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Biochemistry

समानांतर प्रतिक्रिया निगरानी द्वारा सर्वव्यापकइन चेन विश्लेषण

Published: June 17, 2020 doi: 10.3791/60702
Automatic Translation
1, 1, 1
1Quantitative Biology Unit, Luxembourg Institute of Health

Summary

यह विधि सर्वव्यापक श्रृंखला टोपोलॉजी में वैश्विक परिवर्तनों के आकलन का वर्णन करती है। मूल्यांकन एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित लक्षित प्रोटेओमिक्स दृष्टिकोण के आवेदन द्वारा किया जाता है।

Abstract

एक प्रोटेम के भीतर सर्वव्यापी श्रृंखला topologies के वैश्विक प्रोफ़ाइल का आकलन जैविक सवालों की एक विस्तृत श्रृंखला का जवाब देने के लिए ब्याज की है । यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल एक श्रृंखला में शामिल सर्वव्यापी के ट्राइप्टिक पाचन के बाद छोड़े गए डी-ग्लाइसिन (-जीजी) संशोधन का लाभ उठाता है। इन टोपोलॉजी-विशेषता पेप्टाइड्स को निर्धारित करके प्रत्येक सर्वव्यापक श्रृंखला टोपोलॉजी की सापेक्ष बहुतायत निर्धारित की जा सकती है। एक समानांतर प्रतिक्रिया निगरानी प्रयोग द्वारा इन पेप्टाइड्स की मात्रा निर्धारित करने के लिए आवश्यक कदम सर्वव्यापक श्रृंखलाओं के स्थिरीकरण को ध्यान में रखते हुए सूचित कर रहे हैं । उचित मास स्पेक्ट्रोमीटर सेटअप और डेटा विश्लेषण वर्कफ़्लो के साथ भारी नियंत्रण, सेल लाइसिस और पाचन की तैयारी का वर्णन किया गया है। सर्वव्यापी टोपोलॉजी में क्षोभ के साथ सेट एक उदाहरण डेटा प्रस्तुत किया जाता है, जिसमें प्रोटोकॉल का अनुकूलन परिणामों को कैसे प्रभावित कर सकता है, इसके उदाहरण भी दिए जाते हैं। उल्लिखित चरणों का पालन करके, एक उपयोगकर्ता अपने जैविक संदर्भ के भीतर सर्वव्यापी टोपोलॉजी परिदृश्य का वैश्विक आकलन करने में सक्षम होगा।

Introduction

प्रोटीन समारोह और स्थिरता के करीब विनियमन सर्वोपरि महत्व का है, क्योंकि वे जीव विज्ञान के फेनोटाइपिक नियंत्रण के प्रमुख चालक हैं । प्रोटीन का कार्य दो घटकों से बनाया जाता है: इसका आंतरिक पॉलीपेप्टाइड अनुक्रम और कोई पोस्टट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएमएस)। ग्लाइकोसिलेशन, फॉस्फोरिलेशन, एसिटिलेशन, और मिथाइलेशन1सहित विभिन्न रासायनिक पीटीएम की पहचान की गई है। 1975 में, गोल्डस्टीन एट अल2 ने एक छोटे प्रोटीन की पहचान की और इसे सर्वव्यापी प्रकृति के कारण सर्वव्यापी नाम दिया। प्रोटीन क्षरण3में सर्वव्यापी महत्वपूर्ण पाया गया . हालांकि, तब से यह स्थापित किया गया है कि एक संकेत अणु के रूप में सर्वव्यापकता का कार्य प्रोटीन स्थिरता के नियमन से कहीं आगे तक फैली हुई है । सर्वव्यापी संकेत प्रोटीन स्थिरीकरण, ऑटोफैगी, सेल चक्र नियंत्रण, और प्रोटीन तस्करी4जैसे अन्य जैविक कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला में शामिल है।

जबकि अन्य पीटीएम आम तौर पर बाइनरी होते हैं (यानी, प्रोटीन को किसी दिए गए साइट के लिए संशोधित या असंशोधित छोड़ दिया जाता है), सर्वव्यापी प्रोटीन को मोनोमर या पॉलीमेरिक चेन दोनों के रूप में संशोधित कर सकता है, जिसमें संलग्न सर्वव्यापकता ही सर्वव्यापी है। इसके अलावा, यह पॉलीफाउंपनेशन चेन कई टोपोलोजी में विकसित हो सकती है, जिसमें पिछले सर्वव्यापकता के सर्वव्यापकता के साथ आठ लिंकेज साइटों में से एक5,6से जुड़ा हुआ है। सर्वव्यापकता को एक मल्टीस्टेप एंजाइमैजी प्रक्रिया(चित्रा 1)द्वारा स्थानांतरित किया जाता है जहां सर्वव्यापकता का सी-टर्मिनस इसके सात लिसिन अवशेषों में से एक (K06, से जुड़ा हुआ है K11, K27, K29, K33, K48, या K63) या पिछले सर्वव्यापकता के एन-टर्मिनल (M1 या रैखिक सर्वव्यापकता के रूप में संदर्भित)5,6. यह श्रृंखला टोपोलॉजी संशोधन के तहत प्रोटीन के भाग्य के लिए महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, K48 या K11 से जुड़ी श्रृंखला के साथ संशोधन प्रोटेसोम में संशोधित प्रोटीन की गिरावट की ओर जाता है, जबकि एनएफ-केबी सिग्नलिंग की सक्रियता के लिए एक रैखिक श्रृंखला आवश्यक है। इस प्रकार, इन श्रृंखला topologies के सापेक्ष वितरण जैविक सवालों की एक विस्तृत विविधता के लिए प्रासंगिक है।

मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) का उपयोग सर्वव्यापी श्रृंखला टोपोलॉजी विश्लेषण के लिए विशेष लाभ का है क्योंकि यह एंटीबॉडी-आधारित या आत्मीयता आधारित बातचीत7,8पर निर्भर नहीं है, जिनमें से कई में सीमित विशिष्टता है और विभिन्न श्रृंखला प्रकारों के बीच अंतर नहीं है। एक अलग पता लगाने की संभावना आनुवंशिक रूप से संशोधित सर्वव्यापकता म्यूटेंट का उपयोग कर रही है। यहां आर्जिनिन के लिए एक विशिष्ट lysine का आदान-प्रदान किया जाता है, जो सर्वव्यापी द्वारा संशोधन का समर्थन नहीं कर सकता । सब्सट्रेट प्रोटीन पर सर्वव्यापकता श्रृंखला निर्माण की कमी को तब एक विशिष्ट टोपोलॉजी 9 के लिए साक्ष्य के रूप में समझाजाताहै ।

सर्वापित प्रोटीन की एमएस-आधारित पहचान इस तथ्य पर आधारित है कि सर्वव्यापकता के सी-टर्मिनस में स्थिति 74 में एक आर्जिनिन अवशेष होता है जो एमएस विश्लेषण के लिए नमूनों की प्रोटियोलिटिक तैयारी के दौरान ट्राइपसिन द्वारा मान्यता प्राप्त है, सी-टर्मिनल डबल ग्लाइसिन को अलग करता है। यह ग्लाइगली (-जीजी) सब्सट्रेट प्रोटीन के lysine अवशेषों के ε-अमीनो समूह से जुड़ा रहता है। सर्वव्यापकता टोपोलॉजी विश्लेषण के लिए, संशोधन सर्वव्यापी के सात lysine अवशेषों में से एक पर होता है। यह सात प्रमुख पेप्टाइड्स का एक सेट बनाता है जो एक lysine अवशेष ले जाता है जिसे जीजी द्वारा संशोधित किया जाता है, जो प्रत्येक टोपोलॉजी(चित्र 2)के लिए विशिष्ट है। उदाहरण के लिए, K06 टोपोलॉजी के साथ, अमीनो एसिड अनुक्रम पर स्थिति 6 पर lysine इस lysine में जोड़ा ११४ डीए के एक-GG संशोधन के साथ ट्रिप्टिक पाचन से संरक्षित किया जाएगा ।

एमएस द्वारा विशिष्ट पूर्व निर्धारित पेप्टाइड्स की पहचान को लक्षित प्रोटेओमिक्स, या अधिक विशेष रूप से लक्षित पेप्टाइड अधिग्रहण10के रूप में जाना जाता है। उपयोग किए जा रहे द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर के प्रदर्शन के आधार पर दो तरीके विकसित किए गए हैं। ये चयनित रिएक्शन मॉनिटरिंग (एसआरएम) हैं, जिन्हें मल्टीपल रिएक्शन मॉनिटरिंग (एमआरएम) और पैरलल रिएक्शन मॉनिटरिंग (पीआरएम) भी कहा जाता है । एसआरएम में अग्रदूत एम/जेड और उत्पाद आयन एम/जेड से मिलकर संक्रमण का चयन शामिल है । इसके विपरीत, पीआरएम को केवल अग्रदूत एम/जेड की आवश्यकता होती है। चयन के बाद, उत्पाद आयनों का पूरा सर्वेक्षण स्कैन किया जाता है। इसका लाभ यह है कि माप11से पहले विशिष्ट द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर पर मात्रा के लिए उपयुक्त उत्पाद आयनों का कोई चयन आवश्यक नहीं है । एसआरएम और पीआरएम दोनों, साधन के आधार पर, निर्धारित किया जा सकता है । शेड्यूलिंग एक समय खिड़की को निर्दिष्ट करने का अभ्यास है जिसके दौरान विश्लेषण के लिए एक विशेष आयन को शामिल किया जाएगा, क्योंकि पेप्टाइड्स क्रोमेग्राफिक सिस्टम से परिभाषित प्रतिधारण समय पर eluting हैं । किसी भी समय पूछताछ की जा रही आयनों की संख्या को कम करने से उस समय निर्धारित आयनों की पूछताछ की आवृत्ति बढ़ जाती है, इस प्रकार डेटा सटीकता में सुधार होता है ।

सामान्य तौर पर, सर्वव्यापकता टोपोलॉजी के लिए लक्षित प्रोटेओमिक्स का अनुप्रयोग किसी भी अन्य लक्षित प्रोटेओमिक्स प्रयोग के समान है। हालांकि, दो प्रमुख मतभेद महत्वपूर्ण हैं: पहला, सर्वव्यापक श्रृंखलाओं की स्थिरता पर विचार किया जाना चाहिए । कई शक्तिशाली डीव्यवसुत एंजाइम (डीयूबी) हैं जो तेजी से कोशिका लाइसिस पर जंजीरों को नीचा दिखाते हैं। सर्वव्यापकता-विशिष्ट प्रोटीज दो श्रेणियों में आते हैं, थिओएस्टेरेस और मेटललोप्रोटीज। अधिकांश सर्वव्यापकता-हाइड्रोलेस थिओएस्टेरेस हैं और अपने सक्रिय केंद्र में एक सिस्टीन अवशेष ले जाते हैं। इस सिस्टीन अवशेषों को एल्किलेट करके, उन्हें निष्क्रिय किया जा सकता है। जैसे, एन-एथिलमलीमाइड (एनईएम) जैसे एल्किलाटिंग एजेंटों वाले सर्वव्यापी स्थिरीकरण बफ़र्स का उपयोग, और अत्यधिक वैज्ञानिक रसायन, और नमूनों को ठंडा रखना एक सफल विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है। दूसरा, अन्य लक्षित प्रयोगों के विपरीत, पेप्टाइड विकल्प तय किया गया है। एक विशिष्ट लक्षित प्रयोग में, अच्छे क्रोमेटोग्राफिक और आयनीकरण प्रदर्शन के लिए एक प्रोटेटीपिक पेप्टाइड का चयन किया जा सकता है। कुछ टोपोलॉजी-विशेषता पेप्टाइड्स जैसे K48 के लिए ये गुण अच्छे हैं, जबकि दूसरों के लिए, वे कम वांछनीय हैं। उदाहरण के लिए, एक विशिष्ट रिवर्स-फेज सेटअप में K33 क्रोमेटोग्राफी एक विस्तारित एल्यूशन प्रोफाइल के गठन के कारण खराब है, और K27 पेप्टाइड के खराब आयनीकरण गुण एमएस12द्वारा इसकी दृश्यता को कम करते हैं।

