Summary
Questo metodo descrive la valutazione dei cambiamenti globali nella topologia della catena di ubiquitina. La valutazione viene eseguita mediante l'applicazione di un approccio di proteomica mirata basato sulla spettrometria di massa.
Abstract
La valutazione del profilo globale delle topologie a catena di ubiquitina all'interno di un proteoma è interessante per rispondere a un'ampia gamma di domande biologiche. Il protocollo qui delineato sfrutta la modifica della diglicina (-GG) lasciata dopo la digestione triptica dell'ubiquitina incorporata in una catena. Quantificando questi peptidi caratteristici della topologia si può determinare l'abbondanza relativa di ogni topologia a catena di ubiquitina. Le misure necessarie per quantificare questi peptidi mediante un esperimento parallelo di monitoraggio della reazione sono riportate tenendo conto della stabilizzazione delle catene di ubiquitina. La preparazione di controlli pesanti, lisi cellulare e digestione sono descritti insieme all'appropriata configurazione dello spettrometro di massa e al flusso di lavoro di analisi dei dati. Viene presentato un set di dati di esempio con perturbazioni nella topologia ubiquitina, accompagnato da esempi di come l'ottimizzazione del protocollo può influire sui risultati. Seguendo i passaggi descritti, un utente sarà in grado di eseguire una valutazione globale del paesaggio della topologia dell'ubiquitina all'interno del proprio contesto biologico.
Introduction
La stretta regolazione della funzione e della stabilità proteica è di fondamentale importanza, in quanto sono i principali motori del controllo fenotipico della biologia. La funzione di una proteina è costruita da due componenti: la sua sequenza intrinseca di polipeptidi e qualsiasi modificazione posttraslazionale (PTM). Sono state identificate varie PTM chimiche tra cui glicosilazione, fosforilazione, acetilazione e metilazione1. Nel 1975, Goldstein etal. L'ubiquitina è stata trovata importante nella degradazione delle proteine3. Tuttavia, da allora è stato stabilito che la funzione dell'ubiquitina come molecola di segnalazione si estende ben oltre la regolazione della stabilità proteica. La segnalazione dell'ubiquitina è coinvolta in una vasta gamma di altre funzioni biologiche, come la stabilizzazione delle proteine, l'autofagia, il controllo del ciclo cellulare e il trafficoproteico 4.
Mentre altre PTM sono generalmente binarie (cioè, la proteina viene modificata o lasciata non modificata) per un dato sito, l'ubiquitina può modificare una proteina sia come monomero che come catena polimerica, con l'ubiquitinazione stessa attaccata. Inoltre, questa catena di poliubiquitinazione può svilupparsi in diverse topologie con l'ubiquitinazione della precedente ubiquitina allegandosi a uno degli otto siti di collegamento5,6. L'ubiquitina viene trasferita da un processo enzimatico multipasso (Figura 1) in cui il C-terminale dell'ubiquitina è collegato a uno dei suoi sette residui di lisina (K06, K11, K27, K29, K33, K48 o K63) o all'N-terminale dell'ubiquitina precedente (indicato come m1 o ubiquitinazione lineare)5,6. Questa topologia a catena è la chiave del destino della proteina in fase di modifica. Ad esempio, la modifica con una catena collegata K48 o K11 porta alla degradazione della proteina modificata al proteasome, mentre una catena lineare è necessaria per l'attivazione della segnalazione NF-kB. Pertanto, la distribuzione relativa di queste topologie a catena è rilevante per un'ampia varietà di questioni biologiche.
L'uso della spettrometria di massa (SM) è di particolare beneficio per l'analisi della topologia della catena di ubiquitina in quanto non dipende da interazioni basate suanticorpi o affinità 7,8, molte delle quali hanno una specificità limitata e non distinguono tra i vari tipi di catena. Un'altra possibilità di rilevamento è l'uso di mutanti ubiquitina geneticamente modificati. Qui, una lysina specifica viene scambiata con arginina, che non può supportare la modifica con ubiquitina. La mancanza di formazione di catena di ubiquitina sulla proteina del substrato viene quindi interpretata come prova di una topologiaspecifica 9.
