Summary
Vi beskriver en in vivo metode for å undersøke funksjonell tap av et bestemt gen i satellitt celler ved hjelp av en kombinasjon av cardiotoxin mediert skade av skjelettlidelser muskel og injeksjon av en selv-levere siRNA.
Abstract
Skjelettmuskelen besitter en enorm evne til å regenerere etter skade. Denne prosessen er hovedsakelig drevet av muskel stamceller, også betegnet satellitt celler. Satellitt celler er preget av uttrykk for transkripsjon faktor Pax7 og deres plassering under basal lamina i hvile skjelettmuskelen. Ved skade, satellitt celler blir aktivert, gjennomgår selv-fornyelse eller differensiering til enten danne nye myofibers eller å fusjonere med skadet seg. Funksjonaliteten til satellitt celler in vivo kan undersøkes ved hjelp av en cardiotoxin basert skademodell av skjelettmuskulatur. For å studere funksjonen av ett gen under regenerering av Skjelettmuskel, transgene Mouse modeller brukes mest. Her presenterer vi en alternativ metode til transgene mus, for å undersøke gen funksjonen i satellitt celler under regenerering, f. eks, i tilfeller der transgene mus ikke er tilgjengelig. Vi kombinerer cardiotoxin mediert skade av en bestemt Skjelettmuskel med injeksjon av en selv-levere siRNA inn i regenererende muskelen som deretter tas opp av satellitt celler blant andre celler. Derved gir vi en metode for å analysere gen funksjon i satellitt celler under regenerering under fysiologiske forhold uten behov for transgene mus.
Introduction
Skjelettmuskel er kroppens største vev representerer ca 40% av total kroppsvekt muliggjør frivillig bevegelse. Vevs arkitekturen av skjelettmuskelen består hovedsakelig av postmitotic, uhelbredelig differensiert, multinucleated myofibers samt diverse andre celler fra det perifere nervesystemet, vaskulær system, og interstitiell celler1. Viktigere, skjelettlidelser muskelen har en enorm kapasitet til å regenerere og gjenopprette funksjon på skade eller skade2. Denne prosessen avhenger av vevet bosatt muskel stamceller også kalt satellitt celler3,4. Satellitt celler er plassert mellom myofiber og basal lamina og preget av uttrykk for transkripsjon faktor Pax75,6,7. Under homøostatisk forhold, satellitt celler er Quiescent men blir aktivert på grunn av traumatisk skade, f. eks, gjennom eksentrisk trening eller eksperimentelt gjennom injeksjon av slange Venomcardiotoxin. Når aktivert, Pax7 positive satellitt celler co-Express MyoD og Myf5, som begår stamceller til myogenic differensiering. Satellitt celler som motstår oppregulering av innsatsfaktorer vil beholde sitt stemness potensiale og gå tilbake til fredfulle omgivelser for å etterfylle Stamcelle utvalget for fremtidige behov. Etter utvidelsen av myogenic stamfar bassenget, transcriptional nettverk aktiveres av differensiering faktorer som Myogenin å starte celle syklus exit og Terminal differensiering. Disse myoprogenitors deretter sikring til hverandre eller til eksisterende myofibers bidrar myonuclei å opprettholde størrelsen på myonuclear domenet. Den myofibers Express Terminal muskel differensiering gener som myosin Heavy Chain. Endelig, den nyopprettede myofibers vokse og modne til å bygge funksjonelle enheter av skjelettlidelser muskel9,10.
Regenerering av skjelettmuskulatur kan påvirkes av ulike forhold, inkludert muskel sykdommer eller aldring11,12, alt fra milde hemninger til livstruende forhold, for eksempel i Duchenne muskuløse dystrofi13 , 14. derfor har regenererende medisin som mål å gjenopprette skadet eller defekt skjelettlidelser muskel vev ved hjelp av sin iboende regenererende kraft ved å målrette satellitt celle funksjon15,16. For å bruke sitt fulle potensiale en helhetlig forståelse av satellitt celler i sin endogene nisje under regenerering av skjelettmuskulatur er nødvendig. Selv om eksperimentelle tilnærminger eksisterer for å isolere satellitt celler ved siden av deres myofibers17, kan full kompleksitet av cellulære og systemiske interaksjoner av satellitt celler med deres miljø bare være sammenfattet in vivo. I den forbindelse, stor kunnskap om skjelettlidelser muskel regenerering er ervervet ved hjelp av musen skade modeller2,18.
