Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تحت إشراف التعلم الآلي من أجل تحديد شبه كمي للحمض النووي خارج الخلية في التهاب الجلوميرولونية

Published: June 18, 2020 doi: 10.3791/61180
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,3
1Department of Medicine, Monash University, 2Monash Micro Imaging, Monash University, 3Immunology Department, Monash Health

Summary

الحمض النووي خارج الخلية (ecDNA) صدر أثناء موت الخلايا هو proinflammatory ويساهم في التهاب. قياس ecDNA في موقع الإصابة يمكن تحديد فعالية العلاج العلاجي في الجهاز المستهدف. يصف هذا البروتوكول استخدام أداة التعلم الآلي لأتمتة قياس ecDNA في أنسجة الكلى.

Abstract

موت الخلايا الكبيبية هو سمة مرضية من النيولوبيروكسيديز المضادة للعدلات الأجسام المضادة السيتوبلازمية المرتبطة التهاب الأوعية الدموية (MPO-AAV). يتم تحرير حمض ديوكسيريبونوكليك (ecDNA) خارج الخلية (ecDNA) خلال أشكال مختلفة من موت الخلايا بما في ذلك موت الخلايا، نخر، نخر، العدلات الفخاخ خارج الخلية (NETs) و pyroptosis. قياس موت الخلية هذا يستغرق وقتا طويلا مع العديد من المؤشرات الحيوية المختلفة اللازمة لتحديد الأشكال الكيميائية الحيوية المختلفة لوفيات الخلايا. يتم قياس ecDNA بشكل عام في المصل والبول كبديل للتلف الكلوي ، وليس في الجهاز المستهدف الفعلي حيث تحدث الإصابة المرضية. الصعوبة الحالية في التحقيق ecDNA في الكلى هو عدم وجود طرق لinslyin الأنسجة المضمنة البرافين الثابتة (FFPE) على حد سواء تجريبيا وفي خزعات الكلى البشرية المؤرشفة. هذا البروتوكول يقدم ملخصا للخطوات المطلوبة لطخة ل ecDNA في أنسجة FFPE (كل من الإنسان و murine) ، وإخماد autofluorescence وقياس ecDNA في الصور الناتجة باستخدام أداة التعلم الآلي من المصدر المفتوح المتاح علنا ImageJ المساعد تدريب تجزئة Weka. يتم تطبيق تجزئة Weka القابلة للتدريب على ecDNA داخل الكبيات حيث يتعلم البرنامج تصنيف ecDNA. يتم تطبيق هذا المصنف على صور الكلى المكتسبة اللاحقة ، مما يقلل من الحاجة إلى التعليقات التوضيحية اليدوية لكل صورة على حدة. وقد ثبت أن القدرة على التكيف من تجزئة Weka القابلة للتدريب أكثر في أنسجة الكلى من التهاب الميرين التجريبي المضاد للكبيباتولونية (GN) ، لتحديد NETs وecMPO ، والمساهمين المرضية المشتركة لمكافحة MPO GN. توفر هذه الطريقة تحليلًا موضوعيًا لـ ecDNA في أنسجة الكلى يوضح بوضوح فعالية برنامج تجزئة Weka القابل للتدريب الذي يمكن أن يميز ecDNA بين أنسجة الكلى الطبيعية السليمة وأنسجة الكلى المريضة. ويمكن بسهولة تكييف هذا البروتوكول لتحديد ecDNA، NETs وecMPO في الأجهزة الأخرى.

Introduction

Myeloperoxidase المضادة للعدلات cytoplasmic الأجسام المضادة المرتبطة بهشاشة الأوعية الدموية (MPO-AAV) هو مرض المناعة الذاتية التي تؤدي إلى الفشل الكلوي من الإصابة الكبيبية المرضية مع موت الخلايا كبيرة وإطلاق حمض ديوكسي تريبونوكلليك (الحمض النووي)1,2. الحمض النووي يمكن تنشيط الجهاز المناعي من خلال العمل كإشارة الخطر. في ظل الظروف الصحية العادية، يوفر الموقع النووي للحمض النووي الحماية من التعرض للجهاز المناعي. الحمض النووي الذاتي الذي يتم تحريره خارج الخلية خلال العمليات المسببة للأمراض أو autoimmunity ينظر إليه من قبل الجهاز المناعي باعتباره الضرر proinflammatory قوية المرتبطة البروتين الذاتي الجزيئي (DAMP)3. يتم تحرير الحمض النووي الخلوي الإضافي (ecDNA) من الخلايا المحتضرة من خلال العديد من الآليات المتميزة التي تحكمها مسارات بيوكيميائية متميزة ، مثل المبرمج ، نخر العدلات العدلات تكوين فخ خارج الخلية (NETs) ، نخر أو pyroptosis4،5،6،,8.8

نحن وصف هنا أساليب لطخة وقياس ecDNA صدر من الخلايا المحتضرة في أقسام من البارافين ثابتة (FFPE) الكليتين من التجريبية المضادة MPO GN وخزعات الكلى من المرضى الذين يعانون من MPO-AAV9,10. توجد طرق متعددة للكشف عن تعميم الحمض النووي المزدوج (DsDNA) ومجمعات الحمض النووي من كل من المصل والبول ومن المختبرات11,12. هذه الطرق، على الرغم من دقة في تحديد كمية ecDNA، لا تحدد أين يتم تحرير ecDNA تشريحيا. هناك طرق تصف قياس محدد من ecDNA مثل موالف ل المبرمج وقياس حطام الخلية13،14. لا توجد طريقة تصف قياس ecDNA بلغت ذروتها من جميع أشكال موت الخلايا في الكلى FFPE حيث يحدث الضرر المرضي. وهذا أمر مهم لتحديد ما إذا كانت العلاجات العلاجية التجريبية وتطهير ecDNA من مواقع الإصابة المرضية في الجهاز المستهدف الفعلي.