इस प्रोटोकॉल में, हम पीआरएम द्वारा जैविक नमूने के सर्वव्यापक टोपोलॉजी मूल्यांकन करने का तरीका बताते हैं। प्रक्रिया के लिए उदाहरण डेटा कई अलग-अलग सेल प्रकारों में एमजी-132 अवरोधक उपचार का उपयोग करके प्रोटेसोम के एक क्षोभ का उपयोग करके प्रस्तुत किए जाते हैं।

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Protocol

1. एक भारी पेप्टाइड मानक की तैयारी

  1. आपूर्तिकर्ता और खरीदे गए भारी पेप्टाइड्स की गुणवत्ता के आधार पर, भारी पेप्टाइड्स को पतला करने की आवश्यकता होगी। इस प्रोटोकॉल ने टेबल 1में रिपोर्ट किए गए पेप्टाइड दृश्यों का उपयोग किया, जिसमें सी-टर्मिनल अमीनो एसिड को Lysine(13सी6 15एन2-lysine) या आर्जिनाइन(13सी6 15एन4-arginine) में संशोधित किया गया था।
    1. 10 माइक्रोन पर प्रत्येक पेप्टाइड के साथ पेप्टाइड मिश्रण बनाने के लिए 50% एसीटोनिट्रील (एसीएन) के साथ मिश्रण को कमजोर करते हुए भारी पेप्टाइड मिलाएं।
    2. पेप्टाइड मिक्स के एलिकोट्स बनाएं और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. नमूना तैयार करना

  1. सैंपल लाइसिस
    नोट: नमूना तैयार करने के दौरान सर्वव्यापी श्रृंखलाओं की स्थिरता पर विचार किया जाना चाहिए। जैविक नमूनों और बफ़र्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा रखें और जितनी जल्दी हो सके सर्वव्यापी स्थिरीकरण बफर में नमूने जोड़ें।
    1. पानी में 1 एम एनएच4एचसीओ3 (अमोनियम बाइकार्बोनेट) का समाधान तैयार करें और 1 एम नाओएच का उपयोग करके पीएच को 8 में समायोजित करें।
    2. पानी में 200 एमएम एन-एथिलमलेमाइड (एनईएम) का घोल तैयार करें।
    3. सर्वव्यापकता स्थिरीकरण बफर तैयार करें 50 एमएम एनएच4एचसीओ3 /10एमएम एनईएम में 8 एम यूरिया का उपयोग करते हुए सर्वापिति स्थिरीकरण बफर को हर बार हौसले से तैयार किया जाना चाहिए।
      नोट: यूरिया के साथ संतृप्त समाधान में पानी के विस्तार को देखते हुए 8 मीटर यूरिया के 5 एमएल समाधान के लिए पानी के विस्तार को देखते हुए 5 एमएल से काफी कम पानी की आवश्यकता होगी।
      सावधानी- यूरिया के उच्च तापमान पर पॉलीयूरिया बनाने की प्रवृत्ति के कारण 50 डिग्री सेल्सियस से ऊपर बफर तैयार न करें।
    4. जैविक नमूने को सर्वव्यापकता स्थिरीकरण बफर में जांच करने के लिए फिर से खर्च करें जिसका लक्ष्य प्रोटीन के 0.5 माइक्रोग्राम/माइक्रोन के लिए है और नमूने के लिए उपयुक्त विधि के साथ कोशिकाओं को lyse करना है। एक सोनीफिकेशन विधि जिसमें एसएफएक्स 150 ब्रैनसन सोनिफायर के साथ तीन 10 एस दालों से मिलकर प्रत्येक पल्स के बीच बर्फ पर 10 एस ब्रेक के साथ 70% तीव्रता पर सेट किया गया था, इस प्रोटोकॉल में सेल लाइनों के लिए उपयोग किया गया था।
    5. एक टेबलटॉप अपकेंद्रित्र में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 18,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज नमूना।
    6. एक ताजा कम प्रोटीन बाध्यकारी माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में सुपरनेट ट्रांसफर करें। यदि आवश्यक हो तो इस बिंदु पर नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. नमूना और नियंत्रण की तैयारी
    1. यदि नमूने जमे हुए हैं, तो यूरिया को तेजी से भंग करने के लिए गल जाते समय (उदाहरण के लिए, थर्मोमिक्सर के साथ) मिलाएं।
      सावधानी: उच्च तापमान पर पॉलीयूरिया बनाने के लिए यूरिया की प्रवृत्ति के कारण 50 डिग्री सेल्सियस से ऊपर के तापमान का उपयोग न करें।
    2. एक टेबलटॉप अपकेंद्रित्र में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 18,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज नमूना।
    3. एक ताजा कम बांध माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब के लिए नमूना के 20 माइक्रोग्राम हस्तांतरण और सर्वव्यापकता स्थिरीकरण बफर के साथ 50 μL करने के लिए मात्रा समायोजित करें।
    4. सर्वव्यापकता स्थिरीकरण बफर (50 माइक्रोन) की सामान्य मात्रा का उपयोग करके एक नकारात्मक नियंत्रण बनाएं। इस नमूने में, प्रत्येक पेप्टाइड का कोई हल्का संस्करण मौजूद नहीं होना चाहिए, जिससे स्पाइक-इन हैवी पेप्टाइड्स से उत्पन्न होने वाले किसी भी हल्के संदूषण का अवलोकन हो सके। इस नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग धारा 3.1 में वर्णित पीआरएम के प्रतिधारण समय निर्धारण के लिए भी किया गया था।
    5. सर्वव्यापी स्थिरीकरण बफर और सर्वव्यापकता स्थिरीकरण बफर (50 माइक्रोल) की सामान्यीकृत मात्रा में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध श्रृंखला प्रकारों के अलावा एक सकारात्मक नियंत्रण भी बनाया गया था। आमतौर पर, K63, K48, और M1 उपलब्ध हैं। प्रतिनिधि परिणामों में K48, K63, और M1 के 20 एनजी का उपयोग किया गया।
  3. कमी, एल्किलेशन, और पाचन
    1. पानी में 50 एमएम अमोनियम बाइकार्बोनेट (एनएच4एचसीओ3)का घोल तैयार करें और सैंपल को 1 एम नाओह के साथ पीएच = 8 में एडजस्ट करें।
    2. एलबी शोरबा में उगाई जाने वाली ई कोलाई की संस्कृति को एक गोली बनाने के लिए 5 मिनट के लिए 5,000 x g की संस्कृति थी, जिसे तब 5 μg/μL पर सर्वव्यापंकण स्थिरीकरण बफर में पुनर्प्रापन्न होने से पहले पीबीएस के साथ 2x धोया गया था।
    3. प्रत्येक नमूने और नियंत्रण के लिए ई. कोलाई lysate के 1 μg जोड़ें। यह प्रोटोकॉल ई. कोलाई (DH10B) का उपयोग करता है, लेकिन सर्वव्यापी के बिना किसी भी जटिल lysate का उपयोग किया जा सकता है। ध्यान दें कि सर्वव्यापी सभी यूकेरियोट्स के लिए आम है।
      नोट: ई कोलाई lysate मैट्रिक्स का उपयोग प्लास्टिकवेयर के लिए गैर विशिष्ट आसंजन के कारण पेप्टाइड्स के नुकसान को कम कर देता है । यह विशेष रूप से सीमित प्रोटीन सामग्री वाले नकारात्मक नियंत्रण या नमूनों में ध्यान देने योग्य है और K6312के अवलोकन पर इसका मजबूत प्रभाव पड़ता है ।
    4. एमएस ग्रेड वॉटर (डीटीटी एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है) में 500 mm tris (2-carboxyethyl) फॉस्फिन (TCEP) का समाधान तैयार करें।
    5. 50 mm की अंतिम एकाग्रता के लिए TCEP के अलावा द्वारा नमूनों और नियंत्रण को कम करें। भंवर कमरे के तापमान (आर टी) पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेटिंग से पहले संक्षेप में । अगर डीटीटी का इस्तेमाल किया जाए तो तापमान को 50 डिग्री सेल्सियस तक ऊंचा करना होगा।
      सावधानी: उच्च तापमान पर पॉलीयूरिया बनाने के लिए यूरिया की प्रवृत्ति के कारण 50 डिग्री सेल्सियस से ऊपर के तापमान का उपयोग न करें।
    6. एनएच4एचसीओ3में 550 एमएम क्लोरोसेटामाइड (सीएए) का घोल तैयार करें। अंधेरे में स्टोर करें।
    7. 55 mm की अंतिम एकाग्रता के लिए सीएए जोड़कर नमूनों और नियंत्रणों को एल्किलेट करें। भंवर संक्षेप में अंधेरे में आरटी में 20 मिनट के लिए इनक्यूबेटिंग से पहले ।
      नोट: सीएए का उपयोग iodoacetamide के बजाय कटौती एजेंट के रूप में किया जाता है ताकि एक lysine अवशेषों पर डबल कार्बामिडोमेथाइल संशोधन (114.0429) की संभावना को कम किया जा सके- जीजी संशोधन (114.0429)13।
    8. प्रोटीन सामग्री के लिए 1:25 (w/w) अनुपात में नमूनों में एंडोपेप्टिडेस LysC जोड़ें । 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
    9. 50 m NH4HCO3 पीएच = 8 (1:5 v/v) के 200 माइक्रोन के साथ नमूनों और नियंत्रण को पतला करें।
    10. प्रोटीन सामग्री के लिए 1:25 w/w अनुपात में नमूनों में ट्रिपसिन जोड़ें । 37 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
    11. प्रत्येक नमूने और नियंत्रण नमूने के लिए एक 1:10 अनुपात v/v पर एमएस ग्रेड पानी में 10% formic एसिड (एफए) समाधान जोड़ें । सी18 सफाई से पहले पीएच & 3 है और जरूरत पड़ने पर अधिक फॉर्मिक एसिड जोड़ें।
    12. प्रत्येक नमूने और नियंत्रण के लिए धारा 1 में बनाए गए भारी पेप्टाइड मानक का 0.5 माइक्रोल जोड़ें।
  4. पेप्टाइड सफाई
    1. कई निर्माता सी18 सफाई टिप्स या प्लेटें प्रदान करते हैं। उपयोग किए गए उत्पाद के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें, और एमएस विश्लेषण के लिए तैयार वैक्यूम सेंट्रलाइज में सूखे एल्यूटेड पेप्टाइड्स।