Her introduserer vi en bestemt eksperimentell mus skademodell for å studere Stam cellen mediert regenerering av cardiotoxin-indusert skade av tibialispuls fremre muskel in vivo. Cardiotoxin, en slange avledet cytolytisk giftstoffer som forårsaker myofiber depolarization og nekrose, injiseres i tibialispuls fremre muskelen, som igjen vil utløse vev degenerasjon etterfulgt av regenerering. For å analysere funksjon av gener under akutt regenerering, selv levere siRNAs injiseres på dag 3 etter skade, på toppen av satellitt celle ekspansjon. Eksperimentelle dyr er ofret på ulike tidspunkter og tibialispuls fremre musklene er samlet. Dissekert musklene er frosset og behandlet for videre fryse-snitting. Immunofluorescence mikroskopi brukes deretter til å analysere markører for regenerering. Denne metoden gjør det mulig for etterforskningen av funksjonen til et enkelt gen under satellitt celle drevet regenerering av skjelettmuskulatur med vill type mus.
Protocol
Alle dyr prosedyrer ble godkjent av Animal Welfare Department av Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz (03-048/16; TLV Bad Langensalza, Tyskland).
1. Cardiotoxin-indusert muskel skade
Merk: Utfør alle eksperimenter som involverer levende mus i samsvar med den nasjonale dyre velferds loven og under egnede aseptisk forhold. Dessuten må ofring av dyr utføres i samsvar med den nasjonale Animal Welfare Act.
- Desinfisere inhalasjons boksen brukes til inhalasjon anestesi og operasjonsområdet med 70% etanol. Plasser en steril kirurgisk klut på varmeputen der operasjonen vil finne sted.
- Slå på varmeputen ved 37 ° c.
- Administrering av smertestillende (f.eks. 1 mg/kg kroppsvekt meloksikam subkutant) 15 minutter før operasjonen starter.
Merk: For et typisk eksperiment, bruk mus som er minst 6 uker gammel, Sex-matchet og i en god generell fysisk tilstand. - Klargjør cardiotoxin løsningen (20 μM i 0,9% NaCl), Oppbevar løsningen ved-20 ° c.
- La den cardiotoxin løsningen nå romtemperatur (RT).
- Overfør musen inn i inhalasjons boksen og indusere anestesi med isoflurane (initiering 3,5 – 5% i rent oksygen). Sjekk dybden av anestesi med mangel på respons på en tå knipe.
- Plasser musen på et rent papir håndkle og vedlikeholde anestesi med en nesemaske (1,5-3% isoflurane i rent oksygen). Barbere injeksjonsområdet av skallen leggen (fra kne til pote, figur 1a). Fjern alt overflødig løs hår.
Merk: Fysisk skille skjære-og injeksjonsområdet i rommet vil gi mer sterile betingelser for injeksjoner. - Plasser musen i lateral liggende posisjon på varmeputen dekket med en steril kirurgisk klut og opprettholde anestesi med en nesemaske (1,5-3% isoflurane i rent oksygen).
- Desinfisere injeksjonsområdet av skallen leggen (fra kne til pote) med 70% etanol.
- Utfør en tå klype før du starter intramuskulær injeksjon for å sikre en tilstrekkelig dybde av anestesi.
- Injiser 50 μL cardiotoxin (20 μM i 0,9% NaCl) inn i den tibialispuls fremre muskelen ved hjelp av en insulinsprøyte med en 29-gauge nål. Først Pierce huden bare en rekke av kneet.
- Sett nålen helt inn i muskelen (i myofiber orientering/parallelt med Tibia bein) og injisere cardiotoxin langsomt (10-20 s) langs hele lengden av muskelen mens du flytter nålen frem og tilbake for å tillate en jevn fordeling av cardiotoxin dermed skadet hele tibialispuls fremre muskelen (figur 1B, C).
Merk: Skade tibialispuls fremre muskelen fra bare ett ben, kontralateral tibialispuls fremre muskelen kan tjene som en intern kontroll for å fastslå at skjelettlidelser musklene ikke var patologisk påvirket før cardiotoxin skade. - Forflytning musa rygg å dens bur oppstilt opp på en varmer pute og dataskjerm det det å bli frisk forarbeide til det dyr er bevisst og blir oppegående.
Merk: Musene vil bare vise litt halte. Hvis mus er halt tungt og ikke legge vekt på beinet i det hele tatt, ofre musen. - Administrere smertestillende i løpet av de følgende 2 dagene (f.eks. 1 mg/kg kroppsvekt meloksikam subkutant, hver 24 h) og overvåke dem på ukentlig basis.
2. injeksjon av Self-levere siRNA inn regenererende Tibialispuls fremre muskel (på dag 3 post Cardiotoxin skade)
- Klargjør siRNA-løsningen ved å blanding siRNA (for eksempel siRNA smart pool) i 0,9% NaCl (siste konsentrasjon på 2 μg/μL) i henhold til produsentens instruksjoner.
Merk: Den siRNA er kjemisk modifisert for å lette passiv opptak av celler og beskytte den mot nuklease degradering. Ingen transfeksjoner reagenser er nødvendig, og reduserer dermed toksisitet. Ved hjelp av en smart pool av fire uavhengige siRNA sekvenser rettet mot det samme genet øker knockdown effektivitet. - Oppbevar siRNA ved-20 ° c og overfør den på is til operasjonsrommet.