إن الحصول على صور متعددة من عينات الكلى يخلق كمية كبيرة من البيانات التي يتم تحليلها بشكل شائع من قبل مستخدم واحد. هذا كثيف العمالة، تستغرق وقتا طويلا ويمكن أن تخضع لإعادة إنتاج لا يمكن الاعتماد عليها من قبل المستخدمين الآخرين، وذلك بسبب تحيز المستخدم. تجزئة Weka القابلة للتدريب هو برنامج إضافي مفتوح المصدر لـ ImageJ يستخدم أدوات متطورة للمعلومات الحيوية لتصنيف وحدات البكسل باستخدام خوارزميات التعلم الآلي15،16. هذا الأسلوب هو "تدريب" حيث أنه يتعلم من تصنيف المستخدم من شرائح من بكسل وتطبيق التصنيف الجديد المستفادة على الصور الأخرى. تعتمد هذه الطريقة على أدوات التحليل الشائعة ضمن برنامج ImageJ التي تستخدم "لتصنيف" كل بكسل في مقطع على أنه ينتمي إلى "فئة" معينة. بمجرد أن يتعلم البرنامج "المصنفات"، يمكن استخدامها لتحديد شرائح أخرى مصنفة مماثلة داخل نفس الصورة. ثم يتم حفظ هذا النموذج وتطبيقه على مجموعات أخرى من الصور ضمن نفس التجربة.

العقبات الحالية لتحديد ecDNA في الموقع في أقسام الكلى هو ذاتي endfluorescence الذاتية من التثبيت في formalin وتحليل العمالة الكثيفة من الصور. نحن نصف هنا كيفية إخماد هذا autofluorescence، والكشف عن ecDNA، واستخدام التعلم الآلي تحت إشراف لقياس الإنتاجية عالية من ecDNA. لقد سبق أن نشرنا قياس NETs وMPO خارج الخلية (ecMPO) باستخدام ماكرو في ImageJ ، ونحن الآن نبرهن شبه أتمتة هذه الأساليب باستخدام التعلم الآلي تحت إشراف1. نحن نبرهن على قدرة على التكيف مع أداة التعلم الآلي، لتصنيف بقعة بديلة لـ NETs و ecMPO داخل نفس الصورة. ويمكن ترجمة هذه الأساليب تلطيخ المذكورة هنا للكشف عن ecDNA، NETs وecMPO إلى الأجهزة الصلبة الأخرى والأمراض حيث ecDNA, NETS وecMPO يلعب دورا في إدامة المرض مثل التهاب المفاصل الروماتويدي والذئبة17,18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

هذه الطريقة تمكن من الكشف عن عموم ecDNA من جميع أشكال موت الخلايا. وتستخدم نفس الطريقة والأجسام المضادة لالأنسجة خزعة الكلى البشرية (من الخطوة 4). جميع البشر والحيوانات كان على موافقة الأخلاقيات من جامعة موناش، وموناش الصحة، كلايتون، فيكتوريا، أستراليا.

1. تلطيخ ل ecDNA مع DAPI و β -Actin

  1. حث نموذج 20 يوما من glomerulonephs المضادة للنخاع (المضادة MPO-GN) في 8-10 أسابيع الفئران C57/Bl6 القديمة، مع الضوابط9.
    1. القتل الرحيم الفئران إنسانيا باستخدام غرفة CO2.
    2. إزالة الكلى عن طريق إجراء شق خط الوسط الأمامي من خلال الجلد مع مقص، ومن ثم قطع بعناية الصفاق ودبوس مرة أخرى على لوحة تشريح. باستخدام ملقط جانبا اللفافة الكلوية الأمامية والصاقوم الجداري وقطع الكلى مجانا عن طريق قطع الحالب والأوعية الدموية (الشريان الكلوي والوريد) في الحوض الكلوي. إزالة مع ملقط وقطع الكلى في النصف (الطائرة القوس) مع مشرط حجم 22.
    3. ضع الكلى في التثبيت (4٪ من الـ 16 ساعة في درجة حرارة الغرفة(RT) إزالة ونقع الكلى الثابتة في 30٪ الإيثانول لمدة 24 ساعة قبل المعالجة.
  2. معالجة الكلى باستخدام دورة قياسية مدتها 6 ساعات:
    70% الإيثانول لمدة 15 دقيقة
    90% الإيثانول لمدة 15 دقيقة
    100٪ الإيثانول لمدة 15 دقيقة
    100٪ الإيثانول لمدة 20 دقيقة
    100٪ الإيثانول لمدة 25 دقيقة
    100٪ الإيثانول لمدة 30 دقيقة
    إكسيلين لمدة 20 دقيقة
    إكسيلين لمدة 30 دقيقة
    إكسيلين لمدة 40 دقيقة
    الشمع لمدة 30 دقيقة
    الشمع لمدة 35 دقيقة
    الشمع لمدة 40 دقيقة
    ملاحظة: هذا مهم لأن الكلى لا ينبغي أن تتعرض لفترات طويلة التعرض للحرارة في الشمع، كما أنها يمكن أن تدمر المستضدات من الفائدة.
