Summary
We beschrijven een in vivo methode om het functionele verlies van een specifiek gen in satelliet cellen te onderzoeken met behulp van een combinatie van cardiotoxine gemedieerde verwonding van de skeletspieren en de injectie van een zelfvoorzienend siRNA.
Abstract
Skeletspieren bezit een enorme capaciteit om te regenereren na letsel. Dit proces wordt voornamelijk gedreven door spier stamcellen, ook wel satelliet cellen genoemd. Satelliet cellen worden gekenmerkt door de uitdrukking van de transcriptiefactor Pax7 en hun locatie onder de basale lamina in de rust skeletspieren. Bij letsel worden de satelliet cellen geactiveerd, ondergaan ze zelf vernieuwing of differentiëren om nieuwe myovezels te vormen of om te smelten met beschadigde. De functionaliteit van de satelliet cellen in vivo kan worden onderzocht met behulp van een cardiotoxine gebaseerd letsel model van skeletspieren. Om de functie van één gen tijdens de regeneratie van de skeletspieren te bestuderen, worden transgene muismodellen meestal gebruikt. Hier presenteren we een alternatieve methode voor transgene muizen, om de genfunctie in satelliet cellen tijdens regeneratie te onderzoeken, bijvoorbeeld in gevallen waarin geen transgene muizen beschikbaar zijn. We combineren de cardiotoxine gemedieerde verwonding van een specifieke skeletspier met de injectie van een self-leveren siRNA in de regeneratie spier die vervolgens wordt overgenomen door satelliet cellen onder andere cellen. Daardoor bieden we een methode om de genfunctie in satelliet cellen te analyseren tijdens regeneratie onder fysiologische omstandigheden zonder de noodzaak van transgene muizen.
Introduction
Skeletspieren is het grootste weefsel van het lichaam dat ongeveer 40% van het totale lichaamsgewicht vertegenwoordigt, waardoor vrijwillige motoriek mogelijk is. De weefsel architectuur van de skeletspieren bestaat voornamelijk uit postmitotische, terminaal gedifferentieerde, meerkernige myovezels en verschillende andere cellen uit het perifere zenuwstelsel, het vasculaire systeem en de interstitiële cellen1. Belangrijk, skeletspieren heeft een enorme capaciteit om te regenereren en herstellen van de functie op letsel of schade2. Dit proces is afhankelijk van de weefsel Resident spier stamcellen ook wel satelliet cellen3,4. Satelliet cellen bevinden zich tussen de myofiber en de basale lamina en worden gekenmerkt door de uitdrukking van de transcriptiefactor Pax75,6,7. Onder homeostatische omstandigheden, satelliet cellen zijn stilaan, maar worden geactiveerd als gevolg van traumatisch letsel, bijvoorbeeld door excentrieke oefening of experimenteel door middel van injectie van de slang Venom cardiotoxin6,8. Eenmaal geactiveerd, Pax7 positieve satelliet cellen Co-express MyoD en Myf5, die de stamcellen tot myogenic differentiatie verbindt. Satelliet cellen die weerstaan aan de opregulatie van commitment factoren zullen hun stemlijkheid potentieel behouden en terugkeren naar onbeweeglijkheid om de stamcel pool aan te vullen voor toekomstige eisen. Na de uitbreiding van de myogene voorlopercellen pool worden transcriptionele netwerken geactiveerd door differentiatie factoren zoals Myogenin om de celcyclus uitgang en terminale differentiatie te initiëren. Deze myoprogenitoren smelten vervolgens met elkaar of met bestaande myofibers die myonuclei bij zich dragen om de grootte van het myonuclear domein te behouden. De myofibers Express terminale spier differentiatie genen zoals myosin Heavy chain. Tot slot, de nieuw gevormde myofibers groeien en volwassen te bouwen van de functionele eenheden van skeletspieren9,10.
De regeneratie van de skeletspieren kan worden beïnvloed door verschillende aandoeningen, waaronder spierziekten of veroudering11,12, variërend van milde beperkingen tot levensbedreigende omstandigheden, bijvoorbeeld in Duchenne spierdystrofie13 , 14. Daarom, regeneratieve geneeskunde is bedoeld om te herstellen van beschadigde of slecht functionerende skeletspieren weefsel met behulp van de inherente regeneratieve kracht door targeting satelliet Cell functie15,16. Om zijn volledige potentieel te gebruiken een uitgebreid begrip van de satelliet cellen in hun endogene niche tijdens de regeneratie van de skeletspieren is vereist. Hoewel experimentele benaderingen bestaan voor het isoleren van satelliet cellen grenzend aan hun myofibers17, kan de volledige complexiteit van cellulaire en systemische interacties van satelliet cellen met hun omgeving alleen in vivo worden geherculeerd. In dat opzicht is grote kennis over de regeneratie van skeletspieren verworven met behulp van muis blessure modellen2,18.