- Desinfisere inhalasjons boksen brukes til inhalasjon anestesi og operasjonsområdet med 70% etanol. Plasser en steril kirurgisk klut på varmeputen der operasjonen vil finne sted.
- Slå på varmeputen ved 37 ° c.
- Overfør musen inn i inhalasjons boksen og indusere anestesi med isoflurane (initiering 3,5 – 5% i rent oksygen). Sjekk dybden av anestesi med mangel på respons på en tå knipe.
- Plasser musen i lateral liggende posisjon på varmeputen dekket med en steril kirurgisk klut og opprettholde anestesi med en nesemaske (1,5-3% isoflurane i rent oksygen).
- Desinfisere injeksjonsområdet av skallen leggen (fra kne til pote).
- Utfør en tå klype før du starter intramuskulær injeksjon for å sikre en tilstrekkelig dybde av anestesi.
- Injiser opptil 50 μL siRNA-løsning (opptil 100 mikrogram totalt i 0,9% NaCl; rettet mot mål genet; bruk forvrengt siRNA som kontroll) i den skadde tibialispuls fremre muskelen ved hjelp av en insulinsprøyte med en 29 G nål. Først Pierce huden bare ned i kneet, og deretter sette nålen inn i tibialispuls fremre muskelen.
- Sett nålen helt inn i muskelen (i myofiber orientering/parallelt med Tibia bein) og injisere siRNA løsningen langsomt (10 – 20 s) langs hele lengden av muskelen mens du flytter nålen frem og tilbake for å tillate en jevn fordeling av siRNA langs hele tibialispuls fremre muskelen.
- Forflytning musa rygg å dens bur oppstilt opp på en varmer pute og dataskjerm det det å bli frisk forarbeide til det dyr er bevisst og blir oppegående.
Merk: Analgesi er ikke nødvendigvis etter injeksjon av siRNA.
3. Disseksjon av Tibialispuls fremre muskelen
- Forbered frysing løsning (2 deler OCT sammensatte og 1 del 30% sukrose i deionisert vann) minst 12 timer før bruk for å unngå luftbobler.
- Forbered frysing muggsopp ved å pakke en aluminiumsfolie rundt en blyant og forsegle den med tape. Det er viktig at bunnen av mold gir en jevn, lukket overflate.
Merk: Mindre frysing muggsopp tillate raskere frysing av muskelen unngå frysing gjenstander. - Ofre musen, for eksempel ved CO2 inhalasjon, ved de respektive tidspunktet punktet for regenerering og spray hele musen og disseksjon verktøy med 70% etanol.
Merk: Cervical forvridning kan påføres, i tillegg, for å unngå overdreven blødning på beinet når isolere tibialispuls fremre muskelen. - Fjern pelsen og huden fra den skadde hindlimb bentap ved å kutte huden på ankelen med ekstra fin skarp saks (cutting edge: 13 mm) og trekke opp huden mot kneet ved hjelp av tang.
- For å avdekke tibialispuls fremre sene ved ankelen, trekk den resterende huden mot foten eller skjær med skarpe saks.
Merk: Musen kan festes til et Støttebrett for å gi bedre fiksering. - Før høsting av tibialispuls fremre muskelen, fjerne konseptet med fine tang (Dumont 5 eller 7, rett eller buet). Knip den lukkede pinsett gjennom dashbordet ved siden av Tibia benet på ankelen av den skadde benet (figur 2a). Flytt pinsett mot kneet og dermed rive på dashbordet og utsette tibialispuls fremre muskelen (figur 2b).
- For å isolere tibialispuls fremre muskelen, utsett den klare sene og grip den med fin tang (Dumont 7, buet). Skjær senen ved hjelp av fjær saks (cutting edge: 5 mm, spissdiameter: 0,35 mm) og trekk i muskelen (holder den på senen) mot kneet.
- Å høste tibialispuls fremre muskelen, skjær den så nær kneet som mulig ved hjelp av skarpe saks.
- Før frysing, kutt tibialispuls fremre muskelen på midten av magen regionen av muskelen med rett saks i to halvdeler av samme størrelse for å tillate analyse av midten av magen regionen (figur 2C, D).
- Fyll fryse formen halvveis med fryse løsningen.
- Sett inn de to halvdelene av tibialispuls fremre muskelen i frysing mold med midten av magen regionen mot bunnen av mold (figur 2e). Kontroller at tibialispuls fremre halvdelene er satt inn i en oppreist posisjon lener seg mot veggen av frysing mold å unngå tipping av muskelen.
Merk: Jo mer frysing løsningen er i mold, jo lenger frysing vil ta, og dermed øke risikoen for fryse-gjenstander. - Hold frysing mold bruker tang og overføre den halvveis i flytende nitrogen (figur 2F). Pass på at ingen flytende nitrogen går inn i frysing mold under fryse prosessen.
