Summary
Deze methode beschrijft de beoordeling van wereldwijde veranderingen in de ubiquitin ketentopologie. De beoordeling wordt uitgevoerd door de toepassing van een op massaspectrometrie gebaseerde gerichte proteomics-benadering.
Abstract
Beoordeling van het globale profiel van ubiquitin ketentopologieën binnen een proteoom is van belang om een breed scala aan biologische vragen te beantwoorden. Het hier geschetste protocol maakt gebruik van de di-glycine (-GG) modificatie die overblijft na de tryptische vertering van ubiquitin opgenomen in een keten. Door deze topologie-karakteristieke peptiden te kwantificeren kan de relatieve overvloed van elke ubiquitin ketentopologie worden bepaald. De stappen die nodig zijn om deze peptiden te kwantificeren door middel van een experiment voor parallelle reactiemonitoring worden gerapporteerd rekening houdend met de stabilisatie van alomtegenwoordige ketens. Voorbereiding van zware controles, cellyse en spijsvertering worden beschreven, samen met de juiste workflow voor het instellen van massaspectrometers en gegevensanalyse. Een voorbeeld van een dataset met verstoringen in de ubiquitin topologie wordt gepresenteerd, vergezeld van voorbeelden van hoe optimalisatie van het protocol de resultaten kan beïnvloeden. Door de beschreven stappen te volgen, kan een gebruiker een globale beoordeling uitvoeren van het alomtegenwoordige topologielandschap binnen hun biologische context.
Introduction
De nauwe regulering van de eiwitfunctie en -stabiliteit is van het grootste belang, omdat ze belangrijke aanjagers zijn van fenotypische controle van de biologie. De functie van een eiwit is opgebouwd uit twee componenten: de intrinsieke polypeptidesequentie en eventuele posttranslationele modificaties (PTM's). Er zijn verschillende chemische PTM's geïdentificeerd, waaronder glycosylatie, fosforylering, acetylatie en methylatie1. In 1975 identificeerden Goldstein et al.2 een klein eiwit en noemden het alomtegenwoordig vanwege zijn alomtegenwoordige aard. Ubiquitin bleek belangrijk te zijn bij eiwitafbraak3. Sindsdien is echter vastgesteld dat de functie van alomtegenwoordigheid als signaalmolecuul veel verder reikt dan de regulering van eiwitstabiliteit. Ubiquitin-signalering is betrokken bij een breed scala aan andere biologische functies, zoals eiwitstabilisatie, autofagie, celcycluscontrole en eiwithandel4.
Terwijl andere PTM's over het algemeen binair zijn (d.w.z. het eiwit wordt gewijzigd of ongewijzigd gelaten) voor een bepaalde site, kan ubiquitin een eiwit zowel als monomeer als als polymere keten wijzigen, waarbij de bijgevoegde ubiquitin zelf wordt alomtegenwoordig. Verder kan deze polyubiquitinatieketen zich in verschillende topologieën ontwikkelen met de alomtegenwoordigheid van de vorige ubiquitin die zich hecht aan een van de acht koppelingsplaatsen5,6. Ubiquitin wordt overgedragen door een multistep enzymatisch proces (Figuur 1) waarbij het C-eindpunt van ubiquitin is gekoppeld aan een van de zeven lysineresiduen (K06, K11, K27, K29, K33, K48 of K63) of de N-terminal van de vorige ubiquitin (aangeduid als de M1 of lineaire ubiquitinatie)5,6. Deze ketentopologie is de sleutel tot het lot van het eiwit onder modificatie. De modificatie met een K48- of K11-gekoppelde keten leidt bijvoorbeeld tot de afbraak van het gemodificeerde eiwit bij het proteasoom, terwijl een lineaire keten nodig is voor de activering van NF-kB-signalering. De relatieve verdeling van deze ketentopologieën is dus relevant voor een breed scala aan biologische vragen.
Het gebruik van massaspectrometrie (MS) is van bijzonder belang voor de analyse van de ubiquitinketentopologie, omdat het niet afhankelijk is van op antilichamen gebaseerde of op affiniteit gebaseerde interacties7,8, waarvan er vele een beperkte specificiteit hebben en geen onderscheid maken tussen de verschillende ketentypen. Een andere detectiemogelijkheid is het gebruik van genetisch gemodificeerde ubiquitin mutanten. Hier wordt een specifieke lysine ingeruild voor arginine, die de modificatie door ubiquitin niet kan ondersteunen. Het gebrek aan ubiquitin ketenvorming op het substraateiwit wordt vervolgens geïnterpreteerd als bewijs voor een specifieke topologie9.