Hier introduceren we een specifiek experimenteel muis blessure model om de stamcel gemedieerde regeneratie van cardiotoxine-geïnduceerde schade van het tibialis anterieure spier in vivo te bestuderen. Cardiotoxine, een slang afgeleid cytolytische toxine die myofiber depolarisatie en necrose veroorzaakt, wordt geïnjecteerd in het tibialis anterieure spier, die op zijn beurt zal leiden tot weefsel degeneratie gevolgd door regeneratie. Om de functie van genen tijdens acute regeneratie te analyseren, worden zelfvoorzienende Sirna's geïnjecteerd op dag 3 na letsel, op het hoogtepunt van de uitbreiding van de satelliet cellen. Proefdieren worden geofferd op verschillende tijdstippen en de tibialis anterieure spieren worden opgevangen. De ontleed spieren worden bevroren en verwerkt voor verdere Cryo-sectioning. Immunofluorescentie microscopie wordt vervolgens gebruikt om markers voor regeneratie te analyseren. Deze methode maakt het mogelijk om de functie van een enkel gen te onderzoeken tijdens de regeneratie van de skeletspieren door een satelliet cel met behulp van wild type muizen.
Protocol
Alle dier procedures zijn goedgekeurd door de afdeling dierenwelzijn van het Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz (03-048/16; TLV Bad Langensalza, Duitsland).
1. cardiotoxine-geïnduceerde spier letsel
Opmerking: Alle experimenten met levende muizen uitvoeren in overeenstemming met de nationale dierenwelzijns Akte en onder passende aseptische omstandigheden. Ook moet het offeren van dieren worden uitgevoerd in overeenstemming met de nationale dierenwelzijns akte.
- Desinfecteer de inhalatie doos gebruikt voor inhalatie anesthesie en het operatiegebied met 70% ethanol. Plaats een steriele chirurgische doek op het verwarmingskussen waar de operatie zal plaatsvinden.
- Zet het verwarmingspaneel aan op 37 °C.
- Toediening van analgetica (bijv. 1 mg/kg lichaamsgewicht Meloxicam subcutaan) 15 min vóór aanvang van de operatie.
Opmerking: Voor een typisch experiment, gebruik van muizen die ten minste 6 weken oud, geslacht-gematcht en in een goede algemene lichamelijke conditie. - Bereid de cardiotoxine oplossing (20 μM in 0,9% NaCl), bewaar de oplossing bij-20 °C.
- Laat de cardiotoxine oplossing op kamertemperatuur (RT) komen.
- Breng de muis in de inhalatie doos en induceren anesthesie met Isofluraan (initiatie 3,5 – 5% in zuivere zuurstof). Controleer de diepte van de anesthesie met een gebrek aan reactie op een teen knijpen.
- Plaats de muis op een schone papieren handdoek en onderhoud anesthesie met een neusmasker (1,5 – 3% Isofluraan in zuivere zuurstof). Scheer het injectiegebied van het schedel onderbeen (van knie tot poot, Figuur 1a). Verwijder al het overtollige losse haar.
Opmerking: Fysiek scheiden van het scheren en injectiegebied in de kamer zal meer steriele omstandigheden voor de injecties te bieden. - Plaats de muis in de laterale ligpositie op de verwarmingskussen bedekt met een steriele chirurgische doek en onderhoud anesthesie met een neusmasker (1,5 – 3% Isofluraan in zuivere zuurstof).
- Desinfecteer het injectiegebied van het schedel onderbeen (van knie tot poot) met 70% ethanol.
- Voer een teen knijpen voor het starten van de intramusculaire injectie om een adequate diepte van anesthesie te garanderen.
- Injecteer 50 μL cardiotoxine (20 μM in 0,9% NaCl) in de anterieure spier van tibialis met behulp van een insulinespuit met een 29-gauge naald. Eerst, doorboren de huid gewoon distale van de knie.
- Steek de naald volledig in de spier (in myofiber oriëntatie/parallel aan het Tibia-Bot) en Injecteer de cardiotoxine langzaam (10-20 s) langs de volledige lengte van de spier terwijl u de naald heen en weer beweegt om een gelijkmatige verdeling van het cardiotoxine mogelijk te maken de hele tibialis anterieure spier verwonden (Figuur 1B, C).
Opmerking: Verwonden het tibialis anterieure spier van slechts één been, de contralaterale tibialis anterieure spier kan dienen als een interne controle om te bepalen dat skeletspieren niet pathologisch beïnvloed werden vóór cardiotoxine letsel. - Breng de muis terug naar de kooi die op een verwarmingskussen wordt geplaatst en bewaak het herstelproces totdat het dier bewuster is en ambulant wordt.
Opmerking: De muizen zullen alleen een lichte slap vertonen. Als muizen zwaar liken en helemaal geen gewicht op het been leggen, de muis opofferen. - Dien analgetica toe gedurende de volgende 2 dagen (bijv. 1 mg/kg lichaamsgewicht Meloxicam subcutaan, elke 24 uur) en bewaak ze wekelijks.
2. injectie van zelf-leveren siRNA in de regenererende tibialis anterieure spier (op dag 3 post Cardiotoxine letsel)
- Bereid de siRNA-oplossing door de siRNA (bv. siRNA Smart pool) opnieuw op te schorten in 0,9% NaCl (eindconcentratie van 2 μg/μL) volgens de instructies van de fabrikant.
Opmerking: De siRNA is chemisch gemodificeerd om de passieve opname door cellen te vergemakkelijken en te beschermen tegen Nuclease afbraak. Er zijn geen trans fectie reagentia nodig, waardoor de toxiciteit afneemt. Het gebruik van een slimme pool van vier onafhankelijke siRNA-sequenties gericht op hetzelfde gen verhoogt de knock-down efficiëntie. - Bewaar de siRNA bij-20 °C en breng het op het ijs over naar de operatiekamer.
- Desinfecteer de inhalatie doos gebruikt voor inhalatie anesthesie en het operatiegebied met 70% ethanol. Plaats een steriele chirurgische doek op het verwarmingskussen waar de operatie zal plaatsvinden.
- Zet het verwarmingspaneel aan op 37 °C.
- Breng de muis in de inhalatie doos en induceren anesthesie met Isofluraan (initiatie 3,5 – 5% in zuivere zuurstof). Controleer de diepte van de anesthesie met een gebrek aan reactie op een teen knijpen.
- Plaats de muis in de laterale ligpositie op de verwarmingskussen bedekt met een steriele chirurgische doek en onderhoud anesthesie met een neusmasker (1,5 – 3% Isofluraan in zuivere zuurstof).
- Desinfecteer het injectiegebied van het schedel onderbeen (van knie tot poot).
- Voer een teen knijpen voor het starten van de intramusculaire injectie om een adequate diepte van anesthesie te garanderen.
- Injecteer tot 50 μL siRNA-oplossing (tot 100 μg in totaal in 0,9% NaCl; gericht tegen het doel gen; gebruik gecodeerde siRNA als controle) in het gewonde tibialis anterieure spier met behulp van een insulinespuit met een 29 G naald. Eerst, prik de huid gewoon distale van de knie, dan steek de naald in de tibialis anterieure spier.
- Steek de naald volledig in de spier (in myofiber oriëntatie/parallel aan het Tibia-Bot) en Injecteer de siRNA-oplossing langzaam (10 – 20 s) langs de volledige lengte van de spier terwijl u de naald heen en weer beweegt, zodat een gelijkmatige verdeling van de siRNA langs de hele tibialis anterieure spier.
- Breng de muis terug naar de kooi die op een verwarmingskussen wordt geplaatst en bewaak het herstelproces totdat het dier bewuster is en ambulant wordt.
Opmerking: Analgesie is niet noodzakelijkerwijs na de injectie van siRNA.
3. dissectie van tibialis anterieure spier
- Bereid de Vries oplossing (2 delen OCT compound en 1 deel 30% sucrose in gedeïoniseerd water) ten minste 12 h voor gebruik om luchtbellen te voorkomen.
- Bereid bevriezings mallen door een aluminiumfolie rond een potlood te wikkelen en te verzegelen met tape. Het is belangrijk dat de bodem van de mal een gelijkmatig, gesloten oppervlak biedt.
Opmerking: Kleinere bevriezing mallen maken het sneller bevriezen van de spier te voorkomen van bevriezing artefacten. - Opofferen van de muis, bijvoorbeeld door CO2 inademing, op het respectieve tijdpunt van regeneratie en spray de hele muis en dissectie gereedschappen met 70% ethanol.
Opmerking: Cervicale dislocatie kan bovendien worden toegepast om overmatige bloeding in het been te voorkomen bij het isoleren van de anterieure spier van tibialis. - Verwijder de vacht en de huid van het geblesseerde achterlijf door de huid bij de enkel te snijden met een extra fijne scherpe schaar (snijkant: 13 mm) en de huid naar de knie te trekken met behulp van een tang.
- Om de tibialis anterieure pees aan de enkel bloot te stellen, trek de overblijvende huid naar de voet of snijd met een scherpe schaar.
Opmerking: De muis kan worden vastgemaakt aan een ondersteunings bord om een betere fixatie mogelijk te maken. - Voor het oogsten van het tibialis anterieure spier, verwijder de fascia met behulp van fijne Tang (Dumont 5 of 7, recht of gebogen). Knijp de gesloten tang door de fascia naast het tibia-bot bij de enkel van het gewonde been (Figuur 2a). Beweeg de Tang naar de knie waardoor de fascia wordt verscheuren en de anterieure spier van tibialis wordt blootgesteld (Figuur 2b).
- Om de tibialis anterieure spier te isoleren, bloot de distale pees en pak het met fijne Tang (Dumont 7, gebogen). Snijd de pees met behulp van veer schaar (snijkant: 5 mm, tip diameter: 0,35 mm) en trek de spier (vasthouden aan de pees) naar de knie.
- Om de tibialis anterieure spier te oogsten, snijd het zo dicht mogelijk bij de knie met behulp van een scherpe schaar.
- Snijd vóór het invriezen de tibialis anterieure spier in het middenbuik gebied van de spier met rechte schaar in twee helften van gelijke grootte om de analyse van de middenbuik streek mogelijk te maken (Figuur 2C, D).
- Vul de Vries vorm halverwege met de Vries oplossing.
- Steek de twee helften van de tibialis anterieure spier in de Vries vorm met het midden van de buik regio op de bodem van de mal (figuur 2e). Zorg ervoor dat de tibialis anterieure helften in een rechtopstaande positie worden geplaatst tegen de wand van de bevriezings mal om kantelen van de spier te voorkomen.
Opmerking: De meer Vries oplossing is in de mal, hoe langer de bevriezing zal nemen, waardoor het risico van Cryo-artefacten. - Houd de bevriezings mal met behulp van een tang en breng deze halverwege over in vloeibare stikstof (figuur 2F). Zorg ervoor dat er geen vloeibare stikstof in de Vries vorm terechtkomt tijdens het vriesproces.
- Observeer het vriesproces, het Vries medium verandert de kleur van transparant naar wit en wordt solide. Dompel de Vries vorm in vloeibare stikstof gedurende enkele seconden in en breng de Vries vorm over naar een vriezer van 80 °C of naar droogijs voor toekomstige verwerking.
- Bewaar de bevroren spieren in de Vries mallen bij-80 °C tot verder gebruik.
Opmerking: De Vries mallen passen goed in 24-Well platen of 1,5 mL reactie buizen waardoor labeling en georganiseerde opslag. - Behandel de spier in de Vries mallen voor verder gebruik altijd op droogijs.
4. cryosectioning van regenererende tibialis anterieure spier
- Voordat u begint met snijden, stelt u de kamertemperatuur van de cryostaat in op-21 °C, de object temperatuur tot-20 °C en de snijdikte tot 10, 12 of 14 μm (afhankelijk van de toekomstige toepassingen) (Figuur 3a).
- Breng het spier monster in de Vries vorm over in de cryostaat en laat het gedurende enkele minuten aan de temperatuur aanpassen. Label de Microscoop-dia's gedurende deze tijd.
- Verwijder de folie rond de ingesloten spier met behulp van de voorgekookte Tang in de cryostat. Vermijd het aanraken van het monster omdat het cryomedium gemakkelijk begint te ontdooien.
- Monteer het monster met behulp van cryomedium met de middelste buikstreek van de tibialis anterieure spier naar boven gericht op de metalen monsterhouder van de cryostaat. Dit zorgt ervoor dat de snij plaats van de spier (bodem van de mal) wordt geconfronteerd met de experimenteerder.
- Steek de monsterhouder met het gemonteerde monster in het snijmechanisme.
Opmerking: Gebruik een nieuwe blade voordat u begint om een juiste snede van het monster te garanderen. - Trim eerst het monster blok (30 μm) om een gelijkmatig snijvlak te krijgen en het betreffende gebied van de spier te bereiken (Figuur 3b).
- Knip na het trimmen opeenvolgende delen van de respectieve dikte (bijv. 14 μm).
- Verzamel de delen van de Microscoop glaasjes door de Schuif naar beneden over de sectie te houden. De sectie wordt aan de dia verbonden (figuur 3c).
- Bewaar secties bij-80 °C of-20 °C tot verder gebruik of direct gebruik voor immunofluorescentie of immunohistochemie.
5. immunokleuring voor markers van regeneratie
- Voer alle verdere stappen in een bevoficeerde kamer uit.
- Kort de secties op kamertemperatuur.
- Repareer secties met 1 mL 2% PFA (in PBS, pH 7,4) per glijbaan gedurende 5 min bij RT.
- Verwijder de 2% PFA-oplossing door deze in de betreffende afvalbak te gieten.
- Was 3 keer met 1 mL PBS (pH 7,4) gedurende 5 min bij RT.
- Verwijder de PBS door deze in een afvalbak te gieten.
- Voeg per dia 1 mL van de permeabilization oplossing (0,1% Triton X-100, 0,1 M glycine in PBS pH 7,4) gedurende 10 minuten toe.
- Verwijder de permeabilization-oplossing door deze in een afvalbak te gieten.
- Voeg 150 μL van de blokkerende oplossing (M.O.M. 1:40 in PBS pH 7,4) toe per dia en dek af met de afdekplaat. Incuberen gedurende 1 uur bij RT.
- Verwijder de dekglaasje en de blokkerende oplossing, Breng 100 μL primaire antilichaam oplossing aan [PAX7, DSHB, muis IgG1, onverdund of devMHC, DSHB, onverdund, muis IgG1and laminine (konijn, 1:1000)] per dia. Afdekking met dekslip. Incuberen O/N (overnachting) bij 4 °C.
Opmerking: Voer een controle kleuring uit door de primaire antilichamen te weglaten, inbroed de sectie met blokkerende oplossing in plaats daarvan. - Was 3 keer met 1 mL PBS (pH 7,4) gedurende 5 min bij RT.
- Verwijder PBS door het in een afvalbak te gieten.
- Voeg 100 μL van de oplossing voor secundair antilichaam (Alexa Fluor 546 Goat anti-Mouse IgG1 en Alexa Fluor 488 Donkey anti-konijn IgG in blokkerende oplossing, 1:1.000) per glijbaan en dek af met de dekglaasje. Incuberen gedurende 1 uur bij RT.
- Inbroed de glaasjes in het donker, bijv. gebruik een aluminiumfolie om een zwarte bevoficeerde kamer te bedekken of te gebruiken.
Opmerking: Vanaf nu moeten alle stappen worden uitgevoerd in gereduceerde lichtomstandigheden, omdat sommige secundaire antilichamen lichtgevoelig zijn. - Verwijder de dekslip en de secundaire antilichaam oplossing.
- Was 3 keer met 1 mL PBS (pH 7,4) gedurende 5 min bij RT.
- Verwijder de PBS door deze in een afvalbak te gieten.
- Voer DAPI-kleuring uit door 1 mL van de oplossing per dia toe te voegen aan een uiteindelijke concentratie van 10 μg/mL gedurende 5 minuten bij RT.
