNAs. Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).
  14. Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).
  15. Wang, H. Q., et al. Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing. New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).
  16. Maloney, A. P., et al. Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5'-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing. Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).
  17. Green, R. M., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. New York. (2012).
  18. Canino, G., et al. Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes. Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).
  19. Gobert, A., et al. A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity. Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).
  20. Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis. Genes & Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).
  21. Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. Chloroplast RNA metabolism. Annual Review of Plant Biology. 61, 125-155 (2010).

Tags

Генетика Выпуск 149 круговой RT-PCR Северная подательная количественная RT-PCR лечение полифосфатазы РНК 5 нормализация РНК первичные и обработанные транскрипты митохондрион кукурузы
Дискриминация и картирование первичных и обработанных стенограмм в митохондрии кукурузы с использованием круговой стратегии на основе РТ-ПЦР
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Y., Liao, X., Luo, P., Peng,… More

Zhang, Y., Liao, X., Luo, P., Peng, K., Ye, W., Lian, T., Ma, Q., Nian, H. Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy. J. Vis. Exp. (149), e60019, doi:10.3791/60019 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter