Summary
Bu çalışmada kanser hücrelerine karşı makrofaj fagositik aktivite, özellikle 4T1 fare meme karsinom hücreleri görüntülendi. Canlı hücre kokültür modeli floresan ve diferansiyel girişim kontrast mikroskobu kombinasyonu kullanılarak oluşturulmuş ve gözlenmiştir. Bu değerlendirme, çok noktalı hızlandırılmış video geliştirmek için görüntüleme yazılımı kullanılarak görüntülendi.
Abstract
Tümörilişkili makrofajlar (TAM) tümör büyümesi, invazyon, metastaz ve kanser tedavilerine karşı direnç için önemli bir bileşen olarak tanımlanmıştır. Ancak, tümör ilişkili makrofajlar tümör mikroçevrebağlı olarak tümör için zararlı olabilir ve geri ya bağışıklık hücrelerinin sitotoksik aktivitesi niantüre veya anti-tümör yanıtı artırarak onların fenotipik özelliklerini değiştirebilir. Makrofajların moleküler eylemleri ve tümör hücreleriyle etkileşimleri (örn. fagosittoz) kapsamlı olarak incelenmemiştir. Bu nedenle, bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşim (M1/M2-subtype TAM) ve tümör mikroortamında kanser hücreleri arasındaki etkileşim artık kanser immünoterapi araştırmalarının odak noktasıdır. Bu çalışmada, faz kontrastı, floresan ve diferansiyel girişim kontrastı (DIC) mikroskobu kullanılarak makrofajların fagositik aktivitesini değerlendirmek için indüklenen M1 makrofajlar ve fare meme 4T1 karsinom hücrelerinin canlı hücre kokültür modeli geliştirilmiştir. Bu yöntem fagositözün çok noktalı canlı hücre görüntülemesini gözlemleyebilir ve belgeleyebilir. 4T1 hücrelerinin M1 makrofajları ile fagosittozisi, karboksifluorescein succinimidyl ester (CFSE) ile 4T1 hücrelerini boyamadan önce floresan mikroskopi ile görülebilir. Mevcut yayın, makrofajları ve tümör hücrelerini tek bir görüntüleme kabında nasıl birarada hale getirmek, M1 makrofajları polarize etmek ve 13 saat boyunca 4T1 hücresini içine alan makrofajların çok noktalı olaylarını kaydetmeyi açıklamaktadır.
Introduction
Makrofajlar bağışıklık savunmasının ilk hattıdır ve kanser hücreleri de dahil olmak üzere patojenlere ve yabancı maddelere karşı bağışıklık yanıtlarının düzenlenmesinde rol oynarlar. Onlar yok eder ve vücutta istenmeyen parçacıklar kurtulur özel bir fagosit vardır. Makrofajlar apoptotik hücrelerin ve mikroorganizmaların temizlenmesi ve diğer bağışıklık hücrelerinin işe alınması gibi savunma fonksiyonları katkıda1. Makrofajlar, çevresel sinyallere yanıt olarak M1 ve M2 makrofajları olmak üzere iki farklı tipe ayırabilir2. M1-polarize makrofajlar (yani, klasik olarak aktive makrofajlar) sitokin interferon-γ (IFN-γ) ve lipopolisakkaritler (LPS) tarafından aktive edilir ve inflamatuar yanıt, patojen açıklık, etkin fagositoz ve tümörial bağışıklık3,4katılır. M2 makrofajlar yakından tümör ilişkili makrofajlar ile ilgili (TAMs) ve anti-inflamatuar ve tümör promosyonözellikleri4 var.
Fagositoz, Antik Yunanca 'dan türetilmiştir (fajin), anlamı "yutmak", (kytos), anlamı "hücre", ve -osis, anlamı "süreç"5. Fagosittoz, fagositlerin (makrofajlar, monositler ve nötrofiller dahil) istilacı patojenleri öldürüp yuttuğu, yabancı parçacıkları temizlediği ve apoptotik hücre enkazlarını temizlediği reseptör aracılı bir süreçtir. Tümör ilişkili makrofajlar (TAM) meme kanseri de dahil olmak üzere farklı tümörlerde stroma bulunur, ve pro-tümör fonksiyonları var6,7, fagosityolis direnç ile sonuçlanan. Makrofajlar ile tümör hücrefagositozunun detaylı mekanizması henüz anlaşılamamıştır.
Bu çalışmada iki aşamalı bir yöntem ortaya konmaktadır: 1) 4T1 fare meme karsinom hücreleri ve M1-polarize makrofajlar birlikte kültürlenmiş, ve 2) makrofajların fagositik aktivitesi canlı hücreli video mikroskopisi kullanılarak değerlendirilmektedir. CFSE floresan boya 4T1 fare meme karsinom hücreleri leke kullanılmıştır. Leke etiketler 4T1 hücreleri tek bir görüntüleme çanak içinde cocultured M1 makrofajlar onları ayırt etmek için. RAW 264.7 makrofajlar LPS ve IFN-γ ile M1 fenotip içine polarize edilir. Tam bir polarizasyon sağlamak için FITC'ye konjuge anti-iNOS antikorile immünoleme yapıldı. Daha sonra, zaman atlamalı görüntülerin çok noktalı bir dizi eşkültür içinde, fagositoksis de dahil olmak üzere birden fazla olay gözlemlemek için elde edildi.
Tümör hücreleri ve makrofajlar arasındaki etkileşimlerin daha iyi anlaşılması potansiyel kanser immünoterapisine yol açabilir. Canlı hücre görüntüleme gerçek zamanlı bir ortamda hücresel dinamiklerin ayrıntılı bir görünüm sunar ve hücre göçü, fenotipik tarama, apoptoz ve sitotoksisite8,9 nörobilim, gelişimsel biyoloji ve ilaç keşfi çalışma için kullanılmıştır. Bu çalışmada önerilen tümör meme kanseri olmasına rağmen, yöntem aynı zamanda birden fazla hedef hücreleri ve farklı etki hücreleri uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bölüm 1−6 4T1 fare meme karsinom hücrelerinin ve RAW 264.7 fare makrofajlarının eşkültür modelini tanımlar. Bölüm 7, Fagosilenmiş 4T1 hücrelerinin M1 makrofajlarının hızlandırılmış değerlendirmesini açıklar.
1. Culturing 4T1 fare meme karsinom hücreleri ve RAW 264.7 fare makrofajlar
- 37 °C'de bir su banyosunda hafif ajitasyon veya hücre hatları için normal büyüme sıcaklığı ile kriyojenik olarak korunmuş 4T1 ve RAW 264,7 passage 6 hücrelerinden oluşan bir şişeyi eritin.
NOT: Erime hızlı bir şekilde, yaklaşık 2 dakika içinde yapılmalıdır. Kontaminasyonu önlemek için, su banyosundan şişeyi çıkarın ve %70 etanol püskürterek dezenfekte edin. Genetik sürüklenme önlemek için, özellikle makrofajlar için, düşük bir geçiş numarası kullanın (yani, az 20). - 15 mL konik tüp içinde tam DMEM orta 10 mL çözülmüş hücreleri seyreltmek ve bir hücre pelet elde etmek için 5 dakika için 600 x g hücreleri santrifüj.
NOT: Protokol boyunca %10 (v/v) fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS), 200 U/mL penisilin/streptomisin ve 2 mM L-glutamin ile takviye edilen komple DMEM ortamı kullanılmaktadır. - Dikkatlice medya aspire, tam orta 8 mL hücreleri resuspend ve 25 cm2 doku kültürü tedavi şişe içine transfer. Kültür hem 4T1 ve RAW 264.7 hücreleri tam DMEM orta 37 °C% 5 CO2ile .
NOT: Hücre peletlerini yavaşça askıya alın ve hücreleri öldürmemek için hücre yiğindamla damlasına kadar hücre süspansiyonunu kültür şişesine ekleyin. - Hücre yapışmasına izin vermek için 1 haftalık bir kültürden sonra, şişeyi günlük olarak izleyin ve gerektiğinde 8 mL tam DMEM ortamı ekleyin.
2. M1 polarize RAW 264.7 makrofajların immünboylemi
- RAW 264.7 hücrelerinin birleşmesi %70−80'e ulaştığında, kültür ortamını atın ve en az 2 mL PBS ile 2 kat hafifçe durulayın.
NOT: RAW 264.7 hücrelerini tohumlamadan önce, hücre farklılaşmasının (örn. dendrit benzeri fenotip ve/veya artan hücre boyutu) meydana gelmediğinden emin olun. Hücre morfolojisi değişiklikleri görünürse, kültürü atın ve önceki geçiş şişesinden yeni bir hücre hattını eritin. - Bir hücre kazıyıcı kullanarak yapışık hücreleri yavaşça etkisiz hale getirerek makrofajları toplama için hazırlayın ve bunları 15 mL konik tüpe aktarın.
- Hücreleri hemositometre kullanarak sayın ve tam DMEM ortamını kullanarak 1 x 105 hücre/çanak hücre süspansiyonu hazırlayın.
- Makrofajların tohum 2 mL'si iki görüntüleme yemeğine süspansiyon. Hücreleri 2−3 h 37 °C'de %5 CO2 ile tüpaltında tünyolayın ve hücre yapışmasını bekleyin.
- Komple DMEM orta10içine100 ng/mL LPS ve 20 ng/mL IFN-γ ekleyerek M1 polarizasyon ortamını hazırlayın,11.
- Makrofajlardan kültür supernatant atın ve dikkatle PBS en az 1 mL ile çanak 2x monolayers yıkayın.
- Görüntüleme türlerinden birine 2 mL M1 polarizasyon ortamı ekleyin, RAW 264.7 hücrelerinin M1 makrofaj fenotipini indüklemesine izin verin ve %5 CO2ile 37 °C'de 2-3 saat kuluçkaya yatırın.
