Summary
نحن نصمم اختبار ECL متعدد الإرسال بسيط يجمع بين 7 اختبارات للأجسام المضادة الذاتية معا. الفحص قادر على فحص T1D وأمراض المناعة الذاتية الأخرى المتعددة ، في وقت واحد ، بما في ذلك مرض الاضطرابات الهضمية ، وأمراض الغدة الدرقية المناعية الذاتية ، ومتلازمة المناعة الذاتية متعددة الغدد 1.
Abstract
تستخدم الأجسام المضادة الذاتية للجزيرة (IAbs) على نطاق واسع في تشخيص مرض السكري من النوع الأول (T1D) والتنبؤ به. أربعة IAbs الرئيسية إلى الأنسولين (IAA) ، ديكاربوكسيلاز الغلوتامات -65 (GADA) ، مستضد insulinoma -2 (IA-2A) ، وناقل الزنك -8 (ZnT8A) هي بنفس القدر من الأهمية في التنبؤ بالأمراض. في الوقت الحاضر ، ما يصل إلى 40 ٪ من المرضى الذين تم تشخيصهم ب T1D يستمرون في تطوير اضطرابات المناعة الذاتية الأخرى. لسوء الحظ ، فإن طرق الفحص الحالية التي تستخدم جسما مضادا ذاتيا واحدا للقياس شاقة وغير فعالة لدراسات الفحص واسعة النطاق. لقد طورنا مؤخرا اختبارا بسيطا للتلألؤ الكهروكيميائي المتعدد الإرسال (ECL) لمعالجة هذه المشكلات الحالية. يجمع الفحص بين جميع اختبارات الأجسام المضادة الذاتية ال 7 في بئر واحد. يتضمن كل بئر ثلاثة IAbs (IAA و GADA و IA-2A) ، والأجسام المضادة الذاتية لبيروكسيديز الغدة الدرقية (TPOA) والجلوبيولين الدرقي (ThGA) للكشف عن أمراض الغدة الدرقية المناعية الذاتية ، والأجسام المضادة الذاتية للأنسجة transglutaminase (TGA) لمرض الاضطرابات الهضمية ، والأجسام المضادة الذاتية للإنترفيرون ألفا (IFNαA) لمتلازمة المناعة الذاتية متعددة الغدد -1 (APS-1) ؛ كل ذلك فحص ل T1D وغيرها من أمراض المناعة الذاتية ذات الصلة ، في وقت واحد. يعتمد فحص ECL متعدد الإرسال على منصة فحص ECL المفردة ، ولكنه يستخدم بدلا من ذلك لوحة متعددة الإرسال تجمع بين اختبارات الأجسام المضادة الذاتية المتعددة ، حتى 10 ، في بئر واحد. الفرق الرئيسي عن فحص ECL الفردي هو أن كل مركب مستضد الأجسام المضادة يتكون في مرحلة السائل يتم تقييده على بقعة محددة على كل بئر من خلال نظام رابط على لوحة متعددة الإرسال. تم التحقق من صحة فحص 7-Plex ECL ، في هذه الدراسة ، مقابل مقايسات الربط الإشعاعي القياسية (RBA) وفحوصات ECL المفردة ، باستخدام مجموعة كبيرة من مرضى T1D الذين تم تشخيصهم حديثا والضوابط الصحية المتطابقة مع العمر ، مما أدى إلى حساسية وخصوصية ممتازة للفحص.
Introduction
مرض السكري من النوع الأول (T1D) هو مرض مزمن خطير هو الأكثر شيوعا في مرحلة الطفولة. حاليا ، حوالي 1.4 مليون شخص لديهم T1D في الولايات المتحدة. ومن اللافت للنظر أن معدل الإصابة ب T1D يتزايد باطراد بنسبة 3-5٪ كل عام في جميع أنحاء العالم وقد تضاعف في العقدين الماضيين ، خاصة في الأطفال الصغار 1,2. الأجسام المضادة الذاتية للجزيرة (IAbs) في الدورة الدموية هي العلامة الحيوية الأكثر موثوقية في الوقت الحاضر. قد تظهر IAbs قبل سنوات من تطور T1D السريري3. حاليا ، يتم استخدام أربعة IAbs رئيسية على نطاق واسع في تشخيص T1D وفحص المخاطر بما في ذلك الأجسام المضادة الذاتية للأنسولين (IAA) ، ديكاربوكسيلاز الغلوتامات -65 (GADA) ، مستضد insulinoma -2 (IA-2A) ، وناقل الزنك -8 (ZnT8A). هذه IAbs الأربعة لها نفس القدر من الأهمية في التنبؤ بتطوير T1D. تم إعادة تعريف تصنيف T1D مؤخرا على أنه وجود ≥2 من أي 4 IAbs مع استقلاب الجلوكوز الطبيعي كمرحلة المرض 14.
في دراسة المناعة الذاتية لمرض السكري في الشباب (DAISY) ، تم الكشف عن أن واحدا من كل أربعة أطفال معرضين لخطر T1D من المرجح أن يتقدم إلى المناعة الذاتية للجزيرة أو الاضطرابات الهضمية أو الغدة الدرقية أو الروماتويد ، والأكثر لفتا للنظر ، ما يقرب من 40 ٪ من المرضى الذين تم تشخيصهم ب T1D يطورون في النهاية حالة مناعة ذاتية إضافية 5,6,7 . تحديد الأجسام المضادة الذاتية ضرورية للتنبؤ وتشخيص أمراض المناعة الذاتية هذه ويجب أن توفر رعاية سريرية أفضل للمرضى. لا توجد طريقة سهلة وغير مكلفة في الوقت الحاضر للكشف عن حالات المناعة الذاتية المتعددة هذه. طرق الفحص الحالية باستخدام فحص الربط الراديوي القياسي (RBA) ، مع قياس واحد للأجسام المضادة الذاتية ، شاقة وغير فعالة لإجراء فحص واسع النطاق.
هنا ، سنصف فحص ECL البسيط متعدد الإرسال الذي تم تطويره حديثا ، والذي قمنا بمصادقته باستخدام منصة فحص ECL واحدة 8,9,10,11. يجمع فحص ECL متعدد الإرسال بين 7 اختبارات للأجسام المضادة الذاتية في بئر واحد ، باستخدام 15 ميكرولتر فقط من المصل ، وهو قادر على فحص T1D وأمراض المناعة الذاتية المتعددة ذات الصلة في وقت واحد بما في ذلك مرض الاضطرابات الهضمية وأمراض الغدة الدرقية المناعية الذاتية و APS-1. لم يتم تطوير فحص ZnT8A ECL في ذلك الوقت ولم يتم تضمينه في الفحص متعدد الإرسالات. يوفر فحص ECL متعدد الإرسال أداة ممتازة للإنتاجية العالية في الفحص العام للسكان ل T1D وأمراض المناعة الذاتية المتعددة.
Protocol
تمت الموافقة على بروتوكول البحث من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المتعددة في كولورادو.
1. إعداد المخزن المؤقت
- اجعل المخزن المؤقت لوضع العلامات (2x PBS ، الرقم الهيدروجيني 7.9). باستخدام 400 مل من الماء منزوع الأيونات المقطر (DD) ، أضف 100 مل من 10x PBS. لضبط الرقم الهيدروجيني للمحلول ، أضف NaOH حتى يصل إلى 7.9.
- قم بإنشاء 3 mM biotin عن طريق إذابة 1 ملغ من البيوتين في 588 ميكرولتر من المخزن المؤقت لوضع العلامات الذي تم إنشاؤه مسبقا. اصنع 3 mM Ru Sulfo-NHS عن طريق إذابة 150 نانومول من Ru Sulfo-NHS في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لوضع العلامات.
- اصنع المخزن المؤقت للمستضد (1٪ BSA) عن طريق أخذ 500 مل من 1x PBS وإضافة 5 جم من ألبومين مصل البقر (BSA) إلى المحلول. تحضير 0.5 متر من محلول حمض الخليك. قم بإعداد مخزن مؤقت 1 M Tris-HCl باستخدام قاعدة Trizma وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 9.0.
- بالنسبة للمخزن المؤقت للطلاء (3٪ Blocker A) ، خذ 500 مل من 1x PBS وأضف 15 جم من Blocker A. قم بإعداد المخزن المؤقت للغسيل (0.05٪ Tween 20 ، PBST) عن طريق خلط 5000 مل من 1x PBS مع 2.5 مل من Tween 20. قم بإنشاء مخزن مؤقت للقراءة (2x Read Buffer T مع الفاعل بالسطح) عن طريق إضافة 500 مل من ماء DD و 500 مل من 4x Read Buffer T مع Surfactant.