- Verwijder de DAPI-kleurings oplossing door deze in een afvalbak te gieten.
- Was 3 keer met 1 mL PBS (pH 7,4) gedurende 5 min bij RT.
- Verwijder de PBS die wordt gebruikt voor het wassen volledig.
- Breng 2 – 3 druppels waterig afdekmedium aan en dek de glijbaan direct af met een nieuwe dekglaasje.
- Laat de glaasjes 1 uur drogen bij RT in het donker.
- Bewaar de bevlekt delen bij 4 °C in het donker tot verdere analyse met behulp van een fluorescentiemicroscoop.
6. hematoxyline en eosine kleuring
- Voer alle verdere stappen in een bevoficeerde kamer uit.
- Repareer secties met 1 mL 2% PFA (in PBS, pH 7,4) per glijbaan gedurende 5 min bij RT.
- Verwijder de 2% PFA-oplossing door deze in de betreffende afvalbak te gieten.
- Breng de dia's over in een Coplin jar.
- Spoel de dia's voorzichtig af met kraanwater.
Opmerking: Zet de kraan niet te hoog, want dat kan de secties beschadigen. - Schuif de glaasjes in de bevochtingskamer. Verwijder de vloeistof.
- Breng 1 mL Hematoxylin-kleurings oplossing (Gill no 3) gedurende 2 minuten aan.
- Breng de dia's over in een Coplin jar.
- Spoel de dia's voorzichtig af met het kraanwater totdat de kernen blauw worden.
Opmerking: Zet de kraan niet te hoog, want dat kan je secties beschadigen. - Schuif de glaasjes in de bevochtingskamer. Verwijder de vloeistof.
- Breng 1 mL eosine oplossing aan en incuberen gedurende 2 min.
- Breng de dia's over in een Coplin jar.
- Spoel de dia's voorzichtig af met kraanwater totdat het kraanwater dat uit de glijbanen komt duidelijk is.
- Verwijder alle vloeistof en laat de glaasjes 2 min drogen.
- Bevestiging in bevestigings medium geschikt voor immunohistochemie.
Representative Results
Een typisch resultaat van een hematoxyline en eosine (H & E) kleuring van een tibialis anterieure spier vóór en na cardiotoxine gemedieerde verwonding wordt weergegeven in Figuur 4a, B. In de controle spieren, de architectuur van de spier is intact zoals gezien door de lokalisatie van de kernen in de periferie van de myofibers en het ontbreken van accumulatie van mononucleated cellen in de interstitiële ruimte (figuur 4a). 7 dagen na cardiotoxine gemedieerde verwonding worden nieuwe myovezels gevormd, gekenmerkt door centraal gelegen kernen (figuur 4b). Bovendien kan een accumulatie van mononucleated cellen worden waargenomen, die voornamelijk bestaan uit satelliet cellen, maar ook niet-myogene cellen zoals immuuncellen. De hele spier moet worden gewond gekenmerkt door de centrale ligging van alle myonuclei en de accumulatie van mononucleated cellen op de hele spier sectie.
Om de progressie en het succes van het regeneratieproces te karakteriseren, kunnen verschillende immunofluorescentie kleuring met behulp van markers van regeneratie worden uitgevoerd. Het aantal satelliet cellen kan worden geëvalueerd door kleuring voor Pax7, de canonieke marker voor satelliet cellen (Figuur 4C, D). Drie dagen na de verwonding neemt het aantal satelliet cellen toe (figuur 4D), de satelliet cellen bevinden zich niet meer onder de basale lamina. Om het regeneratieproces verder te analyseren, kunnen nieuw gevormde myovezels worden gekleurd met antilichamen gericht op ontwikkelings myosine (figuur 4e). Nieuw gevormde myofibers vertonen centraal gelegen kernen en een sterke uitdrukking van ontwikkelings myosine. Als de myofibers volwassen, expressie van de ontwikkeling van myosin afneemt, de diameter van de myofiber toeneemt terwijl kernen migreren naar de periferie van de myofibers.
De invloed van een enkel gen op het regeneratieproces kan worden onderzocht met behulp van transgene muizen of zoals hier weergegeven door injectie van een zelfvoorzienend siRNA. Fluorescently gelabelde Self-leveren van de gecodeerde controle siRNA werd geïnjecteerd in de regenererende tibialis anterieure spier op dag 3 na letsel, het tijdstip waarop de proliferatie van satelliet cellen pieken. Twee dagen na de injectie van de siRNA-satelliet cellen werden geanalyseerd op de aanwezigheid van het fluorescently gelabelde siRNA (figuur 4F). We analyseerden hoeveel satelliet cellen de fluorescently gelabeld siRNA twee dagen na de injectie in de regenererende spier hadden opgenomen (Figuur 5). Over 75% van alle satelliet cellen in de regenererende spier waren positief voor het fluorescently gelabelde siRNA. Bovendien bepaalden we dat ongeveer 74% van alle regenererende myovezels positief was voor het fluorescently gelabelde siRNA, wat suggereert dat ofwel 74% van de regenererende myovezels de siRNA had ingenomen of dat siRNA-positieve satelliet cellen ofwel hadden gefuseerd met elkaar om nieuwe myovezels te vormen of dat fusie met reeds bestaande regenererende myovezels optrad (Figuur 5). Dit suggereert dat de satelliet cellen de zelfvoorzienende siRNA innemen en dat de siRNA gedurende ten minste twee dagen in de satelliet cellen blijft.