NOT: Anti-iNOS antikor boyama için bir kontrol olarak% 10 FBS ile desteklenen DMEM ile bir görüntüleme çanak tohum RAW 264.7 makrofajlar. Görüntüleme bulaşıklarını sırasıyla RAW (kontrol) ve M1 makrofajlarını (LPS ve IFN-γ polarize) etiketleyin. - İmmün boyamadan önce RAW 264.7 ve M1 makrofaj hücrelerini 2 mL 4 paraformaldehit ve 15 dakika boyunca 37 °C'de (oda sıcaklığında, RT) kullanarak düzeltin.
- Supernatant çıkarın ve en az 3x PBS 1 mL ile hücre monolayer yıkayın.
- PBS'de 2 mL 50 mM amonyum klorür ve RT'de 15 dakika kuluçkaya yatın.
- RT'de 15 dakika boyunca PBS'de %0,3 Triton X-100'ün 2 mL'sini kullanarak permeabilize edin.
- Supernatant çıkarın ve en az 3x PBS 1 mL ile hücre monolayer yıkayın.
- RT'de 30 dk pbs'de %10 FBS'nin 2 mL'sini kullanarak engelleyin.
NOT: İmmünboyamada engelleme adımı hücre içindeki antikorların spesifik olmayan bağlanmasını en aza indirmektir. - Supernatant çıkarın ve en az 3x PBS 1 mL ile hücre monolayer yıkayın.
- PBS'de 2 mL anti-iNOS-FITC ve 4 °C'de bir gecede %1 FBS ile inkübat.
NOT: Hücreleri üreticinin tavsiyelerine uygun antikor seyreltme sini kullanarak etiketlendirin. Bu noktadan itibaren alüminyum folyo ile kaplayarak bulaşıkları ışıktan koruyun. - Supernatant çıkarın ve en az 3x PBS 1 mL ile hücre monolayer yıkayın.
- 300 nM 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) 10 dakika boyunca 37 °C'de, karanlıkta alüminyum folyo ile kaplayarak görüntüleme yemekleri içine 1 mL incubate.
- Hücreleri 1 mL PBS ile en az 3x yıkayın ve görüntüleme yemeklerine 1 mL tam DMEM ortamı ekleyin.
NOT: Hücreler floresan görüntüleme için hazırdır. Mikroskop kurulumu, seçilen lekeler (bu durumda, FITC ve DAPI) için ters bir aşama ve uyarma filtrelerine ihtiyaç duyacaktır. - Mikroskobu açın ve görüntüleme yazılımını yükleyin. Görüntüleme çanağını mikroskoba yerleştirin ve RAW 264.7 ve M1 makrofajlarını gözlemlemek için odağı ayarlayın. Aktarılan ışığı ve pozlama sürelerini ayarlayarak faz kontrastlı FITC ve DAPI görüntülerinin görünümünü optimize edin.
NOT: Tüm noktalar odaklandığında ve kanallar optimize edildiğinde görüntülemeye başlayın. - Faz kontrastı FITC ve DAPI görüntülerini yakalayın (Şekil 1).
3. Tohumlama 4T1 fare meme karsinom hücreleri
- 4T1 hücrelerinin birleşmesi %70−80'e ulaştığında, kültür ortamını atın ve en az 2 mL PBS ile 2x hafifçe durulayın. Hücreleri ayrıştırmak ve 37 °C'de 20 dakikaya kadar kuluçkaya yatırmak için önceden ısıtılmış tripsin 1 mL ekleyin.
NOT: Hücreleri mikroskop altında gözlemleyin. Ayrılmış hücreler yuvarlanır. - Hücreler bir kez kopup, 15 mL konik bir tüp e aktarın ve trypsin inaktive etmek için önceden ısıtılmış tam DMEM orta 2 mL ekleyin. Hücreleri kurtarmak için hücre tabakası yüzeyini boruya tutarak ortamı yavaşça dağıtın. Daha sonra, bir hücre pelet elde etmek için 5 dk için 600 x g santrifüj.
- Supernatant çıkarın ve önceden ısıtılmış tam DMEM orta 10 mL pelet resuspend.
- Doku kültürü ile tedavi edilen iki adet 35 mm cam dipli görüntüleme çanaklarının her birinde tam DMEM ortamının 2 mL'sinde hemositometre ve tohum 1 x 105 4T1 hücre kullanarak hücreleri sayın. Hücreleri bir gecede %5 CO 2 ile 37 °C'de kuluçkayayatırın.
NOT: M1 polarizasyon ortamı ve etiket 4T1-Inducer (kontrol) ile görüntüleme yemeklerinden birinde Kültür 4T1 hücreleri. Bu indükleyiciler maruz kaldığında 4T1 hücrelerinin normal büyümesini sağlamaktır.
4. CFSE boyama kullanarak yaşayan 4T1 fare meme karsinom hücrelerinin etiketlanması
- İlk olarak, 4T1 hücreleri görüntüleme bulaşıkları mevcut medya kaldırın. Hücre monokatını en az 2x PBS 1 mL ile yıkayın.