3. एलसी-एमएस/एमएस द्वारा विश्लेषण

  1. एक अनिर्धारित फैशन में भारी पेप्टाइड मानक पर प्रारंभिक पीआरएम विश्लेषण निष्पादित करें।
    1. एमएस लोडिंग बफर 2% ACN/0.05% ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड (टीएफए) के 10 माइक्रोल में सूखे नमूनों को फिर से खर्च करें।
    2. एक एचपीएलसी को रिवर्स-फेज सी18 एनालिटिकल कॉलम (75 माइक्रोन x 15 सेमी, 2 माइक्रोन 100 Å C18 मोतियों) से लैस करें जो नैनोफ्लो एमएस के लिए डिज़ाइन किया गया है। फॉर्म रैखिक ग्रेडिएंट्स एमएस ग्रेड पानी का आदान-प्रदान करते हैं जो एसीएन युक्त एसीएन के साथ 0.1% एफए के साथ पूरक होते हैं। विश्लेषणात्मक स्तंभ के जीवन को बनाए रखने के लिए एक बलि जाल कॉलम (75 माइक्रोन x 2 सेमी, 3 माइक्रोन, 100 Å C18 मोती) का उपयोग यहां किया गया था लेकिन इसकी आवश्यकता नहीं है।
    3. एक उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमीटर पर एक नैनो-ईएसआई स्रोत के लिए विश्लेषणात्मक कॉलम के उत्पादन को जोड़ा।
    4. बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर के लिए एक उपयुक्त लक्षित प्रोटेओमिक्स विधि का उपयोग करें। उदाहरण के लिए, क्यू-एक्सिवील प्लस टू-प्रयोग विधि पर, पूर्ण एमएस और पीआरएम प्रयोग के बीच चक्र। पूर्ण एमएस प्रयोग के लिए, अधिकतम आईटी के रूप में 1e6 और 240 एमएस के एजीसी लक्ष्य के साथ 120,000 का संकल्प इस्तेमाल किया गया था। पीआरएम प्रयोग के लिए, एक ही एजीसी लक्ष्य और अधिकतम आईटी 60,000 के कम संकल्प और 1.2 मीटर/
    5. एचपीएलसी ऑटोसंप्लर का उपयोग करके विश्लेषणात्मक कॉलम पर नकारात्मक नियंत्रण के 200 एनजी इंजेक्ट करें। विश्लेषणात्मक कॉलम पर नमूने के लिए एक रैखिक ढाल लागू करें जो ~ 45 मिनट की अवधि में एसीएन एकाग्रता को 2-25% से बढ़ाता है।
      नोट: ठेठ सर्वव्यापकता टोपोलॉजी-विशेषता पेप्टाइड्स की कम हाइड्रोफिलिक प्रकृति के कारण प्रोटेओमिक्स के लिए 25% एसीएन एकाग्रता सामान्य से कम है। यदि अन्य पेप्टाइड्स की मात्रा निर्धारित की जानी है, तो एक उच्च एसीएन एकाग्रता अच्छे लक्ष्य अलगाव को प्राप्त करने के लिए वांछित हो सकती है।
    6. एक अनुसूचित समावेश सूची बनाने के लिए धारा 4.2 में वर्णित शेड्यूलिंग रन के परिणामों का विश्लेषण करें।
  2. नमूनों का विश्लेषण
    1. धारा 4.2 में बनाई गई अनुसूचित समावेश सूची के उपयोग के अलावा 3.1 में शेड्यूलिंग के लिए वर्णित शेष नमूनों को चलाएं।
      नोट: एक खाली सकारात्मक नियंत्रण के बाद चलाया जाना चाहिए सुनिश्चित करने के लिए पिछले रन से कोई लेवर बाद के नमूनों में पता लगाया जा रहा है ।

4. सॉफ्टवेयर विश्लेषण

  1. उपयोग किए गए एमएस के लिए उपयुक्त स्वरूपण की एक समावेश सूची बनाएं। इस प्रोटोकॉल ने ओपन सोर्स सॉफ्टवेयर स्काईलाइन (संस्करण 19.1.0.193) (https://skyline.ms) का उपयोग किया, जो अच्छी तरह से प्रलेखित समर्थन और मदद प्रदान करता है। निर्यात अलगाव सूची सुविधा का उपयोग कर कई बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर के लिए एक समावेश सूची बनाई जा सकती है।
    1. एक नया क्षितिज दस्तावेज़ खोलें।
    2. भारी टोपोलॉजी-विशेषता पेप्टाइड्स के लिए उपयुक्त के रूप में भारी आइसोटोप संशोधनों का चयन करें। सेटिंग में| मॉडिफिकेशन टैब के तहत पेप्टाइड सेटिंग, संभावित संशोधन देखने के लिए नाम फ़ील्ड पर क्लिक करें. चयन खरीदे गए भारी पेप्टाइड्स की आइसोटोपिक स्थिति पर आधारित है। इस उदाहरण में, सी-टर्मिनस में या तो भारी Lysine(13सी615एन2-lysine) या एक भारी आर्जिनिन(13सी615एन4-arginine) ले जाने वाले सिंथेटिक पेप्टाइड्स का उपयोग किया गया था। उपयुक्त लेबल होगा: "लेबल: 13C (6) 15N (2) (सी-टर्म कश्मीर)" और "लेबल:13C (6) 15N (4) (सी-टर्म आर)" ।
    3. सेटिंग का चयन करें| संक्रमण। फ़िल्टर टैब के अंतर्गत अग्रदूत शुल्क 2, 3, 4शामिल हैं .
    4. एडिट चुनकर पेप्टाइड्स डालें| डालें| पेप्टाइड्स।
    5. टोपोलॉजी-विशेषता पेप्टाइड अनुक्रम और एक प्रोटीन नाम (उदाहरण के लिए, "चेन-K63") सहित प्रासंगिक क्षेत्रों में भरें।
    6. अब लक्ष्य पैनल में दिखाए गए प्रत्येक पेप्टाइड का विस्तार करें। अवांछित प्रभारी राज्यों को हटाएं। प्रत्येक टोपोलॉजी-विशेषता पेप्टाइड के लिए उपयोग किए जाने वाले बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर के आधार पर भिन्न हो सकती है, पसंदीदा प्रभारी राज्य और टकराव ऊर्जा तालिका 1में दिखाई जाती है।
    7. प्रत्येक टोपोलॉजी-विशेषता पेप्टाइड के लिए (एम 1 को छोड़कर जहां जीजी अनुक्रम में शामिल है) अनुक्रम पर सही क्लिक करें और संशोधित का चयन करें। नाम क्षेत्र पर क्लिक करके और चयन और लेफ्टिनेंट;सभी को दिखाएंद्वारा एक संरचनात्मक संशोधन के रूप में एक GG जोड़ें ... "ग्लागली (कश्मीर)का चयन करने से पहले।
    8. आइसोलेशन लिस्ट फाइल का निर्यात करें| निर्यात| अलगाव सूची,साधन प्रकार का चयन करें, और विधि प्रकार को मानक पर सेट करें। ओके का चयन करने से एक * .csv फ़ाइल को बचाने का संकेत खुलेगा जिसका उपयोग पीआरएम विधि बनाने के लिए किया जा सकता है।
  2. ओपन सोर्स स्काईलाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके यहां समझाए गए भारी पेप्टाइड शेड्यूलिंग रन के आधार पर एक अनुसूचित समावेश सूची बनाएं।
    1. धारा 4.1 में वर्णित लक्ष्य सूची बनाएं।
    2. फ़ाइल का चयन करके शेड्यूलिंग 3.1 में चलाएं| आयात| परिणाम।
    3. पहचान की समीक्षा करें। प्रत्येक पेप्टाइड के लिए भारी संकेत प्रत्येक भारी पेप्टाइड प्रविष्टि के लिए द्रव्यमान पर क्लिक करके नमूदार है। चोटी की सही मान्यता अक्सर स्वचालित रूप से निर्धारित की जाती है, लेकिन सॉफ्टवेयर को एक्स-एक्सिस के नीचे क्लिक और ड्रैग का उपयोग करके चोटी का चयन करके मैनुअल क्यूरेशन की आवश्यकता हो सकती है।
    4. भारी वेरिएंट के लिए चुने गए प्रतिधारण समय को प्रकाश संस्करणों पर भी लागू किया जाता है, इस प्रकार पीआरएम के लिए एक कार्यक्रम बनाता है। सेटिंग विंडो को सेटिंग के तहत संशोधित किया जा सकता है| पेप्टाइड सेटिंग्स भविष्यवाणी टैब का उपयोग कर, टाइम विंडोबदलकर ।
    5. अब फ़ाइल का उपयोग करके एक अनुसूचित समावेशन सूची का निर्यात किया जा सकता है| निर्यात| आइसोलेशन सूची और उपयुक्त साधन प्रकार का चयन और अनुसूचितकरने के लिए विधि प्रकार की स्थापना ।
  3. डेटा का विश्लेषण करें।
    1. धारा 4.2 में शेड्यूलिंग रन विश्लेषण के लिए नमूनों को उसी तरीके से आयात करें।
    2. सभी नमूनों के पूर्ण आयात के बाद, संक्रमण के क्यूरेशन की सिफारिश की जाती है। यह वह प्रक्रिया है जिसके द्वारा हस्तक्षेप या खराब सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ संक्रमण को हटा दिया जाता है। क्यूरेशन से पहले और बाद में क्रोमेटोग्राम का एक उदाहरण चित्र 4 में दिखाया गयाहै ।
    3. डेटा को अब या तो प्रासंगिक रेखांकन पर सही क्लिक करके और कॉपी डेटा का चयन करके या फ़ाइल का चयन करके निर्यात किया जा सकता है| निर्यात| परिणाम।