ملاحظة: للحفاظ على الاتساق بين المقايسات ، من المهم أن يتم إنشاء كل من حلول البيوتين و Ru Sulfo-NHS قبل إجراء وضع العلامات مباشرة وعدم إنشائها وتخزينها للاستخدام في المستقبل.
2. وضع علامات على كل بروتين مستضد مع البيوتين و Ru Sulfo-NHS بشكل منفصل
ملاحظة: للحصول على تفاعل وضع علامات أكثر فعالية، استخدم تركيز بروتين مستضد ≥0.5 ملغم/مل.
- احسب العدد المولي لكل بروتين مستضد والأعداد المولية للبيوتين و Ru Sulfo-NHS. أضف كمية مناسبة من البيوتين أو Ru Sulfo-NHS إلى بروتين المستضد لوضع العلامات على التفاعل وفقا للنسبة المولية لبروتين المستضد إلى البيوتين أو Ru Sulfo-NHS.
- بالنسبة للمستضد الذي يحتوي على وزن جزيئي أصغر (≤10 كيلو دالتون) ، مثل بروتين البروأنسولين ، استخدم نسبة مولية تبلغ 1: 5 (المستضد: البيوتين و Ru Sulfo-NHS). بالنسبة للمستضد الذي يحتوي على وزن جزيئي أكبر (>50 كيلو دالتون) ، مثل بروتين GAD ، استخدم نسبة مولية تبلغ 1:20. بالنسبة للمستضد الذي له وزن جزيئي متوسط (10-50 kDa) ، استخدم نسبة مولية معدلة بين 1: 5-1: 20.
- بالنسبة لكل من البيوتين و Ru Sulfo-NHS ، قسم كل وزن مستضد على أوزانه الجزيئية المقابلة للحصول على الرقم المولي للمستضد لكل واحد. اقسم العدد المولي على التركيز للحصول على حجم البيوتين. كرر هذا ل Ru Sulfo-NHS.
- امزج بروتين المستضد مع البيوتين باستخدام النسبة المولية المناسبة ، المحددة في الخطوة 2.2. ثم افعل الشيء نفسه مع Ru Sulfo-NHS.
ملاحظة: من أجل كفاءة تفاعل وضع العلامات ، يجب استبدال أي مواد كيميائية مختزلة مثل Tris أو glycine في نظام التخزين المؤقت إلى 2x PBS buffer ، الرقم الهيدروجيني 7.9 بواسطة عمود الدوران التحجيمي. بروتوكولات وضع العلامات للبيوتين و Ru Sulfo-NHS متطابقة. - قم بتغطية أنابيب التفاعل بورق الألومنيوم واحتضنها في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 1 ساعة. السبب في تغطية أنابيب التفاعل مع احباط هو أن كلا من البيوتين و Ru Sulfo-NHS الكواشف حساسة للضوء.
- قم بتعبئة عمود الدوران 2 مل أو 5 مل أثناء احتضان أنابيب التفاعل (يتم تحديد حجم عمود الدوران من خلال الحجم الذي تم تحميله على العمود). املأ عمود الدوران بمخزن مؤقت 2x PBS ثم قم بطرده مركزيا عند 1000 × g لمدة دقيقتين في كل مرة ، ليصبح المجموع ثلاث مرات.
- أوقف تفاعل وضع العلامات بعد انتهاء أنابيب التفاعل من الحضانة. لوقف التفاعل ، قم بتنقية بروتين المستضد المسمى عن طريق تمريره عبر عمود الدوران مرة واحدة. ثم الطرد المركزي للعمود عند 1000 × g لمدة 2 دقيقة.
- احسب إجمالي تركيز المستضد المسمى بقسمة كمية بروتين المستضد الموجودة على الحجم النهائي. Aliquot 50 ميكرولتر من بروتين المستضد المسمى النقي لكل أنبوب وتخزين aliquots في -80 درجة مئوية للاستخدام على المدى الطويل.
ملاحظة: من المهم أن تدرك أنه في كل مرة يمر فيها عمود الدوران ببروتين المستضد ، سيكون هناك معدل احتفاظ يتراوح بين 90 و 95٪.
3. تحديد أفضل تركيز ونسب للمستضدتين الموسومتين للفحص (فحص رقعة الشطرنج)
ملاحظة: نظرا لأن فحص ECL-IAA في هذا الفحص 7-Plex يتطلب معالجة حمضية لعينات المصل ، فإن فحص رقعة الشطرنج لكل مستضد يجب أن يمر بهذه الخطوة قبل احتضانه بخليط المستضد الموسوم.
- قم بتطبيق فحص رقعة الشطرنج لكل مستضد على حدة قبل تشغيل فحص الإرسال المتعدد. ستستخدم الخطوات من 3.2 إلى 3.6 GAD65 كمثال.
- احسب تخفيف بروتين GAD65 الموسوم. التركيز المستهدف الموصى به لأول محلول خليط من GAD65 البيوتينيل هو 2000 نانوغرام / مل و Ru Sulfo-NHS المسمى GAD65 هو 1000 نانوغرام / مل. إذا كان تركيز كل من البيوتينيل و Ru Sulfo-NHS المسمى GAD65 في محلول المخزون هو 1.0 ميكروغرام / ميكرولتر ، فإن الحجم اللازم ل GAD65 البيوتينيل في 560 ميكرولتر من محلول العمل سيكون 1.12 ميكرولتر ، وسيكون الحجم اللازم ل Ru Sulfo-NHS المسمى GAD65 في 700 ميكرولتر من محلول العمل 0.7 ميكرولتر.
- امزج 1.12 ميكرولتر من بروتين GAD65 الحيوي مع 240 ميكرولتر من الرابط المقترن بالستربتافيدين 1 في أنبوب واحد و 160 ميكرولتر من 1٪ BSA. احتضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. أضف 160 ميكرولتر من محلول التوقف إلى الأنبوب واحتضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة أخرى.
- جعل التخفيف التسلسلي. خذ 280 ميكرولتر من الخليط إلى أنبوب جديد وأضف 280 ميكرولتر من محلول التوقف لإجراء تخفيف 1: 2. إعداد عدة أنابيب جديدة. كرر هذه الخطوة لتشغيل تخفيف تسلسلي أفقي للبيوتين المسمى مستضد GAD65 (راجع المنشور السابق12).
- امزج 0.7 ميكرولتر من بروتين Ru Sulfo-NHS المسمى GAD65 (1 ميكروغرام / ميكرولتر) مع 700 ميكرولتر من محلول الإيقاف. ثم خذ 350 ميكرولتر من الخليط إلى أنبوب جديد وأضف 350 ميكرولتر من محلول التوقف لإجراء تخفيف 1: 2. قم بإعداد العديد من الأنابيب الجديدة ، كرر هذه الخطوة لتشغيل تخفيف تسلسلي رأسي لمستضد Ru Sulfo-NHS المسمى GAD65.
- قم بإعداد عينتين من المصل ، عينة إيجابية للغاية ل GADA وعينة واحدة سلبية ل GADA ، لكل منها حجم 0.75 مل. Aliquot 15 ميكرولتر من المصل الإيجابي في كل بئر على النصف الأيسر من لوحة PCR 96 بئر. Aliquot 15 ميكرولتر من المصل السلبي في كل بئر على النصف الأيمن من لوحة PCR 96 بئر.
- أضف 18 ميكرولتر من 0.5 متر من حمض الخليك في كل بئر واخلط. احتضان لمدة 45 دقيقة في RT. قم بإعداد لوحة PCR جديدة بسعة 96 بئرا. أضف 17.5 ميكرولتر من المستضد المسمى بالبيوتين و 17.5 ميكرولتر من المستضد المسمى Ru Sulfo-NHS في كل بئر وفقا للتخفيفات التسلسلية (راجع المنشور السابق12).
- تابع بقية خطوات الفحص الموضحة في الخطوة 5.2 إلى 9.1.
- أوجد نسبة الإشارة من العينات الموجبة العالية مقابل إشارات العينة السالبة المقابلة. اختر أفضل تركيز للمستضد المسمى بالبيوتين والمستضد المسمى Ru Sulfo-NHS من خلال تحديد النقطة التي تحتوي على أعلى أو بالقرب من أعلى نسبة من الإشارة الإيجابية إلى السلبية. في حساب النسبة هذا ، ضع في اعتبارك إشارة الخلفية المنخفضة التي تم الحصول عليها من العينات السلبية.
