Summary
Wir präsentieren einen RT-LAMP-Test für den Nachweis von TiLV in Tilapia-Fischen mit einfachen Instrumenten über einen relativ kurzen Zeitraum im Vergleich zu herkömmlichen RT-PCR-Techniken. Dieses Protokoll kann dazu beitragen, die epidemische Ausbreitung von TiLVD, insbesondere in Entwicklungsländern, zu kontrollieren.
Abstract
Die Tilapia-Seevirus-Krankheit (TiLVD), eine sich abzeichnende Viruserkrankung in Tilapia, die durch das Tilapia-Seevirus (TiLV) verursacht wird, ist eine anhaltende Herausforderung in der Aquakulturindustrie, die in vielen Teilen der Welt zu einer massenhaften Morbidität und Sterblichkeit von Tilapia geführt hat. Ein wirksamer, schneller und genauer diagnostischer Test für TiLV-Infektionen ist daher notwendig, um die anfängliche Infektion zu erkennen und die Ausbreitung der Krankheit in der Aquakulturlandwirtschaft zu verhindern. In dieser Studie wird eine hochempfindliche und praktische Reverse-Transkriptionsschleifen-Schleife-vermittelte isothermale Amplifikation (RT-LAMP) Methode vorgestellt, um Tilapia-Seevirus im Fischgewebe zu erkennen. Ein Vergleich der RT-qPCR- und RT-LAMP-Assays infizierter Proben ergab positive Ergebnisse in 63 (100%) und 51 (80,95%) Proben. Darüber hinaus ergab eine Analyse nicht infizierter Proben, dass alle 63 nicht infizierten Gewebe sowohl bei den RT-qPCR- als auch bei den RT-LAMP-Assays negative Ergebnisse lieferten. Die Kreuzreaktivität mit fünf Krankheitserregern in Tilapia wurde mit RT-LAMP bewertet, und alle Tests zeigten negative Ergebnisse. Sowohl die Leber- als auch die Schleimproben von infizierten Fischen zeigten vergleichbare Ergebnisse mit der RT-LAMP-Methode, was darauf hindeutet, dass Schleim in RT-LAMP als nicht-tödlicher Test verwendet werden kann, um das Töten von Fischen zu vermeiden. Abschließend zeigten die Ergebnisse, dass der vorgestellte RT-LAMP-Assay eine effektive Methode zum TiLV-Nachweis im Tilapiagewebe innerhalb von 1 h bietet. Die Methode wird daher als Screening-Tool in landwirtschaftlichen Betrieben zur schnellen Diagnose von TiLV empfohlen.
Introduction
Tilapia See Viruskrankheit (TiLVD) ist eine Viruserkrankung in Tilapia(Oreochromis spp.), die Berichten zufolge Tilapia Todesfälle in vielen Regionen der Welt verursacht, einschließlich Asien1,2, Afrika, und Amerika. Die Krankheit wurde erstmals während der Massensterblichkeit von Tilapia im Jahr 2009 in Israel erkannt, wo die Zahl der wilden Tilapia im Kinneret-See dramatisch von 257 auf 8 Tonnen proJahr2 sank. Die Krankheit wird durch das Tilapia-Seevirus (TiLV) verursacht, das der Familie Amnoonviridae als neue Gattung Tilapinevirus und einer neuen Art Tilapia Tilapinevirus3zugeordnet wurde. Die genetische Charakterisierung von TiLV zeigte, dass es sich bei dem Virus um ein neuartiges umhülltes, negativ-sinnliches, einsträngiges RNA-Virus handelt, das 10 Segmente hat, die 10 Proteine1,2,4kodieren. Verschiedene Tilapia-Arten der Gattung Sarotherodon, Oreochromis, und Tilapine und andere warme Wasserfische (z.B. Riesen-Gourami (Osphronemus goramy)) haben sich als anfällig für TiLV2,5erwiesen. Derzeit verbreitet sich dieses Virus weiterhin weltweit, möglicherweise durch die Bewegung von infizierten lebenden Fischen6,7, während das Risiko einer viralen Übertragung über gefrorene Tilapia oder sein Produkt begrenzt ist8. Eine erhebliche Sterblichkeit aufgrund einer TiLV-Infektion hat das Potenzial, erhebliche negative wirtschaftliche Auswirkungen auf die Tilapia-Industrie zu haben. Zum Beispiel wurden die wirtschaftlichen Auswirkungen des Sommersterblichkeitssyndroms in Ägypten im Zusammenhang mit einer TiLV-Infektion auf 100MillionenUS-Dollar 9 berechnet. Daher ist es wichtig, eine schnelle und angemessene Diagnosemethode zu entwickeln, um die Bekämpfung dieser Krankheit in Fischfarmen zu erleichtern.