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Representative Results

पीआरएम द्वारा सर्वव्यापकता श्रृंखला विश्लेषण के उपयोग को प्रदर्शित करने के लिए, तीन सेल लाइनों का चयन किया गया: एक माउस मेलानोमा सेल लाइन बी 16, और दो आम मानव सेल लाइनें A549 (एडेनोकारिनोमिक अल्वेलर एपिलथेलियल कोशिकाएं) और हेला (गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर कोशिकाएं)। फसल से पहले 4 घंटे के लिए 0, 10, या 100 MM एमजी-132 के साथ इलाज किए जाने से पहले ये संस्कृतियां उपयुक्त मीडिया में मिडएक्सपोनेंशियल चरण में बढ़ीं। एमजी-132 एक प्रोटीसोम अवरोधक है जो प्रोटेसोम14द्वारा सर्वव्यापी-संयुग्मित प्रोटीन के क्षरण को रोकता है। इस तरह को देखते हुए, यह सर्वव्यापक श्रृंखला विश्लेषण प्रदर्शित करने के लिए एक उपयुक्त परीक्षण शर्त है । K48 श्रृंखला में परिणामी वृद्धि चित्र 3में देखी जा सकती है । प्रोटेसोम अवरोधक उपचार ने K48 जंजीरों में वृद्धि को प्रेरितकिया 15।

जैसा कि परिचय में वर्णित है, एसआरएम या एमआरएम के विपरीत, पीआरएम अग्रदूत आयन के चयन के बाद एक पूर्ण उत्पाद आयन स्कैन करता है। हालांकि इसका मतलब यह है कि उत्पाद आयनों को चलाने से पहले निर्दिष्ट करने की आवश्यकता नहीं है, उन्हें अभी भी पोस्ट रन क्यूरेट किया जाना चाहिए। क्यूरेशन वह प्रक्रिया है जिसके द्वारा इच्छित पेप्टाइड के वास्तव में प्रतिनिधि संक्रमण का चयन किया जाता है। चित्रा 4 क्यूरेशन से पहले और बाद में K48 के लिए उत्पाद आयन क्रोमोग्राम दिखाता है। ऐसे उत्पाद आयनों को हटा दिया गया था जिनमें हस्तक्षेप के कारण असंगत एल्यूशन प्रोफ़ाइल के साथ संकेत दिया गया था। कम तीव्रता वाले उत्पाद आयनों को तब हटा दिया गया था कि सिग्नल-टू-शोर अनुपात ऐसे संक्रमणों के लिए कम अनुकूल है। क्यूरेशन के दौरान चुने गए इष्टतम संक्रमण आमतौर पर प्रयोगों के बीच सुसंगत होंगे, और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग, क्रोमेकोग्राफिक स्थितियों, विश्लेषण सेटिंग्स और नमूने की जैविक पृष्ठभूमि के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। इस प्रकार, प्रत्येक जांच के लिए संक्रमण के उचित क्यूरेशन की आवश्यकता होती है। अधिक संक्रमणों को शामिल करने और इस प्रकार मात्राकरण के लिए तकनीकी प्रतिकृति और स्वच्छ डेटा के बीच एक संतुलन की भी आवश्यकता होती है।

इस प्रयोग में पहचानी गई सर्वव्यापकता श्रृंखला के प्रत्येक के लिए विशिष्ट उत्पाद आयन क्रोमाटोग्राम चित्र 5में दिखाए गए हैं । K27 और K29 यहां छोड़ दिया जाता है क्योंकि इन जैविक परिस्थितियों में संकेत का पता लगाने से नीचे था । K33 के एल्यूशन प्रोफाइल के रूप में यहां दिखाया गया था काफी व्यापक से आमतौर पर पीआरएम विश्लेषण के लिए स्वीकार किया जाएगा । हालांकि, बेहतर एल्यूशन प्रोफाइल के साथ पेप्टाइड्स का वैकल्पिक चयन सर्वव्यापी श्रृंखला विश्लेषण में संभव नहीं है और इस प्रोफ़ाइल के आधार पर एक व्याख्या की जानी चाहिए। यदि K33 विशेष रुचि का है, तो परिवर्तित क्रोमेग्राफिक स्थितियों से इस श्रृंखला प्रकार के मात्राकरण में सुधार हो सकता है, लेकिन अन्य श्रृंखला प्रकारों की हानि होने की संभावना है।