- Observer frysing prosessen, fryser medium skifter farge fra gjennomsiktig til hvit og blir solid. Submerse frysing mold i flytende nitrogen i noen sekunder og overføre frysing mold til a-80 ° c fryser eller til tørr is for fremtidig behandling.
- Oppbevar de frosne musklene i fryse formene ved-80 ° c til videre bruk.
Merk: Den fryse formene passer godt i 24-brønn plater eller 1,5 mL reaksjons rør som tillater merking og organisert lagring. - Håndter muskelen i fryse formene for videre bruk alltid på tørr is.
4. kryosnitt av regenererende Tibialispuls fremre muskel
- Før du starter snitting, Still kammertemperaturen på kryostaten til-21 ° c, objekt temperaturen til-20 ° c og skjæretykkelsen til 10, 12 eller 14 μm (avhengig av fremtidige bruksområder) (figur 3a).
- Overfør muskel prøven i frysing mold i kryostaten og la den justere til temperaturen i flere minutter. I denne perioden skal du sette etiketter på objektglassene.
- Fjern folien rundt den innebygde muskelen ved hjelp av forkjøles tang inne i kryostaten. Unngå å berøre prøven når cryomedium begynner å tine lett.
- Monter prøven med midten av magen regionen av tibialispuls fremre muskelen rettet oppover på metall prøve holderen av kryostaten ved hjelp av cryomedium. Dette sikrer at skjæreområdet av muskelen (bunnen av mold) er vendt mot eksperimentator.
- Sett prøve holderen med den monterte prøven inn i skjæremekanismen.
Merk: For å sikre riktig snitting av prøven, bruk et nytt blad før du starter. - Først trim prøveblokken (30 μm) for å få et jevnt skjære fly og for å nå den respektive regionen av muskelen (figur 3b).
- Etter trimming, kutt påfølgende deler av den respektive tykkelse (f. eks, 14 μm).
- Samle delene på glass objekt lysbildene ved å holde lysbildet med forsiden ned overdelen. Inndelingen knyttes til lysbildet (figur 3c).
- Lagre seksjoner ved-80 ° c eller-20 ° c til videre bruk eller direkte bruk for immunofluorescence eller immunhistokjemi.
5. Immunostaining for markører for regenerering
- Utfør alle ytterligere trinn i et fuktet kammer.
- Kort, likevekt delene ved romtemperatur.
- Fix seksjoner med 1 mL 2% PFA (i PBS, pH 7,4) per lysbilde for 5 min ved RT.
- Fjern 2% PFA-løsningen ved å helle den i den respektive avfallsbeholderen.
- Vask 3 ganger med 1 mL PBS (pH 7,4) i 5 minutter ved RT.
- Fjern PBS-en ved å helle den i en avfallsbeholder.
- Per slide, tilsett 1 mL av den permeabilization løsningen (0,1% Triton X-100, 0,1 M Glycine i PBS pH 7,4) i 10 min.
- Fjern den permeabilization løsningen ved å helle den i en avfallsbeholder.
- Tilsett 150 μL av blokkerings løsningen (M.O.M. 1:40 i PBS pH 7,4) per Slide og dekk med dekkglass. Ruge for 1 time ved RT.
- Fjern dekkglass og blokkerings løsningen, Påfør 100 μL av primær antistoff løsning [PAX7, DSHB, mus IgG1, ufortynnet eller devMHC, DSHB, ufortynnet, mus IgG1and laminin (kanin, 1:1000)] per lysbilde. Dekk med dekkglass. Ruge O/N (overnatting) ved 4 ° c.
Merk: Utfør en kontroll farging ved å utelate den primære antistoffer, ruge delen med blokkering løsning i stedet. - Vask 3 ganger med 1 mL PBS (pH 7,4) i 5 minutter ved RT.
- Fjern PBS ved å helle den i en avfallsbeholder.
- Tilsett 100 μL av sekundær antistoff løsning (Alexa fluor 546 geit anti-mus IgG1 og Alexa fluor 488 esel anti-kanin IgG i blokkering løsning, 1:1 000) per lysbilde og dekk med dekkglass. Ruge for 1 time ved RT.
- Ruge lysbildene i mørket, for eksempel bruke en aluminiumsfolie for å dekke eller bruke en svart fuktet kammer.
Merk: Fra nå av bør alle trinn utføres i redusert lysforhold siden noen sekundære antistoffer er lysfølsomme. - Fjern dekkglass og den sekundære antistoff oppløsningen.
- Vask 3 ganger med 1 mL PBS (pH 7,4) i 5 minutter ved RT.
- Fjern PBS-en ved å helle den i en avfallsbeholder.
- Utfør DAPI farging ved å tilsette 1 mL oppløsning per lysbilde til en endelig konsentrasjon på 10 μg/mL i 5 minutter ved RT.
