Summary
Vi modellerer et simpelt multiplekset ECL-assay, der kombinerer 7 autoantistofassays sammen. Analysen er i stand til at screene for T1D og flere andre autoimmune sygdomme samtidigt, herunder cøliaki, autoimmun skjoldbruskkirtelsygdom og autoimmun polyglandulært syndrom 1.
Abstract
Islet autoantistoffer (IAbs) anvendes i vid udstrækning i type 1-diabetes (T1D) diagnose og forudsigelse. Fire store IAb'er til insulin (IAA), glutamat decarboxylase-65 (GADA), insulinomantigen-2 (IA-2A) og zinktransportør-8 (ZnT8A) er lige så vigtige i sygdomsforudsigelse. I øjeblikket fortsætter op til 40% af patienterne diagnosticeret med T1D med at udvikle andre autoimmune lidelser. Desværre er de nuværende screeningsmetoder, der bruger et enkelt autoantistof til måling, besværlige og ineffektive til store screeningsundersøgelser. Vi har for nylig udviklet et simpelt multiplekset elektrokemiluminescens (ECL) assay for at løse disse aktuelle problemer. Analysen kombinerer alle 7 autoantistoftest i en brønd. Hvert brønd indeholder tre IAbs (IAA, GADA og IA-2A), autoantistoffer mod skjoldbruskkirtelperoxidase (TPOA) og skjoldbruskkirtelglobulin (ThGA) til påvisning af autoimmun skjoldbruskkirtelsygdom, autoantistoffer til vævstransglutaminase (TGA) til cøliaki og autoantistoffer til interferon alfa (IFNαA) til autoimmun polyglandulært syndrom-1 (APS-1); som alle screener for T1D og andre relevante autoimmune sygdomme samtidigt. Multiplex ECL-analysen er baseret på den enkelte ECL-analyseplatform, men bruger i stedet multiplexpladen, der kombinerer flere autoantistofassays, op til 10, i en enkelt brønd. Hovedforskellen fra det enkelte ECL-assay er, at hvert antistof-antigenkompleks dannet i væskefasen fastholdes på et bestemt sted på hver brønd gennem et linkersystem på multiplexpladen. 7-Plex ECL-assayet i denne undersøgelse er valideret mod standard radiobindingsassays (RBA) og enkelte ECL-assays ved hjælp af en stor kohorte af nydiagnosticerede T1D-patienter og aldersmatchede sunde kontroller, hvilket resulterer i fremragende analysefølsomhed og specificitet.
Introduction
Type 1-diabetes (T1D) er en alvorlig kronisk sygdom, der er mest almindelig i barndommen. I øjeblikket har omkring 1,4 millioner mennesker T1D i USA; Det er påfaldende, at forekomsten af T1D stiger støt med 3-5% hvert år på verdensplan og er fordoblet i de sidste to årtier, især hos små børn 1,2. Isole autoantistoffer (IAbs) i blodcirkulationen er den mest pålidelige biomarkør på nuværende tidspunkt. IAbs kan forekomme år før klinisk T1D udvikler3. I øjeblikket anvendes fire store IAb'er i vid udstrækning i T1D-diagnose og risikoscreening, herunder autoantistoffer mod insulin (IAA), glutamatdecarboxylase-65 (GADA), insulinomantigen-2 (IA-2A) og zinktransportør-8 (ZnT8A). Disse fire IAb'er er lige vigtige for forudsigelsen af T1D-udviklingen. Klassificeringen af T1D er for nylig blevet omdefineret som tilstedeværelsen af ≥2 af alle 4 IAbs med en normal glukosemetabolisme som sygdomsstadie 14.
I Diabetes Autoimmunity Study in the Young (DAISY) blev det afsløret, at et ud af fire børn med risiko for T1D sandsynligvis ville udvikle sig til ø, cøliaki, skjoldbruskkirtel eller reumatoid autoimmunitet, og mere slående udvikler ca. 40% af patienterne, der er blevet diagnosticeret med T1D, til sidst en yderligere autoimmun tilstand 5,6,7 . Identifikation af autoantistoffer er afgørende for forudsigelse og diagnosticering af disse autoimmune sygdomme og bør give bedre klinisk pleje til patienter. Der er ingen nem og billig måde på nuværende tidspunkt at screene for disse mange autoimmune tilstande. Nuværende screeningsmetoder ved hjælp af standard radiobindingsassay (RBA) med en enkelt autoantistofmåling er besværlige og ineffektive til en storstilet screening.
Her vil vi beskrive det nyudviklede enkle multipleksede ECL-assay, som vi har godkendt ved hjælp af en enkelt ECL-analyseplatform 8,9,10,11. Multiplex ECL-analysen kombinerer 7 autoantistoftest i en enkelt brønd ved kun at bruge 15 μL serum og er i stand til at screene for T1D og flere relevante autoimmune sygdomme samtidigt, herunder cøliaki, autoimmun skjoldbruskkirtelsygdom og APS-1. Et ZnT8A ECL-assay var ikke blevet udviklet på det tidspunkt og var ikke inkluderet i det multipleksede assay. Multiplex ECL-analysen giver et fremragende værktøj til høj gennemstrømning i generel befolkningsscreening for T1D og flere autoimmune sygdomme.
Protocol
Forskningsprotokollen blev godkendt af Colorado Multiple Institutional Review Board.
1. Forberedelse af buffer
- Lav mærkningsbufferen (2x PBS, pH 7,9). Ved hjælp af 400 ml destilleret deioniseret (DD) vand tilsættes 100 ml 10x PBS. For at justere opløsningens pH tilsættes NaOH, indtil den når 7,9.
- Opret 3 mM biotin ved at opløse 1 mg biotin i 588 μL mærkningsbuffer, der tidligere er oprettet. Lav 3 mM Ru Sulfo-NHS ved at opløse 150 nmol Ru Sulfo-NHS i 50 μL mærkningsbuffer.
- Antigenbufferen (1% BSA) fremstilles ved at tage 500 ml 1x PBS og tilsætte 5 g bovin serumalbumin (BSA) til opløsningen. Forbered 0,5 M eddikesyreopløsning. Forbered 1 M Tris-HCl buffer ved hjælp af Trizma Base og justering af pH til 9,0.
- Til belægningsbufferen (3% blokker A) tages 500 ml 1x PBS og tilsættes 15 g blokker A. Forbered vaskebufferen (0,05 % Tween 20, PBST) ved at blande 5000 ml 1x PBS med 2,5 ml Tween 20. Opret læsebuffer (2x læsebuffer T med overfladeaktivt stof) ved at tilføje 500 ml DD-vand og 500 ml 4x læsebuffer T med overfladeaktivt stof.
BEMÆRK: For at opretholde konsistens mellem assays er det vigtigt, at både biotin- og Ru Sulfo-NHS-opløsningerne oprettes lige før mærkningsproceduren og ikke oprettes og opbevares til fremtidig brug.
2. Mærkning af hvert antigenprotein med biotin og Ru Sulfo-NHS separat
BEMÆRK: For at få en mere effektiv mærkningsreaktion skal du bruge en antigenproteinkoncentration på ≥0,5 mg / ml.
