Summary
암세포, 특히 4T1 마우스 유방 암종 세포에 대한 대식세포 식세포 활성은 본 연구에서 영상화되었다. 살아있는 세포 동배 모델은 형광및 차동 간섭 대조 현미경의 조합을 사용하여 확립되고 관찰되었다. 이 평가는 이미징 소프트웨어를 사용하여 멀티포인트 타임랩스 비디오를 개발하는 데 사용되었습니다.
Abstract
종양 관련 대식세포 (TAM)는 종양 성장, 침략, 전이 및 암 치료에 대한 저항성을 위한 중요한 구성 요소로 확인되었습니다. 그러나, 종양 관련 대식세포는 종양 미세 환경에 따라 종양에 유해할 수 있고 면역 세포의 세포 독성 활성을 길항하거나 항종양 반응을 강화함으로써 그들의 자형질 특성을 가역적으로 변경할 수 있다. 대식세포의 분자 작용과 종양 세포와의 상호 작용 (예를 들어, 식균증)은 광범위하게 연구되지 않았습니다. 따라서, 종양 미세 환경에서 면역 세포 (M1/M2 아류형 TAM)와 암 세포 사이의 상호 작용은 이제 암 면역 요법 연구의 초점이된다. 본 연구에서, 유도된 M1 대식세포 및 마우스 유방 4T1 암종 세포의 살아있는 세포 동배 모델은 상 대비, 형광, 및 차동 간섭 대조(DIC) 현미경을 사용하여 시간 경과 비디오 기능을 사용하여 대식세포의 식세포 활성을 평가하기 위해 개발되었다. 본 방법은 식세포증의 멀티포인트 라이브 셀 이미징을 관찰하고 문서화할 수 있다. M1 대식세포에 의한 4T1 세포의 식세포증은 카르복시플루오레세인 슈치니미딜 에스테르(CFSE)로 4T1 세포를 염색하기 전에 형광 현미경을 사용하여 관찰할 수 있다. 현재 간행물은 단일 이미징 접시에 대식세포 및 종양 세포를 동배하는 방법, M1 대식세포를 편광하고, 13시간 동안 4T1 세포를 포위하는 대식세포의 다점 사건을 기록하는 방법을 설명합니다.
Introduction
대식세포는 면역 방어의 첫번째 선이고 암세포를 포함하여 병원체 및 이물질에 대하여 면역 반응을 조율하는 역할을 합니다. 그들은 파괴하고 몸에 원치 않는 입자를 제거하는 전문 식세포입니다. 대식세포는 세포사멸세포및미생물의클리어비큐비와 다른면역세포의 모집과 같은 방어적 기능을 기여한다1. 대식세포는 환경 신호2에대한 응답으로 M1 및 M2 대식세포두 가지 유형으로 구분할 수 있다. M1 편광 대식세포(즉, 고전적으로 활성화된 대식세포)는 사이토카인 인터페론-γ(IFN-γ) 및 리포폴리사카라이드(LPS)에 의해 활성화되며 염증 반응, 병원균 클리어런스, 효율적인 식세포증 및 종양성면역에관여한다3,4. M2 대식세포는 종양 관련 대식세포(TAM)와 밀접한 관련이 있으며 항염증 및 종양 촉진 특성을 갖는다4.
고대 그리스어 (파게인)에서 파생 된 식균증은 "삼키기"(kytos)를 의미하며 ,"세포"를의미하고 -osis를 의미하며 "과정"5 . 식세포증은 식세포(대식세포, 단핵구 및 호중구 포함)가 침입하는 병원균을 죽이고 삼키고, 이물질을 제거하고, 세포 사멸 세포 파편을 지우는 수용체 매개 과정입니다. 종양 관련 대식세포(TAM)는 유방암을 포함한 다른 종양의 기질에서 발견되며, 친종양 기능이6,7,식세포증에 대한 내성을 초래한다. 대식세포에 의한 종양 세포 식세포증의 상세한 기전은 아직 이해되지 않았다.
본 연구는 2단계 방법을 제시한다: 1) 4) 4T1 마우스 유방 암종 세포 및 M1 편광 대식세포는 공동 배양되고, 2) 대식세포의 식세포 활성은 살아있는 세포 비디오 현미경을 사용하여 평가된다. CFSE 형광 염료는 4T1 마우스 유방 암종 세포를 염색하기 위해 사용되었다. 얼룩은 4T1 세포를 단일 이미징 접시 내의 배양 된 M1 대식세포와 구별합니다. RAW 264.7 대식세포는 LPS 및 IFN-γ로 M1 표현형으로 편광된다. 완전한 분극을 보장하기 위해, FITC에 공액된 항 iNOS 항체로 면역 염색을 수행하였습니다. 그 후, 시간 경과 이미지의 멀티 포인트 시리즈는 공동 배양 내에서 식세포증을 포함한 여러 이벤트를 관찰하기 위해 인수되었다.