Ms-gebaseerde identificatie van alomtegenwoordige eiwitten is gebaseerd op het feit dat het C-eindpunt van ubiquitin een arginineresidu in positie 74 bevat dat door trypsine wordt herkend tijdens de proteolytische bereiding van de monsters voor MS-analyse, waarbij de C-terminale dubbele glycine wordt gescheiden. Deze GlyGly (-GG) blijft verbonden met de ε-aminogroep van het lysineresidu van het substraateiwit. Voor ubiquitin topologie analyse, de wijziging vindt plaats op een van de zeven lysine residuen van ubiquitin. Hierdoor ontstaat een set van zeven belangrijke peptiden die een lysineresidu bevatten dat wordt gewijzigd door GG, specifiek voor elk van de topologieën (Figuur 2). Bijvoorbeeld, met K06 topologie, de lysine op positie 6 op de aminozuur volgorde zal worden beschermd tegen tryptische spijsvertering met een -GG modificatie van 114 Da toegevoegd aan deze lysine.
Identificatie van specifieke vooraf bepaalde peptiden door MS wordt aangeduid als gerichte proteomics, of meer specifiek, gerichte peptide acquisitie10. Afhankelijk van de prestaties van de gebruikte massaspectrometer zijn twee methoden ontwikkeld. Dit zijn selected reaction monitoring (SRM), ook wel multiple reaction monitoring (MRM) en parallel reaction monitoring (PRM) genoemd. SRM omvat de selectie van overgangen bestaande uit de precursor m/z en het product ion m/z. Omgekeerd vereist PRM alleen de voorloper m/z. Na de selectie wordt een volledige enquêtescan van de productionen uitgevoerd. Dit heeft als voordeel dat vóór de meting geen geschikte productionen voor kwantificering op de specifieke massaspectrometer nodig zijn. Zowel SRM als PRM kunnen, afhankelijk van het instrument, worden ingepland. Planning is de praktijk van het toewijzen van een tijdvenster waarin een bepaald ion zal worden opgenomen voor analyse, omdat peptiden eluting op gedefinieerde retentietijden van het chromatografische systeem. Het verminderen van het aantal ionen dat op een bepaald moment wordt ondervraagd, verhoogt de frequentie van ondervraging van die ionen die op dat moment zijn gepland, waardoor de nauwkeurigheid van de gegevens wordt verbeterd.
Over het algemeen is de toepassing van gerichte proteomica voor alomtegenwoordige topologie hetzelfde als elk ander gericht proteomics-experiment. Twee belangrijke verschillen zijn echter belangrijk: ten eerste moet rekening worden gehouden met de stabiliteit van alomtegenwoordige ketens. Er zijn meerdere krachtige deubiquitinerende enzymen (DUBs) die snel ketens afbreken bij cellysis. De alomtegenwoordige proteasen vallen in twee categorieën, de thioesterases en metalloproteases. De meeste ubiquitin-hydrolasen zijn thioesterases en dragen een cysteïneresidu in hun actieve centrum. Door dit cysteïneresidu te alkyleren, kunnen ze worden geactiveerd. Als zodanig is het gebruik van ubiquitin stabilisatiebuffers die alkylerende middelen bevatten, zoals N-ethylmaleimide (NEM), en sterk denaturerende chemicaliën, en het gekoeld houden van monsters van vitaal belang voor een succesvolle analyse. Ten tweede, in tegenstelling tot andere gerichte experimenten, is de peptidekeuze vast. In een typisch gericht experiment kan een proteotypisch peptide worden geselecteerd voor goede chromatografische en ionisatieprestaties. Voor sommige topologie-karakteristieke peptiden zoals K48 zijn deze eigenschappen goed, terwijl ze voor anderen minder wenselijk zijn. K33-chromatografie in een typische omgekeerde fase-instelling is bijvoorbeeld slecht vanwege de vorming van een uitgerekt elutieprofiel en de slechte ionisatie-eigenschappen van het K27-peptide verminderen de zichtbaarheid met MS12.
In dit protocol beschrijven we hoe we een alomtegenwoordige topologiebeoordeling van een biologisch monster door PRM kunnen uitvoeren. Voorbeeldgegevens voor de procedure worden gepresenteerd met behulp van een verstoring van het proteasoom met behulp van MG-132-remmerbehandeling in verschillende celtypen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van een zware peptidestandaard
- Afhankelijk van de leverancier en kwaliteit van de gekochte zware peptiden, moeten de zware peptiden worden verdund. Dit protocol gebruikte de peptidesequenties gerapporteerd in tabel 1, waarbij het C-terminale aminozuur werd gewijzigd in Lysine (13C615N2-lysine) of Arginine (13C615N4-arginine).