Bisher basiert die Diagnose TiLVD auf molekularen Assays, viraler Isolation und Histopathologie. Für die TiLV-Diagnose10,11wurden verschiedene PCR-Protokolle und Primer entwickelt. Zum Beispiel wurde eine SYBR-Grün-basierte Reverse-Transkriptions-quantitative PCR-Methode (RT-qPCR) mit der Empfindlichkeit entwickelt und validiert, nur zwei Kopien/L des Virus zuerkennen. Andere PCR-Methoden für die TiLV-Erkennung sind TaqMan quantitative PCR11, RT-PCR2, geschachtelte RT-PCR12und semi-nested RT-PCR13. Diese Methoden erfordern jedoch ausgeklügelte Laborausrüstung und relativ lange Zeiträume, um aufgrund der Komplexität der Reaktionen Ergebnisse zu erzielen, was sie für die Feldanwendung ungeeignet macht.
Der schleifenvermittelte isotherme Amplifikationstest (LAMP) ist ein schneller, einfacher und praktischer For-Field-Anwendung14,15. Die Technik verwendet das Prinzip einer Strangverschiebungsreaktion, während die Amplifikationsreaktion unter isothermen Bedingungen ohne einen ausgeklügelten und teuren Thermischen Cycler14,15läuft. Daher werden verstärkte LAMP-Produkte oder RT-LAMP-Produkte in leiterartigen Bändern mit Agarose-Gel-Elektrophorese mit einem fluoreszierenden Fleck entweder zur sicheren Visualisierung von DNA oder RNA14 oder zur Beobachtung mit bloßem Auge auf das Vorhandensein von Trübung oder einem weißen Niederschlag16,17,18analysiert. Aus diesen Gründen wurde diese Technik für den Nachweis verschiedener Fischpathogene vor Ort17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Der Zweck dieser Studie war es, einen schnellen, empfindlichen und genauen RT-LAMP-Test für die TiLV-Erkennung zu etablieren. Der RT-LAMP-Test bietet ein Screening auf TiLV in Fischproben innerhalb von 30 min. Die Technik kann für die Diagnose und Überwachung von TiLVD angewendet werden.
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Protocol
Dieses Experiment, das die Verwendung von tierischem Gewebe beinhaltete, wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der Kasetsart University, Bangkok, Thailand (Protokollnummer ACKU61-VET-009) genehmigt.
1. Gewebesammlung
- Euthanisieren Tilapia-Fische mit einer Überdosierung von Nelkenöl (d. h. mehr als 3 ml/L). Tricain-Methansulfonat kann als Alternative zu Nelkenöl verwendet werden.
- Verwenden Sie sterile Mayo-Schere und Zange, um den Bauch der postmortalen Tilapia zu schneiden und etwa 30–50 mg Lebergewebe zu verbrauchen, oder mit einem Mikroskop-Abdeckungglas, sammeln Sie 100 L Schleim, indem Sie die Fischhautschicht längs (von vorderzu- bis nachhinten) in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr kratzen.
- Fahren Sie sofort mit dem RNA-Extraktionsschritt fort oder halten Sie die entnommene Probe bis zum Experiment bei 80 °C. Da intakte RNA empfindlicher ist als DNA, verwenden Sie RNase-freie Materialien und Reagenzien während der RNA-Extraktion.
2. RNA-Extraktion
- Um die RNA aus dem Lebergewebe zu extrahieren, fügen Sie 30–50 mg des Tilapiagewebes in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit 600–1.000 l Guanidinium-Säure-Phenol-Extraktionsreagenz(Materialtabelle)ein und pulverisieren die Probe bis zur Homogenisierung mit einem Handgewebehomogenisator. Die Gewebeproben benötigen ca. 10% des Guanidinium-Säure-Phenol-Extraktionsreagenzes. Für die Schleimproben nur 300 l des Guanidinium-Säure-Phenol-Extraktionsreagenzes (3:1) verwenden.
VORSICHT: Das Guanidinium-Säure-Phenol-Extraktionsreagenz ist giftig; daher muss die Handhabung mit Sorgfalt erfolgen. Schutzausrüstungen wie Schutzbrillen, ein Laborkleid und Sicherheitshandschuhe müssen getragen werden. - Zentrifugieren Sie die homogenisierte Probe bei 10.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur und übertragen Sie den Überstand in ein neues steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.
- Fügen Sie ein gleiches Volumen von 95% Ethanol in das Rohr und mischen Sie gut.
- Übertragen Sie die Lösung in eine Spin-Säule (Materialtabelle), die in einem Sammelrohr und einer Zentrifuge bei 10.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur platziert ist. Verwerfen Sie den Durchfluss, und übertragen Sie die Spinspalte in ein neues Sammelrohr.
- Fügen Sie der Säule und zentrifugieren den Bereich 400 l RNA-Vorwaschreagenz (Materialtabelle) bei 10.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur hinzu, bevor Sie den Durchfluss entsorgen. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
HINWEIS: Um die RNA Pre-Wash vorzubereiten, fügen Sie 10 ml 95% Ethanol zu 40 ml RNA Pre-Wash Konzentrat hinzu. - Fügen Sie der Säule und zentrifugieren 700 l RNA-Waschpuffer (Materialtabelle) bei 10.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur hinzu. Übertragen Sie die Säule in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.
HINWEIS: Um den RNA-Waschpuffer vorzubereiten, fügen Sie 52 ml 95% Ethanol zu 12 ml RNA Wash Buffer Konzentrat hinzu. - Elute die RNA-Probe in der Spin-Säulen-Matrix mit 100 l nukleasefreies Wasser und Zentrifuge bei 10.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur.
- Messen Sie die Konzentration der extrahierten RNA mit einem Mikrovolumenspektrophotometer und verdünnen Sie die RNA mit nukleasefreiem Wasser auf eine gewünschte Konzentration.
HINWEIS: Der qualifizierte Absorptionswert von OD260/OD280 reicht von 1,6 bis 1,9, was auf die akzeptable RNA-Reinheit für den RT-LAMP-Test hinweist. - Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort, oder halten Sie die Probe bis zur Verwendung bei 80 °C.
3. Primer-Design
- Verwenden Sie Primer Explorer Version 4, um die spezifischen Primer für den RT-LAMP zu entwerfen. Gehen Sie zur Website, https://primerexplorer.jp/e/, und klicken Sie auf die Schaltfläche PrimerExplorer V4.
- Wählen Sie die Datei mit den Sequenzen von Segment 3 von TiLV im FASTA-Format aus, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Primer Design.
HINWEIS: Rufen Sie die Sequenzen im FASTA-Format von der GenBank-Beitrittsnummer KX631923 ab, die tilapia lake virus TV1 Segment 31darstellt. - Um die Primer zu entwerfen, geben Sie die folgenden Grundparameter ein:
- Ein GC-Gehalt von 40%–60%
- Ein Amplicon von 280 Basenpaaren (bp)
- Eine ähnliche Schmelztemperatur (Tm) unter Primern mit einer maximalen Differenz von 5 °C
ANMERKUNG: Die Primer dürfen sich nicht ergänzen- Vermeiden Sie Sequenzbereiche, die anfällig für die Bildung von Sekundärstrukturen sind.
- Wählen Sie die Dimer-Primer-Analyse mit einem Minimum von 3,5 € für ein optimales Design für das größte G aus, und wählen Sie die Enden der Primer mit einem Maximum von 4 € für ein optimales Design für das kleinere G aus.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Generieren.
HINWEIS: Nachdem die Software die Verarbeitung der Eingabedaten abgeschlossen hat, werden die Primer-Ergebnisse angezeigt (Abbildung 1).
4. RT-LAMP-Test
- Bereiten Sie einen RT-LAMP-Master-Mix vor, der 2,5 l 1x SD II-Reaktionspuffer, 3 l mit 6 mM MgSO4, 1,4 l mit 1,4 mM dNTP-Set, 4 l mit 0,8 m Betain, 1,3 l mit 0,052 ml Calcein-Mischung, 1 ,6 l TiLV-F3-Primer, 1 L mit 1,6 M TiLV-B3-Primer, 1 l 0,2-M-TiLV-BIP-Primer, 1 l 0,2-M-TiLV-FIP-Primer, 1 l 0,3-U-BST-DNA-Polymerase, 1 L 0,1 U AMV-Reverse-Transkriptase und 3,8 l nukleasefreies Wasser pro Reaktion.
HINWEIS: Bereiten Sie einen überschüssigen Master-Mix vor, der mindestens 10 % des gesamten Reaktionsvolumens umfasst. - Geben Sie 22 l des RT-LAMP-Master-Mix in ein steriles 1,5-Mikrozentrifugenrohr.