Figuur 1: injectie van cardiotoxine in de anterieure spier van tibialis. A) muizen worden verdoiliseerd door inademing van Isofluraan en de onderste ledemaat is geschoren. B) een naald van 29 G wordt geïnjecteerd in de anterieure spier van tibialis (C) en tijdens de injectie van de cardiotoxine oplossing langs het tibia-bot bewogen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: stappen die betrokken zijn bij dissectie en bevriezing van de gewonde tibialis anterieure spier. A) de spieren van de achterledematen worden blootgelegd (B) en de fascia rond de anterieure spier van tibialis wordt geript om de spier bloot te leggen. (C) na het verwijderen van de spier, wordt het gesneden in het midden van de buik regio in twee helften van vergelijkbare grootte met behulp van scherpe rechte schaar (D). E) de helften van de ontleed spier zijn ingebed in een aluminiumfolie mal gevuld met Vries oplossing en bevroren in vloeibare stikstof (F). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: apparatuur en stappen die betrokken zijn bij het cryosnijden van tibialis anterieure spieren. A) de kamertemperatuur van het cryostatisch is ingesteld op-21 °c. B) de voorste spier van tibialis in de Vries oplossing wordt op de monsterhouder gemonteerd. C) de profielen met een dikte van 14 μm zijn aan de glas Microscoop glaasjes bevestigd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: representatieve beelden van het regenereren van tibialis anterieure spieren. H & E kleuring van tibialis anterieure spieren vóór (A) en 7 dagen na een cardiotoxine blessure (B). (C) in onbeschadigde spier Pax7 positieve (in rood) satelliet cellen bevinden zich onder de basale lamina gemarkeerd door laminine (in het groen). Nuclei zijn tegen gekleurd met DAPI (in blauw). Pax7 positieve cellen worden gemarkeerd met een pijl. (D) na 10 dagen van regeneratie worden myovezels gekenmerkt door centraal gelegen kernen (in blauw), Pax7 wordt weergegeven in rood, laminine groen. Pax7 positieve cellen worden gemarkeerd met een pijl. (E) nieuw gevormde myofibers Express ontwikkelings-myosin (in rood), laminine in het groen, kernen zijn tegen gekleurd met DAPI (in blauw). F) fluorescentend gelabelde zelfvoorzienende siRNA (sired, afgebeeld in rood) is nog steeds te vinden in satelliet cellen (Pax7 positief, in groen, gemarkeerd door een pijl in de inzet) 2 dagen na injectie van het zelfstellende siRNA in regenererende tibialis voorste spier (injectie op dag 3 na cardiotoxine gemedieerde verwonding). Laminin wordt weergegeven in het wit, kernen zijn contra-gekleurd met DAPI (in blauw). Schaal staaf = 100 μm (A en B), 50 μm (C-E), 25 μm (F). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: kwantificering van de opname van fluorescently gelabeld siRNA. A) kwantificering van siRNA-opname door satelliet cellen (Pax7 + cellen) en het regenereren van myovezels 2 dagen na de injectie in het regenereren van de skeletspieren. Injectie werd uitgevoerd op dag 3 na cardiotoxine gemedieerde letsel. n = 3, foutbalken weergeven SEM.B) kwantificering aan de hand van de in (A) afgebeelde grafiek. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
Hier presenteren we een methode om de functie van een specifiek gen te onderzoeken tijdens de regeneratie van de skeletspieren zonder de noodzaak van transgene dieren. Dit wordt bereikt door de combinatie van cardiotoxine geïnduceerde spierblessure met de injectie van een self-leveren siRNA in de regenererende skeletspieren op dag 3 na letsel. We hebben beschreven in detail de procedures van spier letsel door cardiotoxine, de injectie van de Self-leveren siRNA en de verwerking van de geoogste spieren om de voortgang van de regeneratie te analyseren. We tonen aan dat injectie van het slangen gif cardiotoxine in skeletspieren de hele spier effectief verwont en dat zelfvoorzienende Sirna's in ongeveer 75% van alle satelliet cellen onder andere celtypen worden aangetroffen twee dagen na hun injectie in de regeneratie van de skeletspieren (Figuur 4, Figuur 5).
Bijzondere aandacht moet worden besteed aan een homogene verwonding van de anterieure spier van tibialis, aangezien verschillende gradaties van letsel de regeneratie uitkomst beïnvloeden en daardoor ook het effect van de siRNA kan worden aangetast. Bovendien is het van cruciaal belang dat het hele regenererende gebied wordt geïnjecteerd met de zelfstellende siRNA. Voor de analyse van het regeneratieproces, is het raadzaam om altijd vergelijkbare gebieden van de regenererende skeletspieren, daarom, de tibialis anterieure spier moet worden gehalveerd om altijd het midden van de buik regio van de spier te vergelijken. Bij het analyseren van de spier, de hele cryosectie moet worden geanalyseerd omdat myofiber samenstelling verschilt in de tibialis anterieure spier en kan daarom regenereren anders.