ملاحظة: ترد أدناه التركيزات المثلى لبروتينات المستضدات المسماة Ru Sulfo-NHS والبيوتين من مقايسات رقعة الشطرنج: 30 نانوغرام/مل و200 نانوغرام/مل ل GAD65 و 120 نانوغرام/مل و 120 نانوغرام/مل للبروأنسولين و 10 نانوغرام/مل و 42 نانوغرام/مل ل IA-2 و 80 نانوغرام/مل و 80 نانوغرام/مل ل TG و 8 نانوغرام/مل و 16 نانوغرام/مل ل TPO 31 نانوغرام/مل و31 نانوغرام/مل ل ThG، و 12 نانوغرام/مل و 12 نانوغرام/مل ل IFNα.
4. إنشاء حل المستضد المختلط المرتبط بالوصلة
- حدد التركيز الأمثل لكل مستضد بناء على فحص رقعة الشطرنج. تمييع البيوتين و Ru Sulfo-NHS المسمى مستضد لتركيز العمل العقلاني.
- ربط روابط مختلفة بكل من بروتينات المستضدات البيوتينيل الفريدة. لفحص لوحة واحد من 96 بئرا ، امزج 4 ميكرولتر من GAD65 الحيوي ، و TPO ، و tTG ، و ThG ، و proinsulin ، و IFN-α و IA-2 مع 240 ميكرولتر من الرابط المترافق مع الستربتافيدين 1 و 2 و 3 و 4 و 8 و 9 و 10 في أنبوب منفصل (الشكل 1). ثم أضف 156 ميكرولتر من PBS / 1٪ BSA لكل أنبوب. احتضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- أضف 160 ميكرولتر من محلول التوقف في كل أنبوب واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة أخرى. خذ 400 ميكرولتر من المستضد المقترن بالوصلة من كل أنبوب، واجمع جميع المستضدات ال 7 معا. أضف 1.2 مل من محلول التوقف ثم أضف 4 ميكرولتر من Ru Sulfo-NHS المسمى GAD65 و TPO و tTG و ThG و proinsulin و IFN-α ومستضد IA-2 إلى الخليط. الآن حل المستضد جاهز للاستخدام في الفحص.
5. احتضان عينات المصل مع المستضد المسمى
ملاحظة: نظرا لأن فحص ECL-IAA في هذا الفحص 7-Plex يتطلب معالجة حمضية لعينات المصل ، فإن كل مصل يتطلب خطوة معالجة الحمض قبل احتضانه بخليط مستضد مسمى لهذا الفحص 7-Plex.
- Aliquot 15 ميكرولتر من المصل لكل بئر للوحة PCR 96 بئر. أضف 18 ميكرولتر من 0.5 متر من حمض الخليك في كل بئر واخلط. احتضان لمدة 45 دقيقة في RT. قم بإعداد لوحة PCR جديدة من 96 بئرا و aliquot 35 ميكرولتر من محلول المستضد في كل بئر.
- بينما لا تزال اللوحة حاضنة ، أضف 13 ميكرولتر من 1 M Tris pH 9.0 المخزن المؤقت إلى كل بئر في لوحة المستضد. أضف المخزن المؤقت إلى جانب كل بئر للحد من خلط المخزن المؤقت Tris والمستضد. بعد اكتمال الحضانة ، خذ 25 ميكرولتر من المصل المعالج بالحمض ، وقم بماصته على الفور في كل بئر على لوحة المستضد. حرك المحلول وقم بتغطية اللوحة بورق ختم PCR لتجنب التعرض للضوء.
- في RT ، ضع اللوحة على شاكر ، مضبوط بسرعة منخفضة ، لمدة 1 ساعة. بعد ذلك ، قم بتخزين اللوحة عند 4 درجات مئوية واترك اللوحة تحضن لمدة 18-24 ساعة.
6. إعداد لوحة متعددة الإرسال
- خذ صفيحة متعددة الإرسال من الثلاجة التي تبلغ درجة حرارتها 4 درجات مئوية واسمح للطبق بالوصول إلى RT. بمجرد أن تكون اللوحة متعددة الإرسال في RT ، أضف 150 ميكرولتر من 3٪ Blocker A إلى كل بئر. قم بتغطية اللوحة متعددة الإرسال بورق الختم. احتضن الطبق في ثلاجة 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظة: يتضمن يوم الفحص 1 الخطوات من 4 إلى 6.
7. نقل مصل / مستضد يحتضن في لوحة متعددة الإرسال
- في اليوم التالي ، ضع المناشف الورقية على الطاولة وخذ لوحة الإرسال المتعدد المحتضنة من الثلاجة. أفرغ كل المخزن المؤقت من اللوحة. للقيام بذلك ، اقلب اللوحة رأسا على عقب وربت عليها على المناشف الورقية المعدة حتى لا يكون هناك مخزن مؤقت موجود في أي من الآبار.
- اغسل اللوحة متعددة الإرسال بإضافة 150 ميكرولتر من PBST إلى كل بئر. تجاهل المخزن المؤقت، كما هو مذكور في الخطوة 7.1.، وكرر هذه الخطوة ثلاث مرات. أضف 30 ميكرولتر من مصل / مستضد يحتضن في كل بئر في لوحة الإرسال المتعدد. قم بتغطية اللوحة بورق القصدير للحد من تعرضها للضوء. ضع اللوحة على شاكر صفيحة ، مضبوطة على سرعة منخفضة ، في RT لمدة 1 ساعة.
8. اغسل اللوحة وأضف المخزن المؤقت للقراءة
- قم بإزالة حاضنات المصل / المستضد من لوحة الإرسال المتعدد عن طريق إمساك الصفيحة رأسا على عقب وإخراج المحلول. أضف 150 ميكرولتر من PBST إلى جميع الآبار وقم بإزالة المخزن المؤقت من اللوحة عن طريق تثبيت اللوحة رأسا على عقب مرة أخرى وإخراج المحلول. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات. بعد اكتمال الغسيل الثالث ، أضف 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للقراءة في كل بئر.
ملاحظة: تتداخل فقاعات الهواء مع قدرة آلة قارئ الألواح على تحليل نتائج اللوحة بدقة ويجب تجنبها بأي ثمن.
9. قراءة اللوحة وتحليل البيانات
- عد اللوحة المحضرة على آلة قارئ اللوحات، واقرأ جميع القيم بالعد في الثانية (CPS).
- احسب المؤشر النسبي للفحص ، باستخدام مستويات الأجسام المضادة التي تم الحصول عليها من آلة قارئ الصفائح ، مع المعادلة التالية:
قيمة المؤشر = [CPS (عينة) - CPS (معيار سلبي)] / [CPS (معيار إيجابي) - CPS (معيار سلبي)]. - حدد نتائج الأجسام المضادة السلبية أو الإيجابية باستخدام القطع التي تم إنشاؤها.
ملاحظة: يتضمن يوم الفحص 2 الخطوات من 7 إلى 9.
Representative Results
ويبين تحليل نتائج الفحص في الجدول 1 والجدول 2 والجدول 3. تأتي قيم القراءة من البيانات من 10 نقاط داخل نفس البئر. تم حساب قيم الفهرس لكل عينة مقابل الضوابط الداخلية الإيجابية والسلبية المقابلة لها كما هو موضح في بروتوكول المقايسة. وترد أمثلة على التكرارات السيئة في الجدول 1 والتي تسببت في حدوث خطأ في حساب الفهرس النهائي في الجدول 3. يجب التحقق من جميع قيم العد الخام لتجنب أي نتائج إيجابية خاطئة أو سلبية خاطئة.
تم التحقق من صحة فحص ECL متعدد الإرسال 7 باستخدام مجموعة كبيرة من العينات من 1026 مريضا تم تشخيصهم حديثا ب T1D و 1022 من العمر والجنس المتطابقين مع مواضيع التحكم الصحية. تمت مقارنة مستويات الأجسام المضادة الذاتية من فحص 7-Plex ECL ل 1026 مريضا T1D مع المستويات من كل من اختبارات ECL الفردية المقابلة لدينا كما هو موضح في الشكل 2 ومن كل RBA قياسي واحد مقابل و ELISA كما هو موضح في الشكل 3. تم إعداد خصائص الفحص متطابقة عند 99في المائة لجميع اختبارات الأجسام المضادة الذاتية باستثناء الأجسام المضادة الذاتية للغدة الدرقية (حيث تم استخدام النسبة المئوية 95) ، من 1022 عنصر تحكم صحي لجميع طرق الفحص الثلاثة (7-Plex ECL أو ECL مفرد أو RBA أو ELISA) كما هو مدرج في الجدول 4. السير الذاتية بين الفحص من GADA و IA-2A و IAA و TPOA و THGA و TGA و IFNαA هي 6.4٪ و 4.5٪ و 9.1٪ و 4.9٪ و 5.7٪ و 11.3٪ و 5.9٪ على التوالي.