- Meng de zware peptiden en verdun de mix met 50% acetonitril (ACN) om een peptidemix te creëren met elk peptide bij 10 μM.
- Maak aliquots van de peptidemix en bewaar bij -80 °C.
2. Monstervoorbereiding
- Monsterlysis
OPMERKING: Bij de bereiding van het monster moet rekening worden gehouden met de stabiliteit van de ubiquitineketens. Houd biologische monsters en buffers gekoeld bij 4 °C en voeg monsters zo snel mogelijk toe aan de ubiquitin stabilisatiebuffer.- Bereid een oplossing van 1 M NH4HCO3 (ammoniumbicarbonaat) in water en stel de pH in op 8 met 1 M NaOH.
- Bereid een oplossing van 200 mM N-ethylmaleimide (NEM) in water.
- Bereid de ubiquitin stabilisatiebuffer voor met 8 M ureum in 50 mM NH4HCO3/10 mM NEM. De Ubiquitin stabilisatiebuffer moet elke keer opnieuw worden bereid.
OPMERKING: Een oplossing van 5 ml van 8 m ureum vereist aanzienlijk minder dan 5 ml water, gezien de uitzetting van water in een verzadigde oplossing met ureum.
LET OP: Bereid de buffer niet voor boven 50 °C vanwege de neiging van ureum om polyureum te vormen bij hoge temperaturen. - Het biologisch monster dat in een ubiquitin stabilisatiebuffer moet worden onderzocht, waarbij 0,5 μg/μL eiwit wordt gebruikt, wordt geresuspendeerd en de cellen met een geschikte methode voor het monster worden gelyseerd. Een sonicatiemethode bestaande uit drie pulsen van 10 s met een SFX 150 Branson sonifier ingesteld op 70% intensiteit met 10 s breuken op ijs tussen elke puls, werd gebruikt voor de cellijnen in dit protocol.
- Centrifugemonster bij 18.000 x g gedurende 10 min bij 4 °C in een tafelcentrifuge.
- Breng supernatant over in een verse eiwitarme microcentrifugebuis. Monsters kunnen op dit punt indien nodig bij -20 °C worden opgeslagen.
- Voorbereiding van monster en controles
- Als de monsters bevroren zijn, mengt u ze (bijv. met een thermomixer) terwijl ze ontdooid zijn om het ureum snel op te lossen.
LET OP: Gebruik geen temperaturen boven 50 °C vanwege de neiging van ureum om polyureum te vormen bij hoge temperaturen. - Centrifugemonster bij 18.000 x g gedurende 10 min bij 4 °C in een tafelcentrifuge.
- Breng 20 μg monster over in een verse microcentrifugebuis met lage binding en stel het volume in op 50 μL met ubiquitin stabilisatiebuffer.
- Creëer een negatieve regeling met behulp van een genormaliseerd volume van de ubiquitin stabilisatiebuffer (50 μL). In dit monster mag geen lichte versie van elk peptide aanwezig zijn, waardoor elke lichte verontreiniging als gevolg van de piek-in zware peptiden kan worden waargekoppeld. Deze negatieve controle werd ook gebruikt voor de retentietijdplanning van de PRM zoals beschreven in punt 3.1.
- Er werd ook een positieve controle gecreëerd met ubiquitin stabilisatiebuffer en de toevoeging van commercieel beschikbare kettingtypes aan het genormaliseerde volume van de ubiquitin stabilisatiebuffer (50 μL). Gewoonlijk zijn K63, K48 en M1 beschikbaar. In de representatieve resultaten werden 20 ng K48, K63 en M1 gebruikt.
- Als de monsters bevroren zijn, mengt u ze (bijv. met een thermomixer) terwijl ze ontdooid zijn om het ureum snel op te lossen.
- Reductie, alkylering en spijsvertering
- Bereid een oplossing van 50 mM ammoniumbicarbonaat (NH4HCO3) in water en stel het monster in op pH = 8 met 1 M NaOH.
- Een kweek van E. coli gekweekt in LB bouillon werd 5.000 x g gecentrifugeerd gedurende 5 min om een pellet te vormen, die vervolgens 2x met PBS werd gewassen voordat resuspensie in ubiquitine stabilisatiebuffer bij 5 μg/μL.
- Voeg 1 μg E. colilysaat toe aan elk monster en controleer. Dit protocol maakt gebruik van E. coli (DH10B), maar elk complex lysaat zonder ubiquitin kan worden gebruikt. Merk op dat ubiquitin gemeenschappelijk is voor alle eukaryoten.