  3. قطع 3 ميكرومتر أقسام على microtome وجبل على الشرائح المجهر الزجاج المتاحة تجاريا المغلفة مع شحنة إيجابية. السماح لتجف بين عشية وضحاها.
  4. وضع الشرائح الزجاجية في رف الشريحة في فرن 60 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
    ملاحظة: الخطوات 1.3 و 1.4 هامة لضمان المقاطع لا تطفو أثناء خطوة استرداد مستضد.
  5. تزج الشرائح في اثنين من التغييرات من المذيبات (الزيلين أو بديل) لمدة 40 دقيقة لكل منهما، في غطاء محرك الدخان.
  6. شرائح إعادة الترطيب في الإيثانول 100٪ ، 100 ٪ الإيثانول ، 70 ٪ الإيثانول لمدة 5 دقائق لكل من. يغسل لمدة 5 دقائق في ماء الصنبور.
  7. ضع صفيحة ساخنة في غطاء الدخان وحل استرجاع مستضد ما قبل البور (10 mM Tris، 1 mM EDTA pH 9.0) في طنجرة الضغط. بمجرد أن يبدأ حل استرجاع المستضد في الغليان ، ضع الشرائح في الوعاء أفقيًا باستخدام زوج من ملقط وقفل الغطاء. يغلي على ارتفاع (ما يعادل 15 psi أو 103 كيلو باسكال) لمدة 10 دقيقة.
    ملاحظة: هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية لأنها تسترد مستضد الفائدة عن طريق كشف عن epitope المستضد (عبر ربط عبر تثبيت formalin) للسماح epitope الأجسام المضادة محددة الربط تلطيخ اللاحقة لن تعمل بدونه.
  8. إزالة طنجرة الضغط من الحرارة وإزالة الغطاء على الفور عن طريق تشغيل الصنبور البارد على رأس الغطاء في بالوعة. اترك الشرائح لتكواز لمدة 20 دقيقة في محلول استرجاع المستضد.
  9. غسل الشرائح مرتين لمدة 5 دقائق في 0.01 M الفوسفات المالحة المخزنة (PBS) (pH 7.4) على شاكر المدارية.
  10. استخدام قلم للماء لرسم دوائر حول أنسجة الكلى مع الحرص على عدم السماح لأي أنسجة تجف في هذا الوقت.
  11. كتلة الأنسجة في 10٪ sera الدجاج في 5٪ البوم مصل البقر (BSA)/PBS (pH 7.4، 0.01 M) لمدة 30 دقيقة، 60 ميكرولتر لكل قسم. لا تغسل بعد هذه الخطوة ولكن بعناية إزالة حل حجب باستخدام ماصة 60 ميكرولتر، لا تدع المقاطع تجف.
  12. تطبيق كوكتيل الأجسام المضادة الأولية لβ-actin المخفف 1/1000 في 1٪ BSA / PBS (درجة الحرارة 7.4، 0.01 م)، 60 ميكرولتر لكل قسم واحتضان بين عشية وضحاها في غرفة الرطوبة في 4 درجة مئوية.
  13. غسل الشرائح مرتين لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني (pH 7.4، 0.01 م) على شاكر المدارية.
  14. تطبيق الأجسام المضادة الثانوية، الدجاج المضادة الأرنب 488 (1/200)، 60 ميكرولتر لكل قسم المخفف في 1٪ BSA / PBS (pH 7.4، 0.01 M) لمدة 40 دقيقة في RT.
  15. اغسل الشرائح مرتين لمدة 5 دقائق في PBS (pH 7.4، 0.01 M) على شاكر مداري.
  16. غمر الشرائح في 0.3٪ أسود السودان في 70٪ الإيثانول لمدة 30 دقيقة في جرة كوبلين.
    ملاحظة: هذه الخطوة الهامة كما quenches الفلوروسينس الناتجة عن تثبيت الشكلية.
  17. غسل الشرائح في ماء الصنبور لإزالة الترسبات ثم تزج في برنامج تلفزيوني (درجة الH 7.4، 0.01 م) لمدة 10 دقائق لمنع مزيد من السودان الأسود العجل من تشكيل.
  18. جبل الشرائح على الأغطية الزجاج confocal باستخدام ثلاث قطرات 60 ميكرولتر من حل تصاعد مع DAPI وختم الأغطية مع طلاء الأظافر عن طريق تطبيق حول محيط الغطاء.
  19. السماح للشرائح لعلاج لمدة 24 ساعة في RT (للسماح للDAPI لاختراق) ومن ثم تخزينها في 4 درجة مئوية محمية من الضوء.
    ملاحظة: من المهم أن تبقى في الظلام لمنع تلاشي المسابير الفلورسنت.
  20. شرائح الصورة باستخدام رئيس مسح ليزر confocal تعلق على المجهر. تثير الشرائح مع الليزر 405 لDAPI و488 ليزر للبيتا أكتين. التقاط صورة 1024 x1024 بكسل من المستوى الواحد باستخدام الالتقاط المتسلسل للخط والمتوسط 4 أسطر، وهو أمر ضروري للكشف عن ecDNA. ويستخدم 40x 1.0 ن هدف النفط.
    1. صورة الحد الأدنى من 20 كبيبات لكل عينة. حفظ الصور كملفات ND2.