L'identificazione basata sulla SM delle proteine ubiquitinate si basa sul fatto che il C-terminale dell'ubiquitina contiene un residuo di arginina nella posizione 74 che è riconosciuto dalla trippasina durante la preparazione proteolitica dei campioni per l'analisi MS, separando la doppia glicina C-terminale. Questo GlyGly (-GG) rimane attaccato al ε-ammino del residuo di lisina della proteina del substrato. Per l'analisi della topologia dell'ubiquitina, la modifica avviene su uno dei sette residui di lisina dell'ubiquitina. In questo modo viene creato un insieme di sette peptidi chiave che trasportano un residuo di lisina modificato da GG, specifico per ciascuna delle topologie (Figura 2). Ad esempio, con la topologia K06, la lisina in posizione 6 sulla sequenza amminoacido sarà protetta dalla digestione triptica con una modifica -GG di 114 Da aggiunta a questa lisina.
L'identificazione di peptidi predeterminati specifici da parte della SM è indicata come proteomica mirata, o più specificamente, acquisizione mirata di peptidi10. Sono stati sviluppati due metodi a seconda delle prestazioni dello spettrometro di massa utilizzato. Questi sono il monitoraggio della reazione selezionata (SRM), chiamato anche monitoraggio della reazione multipla (MRM) e monitoraggio della reazione parallela (PRM). L'SRM comporta la selezione di transizioni costituite dal precursore m/z e dal prodotto ione m/z. Al contrario, il PRM richiede solo il precursore m/z. Dopo la selezione, viene eseguita una scansione completa del sondaggio degli ioni prodotto. Ciò ha il vantaggio che non è necessaria alcuna selezione di ioni di prodotto appropriati per la quantificazione sullo spettrometro di massa specifico prima della misurazione11. Sia SRM che PRM possono, a seconda dello strumento, essere programmati. La programmazione è la pratica di assegnare un lacime temporale durante il quale un particolare ione sarà incluso per l'analisi, poiché i peptidi stanno eluendo in tempi di conservazione definiti dal sistema cromatografico. La riduzione del numero di ioni interrogati in un dato momento aumenta la frequenza di interrogatorio degli ioni programmati in quel momento, migliorando così l'accuratezza dei dati.
In generale, l'applicazione di proteomica mirata per la topologia dell'ubiquitina è la stessa di qualsiasi altro esperimento di proteomica mirato. Tuttavia, due differenze chiave sono importanti: in primo luogo, deve essere considerata la stabilità delle catene di ubiquitina. Ci sono più potenti enzimi deubiquitinanti (DBA) che degradano rapidamente le catene sulla lisi cellulare. Le proteasi ubiquitina-specifiche si suddividono in due categorie: le tioesterasi e le metalloproteasi. La maggior parte delle ubiquitina-idrolasi sono tioesterasi e trasportano un residuo di cisteina nel loro centro attivo. Alchilando questo residuo di cisteina, possono essere inattivati. Come tale, l'uso di tamponi di stabilizzazione dell'ubiquitina contenenti agenti alchilanti, come la N-etilmaleimide (NEM), e sostanze chimiche altamente denaturanti, e mantenere i campioni refrigerati è vitale per un'analisi di successo. In secondo luogo, a differenza di altri esperimenti mirati, la scelta peptidica è fissa. In un tipico esperimento mirato, un peptide proteotipico può essere selezionato per buone prestazioni cromatografiche e ionizzazioni. Per alcuni peptidi caratteristici della topologia come K48 queste proprietà sono buone, mentre per altre sono meno desiderabili. Ad esempio, la cromatografia K33 in una tipica configurazione in fase inversa è scarsa a causa della formazione di un profilo di eluizione allungato e le scarse proprietà di ionizzazione del peptide K27 riducono la sua visibilità di MS12.
In questo protocollo, descriviamo come eseguire la valutazione della topologia dell'ubiquitina di un campione biologico da parte del PRM. I dati di esempio per la procedura sono presentati utilizzando una perturbazione del proteasome utilizzando il trattamento inibitore MG-132 in diversi tipi di cellule.
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Protocol
1. Preparazione di uno standard peptidico pesante
- A seconda del fornitore e della qualità dei peptidi pesanti acquistati, i peptidi pesanti dovranno essere diluiti. Questo protocollo utilizzava le sequenze peptidiche riportate nella tabella 1, con l'amminoacido C-terminale modificato in lisina(13C615N2-lisina) o arginina (13C615N4-arginina).
- Mescolare i peptidi pesanti, diluire il mix con acetonitrile al 50% (ACN) per creare un mix peptidico con ogni peptide a 10 μM.
- Creare aliquote del mix peptidico e conservare a -80 °C.