종양 세포와 대식세포 사이 상호 작용의 더 나은 이해는 잠재적인 암 면역 요법으로 이끌어 낼 수 있습니다. 살아있는 세포 화상 진찰은 실시간 조정에 있는 세포 역학의 상세한 보기를 제안하고 신경과학, 발달 생물학 및 약 발견에 있는 세포 이동, phenotypic 검열, apoptosis 및 세포 독성8,9를 공부하는 것을 이용되었습니다. 본 연구에서 제안된 종양은 유방암이지만, 이 방법은 또한 다중 표적 세포 및 뚜렷한 이펙터 세포에 적용될 수 있다.
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Protocol
참고: 섹션 1-6은 4T1 마우스 유방 암종 세포 및 RAW 264.7 마우스 대식세포의 동문화 모델을 기술한다. 섹션 7은 M1 대식세포 식세포 식세포 4T1 세포의 시간 경과 평가를 기술한다.
1. 배양 4T1 마우스 유방 암종 세포 및 RAW 264.7 마우스 대식 세포
- 극저온 보존 된 4T1 및 RAW 264.7 항도 6 세포의 바이알을 37°C에서 수조에서 부드럽게 교반하거나 세포주의 정상 성장 온도에 의해 해동한다.
참고: 해동은 약 2분 이내에 신속하게 수행해야 합니다. 오염을 방지하려면 수조에서 바이알을 제거하고 70 % 에탄올로 살포하여 오염을 제거하십시오. 유전 적 드리프트를 피하기 위해, 특히 대식세포에 대 식, 낮은 통로 수를 사용 하 여 (즉, 20 미만). - 15 mL 원엽 튜브에서 완전한 DMEM 배지의 10 mL에서 해동 된 세포를 희석하고 세포 펠릿을 얻기 위해 5 분 동안 600 x g에서 세포를 원심 분리합니다.
참고: 10% (v/v) 태아 소 혈청(FBS), 200 U/mL 페니실린/스트렙토마이신, 2 mML-글루타민을 보충한 완전한 DMEM 배지가 프로토콜 전체에 사용됩니다. - 조심스럽게 배지를 흡인하고, 완전한 배지의 8 mL에서 세포를 재중단하고 25cm2 조직 배양플라스크로 전달한다. 37°C에서 완전한 DMEM 배지에서 4T1 및 RAW 264.7 세포를 5%CO2로배양한다.
참고 : 세포 펠릿을 부드럽게 다시 중단하고 세포를 죽이지 않도록 배양 플라스크 드롭에 세포 현탁액을 추가하십시오. - 세포 준수를 허용하기 위해 1주일 간 배양한 후, 매일 플라스크를 모니터링하고 필요에 따라 완전한 DMEM 배지 8mL를 추가하십시오.
2. M1 편광 RAW 264.7 대식세포의 면역 염색
- RAW 264.7 셀의 결합이 70-80%에 도달하면 배양 배지를 폐기하고 적어도 2 mL의 PBS로 2x를 부드럽게 헹구십시오.
참고: RAW 264.7 셀을 시딩하기 전에 세포 분화가 발생하지 않았는지 확인합니다(즉, 수상반식 표현형 및/또는 증가된 세포 크기). 세포 형태 변화가 보이는 경우에, 문화를 버리고 이전 통로 유리병에서 새로운 세포주해. - 셀 스크레이퍼를 사용하여 부착 세포를 부드럽게 분리하여 수집을 위해 대식세포를 준비하고 15 mL 원추형 튜브로 옮김을 전달합니다.
- 혈세포계를 사용하여 세포를 세고 완전한 DMEM 배지를 사용하여 1 x 105 세포 /접시의 세포 현탁액을 준비하십시오.
- 대식세포 현탁액의 종자 2 mL을 두 개의 이미징 접시로 한다. 세포 준수를 허용하기 위해 37 °C에서 2−3 h를 5%CO2로 배양합니다.
- 완전한 DMEM 배지10,11에100 ng/mL LPS 및 20 ng/mL IFN-γ를 추가하여 M1 편광 매체를 준비한다.
- 대식세포에서 배양된 배양을 버리고 적어도 1 mL의 PBS로 접시에 단층을 2x 조심스럽게 씻는다.
- 이미징 접시 중 하나에 M1 편광 매체 2 mL을 추가하고, RAW 264.7 세포가 M1 대식세포 표현형을 유도하도록 허용하고, 5%CO2로37°C에서 2-3h배양한다.
참고: DMEM을 함유한 이미징 접시에 종자 RAW 264.7 대식세포는 항 iNOS 항체 염색을 위한 대조군으로서 10% FBS로 보충되었습니다. 이미징 접시 RAW(제어) 및 M1 대식세포(LPS 및 IFN-γ 편광)를 각각 라벨을 붙입니다. - 면역 염색 전에 RAW 264.7 및 M1 대식세포 세포를 4% 파라포름알데히드 의 2 mL를 사용하여 고치고 37°C(실온, RT)에서 15분 동안 배양합니다.