- CFSE'yi 1 mL PBS'de seyrelterek 5 m CFSE boyama çözeltisi hazırlayın. Her görüntüleme kabına 1 mL 5 mCFSE boyama çözeltisi ekleyin ve hücreleri karanlıkta 20 dakika RT veya 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
NOT: Optimum CFSE boyama konsantrasyonunu elde etmek için hücreleri üreticinin önerilerine ve ön deneylere uygun CFSE çalışma konsantrasyonu kullanarak etiketlendirin. CFSE PBS'de seyreltilirse etiketleme verimliliği daha yüksek olacaktır. - Hücrelere %10 FBS ve boyama çözeltisi içeren eşit hacimli tam DMEM ortamı ekleyerek boyamayı söndürün ve karanlıkta RT'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
- CFSE içeren çözeltiyi atın ve hücreleri eşit hacimli kültür ortamıyla 1kat yıkayın.
NOT: 4T1 hücreleri artık floresan olarak etiketlenmiştir. - 4T1-CFSE hücrelerini %5 CO2 ile RT'deki standart kültür koşullarına geri döndürün.
5. 4T1 ile SEEDing RAW 264.7 fare makrofajları ve coculture
- RAW 264.7'nin birleşimi %70−80'e ulaştığında, kültür ortamını atın ve en az 2 mL PBS ile 2x hafifçe durulayın.
- Bir hücre kazıyıcı kullanarak yapışık hücreleri yavaşça etkisiz hale getirerek makrofajları toplama için hazırlayın ve bunları 15 mL konik tüpe aktarın.
- Hücreleri hemositometre kullanarak sayın ve kalan çözeltiyi tohumlama yoğunluğuna göre tam bir DMEM ortamı ile seyrelterek 1 x 105 hücre/mL'lik bir hücre süspansiyonu hazırlayın.
NOT: Kokültürdeki aşırı konfluent hücreler fagositozu ciddi şekilde azaltabilir. Bu çalışmada makrofajların tohumlama oranı: kanser hücreleri 1:1 oranına göre ayarlanmıştır. Oran tümör hücrelerinin agresifliği ve makrofajların kökenine bağlı olarak ayarlanabilir. - Kokülatyapmadan önce, bir gün önce tohumlanan 4T1 hücrelerinden (adım 4.5) kültür süpernatantını atın ve monolayers 2x'i en az 1 mL PBS ile dikkatlice yıkayın.
- Tohum 1 x 105 RAW 264.7 hücreleri 2 mL tam DMEM orta 4T1 görüntüleme yemeklerinden birine. Hücreleri 2−3 h 37 °C'de %5 CO2 ile tüpaltında tünyolayın ve hücre yapışmasını bekleyin. Görüntüleme çanak 4T1-M1 coculture etiket.
NOT: 4T1 (kontrol) hücreleri makrofajlarla birlikte kullanılmadı.
6. RAW 264.7 makrofajların M1 polarizasyonu
- %10 (v/v) FBS10,11ile tamamlanan komple DMEM ortamına 100 ng/mL IFN-γ ekleyerek M1 polarizasyon ortamını hazırlayın.
- Önce kuluçkaya yatan makrofajlardan (adım 5.5) kültür supernatant'ı atın ve en az 1 mL PBS ile çanak 2x'teki monokatmanları dikkatlice yıkayın.
- Daha sonra, görüntüleme kabına 2 mL M1 polarizasyon ortamı ekleyin ve RAW 264.7 hücrelerinin 37 °C'de %5 CO2ile kuluçkaya yatarak M1 makrofaj fenotipiniçine indüklemesine izin verin.
NOT: M1 makrofaj hücreleri tam polarizasyon elde etmek için kuluçka 2−3 saat sürebilir. Makrofajların tam kutuplaşmasına izin vermek için uygun kuluçka süresini sağlamak için ön deneyler inkübasyon yapılmalıdır.
7. Fagositözcanlı hücreli video mikroskobu
NOT: Görüntü pozlama, zaman ölçümü ve otomatik odaklama düzeltmesinin optimizasyonu da dahil olmak üzere, çoğaltılabilir bir video elde etmek için canlı hücre görüntüleme yaparken birçok faktörün göz önünde bulundurulması gerekir.
- Deneyden önce, 37 °C'de termostatı açarak ve %5 CO2sağlayarak hücre kültürü kuluçka makinesini ayarlayın.
NOT: Mikroskop kurulumu ters bir evre, bir aşama üst kuluçka makinesi, nem kontrolü (%95) ve gaz kuluçka sistemi gerektirir. Bu kurulum uzun vadeli canlı hücre video mikroskobik değerlendirme için hücreleri korumak için çok önemlidir. - Piezo aşaması da dahil olmak üzere mikroskobu açın ve mikroskop görüntüleme yazılımını yükleyin.
- Tohumlu coculture hücrelerini sahnenin ortasına 35 mm'lik cam dipli bir görüntüleme kabına yerleştirin ve üst hazneyi hafifçe vidalayın. Görüntülenecek konumu seçerek sahneyi motorize etmek için joystick'i kullanın.
- Örneği görüntülemek için taretüzerindeki faz kontrast filtresini seçin. Örneği ilk olarak görüntüledikten sonra, uygun alanları bulun ve örneği odak haline getirin.