2. Preparazione del campione
- Lisi campione
NOTA: La stabilità delle catene di ubiquitina deve essere considerata durante la preparazione del campione. Conservare i campioni biologici e i tamponi refrigerati a 4 °C e aggiungere campioni al tampone di stabilizzazione dell'ubiquitina il più rapidamente possibile.- Preparare una soluzione di 1 M NH4HCO3 (bicarbonato di ammonio) in acqua e regolare il pH a 8 utilizzando 1 M NaOH.
- Preparare una soluzione di 200 mM N-etilmaleimide (NEM) in acqua.
- Preparare il buffer di stabilizzazione dell'ubiquitina utilizzando 8 M urea in 50 mM NH4HCO3/10 mM NEM.
NOTA: Una soluzione da 5 mL di urea da 8 M richiederà considerevolmente meno di 5 mL di acqua data l'espansione dell'acqua quando si è in una soluzione satura con urea.
ATTENZIONE: Non preparare il tampone sopra i 50 °C a causa della tendenza dell'urea a formare poliurea ad alte temperature. - Resuspend il campione biologico da esaminare in tampone di stabilizzazione dell'ubiquitina con l'obiettivo di 0,5 μg/μL di proteine e di leccare le cellule con un metodo appropriato per il campione. Un metodo di sonicazione composto da tre impulsi da 10 s con un sonificatore SFX 150 Branson impostato al 70% di intensità con 10 s di pause sul ghiaccio tra ogni impulso, è stato utilizzato per le linee cellulari in questo protocollo.
- Campione di centrifuga a 18.000 x g per 10 min a 4 °C in una centrifuga da tavolo.
- Trasferire il supernatante in un tubo di microcentrifugo fresco a basso legame proteico. I campioni possono essere conservati a -20 °C a questo punto, se necessario.
- Preparazione del campione e dei controlli
- Se i campioni sono congelati, mescolare (ad esempio, con un termomixer) mentre vengono scongelati per sciogliere rapidamente l'urea.
ATTENZIONE: Non utilizzare temperature superiori a 50 °C a causa della tendenza dell'urea a formare poliurea ad alte temperature. - Campione di centrifuga a 18.000 x g per 10 min a 4 °C in una centrifuga da tavolo.
- Trasferire 20 μg di campione in un nuovo tubo di microcentrifugo a bassa lega e regolare il volume a 50 μL con tampone di stabilizzazione dell'ubiquitina.
- Creare un controllo negativo utilizzando un volume normalizzato di buffer di stabilizzazione dell'ubiquitina (50 μL). In questo campione non deve essere presente alcuna versione leggera di ciascun peptide, consentendo l'osservazione di qualsiasi contaminazione leggera derivante dai peptidi pesanti a spillo. Questo controllo negativo è stato utilizzato anche per la pianificazione del tempo di conservazione del PRM descritto nella sezione 3.1.
- È stato anche creato un controllo positivo con buffer di stabilizzazione dell'ubiquitina e l'aggiunta di tipi di catena disponibili in commercio al volume normalizzato di buffer di stabilizzazione dell'ubiquitina (50 μL). Comunemente, K63, K48 e M1 sono disponibili. Nei risultati rappresentativi sono stati utilizzati 20 ng di K48, K63 e M1.
- Se i campioni sono congelati, mescolare (ad esempio, con un termomixer) mentre vengono scongelati per sciogliere rapidamente l'urea.
- Riduzione, alchilazione e digestione
- Preparare una soluzione di bicarbonato di ammonio da 50 mM (NH4HCO3) in acqua e regolare il campione in pH = 8 con 1 M NaOH.
- Una coltura di E. coli coltivata in brodo LB è stata centrifugata 5.000 x g per 5 minuti per formare un pellet, che è stato poi lavato 2 volte con PBS prima della resuspensione in tampone di stabilizzazione ubiquitina a 5 μg/μL.
- Aggiungere 1 μg di E. coli lysate a ciascun campione e controllare. Questo protocollo utilizza E. coli (DH10B), ma è possibile utilizzare qualsiasi lisato complesso senza ubiquitina. Si noti che l'ubiquitina è comune a tutti gli eucarioti.