- Fügen Sie dem Reaktionsröhrchen 3 l der extrahierten RNA hinzu und mischen Sie die Probe durch Wirbeln. Verwenden Sie für die Negativkontrolle destilliertes Wasser anstelle von RNA-Materialien.
- Inkubieren Sie die Reaktion bei 65 °C für 60 min, gefolgt von 80 °C für 10 min, um die Reaktion zu beenden.
- Beobachten Sie nach der Inkubation die farbmetrischen Veränderungen visuell mit bloßem Auge. Ein positives Ergebnis erscheint als fluoreszierende grüne Farbe.
5. Agarose-Gel-Elektrophorese
- Bereiten Sie ein 1,5% w/v Agarose-Gel vor, indem Sie 0,6 g Agarosepulver in 40 ml 1x TAE-Puffer aufhängen. Schmelzen Sie die Mischung, indem Sie sie in einer Mikrowelle für 3-5 min erwärmen, bis die Agarose vollständig aufgelöst ist, und wirbeln, um zu mischen.
- Lassen Sie die Agarose abkühlen, bis die Temperatur 65 °C erreicht. 40 ml der Agarose-Lösung auf ein Geltablett geben und der Gelform einen Kamm hinzufügen.
- Lassen Sie das Agarose-Gel auf Raumtemperatur für 20 bis 30 min einstellen, bis es vollständig erstarrt ist. Dann entfernen Sie den Kamm und legen Sie das Gel in den Geltank.
- Fügen Sie einen Laufpuffer hinzu, um die Oberfläche des Gels im Geltank zu bedecken.
- Fügen Sie jedem Bohrkörper 10 L der RT-LAMP-Probe und 2 l 6x Gel-Ladepuffer hinzu. Fügen Sie der Referenzspur 5 l einer 1 kb DNA-Leiter hinzu.
- Schließen Sie den Deckel an der Kathode und die Anode an, die an ein Netzteil angeschlossen ist. Schalten Sie das Netzteil ein, stellen Sie es auf eine konstante 100 V und laufen Sie für 40 min.
- Nach Abschluss der Geltrennung das Gel aus der Gelschale entfernen. Dann färben Sie das abgetropfte Gel mit Ethidiumbromid (EtBr) in einer Konzentration von 10 mg/ml für 7 min und restain es in destilliertem Wasser für 5 min.
VORSICHT: EtBr ist giftig und gilt als krebserregend; Seien Sie daher vorsichtig, wenn Sie diesen Agenten verwenden. - Setzen Sie das Gel UV-Licht mit einem Gel-Dokumentationssystem aus, in dem Bänder auftreten, und machen Sie ein Bild des Gels.
6. Komplementäre DNA-Synthese (cDNA)
- Bereiten Sie einen cDNA-Synthese-Master-Mix vor, der 2 l 5x RT-Puffer, 0,5 l Primer-Mix, 0,5 l RT-Enzym und 2 l nukleasefreies Wasser pro Reaktion enthält.
HINWEIS: Bereiten Sie überschüssige Master-Mix bestehend aus 1x der Reaktion aufgrund eines potenziellen Verlustes während der Pipettierung. - Geben Sie 5 l des Master-Mix in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.
- 100 ng der verdünnten extrahierten RNA (erhalten aus Schritt 2.8) in das Reaktionsrohr geben, mischen und nach unten drehen, um die gesamte Mischung auf den Boden des Gefäßes zu bewegen.
- Inkubieren Sie die Reaktionen bei 42 °C für 60 min, gefolgt von 98 °C für 5 min in einer PCR-Maschine. Bewahren Sie die cDNA bis zur Verwendung bei 20 °C auf.
7. RT-qPCR
- Bereiten Sie einen TiLV qPCR-Master-Mix vor, der 0,3 l mit 10 ,M Reverse primer, 0,3 l von 10 'M Vorwärtsgrundierung, 5 'L mit 2x SYBR Green DNA Polymerase und 0,4 'L Nuklease-freies Wasser pro Reaktion enthält. Verwenden Sie die folgenden Primer und Steuerelemente:
Vorwärtsgrundierung (TiLV-112F): 5'-CTGAGCTAAAGAGGCAATATGGATT-3'
Reverse Primer (TiLV-112R): 5'-CGTGCGTACTCGTTCAGAGAAGTTCT-3' - Geben Sie 6 l des TiLV qPCR Master-Mix in jede Bohrung des qPCR-Streifens, der mit dem verwendeten Echtzeit-Thermocycler kompatibel ist.
- Fügen Sie 4 l der cDNA-Vorlage, Negativkontrolle (nukleasefreies Wasser), Positivkontrolle (10 pg/l) und pTiLV (Plasmid)10 oder seriell verdünntes TiLV-Plasmid in den Brunnen ein, und mischen Sie jede Probe durch Flicken. Führen Sie jede Probe in dreifacher Ausfertigung durch.
- Legen Sie die qPCR-Reaktionen in den programmierten Echtzeit-Thermocycler. Stellen Sie das qPCR-Programm so ein, dass die Inkubation 3 min bei 95 °C durchgeführt wird, gefolgt von 40 Zyklen von 95 °C für 10 s und 60 °C für 30 s vor dem Schmelzkurvenschritt, in dem die Temperatur von 65 °C auf 95 °C in Schritten von 0,5 °C/5 s ansteigen muss.
- Führen Sie die Datenanalyse durch Auswerten der Amplifikations- und Schmelzkurven durch und berechnen Sie dann die Anzahl der TiLV-Kopien mithilfe der Standardkurve, die aus den Daten gewonnen wird, mit den seriell verdünnten Plasmiden.
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Representative Results
In dieser Studie wurde ein RT-LAMP-Test entwickelt, um eine TiLV-Infektion in Tilapia zu erkennen. Die getesteten Proben wurden zwischen 2015 und 2016 von 14 Farmen in verschiedenen Teilen Thailands entnommen. Die infizierten und nicht infizierten Fische wurden in erster Linie auf der Grundlage physikalischer Diagnosen und des Auftretens von symptomatischer TiLVD gruppiert. TiLV-Infektion wurde anschließend mit RT-PCR nach dem Entnahmeprozess bestätigt. Als Auswertungsmethoden der LAMP-Amplicons (Abbildung 2) wurden Agarose-Gelelektrophorese und der Nachweis einer leuchtend grünen Farbe ausgewählt. Die Leber und der Schleim der infizierten und nicht infizierten Tilapia-Fische waren durch das klinische Auftreten von TiLV-Krankheitssymptomen gekennzeichnet, einschließlich Hauterosion, Hautrötung, Exophthalmos und Bauchschwellung. Frühere Berichte haben die Verwendung von Leberproben in molekulardiagnostischen Assays gezeigt, um das Vorhandensein von TiLV35zu bestimmen. Alternativ kann Schleim im Test von Vorteil sein, da er dazu beitragen kann, das Töten der Tiere zu vermeiden. Die Ergebnisse zeigten ein leiterartiges DNA-Bandmuster und eine fluoreszierende grüne Farbe in der infizierten Leber und Schleimproben infizierter Fische (Abbildung 2), während in den RT-LAMP-Gemischen in nicht infizierten Tierischen Geweben kein DNA-Band und die gelbe Farbe von Calcein beobachtet wurden (Abbildung 2). Interessanterweise wurde eine TiLV-infizierte Tilapia-Probe, die von einer Farm in Malaysia entnommen wurde, auch mit diesem RT-LAMP-Assay als positiv diagnostiziert; Es wurden jedoch Abweichungen in der Größe des PCR-Produkts im Vergleich zu den Proben beobachtet, die von lokalen thailändischen Farmen entnommen wurden (Abbildung 2).
Um die Empfindlichkeit und Spezifität des RT-LAMP-Assays zu überprüfen, wurden insgesamt 63 TiLV-infizierte Gewebe und 63 nicht infizierte Gewebe mit den RT-LAMP- und RT-qPCR-Assays analysiert (Tabelle 1). Ein Vergleich der RT-qPCR- und RT-LAMP-Assays der infizierten Proben ergab ein positives Ergebnis bei 63 (100%) und 51 (80,95%) der Proben. Darüber hinaus ergab eine Analyse der nicht infizierten Proben, dass alle 63 nicht infizierten Gewebe sowohl mit den RT-qPCR- als auch mit rt-LAMP-Assays negative Ergebnisse lieferten (Tabelle 1). Diese Analyse zeigte die Zuverlässigkeit des RT-LAMP-Assays für die primäre TiLV-Erkennung. Um die Spezifität des RT-LAMP-Tests zu testen, wurden Gewebe von Fischen, die mit anderen pathogenen Bakterien und Viren infiziert waren, einschließlich Streptococcus agalactiae, Francisella noatunensis, Flavobacterium columnare, Aeromonas hydrophilaund Iridovirus als Vorlagen für die RT-LAMP- und RT-qPCR-Analysen verwendet. Sowohl die RT-LAMP- als auch die RT-qPCR-Primer lieferten negative Ergebnisse ohne kolorimetrische Veränderungen und ohne fluoreszierende Signale in einer der getesteten Proben (Tabelle 2). Zusätzlich wurde die Empfindlichkeit des RT-LAMP-Assays anhand einer seriellen 10-fachen Verdünnung der RNA-Vorlagen bewertet, die aus TiLV-infizierten Fischen extrahiert wurden. Zum Vergleich: Der RT-qPCR-Assay war empfindlicher als der RT-LAMP-Assay, da der RT-qPCR-Assay eine Nachweisgrenze von 10-8 hatte, während die RT-LAMP-Methode eine10-7-facheVerdünnung benötigte, um das TiLV-Genom zu erkennen (Tabelle 2).