- 상층을 제거하고 적어도 3x PBS의 1 mL로 세포 단층을 세척한다.
- PBS에서 50 mM의 염화암모늄 2 mL로 담금질하고 RT에서 15 분 동안 배양하십시오.
- RT에서 15 분 동안 PBS에서 0.3 % 트리톤 X-100의 2 mL를 사용하여 퍼메아빌화하십시오.
- 상층을 제거하고 적어도 3x PBS의 1 mL로 세포 단층을 세척한다.
- RT에서 30 분 동안 PBS에서 10 % FBS의 2 mL를 사용하여 차단하십시오.
참고: 면역 염색의 차단 단계는 세포 내 항체의 비특이적 결합을 최소화하는 것입니다. - 상층을 제거하고 적어도 3x PBS의 1 mL로 세포 단층을 세척한다.
- PBS에서 2 mL의 항 iNOS-FITC와 4 °C에서 밤새 1% FBS로 배양합니다.
참고 : 제조업체의 권장 사항에 따라 적절한 항체 희석을 사용하여 세포에 라벨을 붙입니다. 이 시점부터 알루미늄 호일로 덮어서 빛을 로부터 접시를 보호하십시오. - 상층을 제거하고 적어도 3x PBS의 1 mL로 세포 단층을 세척한다.
- 300 nM 6-diamidino-2-페니린돌 (DAPI)의 1 mL을 알루미늄 호일로 덮음으로써 어둠 속에서 37 °C에서 10 분 동안 이미징 접시에 배양합니다.
- 적어도 3x PBS의 1 mL로 세포를 세척하고 이미징 접시에 완전한 DMEM 배지 1 mL을 추가합니다.
참고: 세포는 지금 형광 화상 진찰을 위해 준비됩니다. 현미경 설정은 선택한 얼룩에 대한 반전 된 단계와 여기 필터가 필요합니다 (이 경우 FITC 및 DAPI). - 현미경을 켜고 이미징 소프트웨어를 로드합니다. 현미경에 이미징 접시를 장착하고 RAW 264.7 및 M1 대식세포관찰을 위해 초점을 조정합니다. 전송된 빛과 노출 시간을 조정하여 위상 대비 FITC 및 DAPI 이미지의 모양을 최적화합니다.
참고: 모든 점이 초점이 맞고 채널이 최적화된 경우 이미징을 시작합니다. - 위상 대비 FITC 및 DAPI 이미지를 캡처합니다(그림1).
3. 시딩 4T1 마우스 유방 암종 세포
- 4T1 세포의 결합이 70-80%에 도달하면 배양 배지를 폐기하고 적어도 2 mL의 PBS로 2x를 부드럽게 헹구십시오. 세포를 해리하고 37 °C에서 최대 20 분 동안 배양하기 위해 미리 따뜻해진 트립신 1 mL을 추가하십시오.
참고 : 현미경으로 세포를 관찰하십시오. 분리된 셀은 반올림됩니다. - 일단 세포가 분리되면, 15 mL 원추형 튜브로 옮기고 미리 온화한 완전한 DMEM 배지 2 mL를 추가하여 트립신을 비활성화시다. 세포를 회수하기 위해 세포층 표면을 파이펫팅하여 배지를 부드럽게 분산시다. 이어서, 600 x g에서 5분 동안 원심분리기를 사용하여 세포 펠릿을 얻었다.
- 상급체를 제거하고 미리 온화한 완전한 DMEM 배지의 10 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다.
- 전체 DMEM 배지의 2 mL에서 혈세포계 및 종자 1 x 105 4T1 세포를 사용하여 세포 배양으로 처리된 2개의 35 mm 유리 바닥 이미징 접시각각에 셀을 카운트한다. 5%CO2로 37°C에서 밤새 세포를 배양합니다.
참고: 배양 4T1 세포는 M1 편광 배지및 라벨 4T1-유도제(control)를 가진 이미징 접시 중 하나에 있다. 이는 유도제에 노출되었을 때 4T1 세포의 정상적인 성장을 보장하기 위한다.
4. CFSE 염색을 사용하여 살아있는 4T1 마우스 유방 암종 세포에 라벨링
- 먼저, 4T1 세포 이미징 접시에서 기존 매체를 제거한다. 1 mL의 PBS로 세포 단층을 적어도 2x 세척합니다.
- PBS 1 mL에서 CFSE를 희석하여 CFSE 염색 용액 5 μM을 준비합니다. 각 이미징 접시에 5 μM CFSE 염색 용액 1 mL을 넣고 RT 또는 37 °C에서 20 분 동안 세포를 배양하십시오.