2. DAPI و β-Actin تحليل

  1. تثبيت ImageJ: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. تحقق من أن تجزئة Weka القابلة للتدريب متوفرة تحت الإضافات | تجزئة | تجزئة Weka القابلة للتدريب.
  3. إسقاط الصورة على شريط أدوات ImageJ. انقر على صورة | لون | قنوات الانقسام. صورة واحدة مع DAPI في تلطيخ الأزرق سوف تظهر جميع النوى وصورة 1 مع β-actin باللون الأخضر، الذي يحدد الجلجوميري.
    1. إنشاء ملف مدمج من الصور الفردية لرسم منطقة ذات أهمية (ROI) للglomerulus من خلال النقر على اللون | دمج القنوات. سيطلب مربع منبثق تعيين لون لكل قناة. بعد تعيين كل قناة لون، حدد المربع إنشاء مركب ومربع الاحتفاظ بالصور المصدر وانقر فوق موافق. ستظهر صورة مركبة مدمجة.
    2. باستخدام تلطيخ β-actin كدليل، رسم عائد الاستثمار حول خصلة الكبيات. احتفظ بهذه الصورة جانباً لاستخدام عائد الاستثمار في نهاية هذا البروتوكول.
  4. تنفيذ التمويه الغاوسي على صورة DAPI زرقاء واحدة. انقر على معالجة | مرشحات | ضبابي غاوسي، وضعت في 1-2.00. الصورة سوف تبدو الآن غير واضحة قليلا، ولكن النواة هي الآن على نحو سلس والخلفية خففت.
    ملاحظة: هذه الخطوة هو preformed لإزالة الضوضاء لتنظيف الصورة من artifacts التي قد تمنع الكشف ذات الصلة من سمات الصورة لتحليلها.
  5. انقر على الإضافات | تجزئة | تجزئة Weka القابلة للتدريب.
  6. باستخدام أداة الخط على شريط الأدوات في ImageJ ، تتبع أولا حول نوات سليمة باستخدام أدوات اليد الحرة (هناك خيارات أداة سطر ، دائري ، ومربع المتاحة للاختيار من بينها) ، ثم إضافة إلى إضافة فئة 1 مربع.
  7. باستخدام أداة الخط على شريط الأدوات في ImageJ تحديد مناطق الخلفية إلى مربع الفئة 2.
  8. انقر فوق تسمية الزر إنشاء فئة جديدة على إطار تجزئة Weka وتسمية "ecDNA". استخدم أداة الخط (من شريط أدوات ImageJ) لتحديد الحمض النووي الإضافي الملطخ بواسطة DAPI.
  9. انقر على زر Train Classifier في قائمة التدريب في نافذة تجزئة Weka القابلة للتدريب.
    ملاحظة: سوف يظهر الزر STOP بدلاً من زر "تصنيف القطار" ويبقى حتى انتهاء التدريب. لا تنقر على هذا الزر أثناء التدريب حيث سيتم مقاطعة العملية.
  10. انقر على زر إنشاء نتيجة لإنشاء صورة مع جميع المكونات المصنفة ، والتي تتكون من نوى سليمة ، والخلفية وecDNA التي تم تحديدها.
  11. انقر على زر الحصول على احتمال. قم بتبديل الماوس لإعطاء صورة بالأبيض والأسود لكافة الفئات مع تمييز كائن التحديد باللون الأبيض.
  12. تكرار هذه الصورة من خلال النقر على صورة | تكرار.
  13. التبديل إلى الشاشة باستخدام زر الماوس الذي يحتوي على ecDNA. تطبيق عتبة للحصول على ما تم تعريفه باسم ecDNA فقط. انقر فوق تطبيق عندما تكون العتبة كافية.
  14. إذا بعد العتبة، هناك المزيد من المناطق من الحمض النووي التي ليست ecDNA، والعودة إلى الصورة الأصلية المدربة، إضافة المزيد من المصنفات، وتكرار الخطوات 2.1-2.13.
  15. انقر على صورة | ضبط الصورة | جعل ثنائي. انسخ عائد الاستثمار الكبوي الذي تم في الخطوة 2.3 وانقر فوق Ctrl+Shift+E. تفعيل نافذة Weka عن طريق تحرير | اختيارات | الاستعادة، التي تعيد التحديد. انقر فوق تحليل الجسيمات، والتي سوف تقيس فقط جزيئات ecDNA داخل الكبيات.
    ملاحظة: يتم حساب ورقة النتائج مع عدد الجسيمات والمساحة ومتوسطات البكسل والنسبة المئوية للكبيبات التي تحتوي على ecDNA. ويمكن تصدير هذه النتائج إلى جدول بيانات وحفظها، لتحليل إحصائي لاحق.
  16. حفظ المصنف كما ecDNA.classifier عن طريق النقر حفظ المصنف من القائمة خيارات في التطبيق ImageJ على سطح المكتب. ثم انقر فوق حفظ البيانات من قائمة الخيارات وحفظ كـ ecDNA.arff في المجلد ImageJ. يجب إضافة عائد الاستثمار يدويًا في كل مرة حيث سيتغير حجم وشكل الكبيات ، ومع ذلك فقد تعلم البرنامج ما هو ecDNA.
  17. لإعادة تطبيق النموذج على الصور اللاحقة، كرر الخطوات من 2.1 إلى 2.5 مع صورة جديدة. انقر فوق تحميل المصنف من قائمة الخيار ثم ecDNAmodel.classifier في المجلد ImageJ من الخطوة 2.16. قائمة السجل سوف يطفو على المنبثقة وتشغيل النموذج.
  18. بمجرد تشغيل النموذج، انقر فوق "بيانات التحميل" في قائمة الخيارات وحدد الملف ecDNA.arff المحفوظة في المجلد ImageJ من الخطوة 2.16. انقر على إنشاء نتيجة. إذا كانت الصورة الناتجة قد فشلت في التقاط جميع النوى أو الخلفية أو ecDNA انقر على إعادة تدريب المصنف وإضافة المزيد من المصنفات وحفظ النموذج الجديد. أكمل عملية التحليل بتكرار الخطوات 2.9-2.16.
    ملاحظة: يمكن استخدام عدة صور لإنشاء النموذج النهائي المستخدم للكشف عن ecDNA. ويتحقق ذلك عن طريق تطبيق النموذج على الصور اللاحقة، وإضافة المزيد من المصنفات وحفظ النموذج الجديد والبيانات في المجلد ImageJ. يمكن أن يكون هذا مهمًا بشكل خاص عندما تكون العينات المختلفة ذات خلفية أعلى. برنامج تجزئة Weka متوافق أيضا مع لغة الماكرو ImageJ التي تمكن العديد من الأوامر أن تكون ماكرو للتسجيل لأتمتة بعض الخطوات.

3. قياس الفخاخ العدلات خارج الخلية وecMPO

ملاحظة: هذه الطريقة تحدد NETs عن طريق التكلس من الحمض النووي خارج الخلية، Citrullinated Histones peptidyl أرجيناز 4 (PAD4) و MPO.