تم العثور على عدد صغير من العينات المتضاربة لكل من الأجسام المضادة الذاتية ال 7 حول خط الحدود من القطع لكل مقايسة (الشكل 2 والشكل 3). تم العثور على إحدى عشرة عينة تحكم (11/1022 ، 1.1٪) إيجابية متعددة للأجسام المضادة الذاتية فقط في فحص 7-Plex وسالبة في كل فحص واحد مقابل. وبالمثل ، حدث ذلك في 9 عينات من مرضى T1D (9/1026 ، 0.9٪). بالإضافة إلى ذلك ، تم تفويت 10 TPOA إيجابية عالية و ThGA واحد في مجموعة المرضى التي شوهدت في كل من فحص ECL الفردي و RBA في فحص 7-Plex. تم تحويل هذه العينات إيجابية في فحص 7-Plex عندما تم تخفيفها أكثر. بشكل عام ، تمت تغطية 100٪ من الإيجابية في فحص ECL الفردي أو RBA في اختبار ECL 7-Plex ، بنفس خصوصية المقايسة كما هو موضح في الجدول 4.
الشكل 1: رسم توضيحي لفحص Mutiplex ECL.
الأجسام المضادة الذاتية في المصل سوف تربط مستضد Ru Sulfo-NHSged بمستضد البيوتينيلات. ويقترن ذلك برابط محدد لتشكيل مجمع من رابط المستضد والأجسام المضادة والمستضدات. يتم التقاط المجمعات على اللوحة ويتم تقييدها إلى مواقعها المحددة من خلال كل رابط محدد. يتم توضيح أرقام الروابط المقترنة على وجه التحديد ، ل 7 بروتينات مستضدية مختلفة. يتم الكشف عن إشارات الأجسام المضادة باستخدام مستضدات Ru Sulfo-NHS المسماة بالمستضدات مع التلألؤ الكهروكيميائي. الرقم مأخوذ من Gu, Y. et al.13. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مقارنة 7 مستويات من الأجسام المضادة الذاتية في 1026 مريضا جديدا يعانون من T1D بين فحص ECL الفردي وفحص ECL 7-Plex.
تعرض اللوحات A و B و C و D و E و F و G مقارنات لمستويات الأجسام المضادة الذاتية ل GADA و IA-2A و IAA و TKA و TPOA و THGA و IFNαA ، على التوالي. تمثل الخطوط المنقطة قطع الفحص لكل فحص للأجسام المضادة الذاتية. تم تعيين القطع إلى النسبة المئوية 99 من 1022 ضوابط صحية مطابقة للعمر لكل فحص (باستثناء TPOA و ThGA اللذين تم تعيينهماعلى النسبة المئوية 95) ، كما هو موضح في الجدول 4 ، من سن 1022 مطابقة الضوابط الصحية لكل من فحوصات ECL الفردية والمتعددة الإرسال. يتم وضع علامة على الماس الأحمر المغلق على أنه إيجابيات "كاذبة" في فحص 7-Plex ECL ، <1٪ من المجموعة التي تمت دراستها ، وتم التحقق من صحتها على أنها سلبية في كل من ECL الفردي و RBA. يتم وضع علامة على المربعات الحمراء القريبة على أنها سلبيات "كاذبة" في فحص ECL 7-Plex الناجم عن ظاهرة "prozone" ، والتي تحدث بشكل رئيسي في فحص TPOA في <1٪ من المجموعة التي تمت دراستها. تتم مناقشة كل من هذه النتائج الإيجابية الكاذبة والسلبية الكاذبة في قسم المناقشة. الرقم مأخوذ من Gu, Y. et al.13. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مقارنة 7 مستويات من الأجسام المضادة الذاتية في 1026 مريضا جديدا يعانون من T1D بين RBA (ELISA for IFNαA) وفحص 7-Plex ECL.
تقدم اللوحات A و B و C و D و E و F و G مقارنات لمستويات الأجسام المضادة الذاتية ل GADA و IA-2A و IAA و TKA و TPOA و THGA و IFNαA ، على التوالي. تمثل الخطوط المنقطة قطع الفحص لكل فحص للأجسام المضادة الذاتية ، وهي نفس الخصوصية المحددة لكل من RBA و 7-Plex ECL ، كما هو موضح في الجدول 4 ، من سن 1022 مطابقة الضوابط الصحية. يمثل الماس والمربعات الحمراء المغلقة إيجابيات "كاذبة" وسلبيات "كاذبة" تظهر في فحص 7-Plex ECL ، ويظهر الشيء نفسه في الشكل 2. الرقم مأخوذ من Gu, Y. et al.13. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | ||
| A | 5580 | 5674 | 105 | 117 | 125 | 139 | لينكر-1 |
| 100 | 108 | 102 | 102 | 3956 | 3745 | لينكر-2 | |
| 115 | 124 | 107 | 116 | 113 | 124 | لينكر-3 | |
| 67 | 64 | 68 | 61 | 65 | 69 | لينكر-4 | |
| 89 | 87 | 98 | 92 | 90 | 80 | لينكر-5 | |
| 87 | 71 | 89 | 87 | 61 | 72 | لينكر-6 | |
| 94 | 82 | 79 | 85 | 2154 | 2280 | لينكر-7 | |
| 75 | 66 | 1628 | 1594 | 81 | 83 | لينكر-8 | |
| 98 | 103 | 71 | 84 | 69 | 85 | لينكر-9 | |
| 102 | 118 | 93 | 98 | 113 | 99 | لينكر-10 | |
| B | 324 | 337 | 147 | 148 | 5426 | 5366 | لينكر-1 |
| 101 | 102 | 93 | 88 | 86 | 74 | لينكر-2 | |
| 111 | 119 | 119 | 123 | 66 | 72 | لينكر-3 | |
| 72 | 65 | 59 | 68 | 74 | 67 | لينكر-4 | |
| 81 | 98 | 83 | 92 | 79 | 72 | لينكر-5 | |
| 90 | 84 | 93 | 86 | 70 | 76 | لينكر-6 | |
| 101 | 105 | 101 | 97 | 956 | 944 | لينكر-7 | |
| 82 | 83 | 189 | 204 | 97 | 90 | لينكر-8 | |
| 92 | 83 | 78 | 64 | 82 | 78 | لينكر-9 | |
| 83 | 79 | 88 | 93 | 4722 | 4965 | لينكر-10 | |
| C | 110 | 110 | 87 | 81 | 2114 | 2365 | لينكر-1 |
| 5526 | 5680 | 88 | 70 | 86 | 93 | لينكر-2 | |
| 114 | 132 | 67 | 71 | 3326 | 3284 | لينكر-3 | |
| 64 | 62 | 88 | 74 | 64 | 80 | لينكر-4 | |
| 94 | 82 | 86 | 75 | 89 | 76 | لينكر-5 | |
| 77 | 87 | 75 | 63 | 70 | 86 | لينكر-6 | |
| 77 | 86 | 71 | 84 | 138 | 121 | لينكر-7 | |
| 73 | 86 | 80 | 79 | 59 | 73 | لينكر-8 | |
| 86 | 74 | 5064 | 4923 | 88 | 86 | لينكر-9 | |
| 105 | 113 | 85 | 80 | 124 | 114 | لينكر-10 | |
| D | 98 | 88 | 92 | 84 | 136 | 127 | لينكر-1 |
| 288 | 291 | 86 | 86 | 558 | 564 | لينكر-2 | |
| 109 | 101 | 74 | 73 | 141 | 127 | لينكر-3 | |
| 78 | 66 | 66 | 55 | 74 | 66 | لينكر-4 | |
| 79 | 83 | 79 | 86 | 96 | 91 | لينكر-5 | |