NOTA: L'uso di una matrice di lisato E. coli riduce la perdita di peptidi a causa dell'adesione non specifica alle stoviglie. Ciò è particolarmente evidente nel controllo negativo o nei campioni con un contenuto proteico limitato e ha un forte impatto sull'osservazione di K6312. - Preparare una soluzione di 500 mM tris(2-carbossietile)fosfina (TCEP) in acqua di grado MS (DTT può essere utilizzato come alternativa).
- Ridurre i campioni e i controlli con l'aggiunta di TCEP a una concentrazione finale di 50 mM. Vortice brevemente prima di incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (RT). Se si utilizza DTT, la temperatura deve essere elevata a 50 °C.
ATTENZIONE: Non utilizzare temperature superiori a 50 °C a causa della tendenza dell'urea a formare poliurea ad alte temperature. - Preparare una soluzione di 550 mM di cloroacetamide (CAA) in NH4HCO3. Conservare al buio.
- Alchilato i campioni e i controlli aggiungendo CAA ad una concentrazione finale di 55 mM. Vortice brevemente prima di incubare per 20 minuti a RT al buio.
NOTA: CAA viene utilizzato al posto dell'iodoacetamide come agente di riduzione per ridurre la possibilità di una doppia modifica carbamidometile (114.0429) su un residuo di lisina scambiato per una modifica -GG (114.0429)13. - Aggiungere l'endopeptidasi LysC ai campioni con un rapporto 1:25 (w/w) con il contenuto proteico. Incubare per 3 ore a 37 °C.
- Diluire i campioni e i comandi con 200 μL di 50 mM NH4HCO3 pH = 8 (1:5 v/v).
- Aggiungere la tripsidena ai campioni con un rapporto di 1:25 w/w con il contenuto proteico. Incubare per 12 ore a 37 °C.
- Aggiungere la soluzione di acido formico (FA) al 10% in acqua di grado MS con un rapporto 1:10 v/v a ciascun campione e campione di controllo. Verificare che il pH sia <3) prima della pulizia C18 e aggiungere altro acido formico, se necessario.
- Ad ogni campione e controllo aggiungere 0,5 μL dello standard peptidico pesante creato nella sezione 1.
- Pulizia peptidica
- Diversi produttori offrono punte o piastre di pulizia C18. Seguire le istruzioni del produttore per il prodotto utilizzato e i peptidi elusi secchi in una centrifuga sottovuoto, pronti per l'analisi ms.
3. Analisi di LC-MS/MS
- Esegui l'analisi PRM iniziale sullo standard peptidico pesante in modo non programmato.
- Resuspend i campioni essiccati in 10 μL di tampone di carico MS 2% ACN/0,05% acido trifluoroacetico (TFA).
- Equipaggia un HPLC con una colonna analitica C18 in fase inversa (75 μm x 15 cm, 2 μm 100 Å C18 perline) progettata per il nanoflusso MS. Una colonna trappola sacrificale (75 μm x 2 cm, 3 μm, 100 Å C18 perline) per preservare la vita della colonna analitica è stata utilizzata qui ma non è richiesta.
- Accoppiare l'output della colonna analitica a una sorgente nano-ESI su uno spettrometro di massa ad alta risoluzione.
- Utilizzare un metodo di proteomica mirato appropriato per lo spettrometro di massa. Ad esempio, su un Q-Exactive più un metodo a due esperimenti, scorrere tra un full MS e un esperimento PRM. Per l'esperimento Full MS è stata utilizzata una risoluzione di 120.000 con un obiettivo AGC di 1e6 e 240 ms come IT massimo. Per l'esperimento PRM, lo stesso obiettivo AGC e l'IT massimo sono stati utilizzati con una risoluzione inferiore di 60.000 e una finestra di isolamento di 1,2 m/z.
- Iniettare 200 ng del controllo negativo sulla colonna analitica utilizzando l'autocampionatore HPLC. Applicare un gradiente lineare al campione sulla colonna analitica aumentando la concentrazione di ACN dal 2 al 25% in un periodo di ~45 min.
NOTA: La concentrazione di ACN del 25% è inferiore al solito per la proteomica a causa della bassa natura idrofila dei tipici peptidi caratteristici della topologia dell'ubiquitina. Se altri peptidi devono essere quantificati, si può desiderare una maggiore concentrazione di ACN per ottenere una buona separazione del bersaglio. - Analizzare i risultati dell'esecuzione della programmazione come descritto nella sezione 4.2 per creare un elenco di inclusione pianificato.
- Analisi dei campioni
- Eseguire gli esempi rimanenti come descritto per la programmazione in 3.1 a parte l'utilizzo dell'elenco di inclusione pianificato creato nella sezione 4.2.