  1. حث نموذج 20 يوما من glomerulonephs المضادة للنخاع (المضادة MPO-GN) في 8-10 أسابيع الفئران C57/Bl6 القديمة، مع الضوابط9.
    1. القتل الرحيم الفئران إنسانيا باستخدام غرفة CO2.
    2. إزالة الكلى عن طريق إجراء شق خط الوسط الأمامي من خلال الجلد مع مقص، ومن ثم قطع بعناية الصفاق ودبوس مرة أخرى على لوحة تشريح. باستخدام ملقط جانبا اللفافة الكلوية الأمامية والصاقوم الجداري وقطع الكلى مجانا عن طريق قطع الحالب والأوعية الدموية (الشريان الكلوي والوريد) في الحوض الكلوي. إزالة مع ملقط وقطع الكلى في النصف (الطائرة القوس) مع مشرط حجم 22.
    3. ضع الكلى في التثبيت (4٪ من الـ 16 ساعة في درجة حرارة الغرفة(RT) إزالة ونقع الكلى الثابتة في 30٪ الإيثانول لمدة 24 ساعة قبل المعالجة.
  2. معالجة الكلى باستخدام دورة قياسية مدتها 6 ساعات:
    70% الإيثانول لمدة 15 دقيقة
    90% الإيثانول لمدة 15 دقيقة
    100٪ الإيثانول لمدة 15 دقيقة
    100٪ الإيثانول لمدة 20 دقيقة
    100٪ الإيثانول لمدة 25 دقيقة
    100٪ الإيثانول لمدة 30 دقيقة
    إكسيلين لمدة 20 دقيقة
    إكسيلين لمدة 30 دقيقة
    إكسيلين لمدة 40 دقيقة
    الشمع لمدة 30 دقيقة
    الشمع لمدة 35 دقيقة
    الشمع لمدة 40 دقيقة
    ملاحظة: لا ينبغي أن تتعرض الكلى للتعرض لفترات طويلة للحرارة في الشمع، لأنها يمكن أن تدمر المستضدات ذات الأهمية.
  3. قطع 3 ميكرومتر أقسام على microtome وجبل على الشرائح المجهر الزجاج المتاحة تجاريا المغلفة مع شحنة إيجابية. السماح لتجف بين عشية وضحاها
  4. وضع الشرائح الزجاجية في رف الشريحة في فرن 60 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
    ملاحظة: الخطوات 3.3-3.4 الهامة لضمان المقاطع لا تعويم إيقاف أثناء خطوة استرداد مستضد.
  5. تزج الشرائح في اثنين من التغييرات من المذيبات (الزيلين أو بديل) لمدة 40 دقيقة لكل منهما، في غطاء محرك الدخان.
  6. شرائح إعادة الترطيب في الإيثانول 100٪ ، 100 ٪ الإيثانول ، 70 ٪ الإيثانول لمدة 5 دقائق لكل من.
  7. يغسل لمدة 5 دقائق في ماء الصنبور.
  8. ضع صفيحة ساخنة في غطاء أبخرة وحل استرجاع مستضدات ما قبل البور (10 mM Tris-1 mM EDTA pH 9.0) في طنجرة ضغط. بمجرد أن يبدأ حل استرجاع المستضد في الغليان مكان الشرائح في وعاء أفقيا باستخدام زوج من ملقط وتأمين الغطاء. يغلي على ارتفاع (ما يعادل 15 psi أو 103 كيلو باسكال) لمدة 10 دقيقة.
    ملاحظة: هذه الخطوة باسترداد المستضد من الفائدة عن طريق فك كشف عن epitope المستضد (عبر ربط عبر تثبيت formalin) للسماح epitope الأجسام المضادة محددة ربط تلطيخ اللاحقة لن تعمل دون هذه الخطوة.
  9. إزالة طنجرة الضغط من الحرارة وإزالة الغطاء على الفور عن طريق تشغيل الصنبور البارد على رأس الغطاء في بالوعة. اترك الشرائح لتكواز لمدة 20 دقيقة في محلول استرجاع المستضد.
  10. غسل الشرائح مرتين لمدة 5 دقائق في الفوسفات المالحة المخزنة (PBS) (pH 7.4، 0.01 M) على شاكر المدارية.
  11. استخدام قلم للماء لرسم دوائر حول أنسجة الكلى مع الحرص على عدم السماح لأي أنسجة تجف في هذا الوقت.
  12. كتلة الأنسجة في 10٪ sera الدجاج في 5٪ البوم مصل البقر (BSA)/PBS (pH 7.4، 0.01 M) لمدة 30 دقيقة، 60 ميكرولتر لكل قسم. لا تغسل بعد هذه الخطوة ولكن إزالة بعناية حل حجب باستخدام ماصة 60 ميكرولتر. لا تدع المقاطع تجف.
  13. جعل كوكتيل من الأجسام المضادة الأولية المخففة في 1٪ BSA / PBS (pH 7.4، 0.01 م) في 1 أنبوب. تطبيق 60 ميكرولتر لكل أقسام الكلى. تركيز الأجسام المضادة الأولية هي كما يلي:
    أرنب المضادة الإنسان / الماوس H3Cit 1/100
    الماوس المضادة للإنسان / الماوس PAD4 1/50
    الماعز المضادة الإنسان / الماوس MPO 1/200
  14. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في غرفة الرطوبة.
  15. غسل الشرائح مرتين لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني (pH 7.4، 0.01 م) على شاكر المدارية.
  16. جعل مزيج من الأجسام المضادة الثانوية في 1 أنبوب. يتم تطبيق الأجسام المضادة الثانوية في 1٪ BSA / PBS ، 60 ميكرولتر لكل قسم على النحو التالي:
    الدجاج المضادة الأرنب 488 1/200.
    مضاد الماوس الدجاج 647 1/200.
    الدجاج المضادة الماعز 594 1/200.
  17. احتضان في RT لمدة 40 دقيقة.
  18. غسل الشرائح مرتين لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني (pH 7.4، 0.01 م) على شاكر المدارية.
  19. تطبيق الأجسام المضادة الثانوية 1:200 في 1٪ BSA / PBS (pH 7.4، 0.01 م) لمدة 40 دقيقة في RT 60 ميكرولتر لكل قسم.
  20. غسل الشرائح مرتين لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني (pH 7.4، 0.01 م) على شاكر المدارية.
  21. تزج الشرائح في 0.3٪ أسود السودان في 70٪ الإيثانول لمدة 30 دقيقة.
  22. غسل الشرائح في ماء الصنبور لإزالة الترسبات ثم تزج في برنامج تلفزيوني (درجة الH 7.4، 0.01 م) لمدة 10 دقائق لمنع مزيد من السودان أسود العجل من تشكيل.
  23. جبل الشرائح على أغطية الزجاج confocal باستخدام ثلاث قطرات 60 ميكرولتر من حل التركيب مع DAPI. ختم الأغطية مع طلاء الأظافر عن طريق تطبيق حول محيط الغطاء.
  24. السماح للشرائح لعلاج لمدة 24 ساعة في RT (للسماح للDAPI لاختراق) ومن ثم تخزينها في 4 درجة مئوية محمية من الضوء. إبقاء في الظلام لمنع يتلاشى من تحقيقات الفلورسنت.
  25. شرائح الصورة باستخدام رئيس مسح ليزر confocal تعلق على المجهر. تثير الشرائح مع ليزر 405 لDAPI و488 ليزر لH3Cit، 561 لMPO، و 647 لPAD4. التقاط صورة 1024x1024 بكسل من الطائرة الواحدة باستخدام التقاط خط تسلسلي ومتوسط 4-خط وهو أمر ضروري للكشف عن ecDNA. استخدام 40x 1.0 NA هدف النفط. صورة الحد الأدنى من 20 كبيبات لكل عينة. حفظ الصور كملفات ND2.