NOT: Görüntüleme yazılımı tam otomatik objektif seçimi, Perfect Focus Sistemi, hızlandırılmış serisi, çok kanallı görüntü edinimi ve çok noktalı görüntü edinimi kullanımına olanak sağlar. - CFSE etiketleme ve diferansiyel girişim kontrast ı edinme için çok kanallı floresan ayarlamak için, görüntüleme yazılımı edinme iletişim kutusunu açın ve [Lambda] sekmesi onay kutusunu seçin(Şekil 2).
NOT: 13 saatlik hızlandırılmış görüntüleme için faz kontrastlı bir kanal kullanılmalıdır. - [Lambda] sekmesini seçin | [Optik Yapılandırma] ve diferansiyel girişim kontrastı için [10X DIC] ve yeşil floresan filtre onay kutusu için [GFP-R] seçeneğini belirleyin. [Lambda] altında | [Odak] sütununda, odak başvurusu olarak ayarlamak üzere [10X DIC] onay kutusunu seçin.
- Görüntüleme yazılımı edinme iletişim kutusunu açın ve [XYZ Saati ...] düğmesini tıklatın ve [XY] sekmesini seçin.
- Canlı görüntüyü kontrol ederken motorlu sahnedeki joystick'i kullanarak görüntü edinme noktasına geçin veya göz lerden farklı bir konum seçin. Ardından,[Nokta Adı] sütunun altındaki onay kutusunu tıklattığınızda, görüntü yakalama için her konumdaki her noktayı ayarlayın (Bkz. Şekil 3).
NOT: Otomatik aşama, birden çok alanı yakalamak için farklı XY koordinatlarının çok noktalı görüntü edinimine olanak tanır. - Ekranda görüntülenen her örnek için odakta ince ayar. Otomatik odaklama düzeltmesiüzerindeki denetimleri kullanın.
- Hızlandırılmış görüntü yakalamayı ayarlamak için yazılımı kullanın. Görüntüleme yazılımı edinme iletişim kutusunda[Zaman] sekmesini işaretleyin (Bkz. Şekil 4).
- [Interval] (bir zaman noktasının başlangıcı ile başka bir zaman noktası arasındaki gecikme) ve [Süre] (denemenin toplam süresi) belirleyin. Zaman birimleri değişir ve açılan menüden milisaniye (ms), saniye (s), dakika (m) veya saat (h) olarak seçilebilir.
NOT: Floresan ve DIC hızlandırılmış çok kanallı edinimin zaman atlamalı görüntüleme söyme süresi, bu talimikullanılan floresan boyaya bağlı olarak değişebilir. Etiketli hücreler çok uzun süre maruz kalırsa fotobeyazrlama oluşabilir. - Edinilen görüntüleri kaydetmek için [Dosyaya Kaydet] onay kutusunu işaretleyin. [Zaman çizelgesi] sekmesinin altında çok noktalı zaman serisi görüntüleri elde etmek için [Şimdi Çalıştır] düğmesini tıklatın (Bkz. Şekil 5).
NOT: Görüntüleme yazılımında görüntüler nd2 dosya biçiminde kaydedilir. Her zaman atlamalı daha sonra bir MP4 dosya biçiminde ayrı ayrı kaydedilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
4T1 fare meme karsinom hücre hatlarının coculture modelinin zaman atlamalı iki boyutlu (2D) görüntüleri, 13 saatlik bir süre boyunca M1 makrofajları tarafından yutulan 4T1 hücrelerini göstermektedir. İmmünboyama yaparak M1 makrofajlarının tam bir polarizasyonunu sağlamak önemlidir. Sonuçlar(Şekil 1)100 ng/mL lipopolisakkarit (LPS) ve 20 ng/mL IFN-γ polarize RAW 264.7 makrofajkonsantrasyonunun M1 durumuna girdiğini göstermektedir. Hedeflenen hücreleri floresan boya ile etiketlemek ve efektör hücrelerini lekesiz bırakmak canlı hücre ortak kültür modeline olanak sağlar (Film 1). 13 saat ve 15 dk aralık boyunca, 4T1 hücreleri ile birlikte m1 makrofajların fagositik aktivitesi belgelenmiştir(Film 2). Altı çok noktalı video (Film 2'dekiA−F) tek bir 35 mm cam dipli görüntüleme çanak içinde birden fazla olayı değerlendirmek için kaydedildi. Film 3, M1 makrofajları tarafından fagosite edilen 4T1 hücrelerini göstermektedir. Film 4 bu deneyden filme derin bir video bir örnek olarak seçildi ve Film 5 M1 makrofajlar tarafından 4T1 hücrelerinin alımını gösterir.