| 83 | 86 | 96 | 89 | 86 | 73 | لينكر-6 | |
| 87 | 89 | 77 | 87 | 841 | 855 | لينكر-7 | |
| 74 | 72 | 60 | 72 | 90 | 95 | لينكر-8 | |
| 68 | 75 | 331 | 328 | 2460 | 2580 | لينكر-9 | |
| 86 | 98 | 80 | 75 | 123 | 133 | لينكر-10 | |
| E | 101 | 114 | 101 | 106 | 532 | 548 | لينكر-1 |
| 101 | 96 | 110 | 104 | 682 | 675 | لينكر-2 | |
| 6015 | 5988 | 124 | 126 | 101 | 98 | لينكر-3 | |
| 66 | 71 | 82 | 71 | 80 | 62 | لينكر-4 | |
| 102 | 97 | 99 | 80 | 83 | 110 | لينكر-5 | |
| 82 | 67 | 81 | 80 | 60 | 85 | لينكر-6 | |
| 85 | 95 | 52 | 84 | 245 | 221 | لينكر-7 | |
| 72 | 78 | 82 | 74 | 486 | 503 | لينكر-8 | |
| 77 | 97 | 97 | 77 | 56 | 66 | لينكر-9 | |
| 114 | 104 | 5726 | 5814 | 259 | 253 | لينكر-10 | |
| F | 119 | 120 | 133 | 118 | 112 | 96 | لينكر-1 |
| 101 | 91 | 100 | 95 | 96 | 82 | لينكر-2 | |
| 406 | 395 | 111 | 123 | 2127 | 101 | لينكر-3 | |
| 72 | 60 | 86 | 72 | 79 | 83 | لينكر-4 | |
| 76 | 85 | 96 | 99 | 89 | 103 | لينكر-5 | |
| 88 | 78 | 91 | 83 | 89 | 95 | لينكر-6 | |
| 104 | 97 | 87 | 102 | 56 | 66 | لينكر-7 | |
| 76 | 77 | 79 | 93 | 69 | 75 | لينكر-8 | |
| 85 | 71 | 95 | 100 | 83 | 71 | لينكر-9 | |
| 131 | 131 | 358 | 364 | 92 | 86 | لينكر-10 | |
| G | 90 | 95 | 85 | 82 | 105 | 107 | لينكر-1 |
| 99 | 86 | 77 | 76 | 1250 | 1174 | لينكر-2 | |
| 119 | 123 | 120 | 118 | 112 | 108 | لينكر-3 | |
| 76 | 83 | 77 | 80 | 86 | 76 | لينكر-4 | |
| 88 | 86 | 86 | 93 | 107 | 92 | لينكر-5 | |
| 73 | 73 | 71 | 82 | 84 | 75 | لينكر-6 | |
| 5210 | 5173 | 72 | 69 | 76 | 85 | لينكر-7 | |
| 80 | 81 | 79 | 82 | 100 | 101 | لينكر-8 | |
| 96 | 97 | 89 | 83 | 65 | 83 | لينكر-9 | |
| 98 | 103 | 86 | 88 | 1933 | 1979 | لينكر-10 | |
| H | 114 | 124 | 81 | 86 | 299 | 295 | لينكر-1 |
| 107 | 92 | 69 | 72 | 4256 | 4388 | لينكر-2 | |
| 114 | 123 | 125 | 129 | 501 | 536 | لينكر-3 | |
| 77 | 70 | 67 | 64 | 74 | 62 | لينكر-4 | |
| 92 | 110 | 81 | 84 | 77 | 71 | لينكر-5 | |
| 87 | 79 | 72 | 76 | 83 | 81 | لينكر-6 | |
| 328 | 341 | 84 | 80 | 88 | 97 | لينكر-7 | |
| 75 | 84 | 75 | 90 | 74 | 83 | لينكر-8 | |
| 73 | 79 | 78 | 76 | 84 | 70 | لينكر-9 | |
| 113 | 120 | 81 | 76 | 2372 | 2350 | لينكر-10 | |
الجدول 1: تحليل فحص ECL 7-plex: عدد CPS الخام (النصف الأيسر من اللوحة). يتم الحصول على أعداد CPS الخام من لوحة فحص (النصف الأيسر من اللوحة) ويتم تنفيذ كل عينة في نسختين. تحت كل صف من صفوف اللوحة (A-H) ، هناك 10 أسطر من قيم القراءة تمثل البيانات من 10 نقاط داخل نفس البئر ، تتوافق مع كل رقم رابط كما هو محدد. يتم تمييز أمثلة التكرارات السيئة باللون الرمادي ، كما هو موضح في الصف F-linker 3-columns 5 و 6.
| صف الجدول 1 ألف | عمود الجدول 1 ألف | لينكر 1 | لينكر 2 | لينكر 3 | لينكر 7 | لينكر 8 | لينكر 9 | لينكر 10 | |
| A | 1-2 | GADA PC | 5627 | 104 | 120 | 88 | 71 | 101 | 110 |
| B | 1-2 | GADA منخفض الكمبيوتر | 331 | 102 | 115 | 103 | 83 | 88 | 81 |
| C | 1-2 | TPOA PC | 110 | 5603 | 123 | 82 | 80 | 80 | 109 |
| D | 1-2 | TPOA كمبيوتر منخفض | 93 | 290 | 105 | 88 | 73 | 72 | 92 |
| E | 1-2 | TGA PC | 108 | 99 | 6002 | 90 | 75 | 87 | 109 |
| F | 1-2 | TG كمبيوتر منخفض | 120 | 96 | 401 | 101 | 77 | 78 | 131 |
| G | 1-2 | ThGA PC | 93 | 93 | 121 | 5192 | 81 | 97 | 101 |
| H | 1-2 | ThGA منخفض الكمبيوتر | 119 | 100 | 119 | 335 | 80 | 76 | 117 |
| A | 3-4 | IAA PC | 111 | 102 | 112 | 82 | 1611 | 78 | 96 |
| B | 3-4 | IAA كمبيوتر منخفض | 148 | 91 | 121 | 99 | 197 | 71 | 91 |
| C | 3-4 | IFNaA PC | 84 | 79 | 69 | 78 | 80 | 4994 | 83 |
| D | 3-4 | IFNaA كمبيوتر منخفض | 88 | 86 | 74 | 82 | 66 | 330 | 78 |
| E | 3-4 | IA-2A PC | 104 | 107 | 125 | 68 | 78 | 87 | 5770 |
| F | 3-4 | IA-2A كمبيوتر منخفض | 126 | 98 | 117 | 95 | 86 | 98 | 361 |
| G | 3-4 | نورث كارولاينا | 84 | 77 | 119 | 71 | 81 | 86 | 87 |
| H | 3-4 | نورث كارولاينا | 84 | 71 | 127 | 82 | 78 | 77 | 79 |
| A | 5-6 | عينة1 | 132 | 3851 | 119 | 2217 | 82 | 77 | 106 |
| B | 5-6 | عينة2 | 5396 | 80 | 69 | 950 | 94 | 80 | 4844 |
| C | 5-6 | عينة3 | 2240 | 90 | 3305 | 130 | 66 | 87 | 119 |
| D | 5-6 | عينة4 | 132 | 561 | 134 | 848 | 93 | 2520 | 128 |
| E | 5-6 | عينة5 | 540 | 679 | 100 | 233 | 495 | 61 | 256 |
| F | 5-6 | عينة6 | 104 | 89 | 1114 | 61 | 72 | 77 | 89 |
| G | 5-6 | عينة7 | 106 | 1212 | 110 | 81 | 101 | 74 | 1957 |
| H | 5-6 | عينة8 | 297 | 4322 | 519 | 93 | 79 | 77 | 2361 |
الجدول 2: تحليل فحص ECL 7-plex: ترتيب بيانات الجدول 1 ، مع وضع علامة على أنها 7 روابط. وأعيد ترتيب البيانات المستمدة من الجدول 1، مع حذف الروابط من 4 إلى 6 (غير المستخدمة)، وحسبت القيم المتوسطة من كل قراءة مكررة من الجدول 1. قيم الضوابط الإيجابية القياسية الداخلية العالية والمنخفضة ، المقابلة لكل فحص للأجسام المضادة الذاتية ، المقيدة بواسطة رابط معين ، هي بخط غامق مظلم. الكمبيوتر الشخصي ، والسيطرة الإيجابية. NC ، السيطرة العادية.