Abbildung 1. Die Nukleotidsequenzen der sechs in dieser Studie verwendeten RT-LAMP-Primer, die spezifisch für den Nachweis von TiLV waren. Die Position jedes Primers wurde auf Segment 3 des TiLV-Genoms ausgerichtet (Beitrittsnummer KX631923). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Analyse der RT-LAMP-Amplicons aus den TiLV-infizierten und nicht infizierten Proben (A) in 1,5% Agarose-Gel-Elektrophorese und (B) durch fluoreszierende Visualisierung. ( M = 1 kb DNA-Leiter, 1-2 = RNA aus der Leber von TiLV-infizierten Fischen, 3–4 = die cDNA von TiLV-infizierten Fischen, 5–6 = RNA aus dem Schleim von TiLV-infizierten Fischen, 7–8 = Zelllinien von TiLV-infizierten Fischen, 9 = RNA aus der Leber von TiLV-infizierten Fischen (Malaysia), 10 = RNA aus der Leber von nicht-TiLV-infizierten Fischen, 11 = die cDNA von nicht-TiLV-infizierten Fischen, 12 = RNA aus dem Schleim von nicht-TiLV-infizierten Fischen, 13 = keine Vorlagenkontrolle Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Arten von Proben | Anzahl der Proben | Erkennungsgültigkeit (%) | |
| RT-qPCR | RT-LAMPE | ||
| Infizierte Proben | 63 | 100.00 (63/63) | 80.95 (51/63) |
| Nicht infizierte Proben | 63 | 0 (0/63) | 0 (0/63) |
Tabelle 1. Überprüfung von RT-LAMP für TiLV-Nachweis in infizierten und nicht infizierten Fischproben mit RT-qPCR und RT-LAMP
| Spezifität | S.a. | F.n. | Fc. | A.h. | I.v. | |||||
| Qpcr | Lampe | Qpcr | Lampe | Qpcr | Lampe | Qpcr | Lampe | Qpcr | Lampe | |
| – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | |
| Empfindlichkeit | Methode/ | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | 10-7 | 10-8 | 10-9 |
| Verdünnung | ||||||||||
| Qpcr | + | + | + | + | + | + | + | + | – | |
| Lampe | + | + | + | + | + | + | + | – | – | |
Tabelle 2. Spezifität und Empfindlichkeit des RT-LAMP-Assays im Vergleich zu RT-qPCR. Für die Spezifitätsbewertung wurde RNA aus Fischgewebe, das mit anderen Bakterien oder Viren infiziert ist, einschließlich Streptococcus agalactiae (S.a.), Francisella noatunensis (F.n.), Flavobacterium columnare (F.c.), Aeromonas hydrophila (A.h.) und Iridovirus (I.v.), als Vorlagen für RT-qPCR und RT-LAMP verwendet. Für die Sensitivitätsbewertung wurde die rna aus TiLV-infizierten Fischen 10-fach seriell verdünnt von 100 ng auf 1 fg und als Schablone für RT-qPCR und RT-LAMP verwendet. Die + und – Zeichen bedeuten positive bzw. negative Ergebnisse.