Şekil 1: Yeşil de anti-iNOS-FITC ile immünoreskence boyama, mavi çekirdek belirteci DAPI, ve birleştirilmiş görüntülerin geliştirilmiş sürümleri. Bu paneller RAW 264.7 makrofajlar temsil (kontrol) ve M1 makrofajlar (LPS ve IFN-γ uyarılmış) anti-iNOS-FITC ile immünosu (M1 marker) yeşil ve karşıçekirdek belirteç ile karşı, mavi DAPI. (A) DAPI lekesi hem RAW 264.7 hem de M1 makrofajları görülebilir. (B) Anti-iNOS-FITC (yeşil) sadece M1 makrofajlarında floresan. (C) DAPI leke ve anti-iNOS-FITC birleştirilmiş görüntüleri. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Görüntüleme yazılımı edinme iletişim kutusunda floresan ve DIC görüntü edinimi nin ayarlanması. [1] [Lambda] sekmesionay kutusunu seçin, [2] [Optik Yapılandırma] seçin ve yeşil floresan filtre onay kutusu için [10X DIC] ve [GFP-R] seçin, [3] seçin [10X DIC] | [Bu kanalı odak başvurusu olarak ayarlayın]. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Görüntüleme yazılımı edinme iletişim kutusunda çok noktalı görüntü edinimi nin ayarlanması. [4] [XY] sekmesini seçin ve sonraki [5] görüntü yakalama için her noktayı ayarlamak için [Nokta Adı] sütununaltındaki onay kutusunu seçin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Zaman atlamalı ölçüm görüntü yakalama için aralıkları ve süresini ayarlama. Zaman atlamalı görüntü yakalamayı ayarlamak için görüntüleme yazılımı edinme iletişim kutusu denetimi. [Zaman atlamalı görüntü edinimi]'ni [Zaman] sekmesinde ayarlamak için [Zaman] sekmesinde [7] [Interval] (sn, dk veya saate göre) ve [8] [Süre] (sn, dk veya saate göre) belirleyin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Hızlandırılmış ölçüm görüntü yakalama için çok noktalı film panelleri kurma. Altı çok noktalı film panelleri önizleme coculture 13 saat tamamlanmasından sonra kombine. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Film 1: Floresan ve DIC mikroskopi nin çok kanallı edinimi kullanılarak yakalanan kokültürde lekesiz M1 makrofajları ve 4T1 CFSE lekeli fare meme karsinom hücrelerinin temsili bir filmi. 4T1 fare meme karsinom hücrelerinin yeşil etiketli hücre duvarında CFSE'yi gösteren sonuçlar, lekesiz M1 makrofajlarıyla birlikte. Zaman atlamalı görüntüler, çok kanallı edinim kullanılarak 15 dakikalık zaman aralıklarıyla 13 saatlik bir coculture dönemi için elde edilmiştir (adım 7.3, bkz. Şekil 2). (A) Diferansiyel girişim kontrastı, (kırmızı daire) epitel morfolojisi olan 4T1 hücrelerine yapışan küçük, yuvarlak M1 makrofajları gösterir. (B) Makrofajlar tarafından fagositoz dan önce CFSE ile boyanmış 4T1 hücrelerinin floresan mikroskopi görüntüsü. (C) CfSE lekeli 4T1 hücrelerinin lekesiz M1 makrofajları tarafından yutulan DIC ve floresan mikroskopi görüntüleri birleştirilir. Mavi oklar, CFSE etiketli 4T1 hücrelerini yuttukları için lekesiz M1 makrofajlarının yeşilfloresi olduğunu gösterir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Film 2: 4T1 fare meme karsinom hücrelerinin fagositozunun m1 makrofajlar tarafından indüklenen tek bir görüntüleme çanasında birden fazla sahne noktasından canlı hücreli video mikroskobu filmleri. Sonuçlar altı farklı noktayı temsil eder(Movie 2A−F)görüntüleme yazılımı kullanılarak ayarlanmış ve koordine edilmiştir (adım 7.4, bkz. Şekil 3−Şekil 5). M1 makrofajlar gözenekli sitoplazmalı düzensiz, gözleme benzeri morfolojiye sahipken, 4T1 fare meme karsinomları epitel morfolojisine sahiptir. Canlı hücre video mikroskopisi için gözlenmeden önce M1 makrofajlar ve 4T1 hücreleri 37 °C'de evre kuluçka makinesi içinde %5 CO2 ile 13 saat birlikte yetiştirildi. Görüntüler 13 saat boyunca 15 dk zaman aralığında çekildi Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Film 3: Tek bir koordinat noktasının canlı hücrevideo mikroskobu filmi (bkz. Film 2) 4T1 fare meme karsinomlarının fagositozisini ayrıntılı olarak M1 makrofajları indükleyerek göstermek için seçilmiştir. Kırmızı ok fagositoz olduğunu gösteriyor. Sarı daire gösterir ki 4T1 hücrelerinin yutma söndürdü 4T1 hücrelerinin sayısı. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Film 4: M1 makrofajlar tarafından 4T1 hücrelerinin fagositöz sürecini daha fazla görselleştirmek için ayrıntılı bir video. Bu panel gözenekli sitoplazma fenotip ile canlı M1 makrofaj hücreleri gösterir. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Film 5: Hücreden hücreye temas kurmak için 4T1 hücrelerine doğru hareket eden makrofajlar, ardından M1 makrofajlar tarafından 4T1 hücrelerinin alımı (Bkz. Film 2A). Faz-kontrast lı mikroskopi zaman atlamalı video, %5 CO2ile 37 °C'de bir sahne üst kuluçka makinesi içinde 13 saat cokültür için 15 dk zaman aralığında görüntülendi. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Açıklanan protokol iki adım gerektirir: 1) 4T1 fare meme karsinom hücreleri ve M1-polarize makrofajlar coculture ve 2) zaman atlamalı mikroskopi kullanarak makrofaj fagositik aktivitenin değerlendirilmesi. Canlı hücre kokültür yaygın fagositositve göç tahlillerinde kullanılır. Canlı hücre kokültür modeli burada bir floresan boya kullanan basit, uyarlanabilir in vitro prosedürü(Şekil 2)4T1 hedefli hücreleri etiketlemek için kullanılan bir floresan boya, CFSE. Bu, canlı hücre görüntüleme sırasında hücre türlerinin doğru takibi için kullanılır. Zaman atlamalı canlı hücre görüntüleme, 13 saat kokültürden önce çok noktalı zaman atlamalı 2D görüntüleme kullanılarak M1 makrofajlarının fagositik aktivitesini değerlendirmek için kullanıldı.