- Fjern DAPI farge løsning ved å helle den i en avfallsbeholder.
- Vask 3 ganger med 1 mL PBS (pH 7,4) i 5 minutter ved RT.
- Fullstendig fjerne PBS brukes til vask.
- Påfør 2 – 3 dråper vandig montering medium og direkte dekke lysbildet med en ny dekkglass.
- La lysbildene tørke i 1 time ved RT i mørket.
- Oppbevar fargede seksjoner ved 4 ° c i mørket inntil videre analyse ved hjelp av et fluorescens mikroskop.
6. hematoksylin og Eosin farging
- Utfør alle ytterligere trinn i et fuktet kammer.
- Fix seksjoner med 1 mL 2% PFA (i PBS, pH 7,4) per lysbilde for 5 min ved RT.
- Fjern 2% PFA-løsningen ved å helle den i den respektive avfallsbeholderen.
- Overfør lysbildene til en Coplin krukke.
- Skyll lysbildene forsiktig med vann fra springen.
Merk: Ikke slå på kranen for høyt siden det kan skade seksjonene. - Overfør lysbildene til fuktet kammeret. Fjern væsken.
- Påfør 1 mL Hematoksylin farge løsning (Gill nr 3) i 2 min.
- Overfør lysbildene til en Coplin krukke.
- Skyll forsiktig lysbildene med vann fra springen til kjernene blir blå.
Merk: Ikke slå på kranen for høyt siden det kan skade dine seksjoner. - Overfør lysbildene til fuktet kammeret. Fjern væsken.
- Påfør 1 mL Eosin Y-oppløsning og ruge i 2 min.
- Overfør lysbildene til en Coplin krukke.
- Skyll forsiktig lysbildene med vann fra springen til vann fra springen kommer av lysbildene er klar.
- Fjern all væske og la lysbildene tørke i 2 minutter.
- Monter i monterings medium egnet for immunhistokjemi.
Representative Results
Et typisk resultat av en hematoksylin og eosin (H & E) farging av en tibialispuls fremre muskelen før og etter cardiotoxin mediert skade er presentert i Figur 4a, B. I kontroll musklene, er arkitekturen av muskelen intakt sett av lokalisering av kjerner i periferien av myofibers og mangelen på akkumulering av mononucleated celler i interstitiell plass (figur 4a). 7 dager etter cardiotoxin mediert skade nye myofibers er dannet preget av sentralt beliggende kjerner (figur 4b). Videre kan en opphopning av mononucleated celler observeres, bestående hovedsakelig av satellitt celler, men også ikke-myogenic celler som immunceller. Hele muskelen bør være skadet preget av den sentrale plasseringen av alle myonuclei og akkumulering av mononucleated celler på hele muskelen delen.
For å karakterisere utviklingen og suksessen til regenerering prosessen, kan flere immunofluorescent farging ved hjelp av markører for regenerering utføres. Antall satellitt celler kan evalueres ved farging for Pax7, den kanoniske markør for satellitt celler (Figur 4C, D). Tre dager etter skade antall satellitt celler øker (figur 4d), satellitt celler er ikke plassert under basal lamina lenger. For ytterligere å analysere regenerering prosessen, nyopprettede myofibers kan være farget med antistoffer rettet mot utviklingsmessige myosin (figur 4e). Nyopprettede myofibers display sentralt plassert kjerner og et sterkt uttrykk for utviklingsmessige myosin. Som myofibers modne, uttrykk for utviklingsmessige myosin avtar, diameteren av myofiber øker mens kjerner migrerer til periferien av myofibers.
Påvirkningen av et enkelt gen på prosessen med regenerering kan undersøkes ved hjelp av transgene mus eller som vist her ved injeksjon av en selv-levere siRNA. Fluorescensmerkete merket selv levere kryptert kontroll siRNA ble injisert i regenererende tibialispuls fremre muskelen på dag 3 etter skade, tidspunktet punktet når spredning av satellitt celler topper. To dager etter injeksjon av siRNA satellitt celler ble analysert for tilstedeværelsen av fluorescensmerkete merket siRNA (figur 4f). Vi analyserte hvor mange satellitt celler hadde tatt opp fluorescensmerkete merket siRNA to dager etter injeksjon i regenererer muskelen (figur 5). Om 75% av alle satellitt celler i regenererende muskelen var positive for fluorescensmerkete merket siRNA. Videre har vi fastslått at om 74% av alle regenererende myofibers var positive for fluorescensmerkete merket siRNA antyder at enten 74% av regenererende myofibers hadde tatt opp siRNA eller at siRNA-positive satellitt celler enten hadde smeltet sammen med hverandre for å danne nye myofibers eller at fusjon med allerede eksisterende regenererende myofibers oppstod (figur 5). Dette tyder på at satellitt celler tar opp selv levere siRNA og at siRNA vedvarer i satellitten cellene i minst to dager.