참고 : 최적의 CFSE 염색 농도를 얻기 위해 제조업체의 권장 사항 및 예비 실험에 따라 적절한 CFSE 작업 농도를 사용하여 세포에 라벨을 지정합니다. CFSE가 PBS에서 희석되면 라벨링 효율이 높아집니다. - 10% FBS및 염색 용액을 함유하는 완전한 DMEM 배지의 동일한 부피를 첨가하여 염색을 담금질하고 어둠 속에서 RT에서 5분 동안 배양한다.
- CFSE 함유 용액을 폐기하고 동일한 양의 배양 배지로 세포를 1x 세척합니다.
참고: 4T1 세포는 이제 형광으로 표지됩니다. - 4T1-CFSE 세포를 5% CO2로 RT에서 표준 배양 조건으로 되돌려보입니다.
5. 4T1로 RAW 264.7 마우스 대식세포 및 배양 시딩
- RAW 264.7의 결합이 70-80%에 도달하면 배양 배지를 폐기하고 2mL 이상의 PBS로 2x를 부드럽게 헹구십시오.
- 셀 스크레이퍼를 사용하여 부착 세포를 부드럽게 분리하여 수집을 위해 대식세포를 준비하고 15 mL 원추형 튜브로 옮김을 전달합니다.
- 혈세포계를 사용하여 세포를 카운트하고 시딩 밀도에 따라 완전한 DMEM 배지로 나머지 용액을 희석시킴으로써 1 x 105 세포/mL의 세포 현탁액을 준비한다.
참고: 공동 배양에 있는 지나치게 결합한 세포는 가혹하게 식세포증을 감소시킬 수 있습니다. 본 연구에서, 대식세포의 파종 비율: 암세포는 1:1 비율로 조정되었다. 비율은 종양 세포의 공격성과 대식세포의 기원에 따라 조절될 수 있다. - coculturing 전에, 하루 전에 시드된 4T1 세포로부터 배양 상류층을 버리고(단계 4.5) 적어도 1 mL의 PBS로 단층 2x를 조심스럽게 세척하였다.
- 시드 1 x 105 RAW 264.7 세포를 완전한 DMEM 배지의 2 mL당 4T1 이미징 접시 중 하나로 넣습니다. 세포 준수를 허용하기 위해 37 °C에서 2−3 h를 5%CO2로 배양합니다. 이미징 접시 4T1-M1 공동 문화에 라벨을 붙입니다.
참고: 4T1(대조군) 세포는 대식세포와 배양되지 않았다.
6. RAW 264.7 대식세포의 M1 분광
- 100 ng/mL LPS 및 20 ng/mL IFN-γ를 10% (v/v) FBS10,11로보충된 완전한 DMEM 배지에 첨가하여 M1 편광 매체를 준비한다.
- 배양 전(단계 5.5)에서 배양된 배양을 버리고(단계 5.5) 적어도 1 mL의 PBS로 접시에 단층을 2x 조심스럽게 세척한다.
- 이어서, 이미징 접시에 M1 편광 매체 2 mL를 추가하고 RAW 264.7 세포가 5%CO2로37°C에서 배양하여 M1 대식세포 표현형을 유도하도록 한다.
참고: M1 대식세포는 완전한 분극을 달성하기 위해 2−3시간의 배양을 차지할 수 있다. 대식세포의 완전한 분광을 허용하기 위해 적절한 잠복기를 보장하기 위해 예비 실험을 수행해야 합니다.
7. 식균증의 라이브 세포 비디오 현미경 검사법
참고: 라이브 셀 이미징을 수행할 때 이미지 노출 최적화, 시간 측정 및 자동 초점 보정을 비롯한 다양한 요소를 고려해야 합니다.
- 실험 전에, 37°C에서 온도 조절기를 켜고 5%CO2를공급하여 세포 배양 인큐베이터를 설정한다.
참고 : 현미경 설정은 반전 단계, 무대 상단 인큐베이터, 습도 제어 (95 %), 가스 인큐베이션 시스템을 필요로한다. 이 설치는 장기 살아있는 세포 비디오 현미경 평가를 위한 세포를 유지하기 위하여 중요합니다. - 압전 단계를 포함하여 현미경을 켜고 현미경 화상 진찰 소프트웨어를 로드하십시오.
- 시드 공동 배양 세포를 35mm 유리 바닥 이미징 접시에 배치하고 상단 챔버에 부드럽게 나사를 조입니다. 조이스틱을 사용하여 이미지할 위치를 선택하여 스테이지를 동력화합니다.
- 샘플을 보려면 포탑에서 위상 대비 필터를 선택합니다. 샘플을 처음 본 후 적절한 필드를 찾아 샘플을 포커스로 가져옵니다.