पीआरएम प्रयोग को डिजाइन करने में, सिग्नल-टू-शोर बढ़ाकर मात्राकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले उत्पाद आयनों के सिग्नल को अधिकतम करना बेहतर है। टकराव ऊर्जा का अनुकूलन (यानी, उत्पाद आयनों के लिए प्रीकर पेप्टाइड आयनों को खंडित करने के लिए द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर द्वारा उपयोग की जाने वाली ऊर्जा) एक साधन है जिसके द्वारा संकेतको 16में सुधार किया जा सकता है। 14-28 से एक टकराव ऊर्जा रेंज K63 और M1 के परिणामस्वरूप मनाया पीक क्षेत्रों के साथ एक ही नमूने के दोहराया इंजेक्शन के लिए लागू किया गया था चित्रा 6में दिखाया गया है । जैसा कि देखा जा सकता है, K63 के लिए 26 की एक उच्च टकराव ऊर्जा इष्टतम थी, जबकि M1 के लिए 18 की एक कम ऊर्जा आदर्श थी। प्रत्येक टोपोलॉजी-विशेषता पेप्टाइड के लिए टकराव ऊर्जा और असंशोधित सर्वव्यापी टुकड़ों का चयन तालिका 1में दिखाया गया है। इन टकराव ऊर्जा का उपयोग बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर और विखंडन विधि के आधार पर अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है।

Figure 1
चित्रा 1: सर्वव्यापी-संयुग्मित झरना का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। सर्वव्यापकइन पहले एटीपी-निर्भर तरीके से ई 1 एंजाइम से बंधा होता है। सक्रिय सर्वव्यापकता को तब एक E2 एंजाइम में स्थानांतरित कर दिया जाता है जो तब सब्सट्रेट प्रोटीन में सर्वव्यापकइन स्थानांतरित करने के लिए E3-ligase द्वारा शामिल हो जाता है। सब्सट्रेट प्रोटीन पर सर्वव्यापी श्रृंखला बनने तक इस प्रक्रिया को कई बार दोहराया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2: सर्वव्यापक टोपोलॉजी-विशेषता पेप्टाइड के व्युत्पन्न को दर्शाने वाला आरेख। पोस्ट ट्राइप्टिक पाचन अपस्ट्रीम बाइंडिंग साइट डाउनस्ट्रीम सर्वव्यापकता संलग्न के -जीजी सी-टर्मिनल के साथ ली गई है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एक माउस सेल लाइन B16 और दो मानव सेल लाइनों A459 और HeLa के लिए एमजी-१३२ उपचार के तहत K48 श्रृंखला की तुलना । A459 में एमजी-132 की बढ़ती सांद्रता ने K48 श्रृंखलाओं के स्थिरीकरण का नेतृत्व किया। B16 और HeLa कोशिकाओं के साथ एक वृद्धि या तो 10 mm या १०० mm एमजी-१३२ के साथ उपचार के तहत देखा गया था । 10 MM से 100 mm तक देखी गई कमी को बी 16 और हेला कोशिकाओं की एमजी-132 की बढ़ी हुई संवेदनशीलता से समझाया जा सकता है, जिससे सेल डेथ हो जाती है। त्रुटि सलाखों के संक्रमण के मानक विचलन दिखाते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: हस्तक्षेप या कम तीव्रता के लिए संक्रमण के क्यूरेशन से पहले और बाद में एम 1 टोपोलॉजी-विशेषता पेप्टाइड के उत्पाद आयन क्रोमेटोग्राम। एक्स-एक्सिस पर रिटेंशन टाइम मिनट्स में दिखाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5: विभिन्न टोपोलॉजी-विशेषता पेप्टाइड्स के विशिष्ट उत्पाद आयन क्रोमाटोग्राम के साथ-साथ दो गैर-संशोधित सर्वव्यापकाइन पेप्टाइड्स। मिनटों में एल्यूशन का समय और प्रत्येक पेप्टाइड के लिए मनाया गया सामूहिक त्रुटि प्रासंगिक चोटी के शीर्ष से ऊपर सूचित किया जाता है। बिंदीदार रेखाएं भी पीक क्षेत्र के निर्धारण के लिए खिड़की दिखाती हैं। एक्स-एक्सिस पर रिटेंशन टाइम मिनट्स में दिखाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: सामान्यीकृत टकराव ऊर्जा की एक श्रृंखला पर K63 और M1 के लिए मनाया पीक क्षेत्र। विभिन्न रंग प्रत्येक संक्रमण द्वारा योगदान आयन तीव्रता का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चेन प्रकार टोपोलॉजी विशेषता पेप्टाइड प्रभारी राज्य सामान्यीकृत टकराव ऊर्जा
के06 MQIFVK [GG] TLTGK 3 18
K11 TLTGK [GG]TITLEVEPSDTIENVK 3 18
K27 TITLEVEPSDTIENVK [GG] एके 3 18
K29 एके [GG] IQDK 2 22
K33 IQDK [GG] EGIPPDQQR 3 18
K48 LIFAGK [GG] QLEDGR 3 24
K63 TLSDYNIQK [GG] ESTLHLVLR 4 26
M1 (रैखिक) जीजीएमक्यूआईएफवीके 2 18
गैर संशोधित Ubqiuitin ईएसटीएलएचएलवीएलआर 2 26
गैर संशोधित Ubqiuitin TITLEVEPSDTIENVK 2 18
गैर संशोधित Ubqiuitin टीएलएसडीएनआईक्यूके 2 18

तालिका 1: मानव सर्वव्यापकता टोपोलॉजी-विशेषता पेप्टाइड्स, सबसे नमूदार चार्ज राज्य, और अनुकूल सामान्यीकृत टकराव ऊर्जा के लिए दृश्य।