OPMERKING: Het gebruik van een E. coli lysaatmatrix vermindert het verlies van peptiden als gevolg van niet-specifieke hechting aan plasticgoed. Dit is met name merkbaar in de negatieve controle of monsters met een beperkt eiwitgehalte en heeft een sterke invloed op de waarneming van K6312. - Bereid een oplossing van 500 mM tris (2-carboxyethyl)fosfine (TCEP) in MS-water (DTT kan als alternatief worden gebruikt).
- Verminder de monsters en controles door TCEP toe te brengen tot een eindconcentratie van 50 mM. Vortex kort voor incubatie gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT). Bij gebruik van DTT moet de temperatuur worden verhoogd tot 50 °C.
LET OP: Gebruik geen temperaturen boven 50 °C vanwege de neiging van ureum om polyureum te vormen bij hoge temperaturen. - Bereid een oplossing van 550 mM chloroacetamide (CAA) in NH4HCO3. Bewaren in het donker.
- Alkylaat de monsters en controles door CAA toe te voegen aan een eindconcentratie van 55 mM. Vortex kort voor incubatie gedurende 20 minuten bij RT in het donker.
OPMERKING: CAA wordt gebruikt in plaats van iodoacetamide als reductiemiddel om de kans op een dubbele carbamidomethylmodificatie (114.0429) te verminderen op een lysineresidu dat wordt verward met een -GG-modificatie (114.0429)13. - Voeg endopeptidase LysC toe aan de monsters in verhouding van 1:25 (m/w) tot het eiwitgehalte. Incubeer gedurende 3 uur bij 37 °C.
- Verdun de monsters en controles met 200 μL van 50 mM NH4HCO3 pH = 8 (1:5 v/v).
- Voeg trypsine toe aan de monsters in verhouding van 1:25 w/w tot het eiwitgehalte. Incubeer gedurende 12 uur bij 37 °C.
- Voeg 10% mierenzuuroplossing (FA) in MS-water met een verhouding van 1:10 v/v toe aan elk monster en controleer het monster. Controleer of de pH <3) vóór de C18-opruiming is en voeg indien nodig meer mierenzuur toe.
- Voeg aan elk monster en elke controle 0,5 μL van de zware peptidestandaard toe die in rubriek 1 is gemaakt.
- Peptide opruimen
- Verschillende fabrikanten bieden C18 opruimtips of platen aan. Volg de instructies van de fabrikant voor het gebruikte product en droog geëuteerde peptiden in een vacuümcentrifuge, klaar voor MS-analyse.
3. Analyse door LC-MS/MS
- Voer de eerste PRM-analyse uit op de zware peptidestandaard op een ongeplande manier.
- Resuspend de gedroogde monsters in 10 μL MS-belastingsbuffer 2% ACN/0,05% trifluorazijnzuur (TFA).
- Rust een HPLC uit met een omgekeerde fase C18 analytische kolom (75 μm x 15 cm, 2 μm 100 Å C18 kralen) ontworpen voor nanoflow MS. Vorm lineaire gradiënten die MS-grade water uitwisselen aangevuld met 0,1% FA met ACN met 0,1% FA. Hier werd een opofferende valkolom (75 μm x 2 cm, 3 μm, 100 Å C18 kralen) gebruikt om de levensduur van de analytische kolom te behouden, maar is niet vereist.
- Koppel de output van de analytische kolom aan een nano-ESI-bron op een massaspectrometer met hoge resolutie.
- Gebruik een geschikte gerichte proteomics-methode voor de massaspectrometer. Op een Q-Exactive plus een methode met twee experimenten wordt bijvoorbeeld gefietst tussen een Full MS- en een PRM-experiment. Voor het Full MS-experiment werd een resolutie van 120.000 gebruikt met een AGC-doel van 1e6 en 240 ms als maximale IT. Voor het PRM-experiment werd hetzelfde AGC-doel en maximale IT gebruikt met een lagere resolutie van 60.000 en een isolatievenster van 1,2 m/z.
- Injecteer 200 ng van de negatieve controle op de analytische kolom met behulp van de HPLC autosampler. Breng een lineaire gradiënt aan op het monster op de analytische kolom, waardoor de ACN-concentratie van 2-25% over een periode van ~ 45 min.
OPMERKING: De 25% ACN-concentratie is lager dan normaal voor proteomica vanwege de lage hydrofiele aard van typische ubiquitin topologie-karakteristieke peptiden. Als andere peptiden moeten worden gekwantificeerd, kan een hogere ACN-concentratie worden gewenst om een goede doelscheiding te bereiken. - Analyseer de resultaten van de planningsrun zoals beschreven in sectie 4.2 om een geplande opnamelijst te maken.