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Discussion
Die Aquakulturindustrie ist ständig von Virusinfektionen bedroht, die erhebliche wirtschaftliche Verluste verursachen9,23,28. Zum Beispiel stellt die aufstrebende TiLV eine große Bedrohung für Tilapia produzierende Länder in vielen Teilen der Welt1,6,9. Bisher gab es keine spezifischen Therapeutika zur Verhinderung von TiLVD. Während die Entwicklung eines Impfstoffs im Gange ist, wird ein effizienter Impfstoff viel Zeit in Kauf setzen, bevor er für kommerzielle Zwecke verfügbar ist. Unter diesen Umständen sind strenge Biosicherheitsmessungen, wie die Anwendung von Desinfektionsmitteln, in Fischfarmen erforderlich, um die Ausbreitung von TiLVD29,30zu verhindern. Derzeit ist eine der effizientesten Kontrollmaßnahmen zur Reduzierung der TiLV-Übertragung das Screening von Jungfischen und Erwachsenen auf das Vorhandensein oder Fehlen von TiLV31. Zu Screening-Zwecken muss das Diagnoseinstrument schnell, sensibel und spezifisch sein, damit es bei der Beseitigung infizierter Populationen helfen und die weitere Ausbreitung von Krankheiten verhindern kann. Die aktuellen molekularen Assays für TiLV sind jedoch vor Ort schwer umzusetzen. In erster Linie benötigen sie geschickte Forscher und teure Ausrüstung. Zweitens kann es mehrere Tage dauern, um die Laborergebnisse zu erhalten, was es schwierig macht, die Ausbreitung von Krankheiten schnell zu kontrollieren und zu verhindern15,16.
Um diese Probleme zu überwinden, gründeten Notomi et al.14 im Jahr 2000 einen neuartigen Nukleinsäure-basierten Amplifikationstest namens loop-mediale isotherme Amplifikation (LAMP). Die LAMP-Reaktion wurde seitdem erfolgreich angewendet, um verschiedene Fischviren zu erkennen16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,32,33,34. In dieser Studie haben wir ein RT-LAMP-Protokoll zum Nachweis von TiLV in Tilapia-Fischproben entwickelt. Obwohl die Empfindlichkeit der RT-LAMP-Methode zehnmal weniger effizient ist als die des RT-qPCR, kann der RT-LAMP-Assay das Vorhandensein eines TiLV-RNA-Genoms von nur 100 fg erkennen, was für den TiLV-Nachweis bei klinisch erkrankten Fischen34ausreicht. Insbesondere liefert der RT-LAMP-Assay ein Ergebnis innerhalb von 60 min und benötigt nur ein einfaches Wasserbad oder Wärmeblockgeräte34, während der RT-qPCR-Assay mehr Zeit in Anspruch nimmt und teurere Echtzeit-PCR-Geräte für die Analyse15,34benötigt. Darüber hinaus wurde das Endprodukt des RT-LAMP durch eine Farbänderung des Leuchtstofffarbstoffs von hellgelb zu fluoreszierend grün beobachtet, wodurch es mit bloßem Auge sichtbar wurde, ohne dass eine ausgeklügelte Ausrüstung erforderlich ist34. Diese Vorteile machen RT-LAMP für die Felddiagnose geeignet. Darüber hinaus legten die Studienergebnisse nahe, dass sowohl Leber als auch Schleim für den TiLV-Nachweis mit RT-LAMP verwendet werden können. Ähnlich wie frühere Studien erlaubte eine nichttödliche Probe mit Schleim die Diagnose tiLV ohne Tötung von Fisch oder wertvollem Brutbestand35. Kürzlich wurde ein RT-LAMP-Test entwickelt, um chinesische und thailändische Isolate von TiLV-Nukleotidsequenzen im Segment 1 (S1-Region) mit einem Satz von sechs Primern36zu erkennen. Die vorliegende Studie zeigte, dass der entwickelte RT-LAMP-Assay ein falsch-negatives Signal einer TiLV-Infektion bei 27,78% im Vergleich zu RT-PCR diagnostizierte, wenn der gleiche Primer-Set verwendet wurde. Im weiteren Vergleich war das falsch-negative Ergebnis mit 19,05 % bei der Erkennung von Segment 3 von TiLV im Vergleich zu RT-PCR relativ geringer. Beim Vergleich der Effizienz der Viruserkennungsmethode mit anderen Berichten konnten wir eine TiLV-Infektion mit 80,95 % erkennen, während andere Arbeiten das Virus mit 72,22 %36 und 82,89 %37entdeckten. Insgesamt kann davon ausgenommen werden, dass die verschiedenen Komponenten des RT-LAMP-Assays, z. B. die verschiedenen Primer-Sets und die verschiedenen Zielsegmente des TiLV-Genoms wichtige Faktoren sind, die die Gültigkeit des Assays beeinflussen.