NOTA: un vuoto deve essere eseguito dopo il controllo positivo per garantire che non venga rilevato alcun riporto dall'esecuzione precedente nei campioni successivi.
- Eseguire gli esempi rimanenti come descritto per la programmazione in 3.1 a parte l'utilizzo dell'elenco di inclusione pianificato creato nella sezione 4.2.
4. Analisi del software
- Creare un elenco di inclusione della formattazione appropriata per l'MS utilizzato. Questo protocollo utilizzava il software open source Skyline (versione 19.1.0.193) (https://skyline.ms), che offre supporto e aiuto ben documentati. È possibile creare un elenco di inclusione per diversi spettrometri di massa utilizzando la struttura dell'elenco di isolamento delle esportazioni.
- Aprire un nuovo documento Skyline.
- Selezionare modifiche isotopiche pesanti in base alle esigenze dei peptidi caratteristici della topologia pesante. In Impostazioni| Impostazioni peptidice nella scheda Modifica fare clic sul campo nome per visualizzare la potenziale modifica. La selezione si basa sullo stato isotopico dei peptidi pesanti acquistati. In questo esempio sono stati utilizzati peptidi sintetici che trasportano una lisina pesante (13C615N2-lisina) o un'arginina pesante(13C615N4-arginina) al C-terminale. Le etichette appropriate sarebbero: "Label:13C(6)15N(2) (C-term K)" e "Label:13C(6)15N(4) (C-term R)".
- Selezionare Impostazioni| Transizione. Nella scheda Filtro sono includono Precursor Charges 2, 3, 4.
- Inserire peptidi selezionando Modifica| Inserisci| Peptidi.
- Compilare i campi rilevanti, inclusa la sequenza peptidica caratteristica della topologia e un nome proteico (ad esempio, "Catena-K63").
- Espandete ogni peptide ora mostrato nel pannello Bersagli. Eliminare gli stati di addebito indesiderati. Lo stato di carica preferito e l'energia di collisione, che possono differire in base allo spettrometro di massa utilizzato, per ogni peptide caratteristico della topologia è mostrato nella tabella 1.
- Per ogni peptide caratteristico della topologia (ad eccezione di M1 in cui il GG è incluso nella sequenza), fare clic con il pulsante destro del mouse sulla sequenza e scegliere Modifica. Aggiungere un GG come modifica strutturale facendo clic sul campo nome e selezionando <Mostra tutto... > prima di selezionare "GlyGly (K)".
- Esportare l'elenco di isolamento File| Esporta| Elenco diisolamento , selezionare il tipo di strumento e impostare il tipo di metodo su Standard. Selezionando OK verrà aperto un prompt per salvare un file *.csv che può essere utilizzato per creare un metodo PRM.
- Crea un elenco di inclusione pianificato basato su un'esecuzione di pianificazione peptidica pesante spiegata qui utilizzando il software Skyline open source.
- Creare un elenco di destinazione come descritto nella sezione 4.1.
- Importare l'esecuzione della pianificazione in 3.1 selezionando File| Importa| Risultati.
- Rivedere le identificazioni. Il segnale pesante per ogni peptide è osservabile cliccando sulla massa per ogni ingresso peptidico pesante. Il corretto riconoscimento del picco viene spesso determinato automaticamente, ma il software potrebbe richiedere la cura manuale selezionando il picco utilizzando il clic e il trascinamento sotto l'asse x.
- I tempi di ritenzione selezionati per le varianti pesanti vengono applicati anche alle versioni leggere, creando così una pianificazione per il PRM. La finestra di pianificazione può essere modificata in Impostazioni| Impostazioni peptidiche mediante la scheda Previsione, modificando la finestra di tempo.
- Un elenco di inclusione pianificato può ora essere esportato utilizzando File| Esporta| Elenco di isolamento e selezione del tipo di strumento appropriato e impostazione del tipo di metodo su Programmato.
- Analizzare i dati.
- Importare i campioni nello stesso modo dell'analisi di esecuzione della programmazione nella sezione 4.2.
- Dopo l'importazione completa di tutti i campioni, si consiglia la cura delle transizioni. Questo è il processo attraverso il quale vengono rimosse le transizioni con interferenze o scarsi rapporti segnale-rumore. Un esempio di cromatogramma prima e dopo la cura è illustrato nella figura 4.