- Analyse van de monsters
- Voer de resterende voor beelden uit zoals beschreven voor de planning in 3.1, afgezien van het gebruik van de geplande opnamelijst die is gemaakt in sectie 4.2.
OPMERKING: Na de positieve controle moet een blanco worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat er in de volgende monsters geen overdracht van de vorige run wordt gedetecteerd.
- Voer de resterende voor beelden uit zoals beschreven voor de planning in 3.1, afgezien van het gebruik van de geplande opnamelijst die is gemaakt in sectie 4.2.
4. Software analyse
- Maak een opnamelijst met de juiste opmaak voor de gebruikte MS. Dit protocol maakte gebruik van de open source software Skyline (versie 19.1.0.193) (https://skyline.ms), die goed gedocumenteerde ondersteuning en hulp biedt. Er kan een opnamelijst worden gemaakt voor verschillende massaspectrometers met behulp van de exportisolatielijstfaciliteit.
- Open een nieuw Skyline-document.
- Selecteer zware isotoopmodificaties, indien van toepassing op zware topologie-karakteristieke peptiden. In Instellingen| Peptide-instellingen onder het tabblad Wijziging, klik op het naamveld om de mogelijke wijziging te zien. Selectie is gebaseerd op de isotopentoestand van de gekochte zware peptiden. In dit voorbeeld werden synthetische peptiden gebruikt die ofwel een zware Lysine (13C615N2-lysine) of een zware Arginine (13C615N4-arginine) aan het C-eindpunt droegen. Passende labels zijn: "Label:13C(6)15N(2) (C-term K)" en "Label:13C(6)15N(4) (C-term R)".
- Selecteer Instellingen| Overgang. Onder het tabblad Filter staan precursorkosten 2, 3, 4.
- Voeg peptiden in door Bewerken te selecteren| Invoegen| Peptiden.
- Vul de relevante velden in, waaronder de topologie-karakteristieke peptidesequentie en een eiwitnaam (bijv. "Chain–K63").
- Vouw elk peptide uit dat nu wordt weergegeven in het deelvenster Doelen. Ongewenste laadstatussen verwijderen. De voorkeursladingstoestand en botsingsenergie, die kunnen verschillen op basis van de gebruikte massaspectrometer, voor elk topologie-karakteristiek peptide is weergegeven in tabel 1.
- Voor elk topologie-karakteristiek peptide (behalve M1 waar de GG in de reeks is opgenomen) klikt u met de rechtermuisknop op de reeks en selecteert u Wijzigen. Voeg een GG toe als structurele wijziging door op het naamveld te klikken en <Alle... > voordat u "GlyGly (K) "selecteert.
- De isolatielijst Bestand exporteren| Exporteren| Isolatielijst, selecteert u het instrumenttype en stelt u het methodetype in op Standaard. Als u OK selecteert, wordt een prompt geopend om een *.csv bestand op te slaan dat kan worden gebruikt om een PRM-methode te maken.
- Maak een geplande inclusielijst op basis van een zware peptideplanningsrun die hier wordt uitgelegd met behulp van de open source Skyline-software.
- Maak een doellijst zoals beschreven in paragraaf 4.1.
- Importeer de planning in 3.1 door Bestand te selecteren| Importeren| Resultaten.
- Controleer de identificaties. Het zware signaal voor elk peptide is waarneembaar door op de massa voor elke zware peptidevermelding te klikken. De juiste herkenning van de piek wordt vaak automatisch bepaald, maar de software kan handmatige curatie vereisen door de piek te selecteren met klik en sleep onder de x-as.
- Bewaartijden die zijn geselecteerd voor de zware varianten worden ook toegepast op de lichte versies, waardoor een schema voor de PRM wordt gecreëerd. Het planningsvenster kan worden gewijzigd onder Instellingen| Peptide-instellingen met behulp van het tabblad Voorspelling door het tijdvenster tewijzigen.
- Een geplande opnamelijst kan nu worden geëxporteerd met Bestand| Exporteren| Isolatielijst en het selecteren van het juiste instrumenttype en het juiste instellingsmethodetype op Gepland.
- Analyseer de gegevens.
- Importeer de monsters op dezelfde manier als voor de analyse van de planningsrun in punt 4.2.
- Na de volledige invoer van alle monsters wordt curatie van overgangen aanbevolen. Dit is het proces waarbij overgangen met interferentie of slechte signaal-ruisverhoudingen worden verwijderd. Een voorbeeld van een chromatogram voor en na curatie is weergegeven in figuur 4.