Canlı hücre kokültür modeli 4T1 fare meme karsinom hücreleri ve M1 fare makrofajları kullanılarak kurulmuştur. Hücreleri birbirinden ayırmak için 4T1 hücreleri CFSE floresan boya kullanılarak boyandı (bkz. bölüm 4). CFSE hücreleri izleme ve hücre bölünmesi izleme sağlar. CFSE pasif olarak hücrelere yayılabilir, CFSE'yi hedeflenen hücrelerin fagosittozlarını görselleştirmek için uygun bir hücre izleyicisini boyamaya neden olur. Fagositik makrofajlar sindirmek ve kanser hücrelerini yutmak gibi, onlar CFSE boya almak ve sonunda floresan12,13olur . M1 makrofajları öncesi görüntüleme kabında 4T1 hücrelerinin tohumlenmesi esastır. Bunun nedeni her iki hücrenin farklı boyut ve şekillerinden kaynaklanmaktadır. 4T1 hücreleri küçük kümeler halinde çoğalan bir epitel morfolojisi vardır. Ayrıca, 4T1 hücreleri lekesiz M1 makrofajlar ile coculture önce CFSE ile boyanmış olmalıdır. LPS ve IFN-γ kullanılarak makrofaj polarizasyonundan önce, murine makrofajlar RAW 264.7 yuvarlak, küçüktür ve genellikle tek hücre olarak büyür. LPS ve IFN-γ polarizasyon sonra, indüklenen M1 makrofajlar nispeten düzleştirilmiş var, gözlemen gibi şekil, gözenekli bir sitoplazma ile14,15. RAW 264.7'nin M1 durumuna doğru uygun polarizasyonunu sağlamak için, 100 ng/mL LPS ve 20 ng/mL IFN-γ uyarılmış makrofajlar M1 belirteci ile immünosüle edildi, anti-iNOS antikor FITC'ye konsike ydi(Şekil 1). Bu protokol, makrofajların M1 durumuna tamamen polarize olduğundan emin olmak için makrofajlar ve hedeflenen hücreler birleştirilmesinden önce gerçekleştirilir.
Bu çalışmada, yaşayan makrofajların fagositik aktivitesini görselleştirmek için floresan mikroskopi için bir yöntem açıklanmaktadır. Fotobeyaztmayı en aza indirmek ve daha iyi floresan görüntülemesağlamak için floresan mikroskopi, DIC'e benzer şekilde florokroma zarar vermeyen diğer görüntüleme teknikleri ile kombine edilebilir. Bu protokol, fare meme karsinom hücrelerinin fagositozunun LPS ve IFN-γ uyarılmış makrofajlar tarafından floresan ve DIC zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak değerlendirilmesi için gerekli malzeme ve yöntemleri açıklamaktadır. Bununla birlikte, floresan mikroskopi çalışmaları faz-kontrast zaman atlamalı görüntüleme ile karşılaştırıldığında canlı hücre görüntüleme çalışırken sınırlamalar var. Floresan canlı hücre görüntüleme sırasında, uyarma ışık yüksek miktarda uzun süreli maruz kalma ciddi hücre hasarı neden olabilir16. Fotobeyaztma canlı hücre görüntülemeönemli sorunlara neden olabilir. Canlı hücre görüntülemesinde kullanılan yüksek yoğunluklu aydınlatma CFSE boyanın floresan yeteneğini azaltabilir. Bununla birlikte, faz-kontrast lı zaman atlamalı 2D görüntüleme(Filmler 2-5)kullanılarak bu çalışmanın ikinci bölümünde 13 saat fagositositöz değerlendirmesi yapıldı.