4. الفخاخ العدلية خارج الخلية وتحليل ecMPO

  1. تثبيت ImageJ: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. تحقق من أن تجزئة Weka القابلة للتدريب متوفرة تحت الإضافات | تجزئة | تجزئة Weka القابلة للتدريب.
  3. إسقاط الصورة في ImageJ. انقر على صورة | لون | قنوات الانقسام. صورة واحدة مع DAPI باللون الأزرق تلطيخ جميع النوى سوف تظهر، صورة واحدة مع H3Cit باللون الأخضر، صورة واحدة مع MPO باللون الأحمر، وصورة واحدة مع PAD4 باللون الأبيض سوف تظهر.
    1. إنشاء ملف مدمج من الصور الفردية لرسم عائد الاستثمار للglomerulus عن طريق النقر على اللون | دمج القنوات. سيطلب مربع منبثق تعيين لون لكل قناة. بعد تعيين كل قناة لون، حدد المربع إنشاء مركب ومربع الاحتفاظ بالصور المصدر وانقر فوق موافق. تظهر صورة مدمجة. على عكس بروتوكول ecDNA سابقا سوف نستخدم صورة مركبة لتنفيذ بقية الخطوات.
  4. تنفيذ طمس غاوسي على الصورة المركبة. وهذا يسمح تنعيم من النوى. انقر على معالجة | مرشحات | ضبابي غاوسي، وضعت في 1.00-2.00. الصورة سوف تبدو الآن غير واضحة قليلا ولكن النواة هي الآن على نحو سلس والخلفية خففت.
    ملاحظة: هذه الخطوة هو preformed لإزالة الضوضاء لتنظيف الصورة من artifacts التي قد تمنع الكشف ذات الصلة من سمات الصورة لتحليلها.
  5. انقر على الإضافات | تجزئة | تجزئة Weka القابلة للتدريب. ستظهر نافذة جديدة بالكامل مع الصورة التي سيتم تحليلها وأدوات القائمة تجزئة Weka.
  6. باستخدام أداة الخط على شريط الأدوات (في ImageJ)، تتبع أولا حول النوى سليمة ليست إيجابية لجميع مكونات NET 4 (MPO، PAD4، DAPI و H3Cit) باستخدام أداة اليد الحرة وثم إضافة إلى إضافة فئة 1 مربع.
  7. باستخدام أداة الخط على شريط أداة ImageJ تحديد مناطق الخلفية إلى المربع الفئة 2.
  8. انقر على تسمية الزر إنشاء فئة جديدة في قائمة التسمية والتسمية "NETs". استخدم أداة الخط لتحديد NETS التي تم تحديدها كـ DAPI (الأزرق) و MPO (الأحمر) و PAD4 (أبيض) و هستونات citrullinated (الأخضر).
  9. انقر على تسمية زر إنشاء فئة جديدة في قائمة التسمية والتسمية "ecMPO". استخدم أداة الخط لتحديد MPO (أحمر) خالٍ من الخلايا.
  10. انقر على زر تصنيف القطار في قائمة التدريب في إطار تجزئة Weka القابلة للتدريب.
    ملاحظة: سوف يظهر الزر STOP بدلاً من زر "تصنيف القطار" ويبقى حتى انتهاء التدريب. لا تنقر على هذا الزر أثناء التدريب وسيتم مقاطعة العملية.
  11. انقر على زر إنشاء نتيجة في قائمة التدريب ويتم إنشاء صورة مع جميع المكونات المصنفة ، والتي تتكون من نوى سليمة ، والخلفية وما تم تحديده على أنه ecMPO.
  12. انقر على زر الحصول على احتمال في القائمة التدريبية. قم بتبديل الماوس لإعطاء صورة بالأبيض والأسود لكافة الفئات مع تمييز كائن التحديد باللون الأبيض.
  13. تكرار كل من صافي احتمال وصورة احتمال ecMPO من خلال النقر على صورة | تكرار.
  14. التبديل إلى الشاشة باستخدام زر الماوس الذي يحتوي على NETs. تطبيق حد لضمان فقط تسليط الضوء على NETs المحددة. على شريط أدوات القائمة ImageJ، انقر على صورة | ضبط | الحد الأدنى. نقل أشرطة تبديل انزلاق حتى يتم تمييز مكونات NET. انقر فوق تطبيق عندما تكون راضية عن الحد الأدنى. كرر نفس الخطوات لecMPO.
  15. إذا بعد عتبة لا تزال هناك اكتشاف مناطق ecmpo أو NETs، والعودة إلى الصورة الأصلية المدربة وإضافة المزيد من المصنفات وإعادة تطبيق الخطوات 4.1-4.14.
  16. انقر على صورة | ضبط الصورة | جعل ثنائي. نسخ العائد على الاستثمار الكبيّة الذي تم في الخطوة 4.3، انقر فوق Ctrl+Shift+E. تفعيل نافذة Weka عن طريق تحرير | اختيارات | الاستعادة، التي تعيد التحديد. انقر فوق تحليل الجسيمات لقياس فقط جزيئات صافي داخل glomerulus.
  17. التبديل إلى الشاشة باستخدام زر الماوس الذي يحتوي على ecmpo. تطبيق عتبة لضمان الحصول على ECMPO المحدد فقط. انقر فوق تطبيق عندما تكون راضية عن الحد الأدنى. كرر الخطوة 4.16 أعلاه.
    ملاحظة: يتم حساب ورقة النتائج مع عدد الجسيمات والمساحة ومتوسطات البكسل والنسبة المئوية للكبيبات التي تحتوي على كل من NETs وecMPO. ويمكن بعد ذلك وضع هذه النتائج في جدول البيانات وحفظها، لتحليل إحصائي لاحق.
  18. حفظ المصنف كما NETs.classifier بالنقر فوق حفظ المصنف من قائمة الخيارات وحفظ الملف في التطبيق ImageJ على سطح المكتب (مجلد ImageJ). ثم انقر فوق حفظ البيانات من قائمة الخيارات وحفظ كملف NETs.arff. سيكون من الواجب إضافة عائد الاستثمار الكبيائي يدويًا في كل مرة حيث سيتغير حجم وشكل الكبيات ، ولكن البرنامج قد تعلم ما هي كل من NETs و ecMPO.
  19. لإعادة تطبيق النموذج على الصور اللاحقة، كرر الخطوات 4.1-4.5 مع صورة جديدة. انقر فوق تحميل المصنف من قائمة الخيارات. انقر على Nets.classifier في المجلد ImageJ. قائمة السجل سوف يطفو على المنبثقة وتشغيل نموذج، وبمجرد تشغيل النموذج انقر على بيانات التحميل في قائمة الخيارات وحدد الملف NETs.arff.
    1. انقر على إنشاء نتيجة. إذا كانت الصورة الناتجة قد فشلت في التقاط جميع النوى أو الخلفية أو ecDNA انقر على إعادة تدريب المصنف وإضافة المزيد من المصنفات وحفظ النموذج الجديد. أكمل عملية التحليل بتكرار الخطوات 4.11-4.19.
      ملاحظة: يمكن استخدام عدة صور لإنشاء النموذج النهائي المستخدم للكشف عن ecDNA وecMPO وNETs. ويتحقق ذلك عن طريق تطبيق النموذج على الصور اللاحقة، وإضافة المزيد من المصنفات وحفظ النموذج الجديد والبيانات في المجلد ImageJ. يمكن أن يكون هذا مهمًا بشكل خاص عندما تكون العينات المختلفة ذات خلفية أعلى. يتوافق برنامج تجزئة Weka مع لغة الماكرو ImageJ التي تمكن العديد من الأوامر من أن تكون قابلة للتسجيل ماكرو لأتمتة بعض الخطوات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تمثل هذه الصور الخطوات المتعددة المطلوبة لاستخدام تجزئة Weka القابلة للتدريب بنجاح لتقليل القياس اليدوي كثيف العمالة لـ ecDNA في أنسجة الكلى FFPE الملطخة بالفلور من فأرة مع GN مضادة MPO. وتتلخص هذه الخطوات في الشكل 1 والشكل 2 مع الصور المأخوذة مباشرة من برنامج تجزئة Weka، والتي تحدد كل خطوة في عملية التحليل. ثم تظهر القياسات من هذا التحليل في الشكل 3 مما يدل على قدرة البرنامج على تحديد الكميات المختلفة من ecDna المودعة في الكبيبات، في الأنسجة التحكم، دون تحريض المضادة MPO GN. يوضح الشكل 4 أنه يمكن تكييف نموذج ecDNA لتحديد ecDNA في عينات خزعة الكلى من مريض التحكم (لدى مرضى الحد الأدنى من مرض التغيير الحد الأدنى من الضرر الكبيبي الواضح على مستوى النسيج) ومقارنة مع ذلك من خزعة الكلى من مريض مصاب بـ MPO-AAV. الشكل 5 يوضح القدرة الترجمية لهذا البرنامج إلى البقع الأخرى داخل أنسجة الكلى. لقد استخدمنا عينة تمثيلية من كلية ماوس مع التجارب المستحثة المضادة MPO GN لطخة لNETs وecMPO. ثم يتم استخدام برنامج تجزئة Weka القابل للتدريب لتحديد كل من NETS وecMPO داخل نفس الصورة. ويبين الشكل 6 أنه لا يوجد اختلاف كبير في نتائج النتائج في كمية القياس الكمي لـ ECDNA على نفس مجموعة البيانات التي حللت من قبل اثنين من المستخدمين المستقلين الذين يخلقون نموذجين مختلفين مصممين لتكأد التحلل شبه الكمي.