- Beregn det molære antal af hvert antigenprotein og de molære tal for biotin og Ru Sulfo-NHS. Tilsæt en passende mængde biotin eller Ru Sulfo-NHS til antigenprotein til mærkning af reaktion i henhold til det molære forhold mellem antigenprotein og biotin eller Ru Sulfo-NHS.
- For antigenet, der har den mindre molekylvægt (≤10 kDa), såsom proinsulinprotein, skal du bruge et molært forhold på 1: 5 (antigen: biotin og Ru Sulfo-NHS). For antigenet, der har den større molekylvægt (>50 kDa), såsom GAD-protein, skal du bruge et molært forhold på 1:20. For antigenet, der har en mellemmolekylvægt (10-50 kDa), skal du bruge et molært forhold justeret mellem 1: 5-1: 20.
- For både biotin og Ru Sulfo-NHS divideres hver antigenvægt med deres tilsvarende molekylvægt for at få antigenmolarnummeret for hver enkelt. Del det molære tal med koncentrationen for at få volumenet til biotin. Gentag dette for Ru Sulfo-NHS.
- Antigenproteinet blandes med biotin ved hjælp af det korrekte molære forhold, bestemt i trin 2.2. Gør derefter det samme for Ru Sulfo-NHS.
BEMÆRK: For effektivitet af mærkningsreaktionen skal eventuelle reducerende kemikalier som Tris eller glycin i buffersystemet udskiftes til 2x PBS-buffer, pH 7,9 af størrelsesspinkolonnen. Mærkningsprotokollerne for biotin og Ru Sulfo-NHS er identiske. - Dæk reaktionsrørene med aluminiumsfolie og inkuber dem ved stuetemperatur (RT) i 1 time. Årsagen til, at reaktionsrørene dækkes med folie, er, at både biotin og Ru Sulfo-NHS-reagenser er lysfølsomme.
- Prime 2 ml eller 5 ml spin søjlen, mens reaktionsrørene inkuberer (størrelsen af spin kolonne bestemmes af det volumen, der uploades til kolonnen). Fyld centrifugekolonnen med 2x PBS-buffer, og centrifuger den derefter ved 1.000 x g i 2 minutter hver gang, i alt tre gange.
- Stop mærkningsreaktionen, når reaktionsrørene er færdige med at inkubere. For at stoppe reaktionen skal du rense det mærkede antigenprotein ved at føre det gennem spinkolonnen en gang. Centrifuger derefter søjlen ved 1.000 x g i 2 min.
- Den samlede koncentration af mærket antigen beregnes ved at dividere mængden af antigenprotein, der er til stede, med det endelige volumen. Aliquot 50 μL af det rensede mærkede antigenprotein pr. rør og opbevares ved -80 °C til langvarig brug.
BEMÆRK: Det er vigtigt at være opmærksom på, at for hver gang spinkolonnen passerer antigenproteinet igennem, vil der være omkring 90-95% retentionsrate.
3. Definer den bedste koncentration og forhold for de to mærkede antigener til analysen (skakbrætassay)
BEMÆRK: Da ECL-IAA-analysen i dette 7-Plex-assay kræver syrebehandling af serumprøver, skal skakbrætassayet for hvert antigen gennemgå dette trin, før det inkuberes med den mærkede antigenblanding.
- Anvend skakbrætassayet for hvert antigen separat, før multiplexanalysen køres. Trin 3.2-3.6 bruger GAD65 som et eksempel.
- Beregn fortynding af mærket GAD65-protein. Den anbefalede målrettede koncentration af den første blandingsopløsning af biotinyleret GAD65 er 2000 ng / ml og Ru Sulfo-NHS mærket GAD65 er 1000 ng / ml. Hvis koncentrationen af både biotinyleret og Ru Sulfo-NHS-mærket GAD65 i lageropløsning er 1,0 μg/μL, vil det volumen, der er nødvendigt for biotinyleret GAD65 i 560 μL arbejdsløsning, være 1,12 μL, og det volumen, der er nødvendigt for Ru Sulfo-NHS mærket GAD65 i 700 μL arbejdsløsning, vil være 0,7 μL.
- Bland 1,12 μL biotinyleret GAD65-protein med 240 μL streptavidinkonjugeret linker 1 i et rør og 160 μL 1% BSA. Inkuber blandingen ved stuetemperatur i 30 min. Der tilsættes 160 μL stopopløsning til røret, og blandingen inkuberes ved stuetemperatur i yderligere 30 min.
- Lav en seriel fortynding. Tag 280 μL af blandingen til et nyt rør og tilsæt 280 μL stopopløsning for at lave en 1:2 fortynding. Forbered flere nye rør. Gentag dette trin for at køre en vandret seriel fortynding for biotinmærket GAD65-antigen (se den tidligere publikation12).
- Bland 0,7 μL Ru Sulfo-NHS mærket GAD65 (1 μg/μL) protein med 700 μL stopopløsning. Tag derefter 350 μL af blandingen til et nyt rør og tilsæt 350 μL stopopløsning for at lave en 1:2 fortynding. Forbered flere nye rør, gentag dette trin for at køre en lodret seriel fortynding for Ru Sulfo-NHS mærket GAD65 antigen.
- Der forberedes to serumprøver, en prøve, der er meget positiv for GADA, og en prøve, der er negativ for GADA, og som hver har et volumen på 0,75 ml. Aliquot 15 μL positivt serum i hver brønd på venstre halvdel af 96-brønds PCR-pladen. Aliquot 15 μL negativt serum i hver brønd på højre halvdel af 96-brønds PCR-pladen.
- Tilsæt 18 μL 0,5 M eddikesyre i hver brønd og bland. Inkuber i 45 min ved RT. Forbered en ny 96-brønds PCR-plade. Der tilsættes 17,5 μL biotinmærket antigen og 17,5 μL af det Ru Sulfo-NHS-mærkede antigen i hver brønd i henhold til de serielle fortyndinger (se den tidligere publikation12).
- Fortsæt resten af analysetrinnene beskrevet i trin 5.2 til 9.1.
- Bestem signalforholdet fra de høje positive prøver mod de tilsvarende negative prøvesignaler. Vælg den bedste koncentration for det biotinmærkede antigen og det Ru Sulfo-NHS-mærkede antigen ved at identificere det punkt, der har det højeste eller tæt på det højeste forhold mellem positivt og negativt signal. I denne forholdsberegning skal du overveje det lave baggrundssignal opnået fra de negative prøver.
BEMÆRK: De optimale koncentrationer af Ru Sulfo-NHS og biotinmærkede antigenproteiner fra skakbrætassays er vist nedenfor: 30 ng / ml og 200 ng / ml for GAD65, 120 ng / ml og 120 ng / ml for proinsulin, 10 ng / ml og 42 ng / ml for IA-2, 80 ng / ml og 80 ng / ml for TG, 8 ng / ml og 16 ng / ml for TPO, 31 ng/ml og 31 ng/ml for ThG og 12 ng/ml og 12 ng/ml for IFNα.
4. Opret den blandede linker-koblede antigenopløsning
- Vælg den optimale koncentration for hvert antigen baseret på skakbrætassayet. Fortynd biotin og Ru Sulfo-NHS mærket antigen til den rationelle arbejdskoncentration.
- Bind forskellige linkere til hvert af de unikt biotinylerede antigenproteiner. For et 96-brønds pladeassay blandes 4 μL biotinyleret GAD65, TPO, tTG, ThG, proinsulin, IFN-α og IA-2 protein med 240 μL streptavidinkonjugeret linker 1, 2, 3, 4, 8, 9 og 10 i separat rør (figur 1). Derefter tilsættes 156 μL PBS / 1% BSA pr. Rør. Inkuber blandingen ved stuetemperatur i 30 min.
- Der tilsættes 160 μL stopopløsning i hvert rør, og dem inkuberes ved stuetemperatur i yderligere 30 min. Tag 400 μL linkerkoblet antigen fra hvert rør, og kombiner alle 7 antigener sammen. Der tilsættes 1,2 ml stopopløsning, og der tilsættes derefter 4 μL Ru Sulfo-NHS mærket GAD65, TPO, tTG, ThG, proinsulin, IFN-α og IA-2 antigen til blandingen. Nu er antigenopløsningen klar til at blive brugt i analysen.
5. Inkuber serumprøver med det mærkede antigen
BEMÆRK: Da ECL-IAA-analysen i dette 7-Plex-assay kræver syrebehandling af serumprøver, kræver hvert serum syrebehandlingstrinnet, før det inkuberes med mærket antigenblanding til dette 7-Plex-assay.
- Aliquot 15 μL serum pr. brønd til en 96-brønds PCR-plade. Tilsæt 18 μL 0,5 M eddikesyre i hver brønd og bland. Inkuberes i 45 minutter ved RT. Forbered en ny 96-brønds PCR-plade og aliquot 35 μL antigenopløsning i hver brønd.
- Mens pladen stadig inkuberer, tilsættes 13 μL 1 M Tris pH 9,0 buffer til hver brønd i antigenpladen. Tilsæt buffer til siden af hver brønd for at begrænse blandingen af Tris-buffer og antigen. Når inkubationen er afsluttet, tages 25 μL af det syrebehandlede serum og pipetteres det straks i hver brønd på antigenpladen. Omrør opløsningen og dæk pladen med PCR-tætningsfolie for at undgå lyseksponering.
- Ved RT sættes pladen på en ryster, indstillet til en lav hastighed, i 1 time. Derefter opbevares pladen ved 4 ° C og lad pladen inkubere i 18-24 timer.
6. Forbered multiplexpladen
- Tag en multiplexplade fra 4 °C køleskabet, og lad pladen komme til RT. Når multiplexpladen er ved RT, tilsættes 150 μL 3% Blocker A til hver brønd. Dæk multiplexpladen med tætningsfolie. Inkuber pladen i et 4 °C køleskab natten over.
BEMÆRK: Assay Day 1 inkluderer trin 4 til 6.
7. Overfør serum/antigen inkuberer til multiplexpladen
- Den følgende dag skal du placere papirhåndklæder på bordet og tage den inkuberende multiplexplade fra køleskabet. Tøm hele bufferen ud af pladen. For at gøre dette skal du vende pladen på hovedet og klappe den på de forberedte papirhåndklæder, indtil der ikke er nogen buffer til stede i nogen af brøndene.
- Multiplexpladen vaskes ved at tilsætte 150 μL PBST i hver brønd. Kassér bufferen, som nævnt i trin 7.1., og gentag dette trin tre gange. Tilsæt 30 μL serum/antigen inkuberer i hver brønd i multiplexpladen. Dæk pladen med folie for at begrænse dens eksponering for lys. Placer pladen på en pladeryster, indstillet til en lav hastighed, ved RT i 1 time.
8. Vask pladen og tilsæt læsebuffer
- Fjern serum/antigeninkubationerne fra multiplexpladen ved at holde pladen på hovedet og svirpe opløsningen ud. Der tilsættes 150 μL PBST i alle brøndene, og bufferen fjernes fra pladen ved igen at holde pladen på hovedet og svirpe opløsningen ud. Gentag dette trin tre gange. Når den tredje vask er færdig, tilsættes 150 μL læsebuffer i hver brønd.
BEMÆRK: Luftbobler forstyrrer pladelæsermaskinens evne til nøjagtigt at analysere pladens resultater og bør undgås for enhver pris.
9. Læs pladen og analyser data
- Tæl den forberedte plade på pladelæsermaskinen, og læs alle værdierne i tællinger pr. sekund (CPS).
- Beregn det relative indeks for analysen ved hjælp af antistofniveauerne opnået fra pladelæsermaskinen med følgende ligning:
Indeksværdi = [CPS (prøve) - CPS (negativ standard)] / [CPS (positiv standard) - CPS (negativ standard)]. - Bestem, hvilke antistofresultater der er negative eller positive ved hjælp af de afskæringer, der er etableret.
BEMÆRK: Analysedag 2 omfatter trin 7 til 9.
Representative Results
Analyse af analyseresultater blev vist i tabel 1, tabel 2 og tabel 3. Læseværdier kommer fra dataene fra de 10 steder inden for samme brønd. Indeksværdierne for hver prøve blev beregnet i forhold til deres tilsvarende interne positive og negative kontroller som beskrevet i analyseprotokollen. Eksempler på dårlige dubletter er vist i tabel 1 og forårsagede den endelige indeksberegningsfejl i tabel 3. Alle rå tælleværdier skal kontrolleres for at undgå falske positive eller falske negative resultater.
Det 7-multipleksede ECL-assay blev valideret ved hjælp af en stor kohorte af prøver fra 1026 nydiagnosticerede patienter med T1D- og 1022-alders- og kønsmatchede raske kontrolpersoner. Niveauerne af autoantistoffer fra 7-Plex ECL-assay for 1026 T1D-patienter blev sammenlignet med niveauerne fra hver af vores tilsvarende etablerede enkelt-ECL-assays som vist i figur 2 og fra hver tilsvarende enkelt standard RBA og ELISA som vist i figur 3. Analysespecificiteterne blev opstillet identiske ved 99. percentiler for alle autoantistofassays undtagen skjoldbruskkirtelautoantistoffer (hvor den 95. percentil blev anvendt) af 1022 sunde kontroller for alle tre analysemetoder (7-Plex ECL, enkelt ECL, RBA eller ELISA) som anført i tabel 4. Inter-assay CV'erne for GADA, IA-2A, IAA, TPOA, ThGA, TGA og IFNαA er henholdsvis 6,4%, 4,5%, 9,1%, 4,9%, 5,7%, 11,3% og 5,9%.
Et lille antal uoverensstemmende prøver for hvert af de 7 autoantistoffer blev fundet omkring grænsen til afskæringer for hver assay (figur 2 og figur 3). Elleve kontrolprøver (11/1022, 1,1%) blev fundet flere autoantistofpositive kun i 7-Plex-analysen og negative i hvert tilsvarende enkeltassay. Tilsvarende skete det i 9 prøver af T1D-patienterne (9/1026, 0,9%). Derudover blev 10 høje positive TPOA og en ThGA i patientkohorte, der blev set i både det enkelte ECL-assay og RBA, savnet i 7-Plex-analysen. Disse prøver blev konverteret positive i 7-Plex-analysen, da de blev yderligere fortyndet. Generelt var 100 % af positiviteten i et enkelt ECL-assay eller RBA dækket i 7-Plex ECL-analysen med samme assayspecificitet som illustreret i tabel 4.