Hızlandırılmış mikroskopi, istenilen süre boyunca herhangi bir zaman noktasında tek bir deneyden veri üretimi gibi avantajlar sunar ve önemli ölçüde, tek bir görüntüleme çanağı içindeki birden fazla aşama noktası tek bir deney için yakalanabilir. Bu, tek bir deneyde çeşitli pozisyonların gözlemlemesine olanak sağlar. Protokol aynı zamanda kültür plakalarından birden fazla kuyu (örn. 6, 24, 96 kuyu plakası) kullanılarak da kullanılabilir. Başarılı canlı hücre görüntüleme deneyi gerçekleştirmek için en kritik teknik zorluklar arasında 37 °C, nem% 95 ve% 5 CO2istikrarlı bir sıcaklık sağlamak için bir sahne üst kuluçka makinesi kullanarak sağlıklı bir durumda hücreleri korumak içerir. Çünkü deney 13 saat sürdü, mikroskopun normal olarak çalışmasını sağlamak çok önemliydi.
Bu çalışma sırasında, görüntüleme çanağı altı farklı noktaları nokta başına 15 dakika aralıklarla 13 saat süre boyunca yakalandı(Film 2). Noktalar, araştırma altındaki hücrenin olayına bağlı olarak ayarlanabilir. Bu deneme boyunca yakalanacak birden çok aşama noktası olduğu göz önünde bulundurulduğunda, canlı hücre video kaydını gerçekleştirmeden önce her noktanın kararlı bir odak noktası olduğundan emin olmak önemlidir. Araştırma için zaman aralığı optimize edilmelidir. Azalmış bir zaman aralığı görüntülenebilir daha ayrıntılı noktalar alacaktır; ancak, dosya boyutu çok büyük olacaktır. Artan zaman aralığı uzun bir video neden olur ve film sürekliliğini kaybetmek yapacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Finansal Geran Putra Berimpak (GBP), Üniversite Putra Malezya: 9542800 tarafından finanse edilmiştir. Agro-Biotechnology Institute, Malaysia (ABI) laboratuvarları ve mikroskopi görüntüleme tesisine teşekkür ederiz. Bu çalışma için deneysel video düzenleme ve kayıt ile ilgili yardım için Mohd Daniel Hazim için özel teşekkürler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-INOS antibody conjugated FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µg in 1 mL |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/high glucose | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| Fetal bovine serum | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Mouse recombinant interferon-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µg |
| Penicillin-streptomycin solution | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Trypsin EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 tips/case |
| 2 mL serological pipette | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
| 200 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps/case |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning | CLS430639 | Tissue culture treated |
| Bench top centrifuge | Dynamica | FA15C | Model: Velocity 14R |
| Biological safety fume hood | Nuaire | NU-565-400 | Model: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Fume Hood |
| CO2/air mixer | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Air Mixer) with the flow meter |
| Cell scrapper | NEST | 710001 | 220 mm |
| CO2 cell incubator | Panasonic | N/A | Model: MCO-19M(UV) |
| Confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Glass bottom dish | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Available online download | |
| Pipette controller | CappAid | PA-100 | CappController pipette controller, 0.1-100ml |
| Thermostat | Shinko | Discontinued | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
References
- Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A. Macrophage polarization: Tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends in Immunology. , (2002).
- Lee, K. Y. M1 and M2 polarization of macrophages a mini-review. 2 (1), 1-5 (2019).
- Martinez-Marin, D., Jarvis, C., Nelius, T., Filleur, S. Assessment of phagocytic activity in live macrophages-tumor cells cocultures by Confocal and Nomarski Microscopy. Biology Methods and Protocols. 2 (1), 1-7 (2017).
- Tauber, A. I.
- Eiro, N., Gonzalez, L. O., Cid, S., Schneider, J., Vizoso, F. J. Breast Cancer Tumor Stroma: Cellular Components, Phenotypic Heterogeneity, Intercellular Communication, Prognostic ImplicationsTherapeutic Opportunities. Cancers. 11 (5), 1-26 (2019).
- Larionova, I., et al. Interaction of tumor-associated macrophages and cancer chemotherapy. OncoImmunology. 8 (7), 1-15 (2019).
- Jain, P., Worthylake, R. A., Alahari, S. K. Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (63), e3585 (2012).
- Weiss, S., Luchman, H. A., Restall, I., Bozek, D. A., Chesnelong, C. Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58152 (2018).
- Tsitsilashvili, E., Sepashvili, M., Chikviladze, M., Shanshiashvili, L., Mikeladze, D. Myelin basic protein charge isomers change macrophage polarization. Journal of Inflammation Research. 12, 25-33 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Kobelt, G., Eriksson, J., Phillips, G., Berg, J. The burden of multiple sclerosis 2015: Methods of data collection, assessment and analysis of costs, quality of life and symptoms. Multiple Sclerosis Journal. 2, 153-156 (2017).
- Escórcio-Correia, M., Hagemann, T. Measurement of tumor cytolysis by macrophages. Current Protocols in Immunology. , SUPPL.92 1-11 (2011).
- Cui, K., Ardell, C. L., Podolnikova, N. P., Yakubenko, V. P. Distinct migratory properties of M1, M2, and resident macrophages are regulated by αdβ2and αmβ2integrin-mediated adhesion. Frontiers in Immunology. 9, 1-14 (2018).
- McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).
- Penjweini, R., Loew, H. G., Hamblin, M. R., Kratky, K. W. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: A new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. Journal of Microscopy. 45 (1), 100-108 (2012).