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Discussion

एक प्रोटेओम के भीतर सर्वव्यापी राज्य का विश्लेषण जैविक प्रश्नों की एक विस्तृत विविधता के लिए महत्व बढ़ाने का है। एक नमूने की सर्वव्यापकता स्थिति का वर्णन न केवल प्रोटीन के प्रोफ़ाइल सर्वव्यापी होने पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए बल्कि इस तरह के सर्वव्यापकता के टोपोलॉजी पर भी ध्यान केंद्रित करना चाहिए। लक्षित एमएस द्वारा इस टोपोलॉजी के आकलन, जैसा कि यहां वर्णित है, जैविक जांच की एक विस्तृत श्रृंखला में एक भूमिका है ।

यह समझना चाहिए कि यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल एक वैश्विक टोपोलॉजी प्रोफाइल प्रदान करता है। बॉटम-अप प्रोटेओमिक्स दृष्टिकोण का उपयोग पेप्टाइड्स के निर्धारण के लिए अनुमति देता है जो सर्वव्यापी थे, जिसमें सर्वव्यापी पेप्टाइड्स शामिल थे। सर्वव्यापी पेप्टाइड्स के सर्वव्यापकता का अवलोकन श्रृंखला टोपोलॉजी के निर्धारण की अनुमति देता है, लेकिन सर्वव्यापी के लक्ष्य का लिंक खो जाता है। इस प्रकार, किसी भी प्रोटीन पर विशेष श्रृंखला टोपोलॉजी निर्धारित नहीं किया जा सकता है, लेकिन एक वैश्विक टोपोलॉजी प्रोफाइल प्राप्त किया जाता है। विधि को अधिक लक्षित परिणाम प्रदान करने के लिए एक संवर्धन रणनीति के साथ भी जोड़ा जा सकता है। इस तरह के एक संवर्धन श्रृंखला स्थिरता और श्रृंखला की बहुतायत के बाद संवर्धन पर विचार करना चाहिए । श्रृंखला टोपोलॉजी का पता लगाना शुद्धता द्वारा सीमित है संवर्धन रणनीति प्रदान करती है, क्योंकि ब्याज के प्रोटीन से जुड़े लोगों से दूषित प्रोटीन से जुड़े सर्वव्यापी टोपोलॉजी को अलग करना संभव नहीं है। इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम, एक सफल विश्लेषण की सुविधा, सर्वव्यापक प्रोटीन पचाने के दौरान सर्वव्यापक श्रृंखला के संरक्षण का संतुलन है । यह श्रृंखला टूटने की प्रवृत्ति के कारण चुनौतीपूर्ण है जो सर्वव्यापी पाचन के लिए सर्वव्यापी के प्रतिरोध के साथ मिलकर है। इसके अलावा, एक समर्थन मैट्रिक्स के अलावा और एमएस शर्तों के सावधान विचार तरल क्रोमेटोग्राफिक युग्मित मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण के लिए टोपोलॉजी-विशेषता पेप्टाइड्स में से कुछ की कम अनुकूल प्रकृति को देखते हुए आवश्यक हैं।

हालांकि हमने इस प्रोटोकॉल में एक ऐसा साधन रेखांकित किया है जिसके द्वारा सभी सर्वव्यापक श्रृंखला प्रकारों का समवर्ती मूल्यांकन किया जा सकता है, लेकिन ब्याज की विशेष श्रृंखला टोपोलॉजी के आधार पर प्रोटोकॉल के कई पहलुओं को समायोजित करना भी संभव है । क्रोमेग्राफिक स्थितियों में हेरफेर करना या भारी पेप्टाइड सांद्रता को अलग करना एक जांच की सटीकता को बढ़ा सकता है, एक विशेष श्रृंखला टोपोलॉजी के लिए परिणामों में सुधार और प्रस्तावित जैविक प्रश्न की जांच को सिलाई कर सकता है।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा करते हैं ।

Acknowledgments

लेखक एमजी-132 के उपचार के साथ सेलुलर छर्रों के निर्माण में उसकी सहायता के लिए सेलिन जेनेटी को धन्यवाद देना चाहते हैं जैसा कि प्रतिनिधि परिणामों में वर्णित है और प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले ई. कोलाई छर्रों के प्रावधान के लिए एलिस मोमएर्ट्स।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile (ACN) Merck 100029
Ammonium bicarbonate (ABC) Fluka 9830
Centrifuge Beckman Coulter Microfuge 16
Chloroacetamide (CAA) Sigma 22790
Eppendorf LoBind Eppendorf 22431081
Formic acid (FA) Thermo Fisher Scientific 85178
Heavy Peptides JPT Peptide Technologies
HPLC Dionex Ulitimate 3000
LC Column Thermo Fisher Scientific 160321
Lys C Wako 125-05061
Mass Spectrometer Thermo Fisher Scientific Q-Exactive Plus
N-ethylmaleimide (NEM) ACROS Organics 156100050
Positive Control Chain K48 Boston Biochem UC-240
Positive Control Chain K63 Boston Biochem UC-340-100
Positive Control Chain M1 Boston Biochem UC-710B-025
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma S5881
Sonifier Branson sonifier SFX 150
Thermomixer Eppendorf Thermomixer Comfort
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigam T6508
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) Thermo Fisher Scientific 77720
Trypsin Promega V1511A
Urea Sigma 51456
Waters μElution C18 plates Waters 186002318

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References

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बायोकेमिस्ट्री अंक 160 सर्वव्यापकिन चेन मास स्पेक्ट्रोमेट्री पैरलल रिएक्शन मॉनिटरिंग (पीआरएम) प्रोटेओमिक्स लक्षित पोस्टट्रांसलेशनल संशोधन टोपोलॉजी
समानांतर प्रतिक्रिया निगरानी द्वारा सर्वव्यापकइन चेन विश्लेषण
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Longworth, J., Mendes, M. L., Dittmar, G. Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring. J. Vis. Exp. (160), e60702, doi:10.3791/60702 (2020).

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