Figur 1: Illustration af Mutiplex ECL-analysen.
Autoantistoffer i serum vil bygge bro mellem Ru Sulfo-NHSged-antigenet og det biotinylerede antigen. Dette er kombineret med en specifik linker for at danne et kompleks af antigen-antistof-antigen-linker. Komplekserne fanges på pladen og fastholdes til deres specifikke pletter gennem hver specifik linker. De specifikt koblede linkertal for de 7 forskellige antigenproteiner er illustreret. Detektion af antistofsignaler opnås ved hjælp af Ru Sulfo-NHS-mærkede antigener med elektrokemiluminescens. Figuren er fra Gu, Y. et al.13. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Sammenligning af 7 autoantistofniveauer hos 1026 nye debutpatienter med T1D mellem det enkelte ECL-assay og 7-Plex ECL-assayet.
Panelerne a, b, c, d, e, f og g viser sammenligninger af autoantistofniveauer for henholdsvis GADA, IA-2A, IAA, TGA, TPOA, ThGA og IFNαA. De stiplede linjer repræsenterer analyseafskæringerne for hvert autoantistofassay. Afskæringerne blev sat til den 99. percentil af 1022 aldersmatchede sunde kontroller for hvert assay (undtagen TPOA og ThGA, som blev indstillet til 95. percentilen), som vist i tabel 4, fra 1022 aldersmatchede sunde kontroller for både enkelt- og multiplex ECL-assays. Røde lukkede diamanter er markeret som 'falske' positive i 7-Plex ECL-assayet, <1% af den undersøgte kohorte, og de blev valideret som negative i både enkelt ECL og RBA. Røde tætte firkanter er markeret som 'falske' negativer i 7-Plex ECL-analysen forårsaget af 'prozone' -fænomenet, der hovedsageligt forekommer i TPOA-analysen i <1% af den undersøgte kohorte. Begge disse falske positive og falske negative resultater diskuteres i diskussionsafsnittet. Figuren er fra Gu, Y. et al.13. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Sammenligning af 7 autoantistofniveauer hos 1026 nye debutpatienter med T1D mellem RBA (ELISA for IFNαA) og 7-Plex ECL-analysen.
Panelerne a, b, c, d, e, f og g præsenterer sammenligninger af autoantistofniveauer for henholdsvis GADA, IA-2A, IAA, TGA, TPOA, ThGA og IFNαA. De stiplede linjer repræsenterer assayafskæringerne for hvert autoantistofassay, den samme specificitet, der er indstillet for både RBA og 7-Plex ECL-assayet, som vist i tabel 4, fra 1022 aldersmatchede sunde kontroller. Røde lukkede diamanter og firkanter repræsenterer 'falske' positive og 'falske' negativer, der vises i 7-Plex ECL-analysen, det samme er vist i figur 2. Figuren er fra Gu, Y. et al.13. Klik her for at se en større version af denne figur.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | ||
| En | 5580 | 5674 | 105 | 117 | 125 | 139 | linker-1 |
| 100 | 108 | 102 | 102 | 3956 | 3745 | linker-2 | |
| 115 | 124 | 107 | 116 | 113 | 124 | linker-3 | |
| 67 | 64 | 68 | 61 | 65 | 69 | linker-4 | |
| 89 | 87 | 98 | 92 | 90 | 80 | linker-5 | |
| 87 | 71 | 89 | 87 | 61 | 72 | linker-6 | |
| 94 | 82 | 79 | 85 | 2154 | 2280 | linker-7 | |
| 75 | 66 | 1628 | 1594 | 81 | 83 | linker-8 | |
| 98 | 103 | 71 | 84 | 69 | 85 | linker-9 | |
| 102 | 118 | 93 | 98 | 113 | 99 | linker-10 | |
| B | 324 | 337 | 147 | 148 | 5426 | 5366 | linker-1 |
| 101 | 102 | 93 | 88 | 86 | 74 | linker-2 | |
| 111 | 119 | 119 | 123 | 66 | 72 | linker-3 | |
| 72 | 65 | 59 | 68 | 74 | 67 | linker-4 | |
| 81 | 98 | 83 | 92 | 79 | 72 | linker-5 | |
| 90 | 84 | 93 | 86 | 70 | 76 | linker-6 | |
| 101 | 105 | 101 | 97 | 956 | 944 | linker-7 | |
| 82 | 83 | 189 | 204 | 97 | 90 | linker-8 | |
| 92 | 83 | 78 | 64 | 82 | 78 | linker-9 | |
| 83 | 79 | 88 | 93 | 4722 | 4965 | linker-10 | |
| C | 110 | 110 | 87 | 81 | 2114 | 2365 | linker-1 |
| 5526 | 5680 | 88 | 70 | 86 | 93 | linker-2 | |
| 114 | 132 | 67 | 71 | 3326 | 3284 | linker-3 | |
| 64 | 62 | 88 | 74 | 64 | 80 | linker-4 | |
| 94 | 82 | 86 | 75 | 89 | 76 | linker-5 | |
| 77 | 87 | 75 | 63 | 70 | 86 | linker-6 | |
| 77 | 86 | 71 | 84 | 138 | 121 | linker-7 | |
| 73 | 86 | 80 | 79 | 59 | 73 | linker-8 | |
| 86 | 74 | 5064 | 4923 | 88 | 86 | linker-9 | |
| 105 | 113 | 85 | 80 | 124 | 114 | linker-10 | |
| D | 98 | 88 | 92 | 84 | 136 | 127 | linker-1 |
| 288 | 291 | 86 | 86 | 558 | 564 | linker-2 | |
| 109 | 101 | 74 | 73 | 141 | 127 | linker-3 | |
| 78 | 66 | 66 | 55 | 74 | 66 | linker-4 | |
| 79 | 83 | 79 | 86 | 96 | 91 | linker-5 | |
| 83 | 86 | 96 | 89 | 86 | 73 | linker-6 | |
| 87 | 89 | 77 | 87 | 841 | 855 | linker-7 | |
| 74 | 72 | 60 | 72 | 90 | 95 | linker-8 | |
| 68 | 75 | 331 | 328 | 2460 | 2580 | linker-9 | |