참고: 이미징 소프트웨어를 사용하면 완전히 자동화된 목표 선택, 완벽한 포커스 시스템, 타임랩스 시리즈, 멀티채널 이미지 수집 및 멀티포인트 이미지 수집을 사용할 수 있습니다. - CFSE 라벨링 및 차동 간섭 대비 수집을 위한 다중 채널 형광을 설정하려면 이미징 소프트웨어 수집 대화 상자를 열고 [Lambda] 탭 확인란을 선택합니다(그림2).
참고: 13시간 경과 이미징의 경우 위상 대비 채널을 사용해야 합니다. - [람다] 탭 선택 | [광학 구성] 및 녹색 형광 필터 확인란에 대한 차동 간섭 대비 [10X DIC]와 [GFP-R]을 선택합니다. [람다] 아래 | [포커스] 열을 선택하여 [10X DIC] 확인란을 선택하여 포커스 참조로 설정합니다.
- 이미징 소프트웨어 수집 대화 상자를 열고 [XYZ Time ...] 버튼을 클릭하고 [XY] 탭을 선택합니다.
- 라이브 이미지를 확인하면서 전동 스테이지의 조이스틱을 사용하여 이미지 수집 지점으로 이동하거나 아이피스를 통해 다른 위치를 선택합니다. 그런 다음 [점 이름] 열 아래의 확인란을 클릭하여 이미지 캡처를 위해 각 위치의 각 지점을 설정합니다(그림 3참조).
참고: 자동화된 스테이지를 사용하면 서로 다른 XY 좌표를 다중 포인트 이미지로 수집하여 여러 필드를 캡처할 수 있습니다. - 화면에서 본 각 샘플의 초점을 미세 조정합니다. 자동 초점 보정에대한 컨트롤을 사용합니다.
- 이 소프트웨어를 사용하여 타임랩스 이미지 캡처를 설정합니다. 이미징 소프트웨어 수집 대화 상자에서 [시간] 탭을 선택합니다(그림 4참조).
- [간격](한 시점의 시작부터 다른 시점까지의 지연) 및 [지속 시간](실험의 총 시간 길이)을 결정합니다. 시간 단위는 다양하며 드롭다운 메뉴에서 밀리초(ms), 초(들), 분(m) 또는 시간(h)으로 선택할 수 있습니다.
참고: 형광 및 DIC 시간 경과 다중 채널 취득의 시간 경과 화상 진찰 길이는 이 분석에 사용된 형광 염료에 따라서 다를 수 있습니다. 표지된 세포가 너무 오래 노출되면 광표백이 발생할 수 있습니다. - [파일에 저장] 확인란을 선택하여 수집된 이미지를 저장합니다. [시간 일정] 탭에서 [지금 실행] 버튼을 클릭하여 다중 포인트 시계열 이미지를 획득합니다(그림 5참조).
참고 : 이미징 소프트웨어에서 이미지는 nd2 파일 형식으로 저장됩니다. 각 시간 경과는 나중에 MP4 파일 형식으로 개별적으로 저장할 수 있습니다.
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Representative Results
4T1 마우스 유방암종 세포주의 동문화 모델의 타임랩스 2차원(2D) 이미지는 13시간 동안 M1 대식세포에 의해 침몰되는 4T1 세포를 보여준다. 면역 염색을 수행함으로써 M1 대식세포의 완전한 분광을 보장하는 것이 중요하다. 결과(도 1)는100 ng/mL 리포폴리당(LPS) 및 20 ng/mL IFN-γ의 농도가 M1 상태로 의 한RAW 264.7 대식세포로 편광되었다는 것을 보여준다. 표적 세포를 형광 염료로 표지하고 이펙터 세포를 얼룩지게 하지 않은 상태로 두면 살아있는 세포 동배모델(Movie 1)을허용한다. 13시간 및 15분 간격을 통하여, 4T1 세포와의 동문화에서 M1 대식세포의 식세포 활성을 문서화하였다(Movie2). 6개의 멀티포인트비디오(A−F in Movie 2)는단일 35mm 유리 바닥 이미징 접시 내에서 여러 이벤트를 평가하기 위해 기록되었습니다. 동영상 3은 M1 대식세포에 의해 식세포가 식구화된 4T1 세포를 나타낸다. 무비 4는 본 실험에서 촬영된 심층 비디오의 예로 선택되었으며, Movie 5는 M1 대식세포에 의한 4T1 세포의 섭취량을 나타낸다.