- I dati possono ora essere esportati facendo clic con il pulsante destro del mouse sui grafici pertinenti e selezionando Copia dati o selezionando File| Esporta| Risultati.
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Representative Results
Per dimostrare l'uso di un'analisi della catena di ubiquitina da parte del PRM, sono state selezionate tre linee cellulari: una linea cellulare di melanoma del topo B16 e le due comuni linee cellulari umane A549 (cellule epiteliali basali alveolari adenocarcinomiche) e HeLa (cellule tumorali cervicali). Queste colture sono cresciute fino alla fase semiesonziale in mezzi appropriati prima di essere trattate con 0, 10 o 100 mM MG-132 per 4 ore prima della raccolta. MG-132 è un inibitore del proteasome che impedisce la degradazione delle proteine coniugate con ubiquitina dal proteasome14. Dato questo, è una condizione di test appropriata per dimostrare l'analisi della catena di ubiquitina. Il risultante aumento della catena K48 è possibile vedere nella figura 3. Il trattamento inibitore del proteasome ha indotto un aumento delle catene K4815.
Come descritto nell'introduzione, a differenza di SRM o MRM, PRM esegue una scansione completa degli ioni di prodotto dopo la selezione dello ione precursore. Anche se ciò significa che gli ioni prodotto non devono essere specificati prima dell'esecuzione, devono comunque essere curati dopo l'esecuzione. La cura è il processo attraverso il quale vengono selezionate le transizioni veramente rappresentative del peptide previsto. La figura 4 mostra il cromatogramma ionici prodotto per K48 prima e dopo la cura. Gli ioni prodotto che hanno un segnale con un profilo di eluizione incoerente probabilmente a causa di interferenze sono stati rimossi. Gli ioni prodotto a bassa intensità sono stati quindi rimossi dato che il rapporto segnale-rumore è meno favorevole per tali transizioni. Le transizioni ottimali selezionate durante la cura saranno comunemente coerenti tra gli esperimenti e possono differire a seconda dello spettrometro di massa utilizzato, delle condizioni cromatografiche, delle impostazioni di analisi e dello sfondo biologico del campione. Pertanto, per ogni indagine è necessaria una corretta cura delle transizioni. È inoltre necessario un equilibrio tra l'inclusione di più transizioni e quindi repliche tecniche e dati più puliti per la quantificazione.
I cromatogrammi ionici tipici per ciascuna delle topologie a catena di ubiquitina identificate in questo esperimento sono mostrati nella figura 5. K27 e K29 sono omessi qui perché in queste condizioni biologiche il segnale era al di sotto del rilevamento. Il profilo di eluizione di K33, come mostrato qui, era considerevolmente più ampio di quanto sarebbe comunemente accettato per l'analisi PRM. Tuttavia, la selezione alternativa di peptidi con migliori profili di eluizione non è possibile nell'analisi della catena di ubiquitina e un'interpretazione deve essere fatta sulla base di questo profilo. Se K33 è di particolare interesse, le condizioni cromatografiche alterate possono migliorare la quantificazione di questo tipo di catena, ma probabilmente a scapito di altri tipi di catena.
Nel progettare un esperimento PRM, è preferibile massimizzare il segnale degli ioni prodotto utilizzati per la quantificazione aumentando il segnale al rumore. L'ottimizzazione dell'energia di collisione (cioè l'energia utilizzata dallo spettrometro di massa per frammentare gli ioni peptidici precursori agli ioni prodotto) è uno dei mezzi con cui il segnale può esseremigliorato 16. Un intervallo di energia di collisione da 14 a 28 è stato applicato alle iniezioni ripetute di un singolo campione con le aree di picco osservate risultanti di K63 e M1 mostrate nella figura 6. Come si può vedere, per K63 una maggiore energia di collisione di 26 era ottimale, mentre per M1 un'energia inferiore di 18 era l'ideale. L'energia di collisione per ogni peptide caratteristico della topologia e una selezione di frammenti di ubiquitina non modificati sono mostrati nella tabella 1. Queste energie di collisione potrebbero dover essere ottimizzate in base allo spettrometro di massa e al metodo di frammentazione utilizzato.