De functie van satelliet cellen kan worden onderzocht door verschillende experimentele procedures, met inbegrip van hun cultuur op de aangrenzende geïsoleerde enkelvoudige myovezels17, door transplantatie en door het analyseren van de regeneratie van de skeletspieren na geïnduceerde letsel 18,19. Het onderzoeken van de functie van satelliet cellen met behulp van een in vivo geïnduceerde letsel model, bijvoorbeeld, injectie van cardiotoxine, biedt de mogelijkheid om te analyseren van de functie van de satelliet-cel ook in termen van hun interactie met andere celtypen zoals macrofagen en onderzoek naar de invloed van systemische factoren2. Letsel van de skeletspieren kan worden bereikt met verschillende middelen, bijvoorbeeld, excentrische oefening, bevriezing letsel, injectie van BaCl2 of injectie van slangen vergiften zoals cardiotoxine of notexin18. Hoewel excentrische oefening waarschijnlijk de meest fysiologische blessure methode is, is de verwonding aan een bepaalde spier slechts beperkt tot20. Bevriezing verwondingen kunnen worden toegepast wanneer de migratie van satelliet cellen naar de plaats van letsel is het doel van de studie of slechts een specifiek deel van de spier moet worden gewond. Experimenteel het nadeel van bevriezings blessures is de open chirurgie die moet worden uitgevoerd om de gekoelde metaal sonde toe te passen. Injectie van BaCl2 of slangen vergiften is de meest dramatische methode van letsel, waardoor uitdagende satellietcel functie het meest. Bovendien, de injectie is minimaal invasief, chirurgie tijd, in het algemeen, is minder dan vijf minuten en geen betrekking hebben op het suturing, etc. waardoor het risico van infecties te minimaliseren.
Spier letsel wordt meestal gebruikt om de functionele gevolgen van verlies van genfuncties te onderzoeken, bijvoorbeeld verlies van Pax77,21. Vooral als leeftijd muizen de focus van de wetenschappelijke vraag zijn, is de generatie of het gebruik van transgene muizen vaak niet haalbaar. Injectie van zelfvoorzienende Sirna's gericht op een specifiek gen is in die gevallen een levensvatbaar alternatief en is met succes22gebruikt. In het kort, de tibialis anterieure spier van muizen werd gewond door injectie van cardiotoxine en zelfvoorzienende Sirna's gericht tegen fibronectin (FN) werden geïnjecteerd op dag 3 na letsel. De spieren werden 10 dagen na het letsel geanalyseerd en er werd een significante afname van de satelliet cellen waargenomen in siFN versus roerdende siRNA-controle omstandigheden. De daling van de efficiëntie werd bepaald in hele spier lysaten door kwantitatieve real-time PCR 2 dagen na de injectie met siRNA, een afname van de uitdrukkings niveaus van 58% werd bereikt, wat suggereert dat de lever-en afdek efficiëntie voldoende zijn voor functionele analyses22. Alternatieven voor het testen van de knockdown-efficiëntie zijn immunoblot-of immunofluorescentie analyses met antilichamen tegen het doel gen. De efficiëntie en specificiteit van de siRNA gebruikt voor in vivo injecties moet worden bepaald vóór de injectie in muizen, bijvoorbeeld door het testen van de efficiëntie in geïsoleerde satelliet cellen of primaire myoblasten. Het gebruik van een Smart pool bestaande uit 4 verschillende Sirna's versus een enkele siRNA verhoogt de efficiëntie van knockdown, maar verhoogt ook het risico van niet-specifieke targeting. De specificiteit van alle gebruikte siRNA-sequenties moet worden getest in celkweek om niet-doel effecten te voorkomen. Als een controle, moet een niet-gerichte versleutelde siRNA worden gebruikt, aangezien de injectie van een siRNA per se het regeneratieproces kan beïnvloeden als gevolg van de injectie en daardoor extra schade aan de spier. Het tijdpunt van het injecteren van de siRNA is afhankelijk van de wetenschappelijke vraag en het uitdrukkings Profiel van het doel gen. In het algemeen, een injectie van Self-leveren siRNA op dag 3 na cardiotoxine letsel richt zich op de meeste genen belangrijk voor de proliferatie van de satelliet cellen sinds de satelliet celproliferatie pieken rond dag 3 na letsel. Het tijdstip voor de eerste injectie met siRNA mag niet minder zijn dan 48 h na cardiotoxine letsel omdat het injectievolume van cardiotoxine vrij hoog is en reabsorptie van de vloeistof moet plaatsvinden voordat aanvullende oplossingen in de spier worden geïnjecteerd. Over het algemeen zijn meerdere injecties van Sirna's of een combinatie van verschillende Sirna's mogelijk, hoewel men moet bedenken dat elke injectie in de regeneratie spier extra schade veroorzaakt.
Een beperking van de beschreven methode is het feit, dat het waargenomen effect niet noodzakelijkerwijs alleen afhankelijk is van de knockdown van het doel-gen in satelliet cellen, maar kan worden toegeschreven aan andere celtypen zoals immuuncellen of Fibro-adipogene voorlopercellen. Daarom is het noodzakelijk om die experimenten te combineren met experimenten die een zuivere populatie van satelliet cellen onderzoeken. Men kan ofwel experimenten uitvoeren met behulp van zwevende myovezel culturen, waarbij satelliet cellen worden gekweekt op hun aangrenzende myofibers of transplantatie experimenten uitvoeren met geïsoleerde satelliet cellen17.