- Gegevens kunnen nu worden geëxporteerd door met de rechtermuisknop op relevante grafieken te klikken en Gegevens kopiëren te selecteren of door Bestand te selecteren| Exporteren| Resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om het gebruik van een ubiquitinketenanalyse door PRM aan te tonen, werden drie cellijnen geselecteerd: een muismelanoomcellijn B16 en de twee gemeenschappelijke menselijke cellijnen A549 (adenocarcinomic alveolaire basale epitheelcellen) en HeLa (baarmoederhalskankercellen). Deze culturen groeiden tot de midexponentiële fase in geschikte media voordat ze vóór de oogst gedurende 4 uur met 0, 10 of 100 mM MG-132 werden behandeld. MG-132 is een proteasoomremmer die de afbraak van met alomtegenwoordige geconjugeerde eiwitten door het proteasoom14voorkomt. Gezien dit is het een geschikte testvoorwaarde om alomtegenwoordige ketenanalyse aan te tonen. De daaruit voortvloeiende toename van de K48-keten is te zien in figuur 3. Proteasoomremmerbehandeling veroorzaakte een toename van K48-ketens15.
Zoals beschreven in de inleiding voert PRM, in tegenstelling tot SRM of MRM, een volledige productsonscan uit na selectie van het precursorion. Hoewel dit betekent dat productionen niet hoeven te worden opgegeven voor de run, moeten ze nog steeds na de run worden samengesteld. Curatie is het proces waarbij overgangen die echt representatief zijn voor het beoogde peptide worden geselecteerd. Figuur 4 toont het productionenchromatogram voor K48 voor en na curatie. Productionen met een signaal met een inconsistent elutieprofiel waarschijnlijk als gevolg van interferentie werden verwijderd. Productionen met een lage intensiteit werden vervolgens verwijderd, aangezien de signaal-ruisverhouding minder gunstig is voor dergelijke overgangen. De optimale overgangen die tijdens de curatie worden geselecteerd, zullen gewoonlijk consistent zijn tussen experimenten en kunnen verschillen afhankelijk van de gebruikte massaspectrometer, chromatografische omstandigheden, analyse-instellingen en de biologische achtergrond van het monster. Voor elk onderzoek is dus een goede curatie van overgangen vereist. Er is ook een evenwicht nodig tussen het opnemen van meer overgangen en dus technische replica's en schonere gegevens voor kwantificering.
Typische productionchromatogrammen voor elk van de geïdentificeerde ubiquitinketentopologieën in dit experiment zijn weergegeven in figuur 5. K27 en K29 worden hier weggelaten omdat onder deze biologische omstandigheden het signaal onder detectie lag. Het elutieprofiel van K33, zoals hier getoond, was aanzienlijk breder dan algemeen zou worden aanvaard voor PRM-analyse. Alternatieve selectie van peptiden met betere elutieprofielen is echter niet mogelijk in ubiquitin ketenanalyse en op basis van dit profiel moet een interpretatie worden gemaakt. Indien K33 van bijzonder belang is, kunnen gewijzigde chromatografische omstandigheden de kwantificering van dit kettingtype verbeteren, maar waarschijnlijk ten nadele van andere kettingtypen.
Bij het ontwerpen van een PRM-experiment verdient het de voorkeur om het signaal van de productionen die worden gebruikt voor kwantificering te maximaliseren door het signaal-ruis te verhogen. De optimalisering van botsingsenergie (d.w.z. de energie die door de massaspectrometer wordt gebruikt om precursorpeptideionen aan productionen te fragmenteren) is een middel waarmee het signaal kan worden verbeterd16. Een botsingsenergiebereik van 14-28 werd toegepast op herhaalde injecties van één enkel monster met de resulterende waargenomen piekgebieden van K63 en M1 in figuur 6. Zoals te zien is, was voor K63 een hogere botsingsenergie van 26 optimaal, terwijl voor M1 een lagere energie van 18 ideaal was. De botsingsenergie voor elk topologie-karakteristiek peptide en een selectie van ongewijzigde ubiquitinefragmenten is weergegeven in tabel 1. Deze botsingsenergieën moeten mogelijk worden geoptimaliseerd op basis van de gebruikte massaspectrometer en fragmentatiemethode.