Figura 1: Rappresentazione schematica della cascata onnipresente-coniugante. L'ubiquitina è prima legata da un enzima E1 in modo dipendente dall'ATP. L'ubiquitina attivata viene quindi trasferita ad un enzima E2 che viene poi unito da una E3-ligasi per trasferire l'ubiquitina alla proteina del substrato. Questo processo viene ripetuto più volte fino a quando non si forma una catena di ubiquitina sulla proteina del substrato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Diagramma che mostra la derivazione del peptide caratteristiche della topologia dell'ubiquitina. Digestione post-triptica il sito di legame a monte è derivato con il -GG C-terminale dell'ubiquitina a valle attaccata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Confronto della catena K48 sotto il trattamento MG-132 per una linea cellulare di topo B16 e le due linee cellulari umane A459 e HeLa. Nell'A459 l'aumento delle concentrazioni di MG-132 portò alla stabilizzazione delle catene K48. Con le cellule B16 e HeLa è stato visto un aumento in trattamento con 10 mM o 100 mM MG-132. La diminuzione osservata da 10 mM a 100 mM può essere spiegata dall'aumento della sensibilità delle cellule B16 e HeLa a MG-132, portando alla morte cellulare. Le barre di errore mostrano la deviazione standard delle transizioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Cromatogrammi ionici di prodotto del peptide caratteristico della topologia M1 prima e dopo la cura delle transizioni per interferenze o bassa intensità. Il tempo di conservazione sull'asse x viene visualizzato in pochi minuti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Cromatogramma ionici tipico del prodotto di vari peptidi caratteristici della topologia e due peptidi di ubiquitina non modificati. Il tempo di eluizione in minuti e l'errore di massa osservato per ogni peptide sono riportati sopra l'apice del picco pertinente. Le linee tratteggiate mostrano anche la finestra per la determinazione dell'area di picco. Il tempo di conservazione sull'asse x viene visualizzato in pochi minuti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Area di picco osservata per K63 e M1 su una serie di energie di collisione normalizzate. I diversi colori rappresentano l'intensità ionia fornita da ogni transizione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Tipo di catena | Peptide caratteristico della topologia | Stato carica | Energia di collisione normalizzata |
| K06 | MQIFVK[GG]TLTGK | 3 | 18 |
| K11 | TLTGK[GG]TITLEVEPSDTIENVK | 3 | 18 |
| K27 | TITLEVEPSDTIENVK[GG]AK | 3 | 18 |
| K29 | AK[GG]IQDK | 2 | 22 |
| K33 | IQDK[GG]EGIPPDQQR | 3 | 18 |
| K48 | LIFAGK[GG]QLEDGR | 3 | 24 |
| K63 | TLSDYNIQK[GG]ESTLHLVLR | 4 | 26 |
| M1 (lineare) | GGMQIFVK | 2 | 18 |
| Ubqiuitin non modificato | ESTLHLVLR | 2 | 26 |
| Ubqiuitin non modificato | TITLEVEPSDTIENVK | 2 | 18 |
| Ubqiuitin non modificato | TLSDYNIQK | 2 | 18 |
Tabella 1: Sequenze per i peptidi caratteristiche della topologia dell'ubiquitina umana, lo stato di carica più osservabile e l'energia di collisione normalizzata favorevole.
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Discussion
L'analisi dello stato di ubiquitina all'interno di un proteoma è sempre più importante per un'ampia varietà di questioni biologiche. La descrizione dello stato di ubiquitinazione di un campione deve concentrarsi non solo sul profilo delle proteine ubiquitinate, ma anche sulla topologia di tale ubiquitinazione. La valutazione di questa topologia da parte degli Stati membri mirati, come descritto in questa sede, ha un ruolo in un'ampia gamma di indagini biologiche.
Va capito che il protocollo qui delineato fornisce un profilo di topologia globale. L'uso di un approccio proteomico dal basso verso l'alto consente la determinazione di peptidi che sono stati ubiquitinati, compresi i peptidi di ubiquitina. L'osservazione dell'ubiquitinazione dei peptidi di ubiquitina permette la determinazione della topologia a catena, ma il legame con il bersaglio dell'ubiquitina viene perso. Pertanto, la particolare topologia a catena su una data proteina non può essere determinata, ma viene derivato un profilo di topologia globale. Il metodo può anche essere combinato con una strategia di arricchimento per fornire risultati più mirati. Tale arricchimento deve considerare la stabilità della catena e l'abbondanza di catene dopo l'arricchimento. L'individuazione della topologia a catena è limitata dalla purezza offerta dalla strategia di arricchimento, in quanto non è possibile distinguere una topologia di ubiquitina legata a una proteina contaminante da quelle legate alla proteina di interesse. Il passo critico di questo protocollo, facilitando un'analisi di successo, è il bilanciamento della conservazione della catena dell'ubiquitina mentre si digerisce la proteina ubiquitina. Ciò è impegnativo a causa della propensione alla rottura della catena accoppiata alla resistenza dell'ubiquitina stessa alla digestione enzimatica. Inoltre, è necessaria l'aggiunta di una matrice di supporto e un'attenta considerazione delle condizioni ms data la natura meno favorevole di alcuni peptidi caratteristici della topologia all'analisi spettrometrica di massa accoppiata cromatografica liquida.