| 86 | 98 | 80 | 75 | 123 | 133 | linker-10 | |
| E | 101 | 114 | 101 | 106 | 532 | 548 | linker-1 |
| 101 | 96 | 110 | 104 | 682 | 675 | linker-2 | |
| 6015 | 5988 | 124 | 126 | 101 | 98 | linker-3 | |
| 66 | 71 | 82 | 71 | 80 | 62 | linker-4 | |
| 102 | 97 | 99 | 80 | 83 | 110 | linker-5 | |
| 82 | 67 | 81 | 80 | 60 | 85 | linker-6 | |
| 85 | 95 | 52 | 84 | 245 | 221 | linker-7 | |
| 72 | 78 | 82 | 74 | 486 | 503 | linker-8 | |
| 77 | 97 | 97 | 77 | 56 | 66 | linker-9 | |
| 114 | 104 | 5726 | 5814 | 259 | 253 | linker-10 | |
| F | 119 | 120 | 133 | 118 | 112 | 96 | linker-1 |
| 101 | 91 | 100 | 95 | 96 | 82 | linker-2 | |
| 406 | 395 | 111 | 123 | 2127 | 101 | linker-3 | |
| 72 | 60 | 86 | 72 | 79 | 83 | linker-4 | |
| 76 | 85 | 96 | 99 | 89 | 103 | linker-5 | |
| 88 | 78 | 91 | 83 | 89 | 95 | linker-6 | |
| 104 | 97 | 87 | 102 | 56 | 66 | linker-7 | |
| 76 | 77 | 79 | 93 | 69 | 75 | linker-8 | |
| 85 | 71 | 95 | 100 | 83 | 71 | linker-9 | |
| 131 | 131 | 358 | 364 | 92 | 86 | linker-10 | |
| G | 90 | 95 | 85 | 82 | 105 | 107 | linker-1 |
| 99 | 86 | 77 | 76 | 1250 | 1174 | linker-2 | |
| 119 | 123 | 120 | 118 | 112 | 108 | linker-3 | |
| 76 | 83 | 77 | 80 | 86 | 76 | linker-4 | |
| 88 | 86 | 86 | 93 | 107 | 92 | linker-5 | |
| 73 | 73 | 71 | 82 | 84 | 75 | linker-6 | |
| 5210 | 5173 | 72 | 69 | 76 | 85 | linker-7 | |
| 80 | 81 | 79 | 82 | 100 | 101 | linker-8 | |
| 96 | 97 | 89 | 83 | 65 | 83 | linker-9 | |
| 98 | 103 | 86 | 88 | 1933 | 1979 | linker-10 | |
| H | 114 | 124 | 81 | 86 | 299 | 295 | linker-1 |
| 107 | 92 | 69 | 72 | 4256 | 4388 | linker-2 | |
| 114 | 123 | 125 | 129 | 501 | 536 | linker-3 | |
| 77 | 70 | 67 | 64 | 74 | 62 | linker-4 | |
| 92 | 110 | 81 | 84 | 77 | 71 | linker-5 | |
| 87 | 79 | 72 | 76 | 83 | 81 | linker-6 | |
| 328 | 341 | 84 | 80 | 88 | 97 | linker-7 | |
| 75 | 84 | 75 | 90 | 74 | 83 | linker-8 | |
| 73 | 79 | 78 | 76 | 84 | 70 | linker-9 | |
| 113 | 120 | 81 | 76 | 2372 | 2350 | linker-10 | |
Tabel 1: Analyse af 7-plex ECL-assay: rå CPS-tal (venstre halvdel af pladen). Rå CPS-tællinger erhverves fra en analyseplade (den venstre halvdel af pladen), og hver prøve udføres i to eksemplarer. Under hver række af pladen (A-H) er der 10 linjer med læseværdier, der repræsenterer dataene fra de 10 pletter i samme brønd, svarende til hvert linkernummer som markeret. Eksempler på dårlige dubletter er fremhævet med gråt, som det ses i række F-linker 3-kolonne 5 og 6.
| Række i tabel 1A | Kolonne i tabel 1A | Link 1 | Link 2 | Link 3 | Link 7 | Link 8 | Link 9 | Link 10 | |
| En | 1-2 | GADA-pc | 5627 | 104 | 120 | 88 | 71 | 101 | 110 |
| B | 1-2 | GADA lav PC | 331 | 102 | 115 | 103 | 83 | 88 | 81 |
| C | 1-2 | TPOA-pc | 110 | 5603 | 123 | 82 | 80 | 80 | 109 |
| D | 1-2 | TPOA lav pc | 93 | 290 | 105 | 88 | 73 | 72 | 92 |
| E | 1-2 | TGA-pc | 108 | 99 | 6002 | 90 | 75 | 87 | 109 |
| F | 1-2 | TG lav pc | 120 | 96 | 401 | 101 | 77 | 78 | 131 |
| G | 1-2 | ThGA-pc | 93 | 93 | 121 | 5192 | 81 | 97 | 101 |
| H | 1-2 | ThGA lav pc | 119 | 100 | 119 | 335 | 80 | 76 | 117 |
| En | 3-4 | IAA-pc | 111 | 102 | 112 | 82 | 1611 | 78 | 96 |
| B | 3-4 | IAA lav pc | 148 | 91 | 121 | 99 | 197 | 71 | 91 |
| C | 3-4 | IFNaA PC | 84 | 79 | 69 | 78 | 80 | 4994 | 83 |
| D | 3-4 | IFNaA lav pc | 88 | 86 | 74 | 82 | 66 | 330 | 78 |
| E | 3-4 | IA-2A-pc | 104 | 107 | 125 | 68 | 78 | 87 | 5770 |
| F | 3-4 | IA-2A lav pc | 126 | 98 | 117 | 95 | 86 | 98 | 361 |
| G | 3-4 | NC | 84 | 77 | 119 | 71 | 81 | 86 | 87 |
| H | 3-4 | NC | 84 | 71 | 127 | 82 | 78 | 77 | 79 |
| En | 5-6 | stikprøve1 | 132 | 3851 | 119 | 2217 | 82 | 77 | 106 |
| B | 5-6 | prøve2 | 5396 | 80 | 69 | 950 | 94 | 80 | 4844 |
| C | 5-6 | prøve3 | 2240 | 90 | 3305 | 130 | 66 | 87 | 119 |
| D | 5-6 | stikprøve4 | 132 | 561 | 134 | 848 | 93 | 2520 | 128 |
| E | 5-6 | stikprøve5 | 540 | 679 | 100 | 233 | 495 | 61 | 256 |
| F | 5-6 | prøve6 | 104 | 89 | 1114 | 61 | 72 | 77 | 89 |
| G | 5-6 | stikprøve7 | 106 | 1212 | 110 | 81 | 101 | 74 | 1957 |
| H | 5-6 | stikprøve8 | 297 | 4322 | 519 | 93 | 79 | 77 | 2361 |
Tabel 2: Analyse af 7-plex ECL-assay: arrangement af tabel 1-data, markeret som 7 linkere. Dataene fra tabel 1 blev omarrangeret, idet linkene 4 til 6 (ikke anvendt) blev slettet, og middelværdierne blev beregnet ud fra hver duplikataflæsning fra tabel 1. Værdierne af den interne standard høje og lave positive kontroller, svarende til hvert autoantistofassay, fastholdt af en bestemt linker, er i mørk fed. PC, positiv kontrol. NC, normal kontrol.