그림 1: 녹색의 안티 iNOS-FITC로 면역 형광 염색, 파란색의 핵 마커 DAPI 및 병합 된 이미지의 향상된 버전. 이 패널은 RAW 264.7 대식세포(제어) 및 M1 대식세포(LPS 및 IFN-γ 자극)를 녹색으로 항 iNOS-FITC(M1 마커)로 면역화하고 핵 마커, DAPI를 파란색으로 환상시 지정합니다. (A)DAPI 얼룩은 RAW 264.7 및 M1 대식세포 둘 다 관찰할 수 있다. (B)안티 iNOS-FITC (녹색) M1 대식 세포에 만 형광. (C)DAPI 얼룩 및 안티 iNOS-FITC의 병합 된 이미지. 배율 표시줄 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 이미징 소프트웨어 수집 대화 상자 제어에서 형광 및 DIC 이미지 수집 설정 [1] [람다] 탭 확인란을 선택하고[ 2] [광학 구성]을 선택하고 녹색 형광 필터 확인란에 대해 [10X DIC] 및 [GFP-R]을 선택하고[3] [10X DIC]를 선택합니다 | [이 채널을 포커스 참조로 설정]. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 이미징 소프트웨어 수집 대화 상자 제어에서 다중 포인트 이미지 수집 설정 [4] [XY] 탭을 선택하고 다음 [5]는 [점 이름] 열 아래의 확인란을 선택하여 이미지 캡처의 각 점을 설정합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 시간 경과 측정 이미지 캡처를 위한 간격 및 지속 시간 설정. 이미징 소프트웨어 수집 대화 상자 제어를 통해 타임랩스 이미지 캡처를 설정합니다. [시간] 탭에서 시간 경과 이미지 수집[6]을 확인하려면 [7]이 [간격] (초, 최소 또는 시간별) 및 [8] [지속 시간](초, 최소 또는 시간별)을 결정합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 타임랩스 측정 이미지 캡처를 위해 멀티포인트 동영상 패널을 설정합니다. 13시간의 공동 컬쳐를 완료한 후 결합된 6개의 멀티포인트 영화 패널의 미리보기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
영화 1: 얼룩이 없는 M1 대식세포 및 4T1 CFSE 염색 마우스 유방 암종 세포의 대표적인 영화는 형광 및 DIC 현미경 검사법의 다채널 획득을 사용하여 포획되었습니다. 4T1 마우스 유방 암종 세포의 녹색 표지된 세포벽에서 CFSE를 얼룩없는 M1 대식세포와 공동 배양한 결과. 시간 경과 이미지는 멀티채널 수집을 사용하여 15분 간격으로 13시간 의 동문화 기간 동안 획득하였다(단계 7.3, 도 2참조). (a)차동 간섭 대비( 빨간색 원)는 상피 형태를 가지는 4T1 세포에 접한 작고 둥근 M1 대식세포를 나타낸다. (B)대식세포에 의한 식균증 전에 CFSE로 염색한 4T1 세포의 형광 현미경 이미지. (C)CFSE 염색 된 4T1 세포의 DIC 및 형광 현미경 이미지가 얼룩지지 않은 M1 대식세포에 의해 침몰됩니다. 파란색 화살표는 CFSE 표지된 4T1 세포를 삼키면서 녹색으로 변하는 얼룩이 없는 M1 대식세포를 보여줍니다. 배율 표시줄 = 50 μm. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
영화 2: 유도된 M1 대식세포에 의한 4T1 마우스 유방 암종 세포의 식균증을 나타내는 단일 이미징 접시에서 여러 단계 지점에서 의 라이브 세포 비디오 현미경 법. 결과는 이미징 소프트웨어를 사용하여 설정하고 조정한 6개의 상이한점(Movie 2A−F)을나타낸다(단계 7.4, 도 3참조-도 5). M1 대식세포는 다공성 세포질이 있는 불규칙한 팬케이크 와 같은 형태를 가지지만, 4T1 마우스 유방 암종은 상피 형태를 가지고 있습니다. M1 대식세포 및 4T1 세포를 37°C에서 스테이지 인큐베이터 내부에 13시간 동안 배양하고 5%CO2를 사용하여 라이브 세포 비디오 현미경 검사법을 관찰하였다. 이미지는 13 시간 동안 15 분 시간 간격으로 캡처되었습니다. 규모 표시줄 = 50 μm. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
동영상 3: 단일 좌표점의 라이브 셀 비디오 현미경 법(Movie 2 참조)은 M1 대식세포 유도에 의한 4T1 마우스 유방 암종의 식균증을 상세히 나타내도록 선택되었다. 빨간색 화살표는 식세포증을 보여줍니다. 노란색 원은 4T1 세포의 침몰을 담금질한 4T1 세포의 수를 나타낸다. 배율 표시줄 = 10 μm. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
동영상 4: M1 대식세포에 의한 4T1 세포의 식균 과정을 더욱 시각화하는 상세한 비디오. 이 패널은 다공성 세포질 표현형을 가진 살아있는 M1 대식세포 세포를 보여줍니다. 배율 표시줄 = 10 μm. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
동영상 5: 세포 대 세포 접촉을 확립하기 위해 4T1 세포를 향해 이동하는 대식세포, M1 대식세포에 의한 4T1 세포의 섭취(Movie 2A 참조). 위상 대비 현미경 타임랩스 비디오는 37°C에서 37°C에서 5%CO2로스테이지 상부 인큐베이터 내부의 13시간 동안 15분 간격으로 이미지화되었다. 배율 표시줄 = 10 μm. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
기재된 프로토콜은 2단계를 필요로 한다: 1) 4T1 마우스 유방암종 세포 및 M1 편광 대식세포의 공동배양, 2) 타임랩스 현미경을 이용한 대식세포 식세포 활성의 평가. 살아있는 세포 동문화는 식세포증 및 이동 세포 세포에서 널리 사용된다. 여기서 살아있는 세포 동배 모델은 4T1 표적 세포를표지하는 데 사용되는 형광 염료, CFSE를 활용하는 간단하고 적응력이 있는 체외 시술(도 2)이다. 이것은 살아있는 세포 화상 진찰 도중 세포 모형의 적당한 추적을 위해 이용됩니다. 타임랩스 라이브 셀 이미징은 13시간 의 동문화 전에 다점 타임랩스 2D 이미징을 사용하여 M1 대식세포의 식세포 활성을 평가하는데 사용되었다.