| مؤشر GAD | مؤشر TPOA | مؤشر TGA | مؤشر ThGA | IAA-Index | IFNaA-index | IA-2A-مؤشر | |
| GADA PC | 1.000 | 0.005 | 0.000 | 0.003 | -0.006 | 0.003 | 0.004 |
| GADA منخفض الكمبيوتر | 0.045 | 0.005 | -0.001 | 0.006 | 0.002 | 0.000 | -0.001 |
| IAA PC | 0.005 | 1.000 | 0.001 | 0.002 | -0.001 | -0.001 | 0.004 |
| IAA كمبيوتر منخفض | 0.002 | 0.039 | -0.002 | 0.003 | -0.005 | -0.003 | 0.001 |
| IA-2A PC | 0.004 | 0.004 | 1.000 | 0.004 | -0.004 | 0.000 | 0.004 |
| IA-2A كمبيوتر منخفض | 0.007 | 0.004 | 0.048 | 0.006 | -0.002 | -0.002 | 0.008 |
| TGA PC | 0.002 | 0.003 | 0.000 | 1.000 | 0.000 | 0.002 | 0.002 |
| TG كمبيوتر منخفض | 0.006 | 0.004 | 0.000 | 0.052 | -0.001 | -0.002 | 0.005 |
| TPOA PC | 0.005 | 0.005 | -0.001 | 0.002 | 1.000 | -0.002 | 0.001 |
| TPOA كمبيوتر منخفض | 0.012 | 0.003 | 0.000 | 0.006 | 0.076 | -0.003 | 0.001 |
| ThGA PC | 0.000 | 0.000 | -0.008 | 0.001 | 0.000 | 1.000 | -0.001 |
| ThGA منخفض الكمبيوتر | 0.001 | 0.002 | -0.008 | 0.002 | -0.009 | 0.050 | -0.002 |
| IFNaA PC | 0.004 | 0.006 | 0.001 | 0.000 | -0.002 | 0.000 | 1.000 |
| IFNaA كمبيوتر منخفض | 0.008 | 0.004 | 0.000 | 0.005 | 0.004 | 0.002 | 0.048 |
| نورث كارولاينا | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
| نورث كارولاينا | 0.000 | -0.001 | 0.001 | 0.002 | -0.002 | -0.002 | -0.001 |
| عينة1 | 0.009 | 0.683 | 0.000 | 0.419 | 0.001 | -0.002 | 0.003 |
| عينة2 | 0.958 | 0.001 | -0.008 | 0.172 | 0.009 | -0.001 | 0.837 |
| عينة3 | 0.389 | 0.002 | 0.542 | 0.012 | -0.009 | 0.000 | 0.006 |
| عينة4 | 0.009 | 0.088 | 0.003 | 0.152 | 0.008 | 0.496 | 0.007 |
| عينة5 | 0.082 | 0.109 | -0.003 | 0.032 | 0.271 | -0.005 | 0.030 |
| عينة6 | 0.004 | 0.002 | 0.169 | -0.002 | -0.006 | -0.002 | 0.000 |
| عينة7 | 0.004 | 0.205 | -0.002 | 0.002 | 0.013 | -0.002 | 0.329 |
| عينة8 | 0.039 | 0.768 | 0.068 | 0.004 | -0.001 | -0.002 | 0.400 |
الجدول 3: تحليل فحص ECL 7-plex: نتائج قيم المؤشر. تم حساب قيم المؤشر لكل عينة لجميع اختبارات الأجسام المضادة الذاتية ال 7 مقابل الضوابط الإيجابية والسلبية الداخلية المقابلة لها كما هو موضح في بروتوكول المقايسة. تم تعريف أي قيمة مؤشر أكبر من القيمة المقطوعة على أنها نتيجة إيجابية ، موضحة بخط غامق داكن. تم تمييز قيمة مؤشر TGA للعينة6 باللون الرمادي لأنها خطأ ناتج عن تكرارات سيئة تظهر في الصف F-linker 3-columns 5 و 6 في الجدول 1.
| غادا | IA-2A | الاكاديميه | .TGA | تبوا | ثغا | IFNαA* | ||||||||
| سينس | المواصفات | سينس | المواصفات | سينس | المواصفات | سينس | المواصفات | سينس | المواصفات | سينس | المواصفات | سينس | المواصفات | |
| بنك الاحتياطي الأسترالي | 73.4% | 98.5% | 75.2% | 99.0% | 47.7% | 99.1% | 12.9% | 99.0% | 23.9% | 95.2% | 19.3% | 94.7% | 1.0% | 99.6% |
| ECL واحد | 71.6% | 99.1% | 73.6% | 99.3% | 48.3% | 99.7% | 16.0% | 98.9% | 26.3% | 94.9% | 20.6% | 95.1% | 0.8% | 99.2% |
| 7-بلكس ECL | 71.2% | 98.9% | 77.3% | 98.9% | 49.5% | 98.9% | 16.5% | 98.7% | 26.1% | 94.7% | 21.1% | 94.7% | 1.7% | 99.1% |
الجدول 4: حساسية الفحص وخصوصيته بين 1026 مريضا من مرضى T1D و 1022 ضابطا ، متطابقة لكل من العمر والجنس ، في فحص ECL 7-plex ، مقارنة بفحص ECL الفردي المقابل و RBA أو ELISA *. تم تعيين فحوصات مختلفة ل T hree (RBA و ECL مفردة و 7-Plex ECL) لكل جسم مضاد ذاتي على خصائص مماثلة باستخدام الضوابط الصحية المتطابقة مع العمر والجنس 1022. تم تعيين نتيجة الخصوصية من مجموعة التحكم التي تمت دراستها حول 95٪ ل TPOA و ThGA و 99٪ ل 5 اختبارات أخرى. * علامة النجمة تشير إلى اختبار IFNαA ل ELISA ، في حين أن البعض الآخر هو RBA.
Discussion
في العديد من التجارب السريرية الوطنية والدولية لمرض السكري من النوع 1 ، تم إثبات أداء فحص ECL الفردي للكشف عن الأجسام المضادة الذاتية للجزيرة والأجسام المضادة الذاتية ل transglutaminase (TGA) لمرض الاضطرابات الهضمية ،8،9،10،11. خلال هذه المسارات ، زاد هذا الفحص من حساسية وخصوصية الكشف عن المستضدات الذاتية عند تقييمها مقابل معيار RBA "الذهبي" الحالي. يمكن النظر إلى خصوصية المرض المحسنة عند التمييز بين الأجسام المضادة الذاتية للجزيرة عالية التقارب وعالية الخطورة من إشارات منخفضة الخطورة ومنخفضة التقارب ، بين فحص ECL الفردي و RBA14,15,16,17. بناء على فحص ECL واحد ، فإننا نطرح فحصا جديدا للأجسام المضادة الذاتية ECL متعددة الإرسال عالية الإنتاجية ، لتمكيننا من فحص T1D بالإضافة إلى العديد من أمراض المناعة الذاتية القابلة للتطبيق في نفس الوقت.
يستخدم فحص ECL متعدد الإرسال لوحة متعددة الإرسال ، والتي يمكن أن تجمع بين ما يصل إلى 10 اختبارات للأجسام المضادة الذاتية في بئر واحد. بالنسبة للدراسة الحالية ، يتم الجمع بين 7 اختبارات الأجسام المضادة الذاتية معا. تتكون الأجسام المضادة الذاتية من 3 IAbs (IAA و GADA و IA-2A) ، و 2 من الأجسام المضادة الذاتية لأمراض الغدة الدرقية المناعية الذاتية (TPOA و ThGA) ، والأجسام المضادة الذاتية لمرض الاضطرابات الهضمية (TGA) ، والأجسام المضادة الذاتية APS-1 للإنترفيرون ألفا (IFNαA). تعتمد آلية الفحص ، بشكل عام ، على فحص ECL واحد كما تم نشره سابقا9،10،12،18 مع بعض التعديلات. الفرق الرئيسي لفحص ECL متعدد الإرسال من فحص ECL واحد هو أن كل مركب مستضد الأجسام المضادة المتشكل في مرحلة السائل مقيد برابط معين (الشكل 1). يتم احتضان مستضد البيوتين المسمى بالستربتافيدين المقترن ، وهو رابط يستخدم لتشكيل مجمع محدد لربط المستضدات. يتشكل مركب مناعي مستضد الأجسام المضادة بعد الحضانة مع مصل المريض ويتم التقاطه في بقعة محددة من خلال نظام الرابط المحدد على كل بئر من الصفيحة المتعددة. يوفر المستضد المسمى Ru Sulfo-NHS الذي تم التقاطه بواسطة الأجسام المضادة في نفس الوقت الإشارة مع التلألؤ الكيميائي الكهربائي. يمكن لآلة قارئ اللوحات اكتشاف ما يصل إلى 10 إشارات مختلفة من المصادر الفورية الموجودة في كل بئر. للحفاظ على اتساق اختبارات الأجسام المضادة الذاتية بين الصفائح وأثناء إجراء دراسات طويلة الأجل ، نقترح استخدام نفس الرابط.