| GAD-indeks | TPOA-indeks | TGA-indeks | ThGA-indekset | IAA-indeks | IFNaA-indeks | IA-2A-indekset | |
| GADA-pc | 1.000 | 0.005 | 0.000 | 0.003 | -0.006 | 0.003 | 0.004 |
| GADA lav PC | 0.045 | 0.005 | -0.001 | 0.006 | 0.002 | 0.000 | -0.001 |
| IAA-pc | 0.005 | 1.000 | 0.001 | 0.002 | -0.001 | -0.001 | 0.004 |
| IAA lav pc | 0.002 | 0.039 | -0.002 | 0.003 | -0.005 | -0.003 | 0.001 |
| IA-2A-pc | 0.004 | 0.004 | 1.000 | 0.004 | -0.004 | 0.000 | 0.004 |
| IA-2A lav pc | 0.007 | 0.004 | 0.048 | 0.006 | -0.002 | -0.002 | 0.008 |
| TGA-pc | 0.002 | 0.003 | 0.000 | 1.000 | 0.000 | 0.002 | 0.002 |
| TG lav pc | 0.006 | 0.004 | 0.000 | 0.052 | -0.001 | -0.002 | 0.005 |
| TPOA-pc | 0.005 | 0.005 | -0.001 | 0.002 | 1.000 | -0.002 | 0.001 |
| TPOA lav pc | 0.012 | 0.003 | 0.000 | 0.006 | 0.076 | -0.003 | 0.001 |
| ThGA-pc | 0.000 | 0.000 | -0.008 | 0.001 | 0.000 | 1.000 | -0.001 |
| ThGA lav pc | 0.001 | 0.002 | -0.008 | 0.002 | -0.009 | 0.050 | -0.002 |
| IFNaA PC | 0.004 | 0.006 | 0.001 | 0.000 | -0.002 | 0.000 | 1.000 |
| IFNaA lav pc | 0.008 | 0.004 | 0.000 | 0.005 | 0.004 | 0.002 | 0.048 |
| NC | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
| NC | 0.000 | -0.001 | 0.001 | 0.002 | -0.002 | -0.002 | -0.001 |
| stikprøve1 | 0.009 | 0.683 | 0.000 | 0.419 | 0.001 | -0.002 | 0.003 |
| prøve2 | 0.958 | 0.001 | -0.008 | 0.172 | 0.009 | -0.001 | 0.837 |
| prøve3 | 0.389 | 0.002 | 0.542 | 0.012 | -0.009 | 0.000 | 0.006 |
| stikprøve4 | 0.009 | 0.088 | 0.003 | 0.152 | 0.008 | 0.496 | 0.007 |
| stikprøve5 | 0.082 | 0.109 | -0.003 | 0.032 | 0.271 | -0.005 | 0.030 |
| prøve6 | 0.004 | 0.002 | 0.169 | -0.002 | -0.006 | -0.002 | 0.000 |
| stikprøve7 | 0.004 | 0.205 | -0.002 | 0.002 | 0.013 | -0.002 | 0.329 |
| stikprøve8 | 0.039 | 0.768 | 0.068 | 0.004 | -0.001 | -0.002 | 0.400 |
Tabel 3: Analyse af 7-plex ECL-assay: resultater af indeksværdier. Indeksværdier for hver prøve for alle 7 autoantistofassays blev beregnet mod deres tilsvarende interne positive og negative kontroller som beskrevet i analyseprotokollen. Enhver indeksværdi, der var større end afskæringsværdien, blev defineret som et positivt resultat, vist med mørkt fed. TGA-indeksværdien for sample6 blev fremhævet med gråt, da det er en fejl forårsaget af dårlige dubletter vist i række F-linker 3-kolonne 5 og 6 i tabel 1.
| GADA | IA-2A | IAA | .TGA | TPOA | ThGA | IFNαA* | ||||||||
| Sens | Spec | Sens | Spec | Sens | Spec | Sens | Spec | Sens | Spec | Sens | Spec | Sens | Spec | |
| Rba | 73.4% | 98.5% | 75.2% | 99.0% | 47.7% | 99.1% | 12.9% | 99.0% | 23.9% | 95.2% | 19.3% | 94.7% | 1.0% | 99.6% |
| Enkelt ECL | 71.6% | 99.1% | 73.6% | 99.3% | 48.3% | 99.7% | 16.0% | 98.9% | 26.3% | 94.9% | 20.6% | 95.1% | 0.8% | 99.2% |
| 7-Plex ECL | 71.2% | 98.9% | 77.3% | 98.9% | 49.5% | 98.9% | 16.5% | 98.7% | 26.1% | 94.7% | 21.1% | 94.7% | 1.7% | 99.1% |
Tabel 4: Analysefølsomhed og specificitet blandt 1026 T1D-patienter og 1022 kontroller, matchet for både alder og køn, i et 7-plex ECL-assay sammenlignet med det tilsvarende enkelt ECL-assay og RBA eller ELISA*. Forskelligeassays (RBA, enkelt ECL og 7-Plex ECL) for hvert autoantistof blev indstillet til lignende specificiteter ved hjælp af 1022 alders- og kønsmatchede sunde kontroller. Specificitetsresultatet fra den undersøgte kontrolkohorte blev sat omkring 95% for TPOA og ThGA og til 99% for de 5 andre assays. *Asterisk markerer IFNαA-analysen for ELISA, mens andre er RBA.
Discussion
I adskillige nationale og internationale kliniske forsøg med type 1-diabetes er udførelsen af det enkelte ECL-assay til påvisning af ø-autoantistoffer og autoantistoffer mod transglutaminase (TGA) for cøliaki blevet dokumenteret 8,9,10,11. I løbet af disse stier har dette assay øget følsomheden og specificiteten for autoantigendetektion, når den vurderes i forhold til den eksisterende 'guld' standard RBA. Den forbedrede sygdomsspecificitet kan ses, når der skelnes mellem autoantistoffer med høj affinitet og høj risiko fra lavrisikosignaler med lav affinitet mellem det enkelte ECL-assay og RBA14,15,16,17. Med udgangspunkt i det enkelte ECL-assay udgør vi et nyt højt gennemstrømningsmultiplekset ECL-autoantistofassay, så vi kan screene for T1D samt flere relevante autoimmune sygdomme på samme tid.
Multiplex ECL-analysen bruger multiplexpladen, som kan kombinere op til 10 autoantistofassays i en enkelt brønd. Til denne undersøgelse kombineres 7 autoantistofassays sammen. Autoantistofferne består af 3 IAbs (IAA, GADA og IA-2A), 2 autoimmune skjoldbruskkirtelsygdomsautoantistoffer (TPOA og ThGA), cøliaki autoantistoffer (TGA) og APS-1 autoantistoffer til interferon alfa (IFNαA). Analysemekanismen er generelt baseret på et enkelt ECL-assay som tidligere offentliggjort 9,10,12,18 med nogle ændringer. Hovedforskellen i et multiplex ECL-assay fra et enkelt ECL-assay er, at hvert antistof-antigenkompleks dannet i væskefasen fastholdes til en specifik linker (figur 1). Det biotinmærkede antigen inkuberes med Streptavidin-konjugeret, en linker, der bruges til at danne et specifikt antigen-linkerkompleks. Antistof-antigen immunkompleks dannes efter inkubation med patientserum og fanges på et bestemt sted gennem det specifikke linkersystem på hver brønd i multiplexpladen. Ru Sulfo-NHS mærket antigen fanget af antistoffer på samme tid giver signalet med elektrokemiluminescens. Pladelæsermaskinen kan registrere op til 10 forskellige signaler fra spotkilderne i hver brønd. For at holde autoantistofassays konsistente mellem plader og under udførelse af langsigtede undersøgelser foreslår vi, at den samme linker anvendes.