살아있는 세포 동배 모델은 4T1 마우스 유방 암종 세포 및 M1 마우스 대식세포를 사용하여 확립되었다. 세포를 서로 구별하기 위해, 4T1 세포를 CFSE 형광 염료를 사용하여 염색하였다(섹션 4 참조). CFSE는 세포를 추적하고 세포 분열을 모니터링할 수 있습니다. CFSE는 세포로 수동적으로 확산되어 CFSE가 표적 세포의 식세포증을 시각화하는 적합한 세포 추적기를 염색할 수 있습니다. 식세포 대식세포가 암세포를 소화하고 삼키면서, 그들은 CFSE 염료를 복용하고 결국형광12,13이된다. M1 대식세포 전에 이미징 접시에 4T1 세포를 시드하는 것이 필수적입니다. 이것은 두 세포의 다른 크기와 모양 때문입니다. 4T1 세포는 작은 클러스터에서 증식하는 상피 형태를 갖는다. 또한, 4T1 세포는 얼룩이 없는 M1 대식세포와 배양하기 전에 CFSE로 염색되어야 합니다. LPS 및 IFN-γ를 이용한 대식세포 분광 전에, 뮤린 대식세포 RAW 264.7은 둥글고 작으며, 일반적으로 단일 세포로서 성장한다. LPS 및 IFN-γ 분광 후, 유도된 M1 대식세포는 다공성 세포질14,15를가진 비교적 평평하고 팬케이크같은 형상을 가진다. M1 상태로 RAW 264.7의 적절한 편광을 보장하기 위해, 100 ng/mL LPS 및 20 ng/mL IFN-γ 자극 대식세포는 M1 마커로 면역화되었고, 항-iNOS 항체는 FITC에 공액화하였다(도1). 이 프로토콜은 대식세포와 표적 세포를 규합하기 전에 수행되어 대식세포가 M1 상태로 완전히 편광되도록 한다.
본 연구는 살아있는 대식세포의 식세포 활성을 시각화하기 위해 형광 현미경 검사법을 설명하는 방법을 설명합니다. 광표백을 최소화하고 더 나은 형광 이미징을 제공하기 위해 형광 현미경 검사는 DIC와 유사한 형광크롬에 비파괴적인 다른 이미징 기술과 결합될 수 있습니다. 본 프로토콜은 형광 및 DIC 시간 경과 현미경을 사용하여 LPS 및 IFN-γ 자극 대식세포에 의한 마우스 유방 암종 세포의 식균 세포의 평가에 필요한 물질 및 방법을 설명한다. 그럼에도 불구하고, 형광 현미경 연구 결과는 상 대비 시간 경과 화상 진찰에 비교된 살아있는 세포 화상 진찰을 공부할 때 한계가 있습니다. 형광 라이브 세포 이미징 동안, 흥분 빛의 높은 금액에 장기간 노출 심각한 세포 손상을 유도할 수있습니다 16. 광표백은 살아있는 세포 화상 진찰에 있는 중요한 문제를 일으키는 원인이 될 수 있습니다. 살아있는 세포 화상 진찰에서 사용된 고강도 조명은 형광에 CFSE 염료의 기능을 감소시킬 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 13시간 식세포증 평가는 위상 대비 시간 경과 2D 이미징을 사용하여 본 연구의 두 번째 부분에서 달성되었다(영화2-5).
타임랩스 현미경 검사법은 원하는 기간 동안 언제든지 단일 실험에서 데이터를 생성하고 단일 이미징 접시 내의 여러 단계 지점을 단일 실험으로 캡처할 수 있는 이점을 제공합니다. 이를 통해 단일 실험에서 다양한 위치를 관찰할 수 있습니다. 프로토콜은 또한 배양 플레이트(예를 들어, 6, 24, 96 웰 플레이트)로부터 여러 웰을 사용하여 사용될 수 있다. 성공적인 라이브 셀 이미징 실험을 수행하기 위한 가장 중요한 기술적 과제 중 에는 37°C, 95%의 습도 및 5%CO2의안정적인 온도를 제공하기 위해 스테이지 탑 인큐베이터를 사용하여 건강한 상태로 세포를 유지하는 것이 포함됩니다. 실험은 13 h를 걸렸기 때문에 현미경 기능이 정상적으로 기능하도록 하는 것이 중요했습니다.