Figure 1
الشكل 1: صور توضح تصنيف النوى والخلفية والحمض النووي خارج الخلية داخل كبيبات الكلى الماوس من MPO-ANCA GN التجريبية باستخدام تجزئة Weka القابلة للتدريب. (A) يوضح صور قناة واحدة من DAPI لطخة الحمض النووي (الأزرق)، β actin (الأخضر) لتحديد منطقة الكبيات، وملف مركب مع منطقة ذات فائدة (ROI) تشير إلى المنطقة الكبيبية التي يتعين قياسها. (ب) تصنيف النوى السليمة لتطوير النموذج (الوردي) والنيات غير المصنفة (الأزرق). (ج)تصنيف ما يعتبر خلفية (أخضر). (D) تصنيف ما يعتبر ecDNA (الأرجواني). (E) النموذج الذي تم إنشاؤه بواسطة تجزئة Weka القابلة للتدريب يظهر النوى باللون الأحمر والخلفية في منطقة خضراء و ecDNA باللون الأرجواني. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: صور توضح العنصر الخاضع للإشراف للنموذج للحد من عدم الدقة. نموذج Weka يولد احتمالية التعرف على كل مصنف في مكونات غير مصنفة. (أ)نموذج التصنيف ولدت ما هي النوى سليمة. (B) تصنيف نموذج تم إنشاؤه لما يعتبر خلفية. (C)جيل نموذج ما يعتبر ecDNA. (D) يوضح صورة ecDNA المصنفة unthresholded. (E) يظهر تعديل العتبة لاستبعاد أي أخطاء في ما تم تحديده على أنه ecDNA ، تم تحديد ecDNA الموضح باللون الأحمر. (F) يتم تطبيق عتبة على الصورة وجعلها في صورة ثنائية لتحليل الجسيمات. (G) يتم فرض عائد الاستثمار الكبي على الصورة بحيث يتم تحليل ecDNA الكبية فقط. (H) يعرض ملخص النتائج الناتجة عن التحليل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: صور توضح تصنيف النوى والخلفية والحمض النووي خارج الخلية داخل كبيبات الكلى الماوس من فأر التحكم دون تعبئة تجريبية مستحثة MPO-ANCA GN باستخدام تجزئة Weka القابلة للتدريب. (A) يظهر الصورة الأصلية المدمجة مع المنطقة الكبيبية ليتم تحليلها ، والتدريب والنتيجة نموذج المدربين (خلفية خضراء ، أحمر النوى و ecDNA التي تم تحديدها في الأرجواني. (ب) يظهر احتمالات النموذج لتحديد ، النوى ، الخلفية و ecDNA. (ج) نتائج ما يصنفه النموذج وعرفه باسم ecDNA، معروض في وحدات تعسفية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: الصورة التي توضح تجزئة Weka القابلة للتدريب قابلة للتكيف لتحليل ecDNA في خزعات الكلى البشرية من مريض مصاب بمرض تغيير ضئيل ومريض مصاب بالتهاب الأوعية الدموية MPO-ANCA. (A)يوضح أن يتم الكشف عن الحد الأدنى ecDNA باستخدام تجزئة Weka تدريب سليمة النوى (الأحمر)، الخلفية (الأخضر) و ecDNA (الأرجواني). (B) يوضح كميات كبيرة من ecDNA في خزعة الكلى المريض من مريض مع MPO-ANCA الانوية سليمة (الأحمر) ، الخلفية (الأخضر) والأرجواني ecDNA. وتبين النتائج أنه تم العثور على 8 جزيئات من ecDNA داخل المنطقة الكبيبية للمريض مع MCD مقارنة مع المريض مع التهاب الأوعية الدموية النشط MPO ANCA (180 الجسيمات). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: يمكن استخدام تجزئة Weka القابلة للتدريب لتحديد NETS وecMPO ضمن نفس الصورة وتحليل النموذج ، في أنسجة الكلى الماوس من MPO-ANCA GN التجريبية. (أ) يوضح كبيبات مع NETs [التعريب المشترك للخضرة (سيترولينات هيستون 3) والأحمر (MPO) DAPI (نواتي) و PAD4 (أبيض)]. ويعتبر ecMPO لتكون خالية من الخلايا. (B) التدريب على تحديد المصنفات والأحمر (النوى سليمة) والأخضر (الخلفية) والأرجواني (NETs) والأصفر (ecDNA)]. (C) يستخدم نموذج تجزئة Weka القابلة للتدريب لتصنيف NETs وecMPO والأحمر (نوات سليمة) والأخضر (الخلفية) والأرجواني (NETs) والأصفر (ecDNA). (د)تحليل الجسيمات لما قرر النموذج أنه NETs. (ه) تحليل الجسيمات لما قرر النموذج أنه ecMPO. (F) ورقة النتائج من تحليل الجسيمات لكل من NETs و ecDNA. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: مقارنة بين مستعملين مستقلين في تصميم نموذج للكشف عن ecDNA. (أ)الصورة الأصلية التي تظهر DAPI، بيتا أكتين والصور المدمجة ليتم تحليلها. (ب) مقارنة بين نموذج التدريب ، المصنفات ، العتبات والعائد على الاستثمار الكبيّر بين 2 مستخدمين مستقلين. يشير السهم الأصفر إلى أن المستخدم 2 كان عليه إعادة تدريب النموذج لإزالة الخلفية. (C) النتائج التي تم إنشاؤها تظهر مقارنة عدد ecDNA ، المساحة الكلية ، % المساحة والمحيط ، بين 2 مستخدمين. (د)رسم بياني للنتائج لا يظهر فرقا كبيرا بين عدد ecDNA الكشف داخل كبيبات و٪ منطقة من اثنين من المحققين المستقلين. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار Mann-Whitney U مع مجموعة الأهمية في <0.05. حجم العينة هو n =6. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