Før der oprettes et multiplex ECL-assay, skal enkelte ECL-assays for hvert autoantistof optimeres på henholdsvis en multiplexplade og valideres mod både RBA- og enkelt ECL-assays på en almindelig ECL-plade. For at forbedre skakbrætassayet blev der anvendt en høj positiv patient og en negativ patientprøve til det relaterede autoantistofassay på multiplexpladen. Efter at skakbrætanalysen blev udført, blev de mest ideelle koncentrationer for Ru Sulfo-NHS og biotinmærket antigen beregnet for hvert af de 7 autoantistofassays. Følgende viser disse koncentrationer: 30 ng/ml og 200 ng/ml for GAD65, 120 ng/ml og 120 ng/ml for proinsulin, 10 ng/ml og 42 ng/ml for IA-2, 80 ng/ml og 80 ng/ml for TG, 8 ng/ml og 16 ng/ml for TPO, 31 ng/ml og 31 ng/ml for ThG og henholdsvis 12 ng/ml og 12 ng/ml for IFNα13. Koncentrationerne af nogle af antigenerne fra skakbrætassayet skal muligvis justeres yderligere i henhold til resultaterne i det faktiske multiplexassay efter at have kombineret alle assays sammen.
Da IAS er inkluderet i det nuværende multiplex ECL-assay, er syrebehandling af serumprøver obligatorisk, før serumet inkuberes med antigen, som rapporteret i den tidligere undersøgelse12. Generelt, når et ekstra autoantistof tilsættes til et multiplexassay, påvirkes analysebaggrunden, og et ekstremt højt signal fra et sted i brønden kan hindre resultaterne af nærliggende pletter via krydstale. Derfor skal den maksimale CPS begrænses til 20.000 tællinger for hvert autoantistof eller lavere for de højeste positive prøver. Fra vores viden bør autoantistoffer, der har en lavere baggrund, adskilles ved udformningen af spotkortet langt fra pletter med en højere frekvens af tællinger for at reducere mængden af krydstale.
Høje positive og negative kontroller blev brugt internt i hvert assay til at beregne et nøjagtigt indeks for de ukendte prøver, der blev testet. For nøjagtigt at vurdere og overvåge analysens følsomhed blev der anvendt lave positive kontroller, der var indstillet nær analysens øvre grænse. Disse standard positive og negative kontroller blev oprettet i bulk og aliquot til langvarig brug og opbevaret ved -20 °C eller derunder for at sikre overensstemmelse mellem assays. Af hensyn til kvalitetssikring blev prøverne kørt to gange i hvert assay, og hvert positivt resultat blev gentaget og bekræftet ved at køre prøven i et nyt ECL-assay den næste dag. Hvis der var uenighed med det første og andet bekræftende assay, var et tredje assay nødvendigt. Af de tre udførte assays bestemte resultaterne af de to assays, der var enige (f.eks. +, + eller -,-), det endelige resultat (positivt eller negativt) af prøven.
I det sidste årti søger mange studiegrupper et assay med høj gennemstrømning ved hjælp af multiplexmetoden til at kombinere flere autoantistofassays sammen til en brønd for at screene store populationer. Der er et par undersøgelser, der bruger forskellige typer teknologier til at udføre multiplex autoantistofassays 19,20,21,22, men der er ingen sammenligning for nogen af disse assays i følsomhed og specificitet mod den nuværende 'guld' standard RBA, når man studerer T1D. Disse forskellige typer platforme, der anvendes, valideres ikke gennem det internationale Islet Autoantibody Standardization Program (IASP) værksted eller gennem test af store kohorter i kliniske forsøg. I en nylig generel befolkningsbaseret screening i Tyskland bruges et kombineret assay med høj kapacitet, 3 Screen ICATM ELISA distribueret af Kronus, som et værktøj til første linjescreening til at detektere tre IAbs, GADA, IA-2A og ZnT8A, for at opnå tidlig diagnose af barndoms T1D23. ELISA-analysen med 3 skærme måler 3 autoantistoffer enten i 3 adskilte brønde, der indtager et stort volumen serum, eller i en enkelt brønd med alle 3 assays blandet. Hvis en brønd i ELISA-analysen med 3 skærme er positiv, er man ikke i stand til at skelne mellem, hvilket af tre autoantistoffer der er til stede. Den største ulempe ved dette assay er dets manglende evne til at inkludere IAA-måling. Alle IAA-resultater udført af ELISA, som bevist i IASP-workshops, har ikke en acceptabel følsomhed og specificitet24. IAA er normalt den første IAb, der vises og har en høj forekomst blandt små børn. IAb-screening med IAA er nødvendig for børn, og det anses ikke for acceptabelt at foretage denne screening uden IAA for at vurdere T1D-risikoen i samfundet. Derudover er der ingen offentliggjorte undersøgelser eller data, der viser, at Kronus IAb-kit-analysen er mere T1D-sygdomsspecifik og i stand til at diskriminere høj risiko fra lavrisiko IAbs. 7-Plex ECL-analysen i denne undersøgelse blev valideret ved hjælp af en stor kohorte af nydiagnosticerede patienter med T1D13. Sammenlignet med den nuværende standard RBA og veletableret enkelt ECL-assay er 7-Plex-analysen i stand til at bevare 100% positivitet med samme assayspecificitet (tabel 4). I øjeblikket anvendes 4-Plex ECL-analysen parallelt med standard RBA på et igangværende stort klinisk forsøg: Autoimmunity Screening for Kids (ASK) -undersøgelse. Dette forsøg screener børn i den generelle befolkning, i Denver hovedstadsområdet, for T1D og cøliaki. Sammenlignet med standard RBA, der blev brugt i ASK-undersøgelsen, viser multiplex ECL-analysen fremragende følsomhed og en højere sygdomsspecificitet, identisk med vores tidligere rapporter ved hjælp af den enkelte ECL-undersøgelse25. Desuden viste vores 4-Plex ECL-assay en markant reduktion i arbejdskraft, omkostninger og serumvolumen med 70% sammenlignet med de tilsvarende 4 enkeltassays for ECL og RBA. Ved hjælp af det multipleksede ECL-assay kan vi tilpasse hver brønd med forskellige tal, der repræsenterer forskellige autoantistoffer (op til 10), for at teste for forskellige autoimmune sygdomme, der er specifikke for behovene på et bestemt klinisk sted.