본 연구 동안, 이미징 접시의 6개의 상이한 포인트는 15분 간격으로 13시간 동안 점령되었다(Movie2). 조사 중인 셀의 이벤트에 따라 포인트를 조정할 수 있습니다. 이 실험 전반에 걸쳐 캡처할 여러 스테이지 포인트가 있다는 점을 고려할 때, 라이브 셀 비디오 녹화를 수행하기 전에 각 지점이 안정적인 초점을 맞추는지 확인하는 것이 중요합니다. 조사 시간 간격을 최적화해야 합니다. 시간 간격이 줄어든 경우 이미지화할 수 있는 더 자세한 점이 있습니다. 그러나 파일 크기는 매우 큽요. 시간 간격이 증가하면 비디오가 길어지고 동영상의 연속성이 손실됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 재정적으로 제란 푸트라 Berimpak에 의해 투자되었다 (GBP), 대학 푸트라 말레이시아: 9542800. 우리는 농업 생명 공학 연구소, 말레이시아 (ABI) 실험실 및 현미경 이미징 시설에 감사드립니다. 이 작품에 대한 실험 비디오를 편집하고 녹화하는 데 도움을 주어 Mohd Daniel Hazim에게 특별한 감사를 드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-INOS antibody conjugated FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µg in 1 mL |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/high glucose | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| Fetal bovine serum | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Mouse recombinant interferon-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µg |
| Penicillin-streptomycin solution | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Trypsin EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 tips/case |
| 2 mL serological pipette | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
| 200 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps/case |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning | CLS430639 | Tissue culture treated |
| Bench top centrifuge | Dynamica | FA15C | Model: Velocity 14R |
| Biological safety fume hood | Nuaire | NU-565-400 | Model: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Fume Hood |
| CO2/air mixer | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Air Mixer) with the flow meter |
| Cell scrapper | NEST | 710001 | 220 mm |
| CO2 cell incubator | Panasonic | N/A | Model: MCO-19M(UV) |
| Confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Glass bottom dish | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Available online download | |
| Pipette controller | CappAid | PA-100 | CappController pipette controller, 0.1-100ml |
| Thermostat | Shinko | Discontinued | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
References
- Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A. Macrophage polarization: Tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends in Immunology. , (2002).
- Lee, K. Y. M1 and M2 polarization of macrophages a mini-review. 2 (1), 1-5 (2019).
- Martinez-Marin, D., Jarvis, C., Nelius, T., Filleur, S. Assessment of phagocytic activity in live macrophages-tumor cells cocultures by Confocal and Nomarski Microscopy. Biology Methods and Protocols. 2 (1), 1-7 (2017).
- Tauber, A. I.
- Eiro, N., Gonzalez, L. O., Cid, S., Schneider, J., Vizoso, F. J. Breast Cancer Tumor Stroma: Cellular Components, Phenotypic Heterogeneity, Intercellular Communication, Prognostic ImplicationsTherapeutic Opportunities. Cancers. 11 (5), 1-26 (2019).
- Larionova, I., et al. Interaction of tumor-associated macrophages and cancer chemotherapy. OncoImmunology. 8 (7), 1-15 (2019).
- Jain, P., Worthylake, R. A., Alahari, S. K. Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (63), e3585 (2012).
- Weiss, S., Luchman, H. A., Restall, I., Bozek, D. A., Chesnelong, C. Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58152 (2018).
- Tsitsilashvili, E., Sepashvili, M., Chikviladze, M., Shanshiashvili, L., Mikeladze, D. Myelin basic protein charge isomers change macrophage polarization. Journal of Inflammation Research. 12, 25-33 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Kobelt, G., Eriksson, J., Phillips, G., Berg, J. The burden of multiple sclerosis 2015: Methods of data collection, assessment and analysis of costs, quality of life and symptoms. Multiple Sclerosis Journal. 2, 153-156 (2017).
- Escórcio-Correia, M., Hagemann, T. Measurement of tumor cytolysis by macrophages. Current Protocols in Immunology. , SUPPL.92 1-11 (2011).
- Cui, K., Ardell, C. L., Podolnikova, N. P., Yakubenko, V. P. Distinct migratory properties of M1, M2, and resident macrophages are regulated by αdβ2and αmβ2integrin-mediated adhesion. Frontiers in Immunology. 9, 1-14 (2018).
- McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).
- Penjweini, R., Loew, H. G., Hamblin, M. R., Kratky, K. W. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: A new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. Journal of Microscopy. 45 (1), 100-108 (2012).