Obwohl der RT-LAMP-Assay ein leistungsfähiges Werkzeug für das Krankheitsscreening ist und mehrere nachweisbare Vorteile hat, war diese Studie nicht ohne Einschränkungen. Einer der kritischen Punkte für den RT-LAMP-Assay war das Design eines geeigneten Primer-Sets mit vier bis sechs Primern. Um die Bildung der Stammschleifenstrukturen der PCR-Produkte zu fördern, mussten die entsprechenden Längen der zielgerichteten Gene oder Nukleotidsequenzen länger als etwa 500 bp sein, während die Zielgene des RT-PCR-Assays relativ kurz sein mussten, im Bereich von 50–150 bp14,38,39.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der entwickelte RT-LAMP-Assay schnell, kostengünstig, sensibel und spezifisch für die TiLV-Erkennung ist. Die Analyse kann innerhalb von 1 h im Vergleich zu 4–5 h für den RT-qPCR-Assay abgeschlossen werden. Insbesondere ist der RT-LAMP-Assay für Feldbedingungen praktisch, da positive Ergebnisse mit bloßem Auge beobachtet werden können, ohne dass eine ausgeklügelte Ausrüstung erforderlich ist.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Das Projekt wird vom Thailand Research Fund (TRF) Förderstück RDG6050078 und dem Center for Advanced Studies for Agriculture and Food, Institute for Advanced Studies, Kasetsart University, Bangkok, Thailand im Rahmen des Higher Education Research Promotion and National Research University Project of Thailand, Office of the Higher Education Commission, Ministry of Education, Thailand, finanziert. Die Forschung wird zum Teil durch das Graduate Program Stipendium der Graduate School, Kasetsart University, unterstützt. Die Autoren danken Dr. Kwanrawee Sirikanchana für die Erzählung des Videos und Piyawatchara Sikarin für die Bearbeitung des Videos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue collection: | |||
| Clove oil | Better Pharma | N/A | |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | An alternative option to clove oil |
| RNA extraction: | |||
| Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent) | ThermoFisher Scientific Corp. | 15596026 | |
| Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent) | Geneaid | GZR100 | |
| Direct-zol RNA Kit: | Zymo Research | R2071 | |
| - Direct-zol RNA PreWash | |||
| - RNA Wash Buffer | |||
| - DNase/RNase-free water | |||
| - Zymo-spin IIICG columns | |||
| - Collection Tubes | |||
| RT-LAMP: | |||
| 1x SD II reaction buffer | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| dNTP set | Bioline | BIO-39053 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B2629 | |
| Calcein mixture | Merck | 1461-15-0 | |
| Bst DNA polymerase | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| AMV reverse transcriptase | Promega | M510A | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10320995 | |
| Elite dry bath incubator, single unit | Major Science | EL-01-220 | |
| Gel electrophoresis: | |||
| Agarose | Vivantis Technologies | PC0701-500G | |
| Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | Sigma-Aldrich | SRE0062 | |
| Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer: | |||
| - Tris | Vivantis Technologies | PR0612-1KG | |
| - Acetic acid (glacial), EMSURE | Merck Millipore | 1000632500 | |
| - Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), Vetec | Sigma-Aldrich | V800170-500G | |
| Neogreen | NeoScience Co., Ltd. | GR107 | |
| DNA gel loading dye (6X) | ThermoFisher Scientific Corp. | R0611 | |
| DNA ladder and markers | Vivantis Technologies | PC701-100G | |
| Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system) | Bio-Rad | 1704487 | |
| PowerPac HC power supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Gel Doc EZ System | Bio-Rad | 1708270 | |
| UV sample tray | Bio-Rad | 1708271 | |
| NαBI imager | Neogene Science | ||
| cDNA synthesis: | |||
| ReverTra Ace qPCR RT Kit | Toyobo | FSQ-101 | |
| Viva cDNA Synthesis Kit | Vivantis Technologies | cDSK01 | An alternative option for cDNA synthesis |
| NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer) | ThermoFisher Scientific Corp. | ND-2000 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| RT-qPCR: | |||
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725120 | |
| Nuclease-free water, sterile water | MultiCell | 809-115-CL | |
| 8-tube PCR strips, white | Bio-Rad | TLS0851 | |
| Flat PCR tube 8-cap strips, optical | Bio-Rad | TCS0803 | |
| CFX96 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1855196 | |
| General equipment and materials: | |||
| Mayo scissors | N/A | ||
| Forceps | N/A | ||
| Vortex Genie 2 (vortex mixer) | Scientific Industries | ||
| Microcentrifuge LM-60 | LioFuge | CM610 | |
| Corning LSE mini microcentrifuge | Corning | 6765 | |
| Pipettes | Rainin | Pipete-Lite XLS | |
| QSP filtered pipette tips | Quality Scientific Plastics | TF series | |
| Corning Isotip filtered tips | Merck | CLS series | |
| Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NEST | Wuxi NEST Biotechnology | 615601 |
References
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