Der er observeret nogle begrænsninger, vist i denne undersøgelse, for et multiplekset ECL-assay ved hjælp af multiplexpladen. Den endelige fortynding af serum, inkuberet med antigen, kan ikke justeres for at give de mest optimale betingelser for hvert enkelt autoantistofassay, der kombineres i en enkelt brønd. Ni prøver (9/1026) fra T1D-patienter blev observeret at have et falsk negativt resultat for bestemte autoantistoffer. 7 af de falske negativer var for TPOA og 2 var for ThGA, i 7-Plex ECL-analysen, men høje positive resultater blev udstillet i både det enkelte ECL-assay og RBA (figur 2 & 3). Efter yderligere fortynding af alle 9 prøver blev de positive på multiplexpladen. Dette resultat skyldes, hvad vi beskriver som fænomenet 'prozone'. Dette fænomen får prøven til at vise et falsk negativt resultat, fordi de høje antistoftitre påvirker dannelsen af antigen-antistofgitter. Ved opstilling af et multiplexassay anbefales det at få foretaget prøver med meget høje titere for hvert af de kombinerede autoantistoffer for at få foretaget forprøver for at identificere den valgfri fortynding af serum til antigeninkubation. Alternativt bør autoantistofassays med lignende optimerede betingelser vælges til at danne et kombineret assay, hvorfra den bedste assayfølsomhed og specificitet opnås for hvert autoantistof. I denne undersøgelse resulterede 7 prøver (7/1022) fra sunde normale kontroller i falske positive for flere autoantistoffer i 7-Plex-analysen, men efter at have kørt et enkelt ECL-assay og RBA (figur 2 & 3) viste disse autoantistoffer sig at være negative i begge assays. Årsagerne til disse falske positive resultater, der forekommer på multiplexpladen, for disse små delmængder af prøver, er i øjeblikket ukendte. For den nuværende anvendelse af multiplex ECL-analysen gentages alle positive prøver med deres tilsvarende enkelt ECL-assay for at bekræfte positivitet, hvilket fjerner denne falske positive fejl fra multiplex ECL-assayet.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH-bevilling DK32083, JDRF Grants 2-SRA-2015-51-Q-R og 2-SRA-2018-533-S-B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 °C refrigerator | |||
| –80 °C and -20 °C freezers | |||
| 96-well Plate Shaker | Wallac - Delfi | ||
| 96-well round bottom plate | Fisher | 8408220 | |
| Acetic acid solution | Fisher | ||
| Aluminum foil | |||
| Antigen proteins | |||
| Human GAD65 full length protein | Diamyd | ||
| Human ThG full length protein | BioMart | ||
| Human TPO full length protein | BioMart | ||
| IA-2 intracellular domain protein | BioMart | ||
| IFN-α protein | Abcam | ||
| Proinsulin protein | AmideBio | ||
| tTG protein | DiaRect | ||
| Biotin | Sigma | ||
| Bottle-Top 500 mL , Filter Units | Fisher | 0974064A or B | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A-7906 | |
| Distilled deionized (DD) water | |||
| HCl | Fisher | ||
| Ice maker | |||
| Ice trays | |||
| MSD Sector | Perkin-Elmer | ||
| Multi-channel pipette | |||
| NaOH | |||
| Paper tower | |||
| PBS | |||
| pH meter | |||
| Pipette-Aid | |||
| Pipettes/tips | |||
| Ru Sulfo-NHS | MSD (R91AN) | ||
| Trizma Base | Fisher | BP152-5 | |
| Tween 20 | Sigma | P-1379 | |
| Uplex Development Kit | MSD | ||
| 96-well UPlex plate | MSD | ||
| Blocker A | MSD | R93AA | |
| Linker-Streptavidin | MSD | ||
| Read buffer | MSD | R92TC | |
| Stop Solution | MSD | ||
| Vortex mixer | |||
| ZeBa Column | Pierce | 89892 |
References
- Harjutsalo, V., Sjoberg, L., Tuomilehto, J. Time trends in the incidence of type 1 diabetes in Finnish children: a cohort study. Lancet. 371 (9626), 1777-1782 (2008).
- Vehik, K., et al. Increasing incidence of type 1 diabetes in 0- to 17-year-old Colorado youth. Diabetes Care. 30 (3), 503-509 (2007).
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W.
- Insel, R. A., et al. Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association. Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).
- Barker, J. M., et al. Autoantibody "subspecificity" in type 1 diabetes: risk for organ-specific autoimmunity clusters in distinct groups. Diabetes Care. 28 (4), 850-855 (2005).
- Triolo, T. M., et al. Additional Autoimmune Disease Found in 33% of Patients at Type 1 Diabetes Onset. Diabetes Care. 34 (5), 1211-1213 (2011).
- de Graaff, L. C., Smit, J. W., Radder, J. K. Prevalence and clinical significance of organ-specific autoantibodies in type 1 diabetes mellitus. Netherlands Journal of Medicine. 65 (7), 235-247 (2007).
- Yu, L., et al. Proinsulin/Insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity. Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).
- Yu, L., et al. Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay. Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).
- Miao, D., et al. GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes. Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).
- Gu, Y., Zhao, Z., High, H., Yang, T., Yu, L. Islet Autoantibody Detection by Electrochemiluminescence (ECL) Assay. Journal of Clinical & Cellular Immunology. 8 (6), (2017).
- Gu, Y., et al. Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies. Journal of Visualized Experiments. (133), e57227 (2018).
- Gu, Y., et al. High-throughput multiplexed autoantibody detection to screen type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases simultaneously. Ebiomedicine. 47, 365-372 (2019).
- Dongmei, M., A, K. S., Li Zh, K., Michelle, G., Ling, J., Taylor, A. Electrochemiluminescence Assays for Insulin and Glutamic Acid Decarboxylase Autoantibodies Improve Prediction of Type 1 Diabetes Risk. Diabetes Technology & Therapeutics. 17 (2), 119-127 (2015).
- Steck, A. K., et al. ECL-IAA and ECL-GADA Can Identify High-Risk Single Autoantibody-Positive Relatives in the TrialNet Pathway to Prevention Study. Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (7), 410-414 (2016).
- Fouts, A., et al. Do Electrochemiluminescence Assays Improve Prediction of Time to Type 1 Diabetes in Autoantibody-Positive TrialNet Subjects. Diabetes Care. 39 (10), 1738-1744 (2016).
- Sosenko, J. M., et al. The Use of Electrochemiluminescence Assays to Predict Autoantibody and Glycemic Progression Toward Type 1 Diabetes in Individuals with Single Autoantibodies. Diabetes Technology & Therapeutics. 19 (3), 183-187 (2017).
- Zhao, Z., et al. Higher Sensitivity and Earlier Identification of Celiac Disease Autoimmunity by a Nonradioactive Assay for Transglutaminase Autoantibodies. Journal of Immunology Research. 2016, 5 (2016).
- Zhang, B., Kumar, R. B., Dai, H., Feldman, B. J. A plasmonic chip for biomarker discovery and diagnosis of type 1 diabetes. Nature Medicine. 20 (8), 948-953 (2014).
- Tsai, C. T., Robinson, P. V., Spencer, C. A., Bertozzi, C. R. Ultrasensitive Antibody Detection by Agglutination-PCR (ADAP). American Chemical Society Central Science. 2 (3), 139-147 (2016).
- Yim, S. W., et al. Four-color alternating-laser excitation single-molecule fluorescence spectroscopy for next-generation biodetection assays. Clinical chemistry. 58 (4), 707-716 (2012).
- Bale, S. S., et al. A highly sensitive microsphere-based assay for early detection of Type I diabetes. Technology. 02 (03), 200-205 (2014).
- Ziegler, A. G., et al. 3 Screen ELISA for High-Throughput Detection of Beta Cell Autoantibodies in Capillary Blood. Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (11), 687-693 (2016).
- Schlosser, M., et al. Diabetes Antibody Standardization Program: evaluation of assays for insulin autoantibodies. Diabetologia. 53 (12), 2611-2620 (2010).
- Zhao, Z., et al. A multiplex assay combining insulin, GAD, IA-2 and transglutaminase autoantibodies to facilitate screening for pre-type 1 diabetes and celiac disease. Journal of Immunological Methods. 430, 28-32 (2016).