قبل إعداد فحص ECL متعدد الإرسال ، يجب تحسين اختبارات ECL المفردة لكل جسم مضاد ذاتي على لوحة متعددة الإرسال ، على التوالي ، والتحقق من صحتها مقابل كل من اختبارات RBA و ECL المفردة على لوحة ECL العادية. لتعزيز فحص رقعة الشطرنج ، إلى فحص الأجسام المضادة الذاتية ذات الصلة على لوحة الإرسال المتعدد ، تم استخدام مريض إيجابي عالي وعينة سلبية من المريض. بعد إجراء فحص رقعة الشطرنج ، فإن التركيزات الأكثر مثالية ل Ru Sulfo-NHS والبيوتين تحمل علامة المستضد حيث يتم حسابها لكل من اختبارات الأجسام المضادة الذاتية 7. وفيما يلي بيان لهذه التركيزات: 30 نانوغرام/مل و200 نانوغرام/مل ل GAD65، و 120 نانوغرام/مل و 120 نانوغرام/مل للبروأنسولين، و 10 نانوغرام/مل و 42 نانوغرام/مل ل IA-2، و 80 نانوغرام/مل و 80 نانوغرام/مل ل TG، و 8 نانوغرام/مل و 16 نانوغرام/مل ل TPO، و 31 نانوغرام/مل و 31 نانوغرام/مل ل ThG، و 12 نانوغرام/مل و 12 نانوغرام/مل على التوالي ل IFNα13. قد تحتاج تركيزات بعض المستضدات من فحص رقعة الشطرنج إلى مزيد من التعديل وفقا للنتائج في فحص الإرسال المتعدد الفعلي بعد الجمع بين جميع المقايسات معا.
نظرا لأن IAA مدرج في فحص ECL متعدد الإرسال الحالي ، فإن المعالجة الحمضية لعينات المصل إلزامية قبل احتضان المصل بالمستضد ، كما ورد في الدراسة السابقة12. بشكل عام ، عند إضافة جسم مضاد ذاتي إضافي إلى فحص متعدد الإرسال ، تتأثر خلفية الفحص وقد تعيق إشارة عالية للغاية من بقعة واحدة ، في البئر ، نتائج البقع القريبة عبر المحادثة المتقاطعة. لذلك ، يجب أن يقتصر الحد الأقصى ل CPS على 20000 عدد لكل جسم مضاد ذاتي ، أو أقل ، لأعلى العينات الإيجابية. من معرفتنا ، من أجل تقليل كمية الأحاديث المتقاطعة المعنية ، يجب فصل الأجسام المضادة الذاتية التي لها خلفية أقل ، عند تصميم خريطة البقعة ، بعيدا عن البقع ذات التردد العالي للعدد.
تم استخدام ضوابط إيجابية وسلبية عالية داخليا في كل فحص لحساب مؤشر دقيق للعينات غير المعروفة التي يتم اختبارها. لتقييم حساسية الفحص ومراقبتها بدقة ، تم استخدام ضوابط إيجابية منخفضة ، تم تعيينها بالقرب من الحد الأعلى للفحص. تم إنشاء هذه الضوابط الإيجابية والسلبية القياسية بكميات كبيرة وأليكوت للاستخدام على المدى الطويل وتخزينها عند -20 درجة مئوية أو أقل ، من أجل الاتساق بين المقاييس. لأغراض ضمان الجودة ، تم تشغيل العينات مرتين في كل فحص وتم إعادة تشغيل كل نتيجة إيجابية وتأكيدها عن طريق تشغيل العينة في فحص ECL جديد في اليوم التالي. إذا كان هناك أي خلاف مع الفحص التأكيدي الأول والثاني ، فمن الضروري إجراء فحص ثالث. من بين الفحوصات الثلاثة التي أجريت ، حددت نتائج الفحصين المتفقين (على سبيل المثال ، + أو + أو -,-) ، النتيجة النهائية (الإيجابية أو السلبية) للعينة.
في العقد الماضي ، تسعى العديد من مجموعات الدراسة إلى إجراء فحص عالي الإنتاجية باستخدام طريقة تعدد الإرسال لدمج اختبارات الأجسام المضادة الذاتية المتعددة معا في بئر واحد لفحص أعداد كبيرة من السكان. هناك عدد قليل من الدراسات التي تستخدم أنواعا مختلفة من التقنيات لإجراء اختبارات الأجسام المضادة الذاتية متعددة الإرسال19،20،21،22 ، ولكن لا توجد مقارنة لأي من هذه الفحوصات في الحساسية والخصوصية مقابل معيار RBA "الذهبي" الحالي ، عند دراسة T1D. لا يتم التحقق من صحة هذه الأنواع المختلفة من المنصات المستخدمة من خلال ورشة العمل الدولية لبرنامج توحيد الأجسام المضادة الذاتية للجزيرة (IASP) أو من خلال اختبار مجموعات كبيرة في التجارب السريرية. في فحص عام قائم على السكان مؤخرا في ألمانيا ، يتم استخدام فحص مشترك عالي الإنتاجية ، 3 Screen ICATM ELISA وزعته Kronus ، كأداة لفحص الخط الأول للكشف عن ثلاثة IAbs ، GADA ، IA-2A ، و ZnT8A ، لتحقيق التشخيص المبكر للطفولة T1D23. يقيس فحص ELISA المكون من 3 شاشات 3 أجسام مضادة ذاتية إما في 3 آبار منفصلة ، تستهلك كمية كبيرة من المصل ، أو في بئر واحد مع خلط جميع الفحوصات الثلاثة. إذا كان أحد البئرين في فحص ELISA المكون من 3 شاشات إيجابيا ، فلن يتمكن المرء من التمييز بين أي من الأجسام المضادة الذاتية الثلاثة موجودة. أكبر عيب في هذا الفحص هو عدم قدرته على تضمين قياس IAA. جميع نتائج IAA التي أجرتها ELISA ، كما ثبت في ورش عمل IASP ، ليس لها حساسية وخصوصية مقبولة24. عادة ما يكون IAA أول IAb يظهر ولديه معدل انتشار مرتفع بين الأطفال الصغار. يعد فحص IAb ، مع IAA ، ضروريا للأطفال ولا يعتبر من المقبول إجراء هذا الفحص بدون IAA لتقييم مخاطر T1D في المجتمع. بالإضافة إلى ذلك ، لا توجد دراسات أو بيانات منشورة تظهر أن اختبار مجموعة Kronus IAb هو أكثر تحديدا لمرض T1D وقادر على التمييز بين المخاطر العالية و IAbs منخفضة المخاطر. تم التحقق من صحة فحص 7-Plex ECL ، في هذه الدراسة ، باستخدام مجموعة كبيرة من المرضى الذين تم تشخيصهم حديثا ب T1D13. بالمقارنة مع RBA القياسي الحالي وفحص ECL الفردي الراسخ ، فإن اختبار 7-Plex قادر على الاحتفاظ بالإيجابية بنسبة 100٪ بنفس خصوصية المقايسة (الجدول 4). حاليا ، يتم تطبيق فحص 4-Plex ECL ، بالتوازي مع RBA القياسي ، على تجربة سريرية كبيرة مستمرة: دراسة فحص المناعة الذاتية للأطفال (ASK). تقوم هذه التجربة بفحص الأطفال في عموم السكان ، في منطقة دنفر الحضرية ، بحثا عن T1D ومرض الاضطرابات الهضمية. بالمقارنة مع RBA القياسي المستخدم في دراسة ASK ، فإن فحص ECL متعدد الإرسال يظهر حساسية ممتازة وخصوصية أعلى للمرض ، مطابقة لتقاريرنا السابقة باستخدام دراسة ECL واحدة25. علاوة على ذلك ، أظهر فحص 4-Plex ECL انخفاضا واضحا في العمالة والتكلفة وحجم المصل بنسبة 70٪ ، مقارنة بالمقايسات الفردية 4 المقابلة ل ECL و RBA. باستخدام فحص ECL متعدد الإرسال ، يمكننا تخصيص كل بئر بأرقام مختلفة ، تمثل أجساما مضادة ذاتية مختلفة (حتى 10) ، لاختبار أمراض المناعة الذاتية المختلفة الخاصة باحتياجات موقع سريري معين.