Figur 1: injeksjon av cardiotoxin i tibialispuls fremre muskelen. (A) mus er anesthetized ved innånding av isoflurane og nedre Lem er barbert. (B) en 29 G nål injiseres i tibialispuls fremre muskelen (C) og beveget seg langs Tibia benet under injeksjon av cardiotoxin løsning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: trinn involvert i disseksjon og frysing av den skadde tibialispuls fremre muskelen. (A) The hind lemmer musklene er eksponert (B) og konseptet rundt tibialispuls fremre muskelen er dratt for å avdekke muskelen. (C) etter å ha fjernet muskelen, er det kuttet på midten magen regionen i to halvdeler av samme størrelse ved hjelp av skarpe rette saks (D). (E) halvdelene av dissekert muskelen er innebygd i en aluminiumsfolie mold fylt med frysing løsning og frosset i flytende nitrogen (F). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: utstyr og trinn involvert i kryosnitt av tibialispuls fremre muskler. (A) kammertemperaturen på kryostaten er satt til-21 ° c. (B) tibialispuls fremre muskel i fryse løsningen er montert på prøve holderen. (C) deler av 14 μm tykkelse er festet til glass mikroskop lysbilder. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: representative bilder av regenererende tibialispuls fremre muskler. H & E farging av tibialispuls fremre muskler før (A) og 7 dager etter cardiotoxin Kader (B). (C) i uskadet muskel Pax7 positive (i rødt) satellitt celler er plassert under basal lamina preget av laminin (i grønt). Kjerner er counterstained med DAPI (i blått). Pax7 positive celler er merket med en pil. (D) etter 10 dager med regenerering, myofibers er preget av sentralt beliggende kjerner (i blått), Pax7 er vist i rødt, laminin i grønt. Pax7 positive celler er merket med en pil. (E) nyopprettede myofibers uttrykke utviklingsmessige myosin (i rødt), laminin i grønt, kjerner er COUNTERSTAINED med DAPI (i blått). (F) fluorescensmerkete merket selv-levere SiRNA (avlet, avbildet i rødt) er fortsatt funnet i satellitt celler (Pax7 positive, i grønt, merket med en pil i innfelt) 2 dager etter injeksjon av selv-levere siRNA til regenererende tibialispuls fremre muskel (injeksjon på dag 3 etter cardiotoxin mediert skade). Laminin er vist i hvitt, kjerner er counterstained med DAPI (i blått). Skala bar = 100 μm (A og B), 50 μm (C-E), 25 μm (F). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: kvantifisering av opptaket av fluorescensmerkete merket siRNA. (A) kvantifisering av siRNA opptak av satellitt celler (Pax7 + celler) og regenererende myofibers 2 dager etter injeksjon til regenererende Skjelettmuskel. Injeksjon ble utført på dag 3 etter cardiotoxin mediert skade. n = 3, feil stolper viser SEM. (B) kvantifisering underliggende grafen avbildet i (A). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Her presenterer vi en metode for å undersøke funksjonen til et bestemt gen under regenerering av skjelettmuskulatur uten behov for transgene dyr. Dette oppnås ved en kombinasjon av cardiotoxin indusert muskel skade med injeksjon av en selv-levere siRNA i regenererende skjelettmuskelen på dag 3 etter skade. Vi har beskrevet i detalj prosedyrene for muskel skade ved cardiotoxin, injeksjon av selv levere siRNA og behandling av høstes musklene å analysere fremdriften av regenerering. Vi viser at injeksjon av slangegift cardiotoxin i skjelettlidelser muskel effektivt skader hele muskelen og at selv-levere siRNAs er funnet i rundt 75% av alle satellitt celler blant andre celletyper to dager etter deres injeksjon i (Figur 4, figur 5).
Spesiell oppmerksomhet bør være fokusert på en homogen skade av tibialispuls fremre muskelen siden varierende grad av skade påvirke regenerering utfallet og dermed også effekten av siRNA kan bli påvirket. Videre er det kritisk viktig at hele regenererer området injiseres med selv levere siRNA. For analyse av regenerering prosessen, det anbefales å alltid sammenligne lignende områder av regenererende Skjelettmuskel, derfor tibialispuls fremre muskelen bør kuttes i to for å alltid sammenligne midten av magen regionen av muskelen. Når analysere muskelen, hele cryosection må analyseres siden myofiber sammensetning varierer i tibialispuls fremre muskelen og kan derfor regenerere annerledes.