Een alternatief voor de injectie van zelfvoorzienende Sirna's is de injectie van kleine molecuul remmers of recombinante eiwitten die kunnen worden uitgevoerd, afhankelijk van de wetenschappelijke vraag. Zo is de injectie van de extracellulaire matrix proteïne fibronectin of kleine molecuul remmers van Jak/Stat-signalering met succes uitgevoerd bij oudere muizen15,16. De analyse van een bepaalde genfunctie in een specifiek celtype tijdens de regeneratie van de skeletspieren, bijvoorbeeld in satelliet cellen, is alleen mogelijk door het gebruik van een induceerbaar genetisch muismodel. Injecties van Self-leveren Sirna's, recombinant eiwitten of kleine molecuul remmers kunnen invloed hebben op meerdere celtypen in het regenereren van skeletspieren.
Disclosures
We willen Christina Picker en Christine Poser bedanken voor de uitstekende technische assistentie en Saskia Steiner voor hulp bij het bepalen van de efficiëntie van siRNA transfectie. Wij danken de kernservice histologie voor de grote technische ondersteuning, met name Sabine Landmann en Linda Rothenburger. We bedanken ook de muis van de dieren faciliteit bij de FLI voor uitstekende ondersteuning. Dit werk werd gesteund door subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (MA-3975/2-1) en de Deutsche Krebshilfe (DKH-JvM-861005) tot en met J.v.M.
Acknowledgments
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Henry Schein | Isothesia | inhalation narcotics |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Anesthesia System (Tec 7) with inhalation box + nose masks | Tem Sega | Minihub | |
| Shaver for rodents | isis | GT420 | |
| Cardiotoxin | Latoxan | L8102 | snake venom needed for muscle injury |
| Accell siRNA smart pool | Dharmacon | depending on your target gene | self delivering siRNA |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-21206 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher | A-21123 | secondary antibody |
| Coverslips | VWR | 631-1574 | |
| CV Mount | Leica | 14046430011 | mounting medium for immunohistochemistry |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | nuclear staining |
| devMHC antibody | DHSB | F.1652 | |
| Eosin Y | Thermo Fisher | 73104 | |
| Haematoxylin Gill No3 | Sigma-Aldrich | GHS316-500ML | |
| Insulin syringe (29 g) | Terumo | 3SS05M2813 | syringue used for muscle injections |
| Laminin antibody | Sigma Aldrich | L9393 | |
| M.O.M blocking reagent | Vector labs | MKB-2213 | blocking for immunofluorescent staining |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | Metacam | analgesics |
| OCT | Thermo Fisher | 6502 | tissue embedding |
| Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | satellite cell specific antibody |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher | P36934 | aequos mounting medium |
| Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | tissue embedding |
| Superfrost plus | Thermo Scientific | J1830AMNZ | microscope slides |
| TritonX-100 | Amresco | 0694-1L | permeabilization reagent |
| Dissection tools | |||
| Dumont 5, straight | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Dumont 7, curved | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Extra fine Bonn scissors (cutting edge: 13 mm) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-16 | |
| Spring scissors (cutting edge: 5 mm, tip diameter: 0.35 mm) | Fine Science Tools | 91500-09 |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Schmidt, M., Schuler, S. C., Huttner, S. S., von Eyss, B., von Maltzahn, J. Adult stem cells at work: regenerating skeletal muscle. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytolology. 9, 493-495 (1961).
- Shea, K. L., et al. Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration. Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).
- von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. Satellite cells and the muscle stem cell niche. Physiological Reviews. 93 (1), 23-67 (2013).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Building muscle: molecular regulation of myogenesis. Cold Spring Harb Perspectives in Biology. 4 (2), (2012).
- Schworer, S., et al. Epigenetic stress responses induce muscle stem-cell ageing by Hoxa9 developmental signals. Nature. 540 (7633), 428-432 (2016).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- von Maltzahn, J., Renaud, J. M., Parise, G., Rudnicki, M. A. Wnt7a treatment ameliorates muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 109 (50), 20614-20619 (2012).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nature Medicine. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Lukjanenko, L., et al. Loss of fibronectin from the aged stem cell niche affects the regenerative capacity of skeletal muscle in mice. Nature Medicine. 22 (8), 897-905 (2016).
- Huttner, S. S., et al. Isolation and Culture of Individual Myofibers and Their Adjacent Muscle Stem Cells from Aged and Adult Skeletal Muscle. Methods in Molecular Biology. , (2019).
- Hardy, D., et al. Comparative Study of Injury Models for Studying Muscle Regeneration in Mice. PLoS One. 11 (1), e0147198 (2016).
- Hall, M. N., et al. Transplantation of Skeletal Muscle Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1556, 237-244 (2017).
- Dueweke, J. J., Awan, T. M., Mendias, C. L. Regeneration of Skeletal Muscle After Eccentric Injury. Journal of Sport Rehabilitation. 26 (2), 171-179 (2017).
- Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements. Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).
- Bentzinger, C. F., et al. Fibronectin regulates Wnt7a signaling and satellite cell expansion. Cell Stem Cell. 12 (1), 75-87 (2013).