Figuur 1: Schematische weergave van de ubiquitin-conjugating cascade. Ubiquitin wordt eerst gebonden door een E1-enzym op een ATP-afhankelijke manier. De geactiveerde ubiquitine wordt vervolgens overgebracht naar een E2-enzym dat vervolgens wordt verbonden door een E3-ligase om de ubiquitin over te brengen naar het substraateiwit. Dit proces wordt meerdere keren herhaald totdat een alomtegenwoordige keten wordt gevormd op het substraateiwit. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Diagram met de afleiding van het ubiquitin topologie-karakteristieke peptide. Na tryptische vergisting wordt de upstream bindingsplaats afgeleid met de -GG C-terminal van de downstream ubiquitin bevestigd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Vergelijking van de K48-keten onder MG-132-behandeling voor een muiscellijn B16 en de twee menselijke cellijnen A459 en HeLa. In A459 leidden toenemende concentraties MG-132 tot stabilisatie van K48-ketens. Bij B16- en HeLa-cellen werd een toename waargenomen onder behandeling met 10 mM of 100 mM MG-132. De waargenomen afname van 10 mM tot 100 mM kan worden verklaard door de verhoogde gevoeligheid van B16- en HeLa-cellen voor MG-132, wat leidt tot celdood. Foutbalken tonen de standaardafwijking van de overgangen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Productionchromatogrammen van het M1 topologie-karakteristieke peptide voor en na curatie van overgangen voor interferentie of lage intensiteit. De retentietijd op de x-as wordt in minuten weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Typisch productionchromatogram van verschillende topologie-karakteristieke peptiden en twee niet-gemodificeerde ubiquitinepeptiden. De elutietijd in minuten en waargenomen massafout voor elk peptide wordt gerapporteerd boven de top van de relevante piek. Stippellijnen tonen ook het venster voor het bepalen van het piekgebied. De retentietijd op de x-as wordt in minuten weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: Waargenomen piekgebied voor K63 en M1 over een reeks genormaliseerde botsingsenergieën. De verschillende kleuren vertegenwoordigen de ionenintensiteit die door elke overgang wordt bijgedragen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Kettingtype | Topologie Karakteristiek Peptide | Laadstatus | Genormaliseerde botsingsenergie |
| K06 | MQIFVK[GG]TLTGK | 3 | 18 |
| K11 | TLTGK[GG]TITELVEPSDTIENVK | 3 | 18 |
| K27 | TITELVEPSDTIENVK[GG]AK | 3 | 18 |
| K29 | AK[GG]IQDK | 2 | 22 |
| K33 | IQDK[GG]EGIPPDQQR | 3 | 18 |
| K48 | LIFAGK[GG]QLEDGR | 3 | 24 |
| K63 | TLSDYNIQK[GG]ESTLHLVLR | 4 | 26 |
| M1 (lineair) | GGMQIFVK | 2 | 18 |
| Niet gewijzigd Ubqiuitin | ESTLHLVLR | 2 | 26 |
| Niet gewijzigd Ubqiuitin | TITELVEPSDTIENVK | 2 | 18 |
| Niet gewijzigd Ubqiuitin | TLSDYNIQK | 2 | 18 |
Tabel 1: Sequenties voor de menselijke ubiquitin topologie-karakteristieke peptiden, de meest waarneembare ladingstoestand en gunstige genormaliseerde botsingsenergie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analyse van de alomtegenwoordige toestand binnen een proteoom is van toenemend belang voor een breed scala aan biologische vragen. De beschrijving van de alomtegenwoordigheidstoestand van een monster moet zich niet alleen richten op het profiel van eiwitten die alomtegenwoordig zijn, maar ook op de topologie van een dergelijke alomtegenwoordigheid. De beoordeling van deze topologie door gerichte MS, zoals hier beschreven, speelt een rol in een breed scala aan biologische onderzoeken.
Het moet worden begrepen dat het hier geschetste protocol een globaal topologieprofiel biedt. Het gebruik van een bottom-up proteomics benadering maakt het mogelijk om peptiden te bepalen die alomtegenwoordig waren, waaronder ubiquitin peptiden. De observatie van de ubiquitinatie van ubiquitin peptiden maakt de bepaling van de ketentopologie mogelijk, maar de link met het doel van ubiquitin gaat verloren. De specifieke ketentopologie op een bepaald eiwit kan dus niet worden bepaald, maar er wordt een wereldwijd topologieprofiel afgeleid. De methode kan ook worden gecombineerd met een verrijkingsstrategie om doelgerichtere resultaten te behalen. Een dergelijke verrijking moet rekening houden met de ketenstabiliteit en de overvloed aan kettingen na verrijking. De detectie van de ketentopologie wordt beperkt door de zuiverheid die de verrijkingsstrategie biedt, omdat het niet mogelijk is om een alomtegenwoordige topologie die is gekoppeld aan een vervuilend eiwit te onderscheiden van degene die zijn gekoppeld aan het eiwit van belang. De cruciale stap in dit protocol, die een succesvolle analyse faciliteert, is het balanceren van het behoud van de ubiquitin-keten tijdens het verteren van het ubiquitine-eiwit. Dit is een uitdaging vanwege de neiging van kettingafbraak gekoppeld aan de weerstand van ubiquitin zelf tegen enzymatische spijsvertering. Verder zijn de toevoeging van een ondersteuningsmatrix en zorgvuldige overweging van MS-omstandigheden vereist gezien de minder gunstige aard van sommige van de topologie-karakteristieke peptiden aan vloeibare chromatografische gekoppelde massaspectrometrische analyse.