Funksjonen til satellitt celler kan undersøkes av ulike eksperimentelle prosedyrer inkludert deres kultur på tilstøtende isolert enkelt myofibers17, ved transplantasjon og ved å analysere regenerering av skjelettlidelser muskel etter indusert skade 18,19. Gransker funksjonen til satellitt celler ved hjelp av en in vivo indusert skademodell, for eksempel injeksjon av cardiotoxin, gir muligheten til å analysere satellitt celle funksjon også i form av deres interaksjon med andre celletyper som makrofager og undersøkelse av påvirkning av systemiske faktorer2. Skade på skjelettmuskulatur kan oppnås ved ulike virkemidler, for eksempel, eksentrisk trening, fryse skade, injeksjon av BaCl2 eller injeksjon av slange gifter som cardiotoxin eller notexin18. Mens eksentriske øvelsen er trolig den mest fysiologiske skade metoden, skaden til en bestemt muskel er bare begrenset20. Frys skader kan brukes når migrasjon av satellitt celler mot stedet for skade er målet for studien eller bare en bestemt del av muskelen bør bli skadet. Eksperimentelt ulempen av fryse skadene er det åpen kirurgi hvilke nødvendig å bli utført å søke det forkjøles metallisk sonde. Injeksjon av BaCl2 eller Snake gifter er den mest dramatiske metoden for skade, og dermed utfordrende satellitt celle fungere mest. Videre injeksjon er minimalt invasiv, kirurgi tid, generelt, er mindre enn fem minutter og innebærer ikke suturing, etc. dermed minimere risikoen for infeksjoner.
Muskel skade er mest brukt til å undersøke de funksjonelle konsekvensene av tap av gen funksjoner, for eksempel tap av Pax77,21. Spesielt hvis alderen mus er fokus for det vitenskapelige spørsmålet, er generering eller bruk av transgene mus ofte ikke gjennomførbart. Injeksjon av selv-levere siRNAs målretting et bestemt gen er et levedyktig alternativ i de tilfellene og har blitt brukt med hell22. Kort sagt, den tibialispuls fremre muskelen av mus ble skadet ved injeksjon av cardiotoxin og selv-levere siRNAs rettet mot fibronektin (FN) ble injisert på dag 3 etter skade. Musklene ble analysert 10 dager etter skade og en betydelig reduksjon i satellitt celle tall ble observert i siFN versus forvrengt siRNA kontroll forhold. Knockdown effektivitet ble bestemt i hele muskel lysater av kvantitativ Real Time PCR 2 dager etter siRNA injeksjon, en reduksjon i uttrykket nivåer på 58% ble oppnådd antyder at levering og knockdown effektivitet er tilstrekkelig for funksjonell analyser22. Alternativer for testing av knockdown effektivitet er enten immunoblot eller immunofluorescence analyser med antistoffer rettet mot mål genet. Effektiviteten og spesifisitet av siRNA brukes til in vivo injeksjoner bør bestemmes før injeksjon til mus, for eksempel ved å teste effektiviteten i isolerte satellitt celler eller primære myoblasts. Bruken av et smart basseng bestående av 4 forskjellige siRNAs kontra en enkelt siRNA øker effektiviteten til knockdown, men øker også risikoen for løs målretting. Spesifisitet av alle siRNA sekvenser som brukes bør testes i cellekultur for å unngå off-Target effekter. Som en kontroll, en ikke-målretting forvrengt siRNA bør brukes siden injeksjon av en siRNA per se kan påvirke regenerering prosessen på grunn av injeksjon og dermed ytterligere skade av muskelen. Tids punktet for injisering av siRNA er avhengig av det vitenskapelige spørsmålet og på uttrykket profilen til målet genet. Vanligvis, en injeksjon av selv-levere siRNA på dag 3 etter cardiotoxin skade mål de fleste gener viktig for satellitt celle spredning siden satellitt celle spredning topper rundt dag 3 etter skade. Tidspunktet for den første siRNA injeksjon bør ikke være mindre enn 48 h etter cardiotoxin Kader siden injeksjonsvolumet av cardiotoxin er ganske høy og reabsorpsjon av væsken burde ha funnet sted før injisere ytterligere løsninger inn i muskelen. Generelt, flere injeksjoner av siRNAs eller en kombinasjon av ulike siRNAs er mulig selv om man må vurdere at hver injeksjon i regenererende muskelen forårsaker ytterligere skade.
En begrensning av den beskrevne metoden er det faktum, at effekten observert er ikke nødvendigvis bare avhengig av knockdown av målet genet i satellitt celler, men kan tilskrives andre celletyper som immunceller eller fibro-adipogenic stamceller. Derfor er det nødvendig å kombinere disse eksperimentene med eksperimenter etterforsker en ren befolkning av satellitt celler. Man kan enten utføre eksperimenter ved hjelp av flytende myofiber kulturer, hvor satellitt celler er kultivert på deres tilstøtende myofibers eller utføre transplantasjon eksperimenter med isolerte satellitt celler17.