هناك بعض القيود التي لوحظت ، كما هو موضح في هذه الدراسة ، لفحص ECL متعدد الإرسال باستخدام لوحة الإرسال المتعدد. لا يمكن تعديل التخفيف النهائي للمصل ، المحتضن بالمستضد ، للحصول على أفضل الظروف لكل فحص للأجسام المضادة الذاتية التي يتم دمجها في بئر واحد. لوحظت تسع عينات (9/1026) ، من مرضى T1D ، أن لها نتيجة سلبية خاطئة لأجسام مضادة ذاتية معينة. 7 من السلبيات الكاذبة كانت ل TPOA و 2 كانت ل ThGA ، في فحص 7-Plex ECL ، ولكن تم عرض نتائج إيجابية عالية في كل من فحص ECL الفردي و RBA (الشكل 2 و 3). بعد مزيد من التخفيف لجميع العينات ال 9 ، أصبحت إيجابية على لوحة الإرسال المتعدد. هذه النتيجة ناتجة عما نصفه بظاهرة "البروزون". تتسبب هذه الظاهرة في إظهار العينة نتيجة سلبية خاطئة لأن عيارات الأجسام المضادة العالية تؤثر على تكوين شبكات الأجسام المضادة المستضدات. عند إعداد فحص متعدد الإرسال ، يوصى بإجراء اختبارات مسبقة لتحديد التخفيف الاختياري للمصل لحضانة المستضدات ذات العيار العالي جدا ، لكل من الأجسام المضادة الذاتية مجتمعة. بدلا من ذلك ، يجب اختيار اختبارات الأجسام المضادة الذاتية ذات الظروف المحسنة المماثلة لتشكيل فحص مشترك يتم من خلاله تحقيق أفضل حساسية وخصوصية للفحص لكل جسم مضاد ذاتي. في هذه الدراسة ، أسفرت 7 عينات (7/1022) ، من الضوابط الطبيعية الصحية ، عن إيجابيات خاطئة للأجسام المضادة الذاتية المتعددة في فحص 7-Plex ، ولكن بعد إجراء فحص ECL واحد و RBA (الشكل 2 و 3) ، تم العثور على هذه الأجسام المضادة الذاتية سلبية في كلا الاختبارين. الأسباب الكامنة وراء هذه النتائج الإيجابية الخاطئة التي تحدث على لوحة الإرسال المتعدد ، لهذه المجموعة الفرعية الصغيرة من العينات ، غير معروفة حاليا. بالنسبة للتطبيق الحالي لفحص ECL متعدد الإرسال ، يتم تكرار جميع العينات الإيجابية مع فحص ECL الفردي المقابل لها لتأكيد الإيجابية ، مما يزيل هذا الخطأ الإيجابي الخاطئ من فحص ECL متعدد الإرسال.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة DK32083 ومنح JDRF 2-SRA-2015-51-Q-R و 2-SRA-2018-533-S-B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 °C refrigerator | |||
| –80 °C and -20 °C freezers | |||
| 96-well Plate Shaker | Wallac - Delfi | ||
| 96-well round bottom plate | Fisher | 8408220 | |
| Acetic acid solution | Fisher | ||
| Aluminum foil | |||
| Antigen proteins | |||
| Human GAD65 full length protein | Diamyd | ||
| Human ThG full length protein | BioMart | ||
| Human TPO full length protein | BioMart | ||
| IA-2 intracellular domain protein | BioMart | ||
| IFN-α protein | Abcam | ||
| Proinsulin protein | AmideBio | ||
| tTG protein | DiaRect | ||
| Biotin | Sigma | ||
| Bottle-Top 500 mL , Filter Units | Fisher | 0974064A or B | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A-7906 | |
| Distilled deionized (DD) water | |||
| HCl | Fisher | ||
| Ice maker | |||
| Ice trays | |||
| MSD Sector | Perkin-Elmer | ||
| Multi-channel pipette | |||
| NaOH | |||
| Paper tower | |||
| PBS | |||
| pH meter | |||
| Pipette-Aid | |||
| Pipettes/tips | |||
| Ru Sulfo-NHS | MSD (R91AN) | ||
| Trizma Base | Fisher | BP152-5 | |
| Tween 20 | Sigma | P-1379 | |
| Uplex Development Kit | MSD | ||
| 96-well UPlex plate | MSD | ||
| Blocker A | MSD | R93AA | |
| Linker-Streptavidin | MSD | ||
| Read buffer | MSD | R92TC | |
| Stop Solution | MSD | ||
| Vortex mixer | |||
| ZeBa Column | Pierce | 89892 |
References
- Harjutsalo, V., Sjoberg, L., Tuomilehto, J. Time trends in the incidence of type 1 diabetes in Finnish children: a cohort study. Lancet. 371 (9626), 1777-1782 (2008).
- Vehik, K., et al. Increasing incidence of type 1 diabetes in 0- to 17-year-old Colorado youth. Diabetes Care. 30 (3), 503-509 (2007).
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W.
- Insel, R. A., et al. Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association. Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).
- Barker, J. M., et al. Autoantibody "subspecificity" in type 1 diabetes: risk for organ-specific autoimmunity clusters in distinct groups. Diabetes Care. 28 (4), 850-855 (2005).
- Triolo, T. M., et al. Additional Autoimmune Disease Found in 33% of Patients at Type 1 Diabetes Onset. Diabetes Care. 34 (5), 1211-1213 (2011).
- de Graaff, L. C., Smit, J. W., Radder, J. K. Prevalence and clinical significance of organ-specific autoantibodies in type 1 diabetes mellitus. Netherlands Journal of Medicine. 65 (7), 235-247 (2007).
- Yu, L., et al. Proinsulin/Insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity. Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).
- Yu, L., et al. Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay. Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).
- Miao, D., et al. GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes. Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).
- Gu, Y., Zhao, Z., High, H., Yang, T., Yu, L. Islet Autoantibody Detection by Electrochemiluminescence (ECL) Assay. Journal of Clinical & Cellular Immunology. 8 (6), (2017).
- Gu, Y., et al. Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies. Journal of Visualized Experiments. (133), e57227 (2018).
- Gu, Y., et al. High-throughput multiplexed autoantibody detection to screen type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases simultaneously. Ebiomedicine. 47, 365-372 (2019).
- Dongmei, M., A, K. S., Li Zh, K., Michelle, G., Ling, J., Taylor, A. Electrochemiluminescence Assays for Insulin and Glutamic Acid Decarboxylase Autoantibodies Improve Prediction of Type 1 Diabetes Risk. Diabetes Technology & Therapeutics. 17 (2), 119-127 (2015).
- Steck, A. K., et al. ECL-IAA and ECL-GADA Can Identify High-Risk Single Autoantibody-Positive Relatives in the TrialNet Pathway to Prevention Study. Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (7), 410-414 (2016).
- Fouts, A., et al. Do Electrochemiluminescence Assays Improve Prediction of Time to Type 1 Diabetes in Autoantibody-Positive TrialNet Subjects. Diabetes Care. 39 (10), 1738-1744 (2016).
- Sosenko, J. M., et al. The Use of Electrochemiluminescence Assays to Predict Autoantibody and Glycemic Progression Toward Type 1 Diabetes in Individuals with Single Autoantibodies. Diabetes Technology & Therapeutics. 19 (3), 183-187 (2017).
- Zhao, Z., et al. Higher Sensitivity and Earlier Identification of Celiac Disease Autoimmunity by a Nonradioactive Assay for Transglutaminase Autoantibodies. Journal of Immunology Research. 2016, 5 (2016).
- Zhang, B., Kumar, R. B., Dai, H., Feldman, B. J. A plasmonic chip for biomarker discovery and diagnosis of type 1 diabetes. Nature Medicine. 20 (8), 948-953 (2014).
- Tsai, C. T., Robinson, P. V., Spencer, C. A., Bertozzi, C. R. Ultrasensitive Antibody Detection by Agglutination-PCR (ADAP). American Chemical Society Central Science. 2 (3), 139-147 (2016).
- Yim, S. W., et al. Four-color alternating-laser excitation single-molecule fluorescence spectroscopy for next-generation biodetection assays. Clinical chemistry. 58 (4), 707-716 (2012).
- Bale, S. S., et al. A highly sensitive microsphere-based assay for early detection of Type I diabetes. Technology. 02 (03), 200-205 (2014).
- Ziegler, A. G., et al. 3 Screen ELISA for High-Throughput Detection of Beta Cell Autoantibodies in Capillary Blood. Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (11), 687-693 (2016).
- Schlosser, M., et al. Diabetes Antibody Standardization Program: evaluation of assays for insulin autoantibodies. Diabetologia. 53 (12), 2611-2620 (2010).
- Zhao, Z., et al. A multiplex assay combining insulin, GAD, IA-2 and transglutaminase autoantibodies to facilitate screening for pre-type 1 diabetes and celiac disease. Journal of Immunological Methods. 430, 28-32 (2016).