Hoewel we in dit protocol een middel hebben geschetst waarmee alle ubiquitin-ketentypen gelijktijdig kunnen worden beoordeeld, is het ook mogelijk om verschillende aspecten van het protocol aan te passen op basis van de specifieke ketentopologie van belang. Het manipuleren van de chromatografische omstandigheden of het variëren van de zware peptideconcentraties kan de nauwkeurigheid van een onderzoek verhogen, de resultaten voor een bepaalde ketentopologie verbeteren en het onderzoek afstemmen op de voorgestelde biologische vraag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.
Acknowledgments
De auteurs willen Céline Jeanty bedanken voor haar hulp bij het maken van cellulaire pellets met behandeling van MG-132 zoals beschreven in de representatieve resultaten en Elise Mommaerts voor haar levering van E. coli pellets die in het protocol worden gebruikt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (ACN) | Merck | 100029 | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | Fluka | 9830 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 16 | |
| Chloroacetamide (CAA) | Sigma | 22790 | |
| Eppendorf LoBind | Eppendorf | 22431081 | |
| Formic acid (FA) | Thermo Fisher Scientific | 85178 | |
| Heavy Peptides | JPT Peptide Technologies | ||
| HPLC | Dionex | Ulitimate 3000 | |
| LC Column | Thermo Fisher Scientific | 160321 | |
| Lys C | Wako | 125-05061 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | Q-Exactive Plus | |
| N-ethylmaleimide (NEM) | ACROS Organics | 156100050 | |
| Positive Control Chain K48 | Boston Biochem | UC-240 | |
| Positive Control Chain K63 | Boston Biochem | UC-340-100 | |
| Positive Control Chain M1 | Boston Biochem | UC-710B-025 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S5881 | |
| Sonifier | Branson sonifier | SFX 150 | |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigam | T6508 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Thermo Fisher Scientific | 77720 | |
| Trypsin | Promega | V1511A | |
| Urea | Sigma | 51456 | |
| Waters μElution C18 plates | Waters | 186002318 |
References
- Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90 (2011).
- Goldstein, G., et al. Isolation of a polypeptide that has lymphocyte-differentiating properties and is probably represented universally in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (1), 11-15 (1975).
- Glickman, M. H., Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: Destruction for the sake of construction. Physiol. Rev. 82, 373-428 (2002).
- Pickart, C. M., Eddins, M. J.
- Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A.
- Komander, D., Rape, M.
- Mattern, M., Sutherland, J., Kadimisetty, K., Barrio, R., Rodriguez, M. S. Using Ubiquitin Binders to Decipher the Ubiquitin Code. Trends in Biochemical Sciences. 44 (7), 599-615 (2019).
- Newton, K., et al. Ubiquitin chain editing revealed by polyubiquitin linkage-specific antibodies. Cell. 134 (4), 668-678 (2008).
- Spence, J., et al. Cell cycle-regulated modification of the ribosome by a variant multiubiquitin chain. Cell. 102 (1), 67-76 (2000).
- Borràs, E., Sabidó, E. What is targeted proteomics? A concise revision of targeted acquisition and targeted data analysis in mass spectrometry. PROTEOMICS. 17 (17-18), (2017).
- Lesur, A., Domon, B. Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics. PROTEOMICS. 15 (5-6), 880-890 (2015).
- Longworth, J., Dittmar, G. Assessment of Ubiquitin Chain Topology by Targeted Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1977, Clifton, N.J. 25-34 (2019).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
- Tawa, N. E., Odessey, R., Goldberg, A. L. Inhibitors of the proteasome reduce the accelerated proteolysis in atrophying rat skeletal muscles. The Journal of Clinical Investigation. 100 (1), 197-203 (1997).
- Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
- MacLean, B., et al. Effect of Collision Energy Optimization on the Measurement of Peptides by Selected Reaction Monitoring (SRM) Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (24), 10116-10124 (2010).