Et alternativ til injeksjon av selv-levere siRNAs er injeksjon av små molekyl hemmere eller rekombinant proteiner som kan utføres, avhengig av det vitenskapelige spørsmålet. For eksempel er injeksjon av ekstracellulære Matrix protein fibronektin eller små molekyl hemmere av jak/stat signalering utført med suksess i alderen mus15,16. Analysen av en bestemt gen funksjon i en bestemt celle type under regenerering av skjelettmuskulatur, for eksempel i satellitt celler, er bare mulig gjennom bruk av en induserbart genetisk musemodell. Injeksjoner av selv-levere siRNAs, rekombinant proteiner eller små molekyl hemmere kan påvirke flere celletyper i regenererende Skjelettmuskel.
Disclosures
Vi vil gjerne takke Christina Picker og Christine poser for utmerket teknisk assistanse og Saskia steiner for hjelp med fastsettelse av siRNA transfeksjoner effektivitet. Vi takker kjernen service histologi for god teknisk støtte, spesielt Sabine Landmann og Linda Rothenburger. Vi takker også dyret anlegget musen på FLI for utmerket støtte. Dette arbeidet ble støttet av stipend fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (MA-3975/2-1) og Deutsche Krebshilfe (DKH-JvM-861005) til J.v.M.
Acknowledgments
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Henry Schein | Isothesia | inhalation narcotics |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Anesthesia System (Tec 7) with inhalation box + nose masks | Tem Sega | Minihub | |
| Shaver for rodents | isis | GT420 | |
| Cardiotoxin | Latoxan | L8102 | snake venom needed for muscle injury |
| Accell siRNA smart pool | Dharmacon | depending on your target gene | self delivering siRNA |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-21206 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher | A-21123 | secondary antibody |
| Coverslips | VWR | 631-1574 | |
| CV Mount | Leica | 14046430011 | mounting medium for immunohistochemistry |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | nuclear staining |
| devMHC antibody | DHSB | F.1652 | |
| Eosin Y | Thermo Fisher | 73104 | |
| Haematoxylin Gill No3 | Sigma-Aldrich | GHS316-500ML | |
| Insulin syringe (29 g) | Terumo | 3SS05M2813 | syringue used for muscle injections |
| Laminin antibody | Sigma Aldrich | L9393 | |
| M.O.M blocking reagent | Vector labs | MKB-2213 | blocking for immunofluorescent staining |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | Metacam | analgesics |
| OCT | Thermo Fisher | 6502 | tissue embedding |
| Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | satellite cell specific antibody |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher | P36934 | aequos mounting medium |
| Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | tissue embedding |
| Superfrost plus | Thermo Scientific | J1830AMNZ | microscope slides |
| TritonX-100 | Amresco | 0694-1L | permeabilization reagent |
| Dissection tools | |||
| Dumont 5, straight | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Dumont 7, curved | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Extra fine Bonn scissors (cutting edge: 13 mm) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-16 | |
| Spring scissors (cutting edge: 5 mm, tip diameter: 0.35 mm) | Fine Science Tools | 91500-09 |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Schmidt, M., Schuler, S. C., Huttner, S. S., von Eyss, B., von Maltzahn, J. Adult stem cells at work: regenerating skeletal muscle. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytolology. 9, 493-495 (1961).
- Shea, K. L., et al. Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration. Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).
- von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. Satellite cells and the muscle stem cell niche. Physiological Reviews. 93 (1), 23-67 (2013).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Building muscle: molecular regulation of myogenesis. Cold Spring Harb Perspectives in Biology. 4 (2), (2012).
- Schworer, S., et al. Epigenetic stress responses induce muscle stem-cell ageing by Hoxa9 developmental signals. Nature. 540 (7633), 428-432 (2016).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- von Maltzahn, J., Renaud, J. M., Parise, G., Rudnicki, M. A. Wnt7a treatment ameliorates muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 109 (50), 20614-20619 (2012).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nature Medicine. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Lukjanenko, L., et al. Loss of fibronectin from the aged stem cell niche affects the regenerative capacity of skeletal muscle in mice. Nature Medicine. 22 (8), 897-905 (2016).
- Huttner, S. S., et al. Isolation and Culture of Individual Myofibers and Their Adjacent Muscle Stem Cells from Aged and Adult Skeletal Muscle. Methods in Molecular Biology. , (2019).
- Hardy, D., et al. Comparative Study of Injury Models for Studying Muscle Regeneration in Mice. PLoS One. 11 (1), e0147198 (2016).
- Hall, M. N., et al. Transplantation of Skeletal Muscle Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1556, 237-244 (2017).
- Dueweke, J. J., Awan, T. M., Mendias, C. L. Regeneration of Skeletal Muscle After Eccentric Injury. Journal of Sport Rehabilitation. 26 (2), 171-179 (2017).
- Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements. Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).
- Bentzinger, C. F., et al. Fibronectin regulates Wnt7a signaling and satellite cell expansion. Cell Stem Cell. 12 (1), 75-87 (2013).