Mentre abbiamo delineato in questo protocollo un mezzo attraverso il quale tutti i tipi di catena di ubiquitina possono essere valutati contemporaneamente, è anche possibile regolare diversi aspetti del protocollo in base alla particolare topologia di catena di interesse. Manipolare le condizioni cromatografiche o variare le concentrazioni di peptidi pesanti può aumentare l'accuratezza di un'indagine, migliorando i risultati per una particolare topologia a catena e adattando l'indagine alla questione biologica proposta.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Céline Jeanty per la sua assistenza nella creazione di pellet cellulari con trattamento di MG-132 come descritto nei risultati rappresentativi e Elise Mommaerts per la sua fornitura di pellet E. coli utilizzati nel protocollo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (ACN) | Merck | 100029 | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | Fluka | 9830 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 16 | |
| Chloroacetamide (CAA) | Sigma | 22790 | |
| Eppendorf LoBind | Eppendorf | 22431081 | |
| Formic acid (FA) | Thermo Fisher Scientific | 85178 | |
| Heavy Peptides | JPT Peptide Technologies | ||
| HPLC | Dionex | Ulitimate 3000 | |
| LC Column | Thermo Fisher Scientific | 160321 | |
| Lys C | Wako | 125-05061 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | Q-Exactive Plus | |
| N-ethylmaleimide (NEM) | ACROS Organics | 156100050 | |
| Positive Control Chain K48 | Boston Biochem | UC-240 | |
| Positive Control Chain K63 | Boston Biochem | UC-340-100 | |
| Positive Control Chain M1 | Boston Biochem | UC-710B-025 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S5881 | |
| Sonifier | Branson sonifier | SFX 150 | |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigam | T6508 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Thermo Fisher Scientific | 77720 | |
| Trypsin | Promega | V1511A | |
| Urea | Sigma | 51456 | |
| Waters μElution C18 plates | Waters | 186002318 |
References
- Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90 (2011).
- Goldstein, G., et al. Isolation of a polypeptide that has lymphocyte-differentiating properties and is probably represented universally in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (1), 11-15 (1975).
- Glickman, M. H., Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: Destruction for the sake of construction. Physiol. Rev. 82, 373-428 (2002).
- Pickart, C. M., Eddins, M. J.
- Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A.
- Komander, D., Rape, M.
- Mattern, M., Sutherland, J., Kadimisetty, K., Barrio, R., Rodriguez, M. S. Using Ubiquitin Binders to Decipher the Ubiquitin Code. Trends in Biochemical Sciences. 44 (7), 599-615 (2019).
- Newton, K., et al. Ubiquitin chain editing revealed by polyubiquitin linkage-specific antibodies. Cell. 134 (4), 668-678 (2008).
- Spence, J., et al. Cell cycle-regulated modification of the ribosome by a variant multiubiquitin chain. Cell. 102 (1), 67-76 (2000).
- Borràs, E., Sabidó, E. What is targeted proteomics? A concise revision of targeted acquisition and targeted data analysis in mass spectrometry. PROTEOMICS. 17 (17-18), (2017).
- Lesur, A., Domon, B. Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics. PROTEOMICS. 15 (5-6), 880-890 (2015).
- Longworth, J., Dittmar, G. Assessment of Ubiquitin Chain Topology by Targeted Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1977, Clifton, N.J. 25-34 (2019).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
- Tawa, N. E., Odessey, R., Goldberg, A. L. Inhibitors of the proteasome reduce the accelerated proteolysis in atrophying rat skeletal muscles. The Journal of Clinical Investigation. 100 (1), 197-203 (1997).
- Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
- MacLean, B., et al. Effect of Collision Energy Optimization on the Measurement of Peptides by Selected Reaction Monitoring (SRM) Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (24), 10116-10124 (2010).