توجد بروتوكولات متعددة تقيس علامات البروفات في المصل والبول لكل من المرضى ونماذج الماوس من التهاب الكريات. يسمح هذا البروتوكول الموصوف بتحليل منتجات موت الخلايا (ecDNA وNETs وecMPO) داخل الكبيات مباشرة. الخطوات الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو إعداد الأنسجة والتصوير. العنصر الرئيسي المقيد لاستخدام طريقة تلطيخ الفلورسنت للتحليل هو الأنسجة autofluorescence. الأنسجة البارافين ثابتة formalin يخضع ل المناعةflufluorescence التي يمكن أن تحجب تلطيخ الفلورسنت محددة. الخطوة الأخيرة في طريقة تلطيخ حيث يتم غمر الشرائح في السودان الأسود، وتخفيف الفلورورات التلقائية من الأنسجة، ويسمح لإضاءة الأجسام المضادة تلطيخ محددة من خلال الحد من الإشارة إلى نسبة الضوضاء19. يجب أن يتم تصوير الأنسجة مع 40x على الأقل التكبير النفط لتكون قادرة على الكشف عن شظايا أصغر من ecDNA و MPO. عندما يتم الحصول على التصوير، فمن المهم أن يتم ذلك بطريقة متتابعة خط لضمان عدم وجود نزيف من خلال من التألق من علامة واحدة إلى أخرى.

ومن مزايا البروتوكول للتحليل أنه متاح في الوصول المفتوح من خلال ImageJ لأي شخص للوصول إلى16. لقد أثبتنا هنا أن الطريقة يمكن تكييفها بسهولة لقياس علامات الفلورسنت المختلفة داخل أنسجة الكلى. مرة واحدة في نموذج تدريب Weka تجزئة تم تحديد أنه يمكن تطبيقها على الصور اللاحقة مع عدم وجود تحيز وبنفس الطريقة بالضبط كل صورة تم تحليلها. تسمح الطبيعة الخاضعة للإشراف للتحليل بتعديل أي خطأ في التجزئة من خلال الخطوات الإضافية لعتبة الصور "المدربة"، أو إعادة تدريب البرنامج وإضافة المزيد من المصنفات. وميزة هذا البرنامج هو أن اثنين من المستخدمين مختلفة سوف تحصل على نتيجة مماثلة باستخدام نفس النموذج، شريطة أن تحدد بدقة خصلة الكبيات. أكبر عدم دقة في إعادة إنتاج اثنين من المستخدمين النهائيين المختلفة يتم إنشاؤها من خلال الطريقة المختلفة التي تتبع الناس حول خصلة الكبيات. على سبيل المثال، إذا كان شخص واحد يرسم دائرة خشنة حول خصلة الكبيبية ومستخدم آخر يرسم بعناية حول الحلقات الشعرية الخارجية المنطقة التي يجري فحصها سوف تختلف (كما هو موضح في النتائج). ولذلك، فمن الضروري أن يتم تدريب كل من المستخدمين لتحديد خصلة الكبيات بطريقة مماثلة. والتطبيق العملي لهذا البرنامج هو أن يقوم مستخدمان بتصميم النموذج معا على صور متعددة لبناء نموذج قوي يتم تطبيقه على مجموعات بيانات أخرى. كلما كانت الصور المستخدمة لتدريب المصنفات أكثر دقة سيكون النموذج.

حدود هذا البروتوكول سيكون قياس أجزاء من ecDNA أصغر مما يمكن الكشف عن المجهر confocal. ويمكن التغلب على ذلك باستخدام التقاط الصور باستخدام أساليب المجهر فائقة الدقة وتطبيق تجزئة Weka القابلة للتدريب على تلك الصور. يضيف المكون الخاضع للإشراف من التعلم الآلي خطوات إضافية ويقلل من القدرة على معالجة مجموعات كبيرة من الصور. ومع ذلك ، كما أظهرنا ضمن النتائج النماذج غير الخاضعة للرقابة قد خفضت الدقة وإدخال العنصر تحت الإشراف خفض عدم الدقة بشكل كبير.

لقد سبق أن نشرنا أنه بالإضافة إلى العدلات المنتجة الفخاخ خارج الخلية ، لوحظ أيضا monocytes / الضامة لإنتاج الفخاخ خارج الخلية (يطلق عليه METs) في التهاب الأوعية ANCA البشري ، ولكن بنسب أصغر1. لا تميز الطرق الحالية الموضحة هنا بين الفخاخ خارج الخلية التي تنتجها العدلات أو أحاديات الخلايا/الضامة. هذا من الصعب تحقيق معظم المجاهر confocal محدودة من قبل عدد من أشعة الليزر. يتطلب تحديد NETs 4 أشعة ليزر مختلفة مما يحد من عدد علامات الخلية التي يمكن معالجتها عن طريق التصوير confocal القياسية. إذا كان مطلوبا خلية MPO إيجابية المنشأ يمكن أن تلطخ مقطع تسلسلي الثاني إما مع العدلات أو علامة الضامة / أحادية، لتحديد نوع الخلية المنتجة للمناس خارج الخلية.

وتشمل السمات المرضية من MPO-ANCA التهاب الأوعية الدموية ترسب ecDNA، NETS وecMPO داخل glomeruli من الكلى20. وقد تم استهداف الحمض النووي العلاجي داخل NETs وecMPO وكذلك قياسها في الخزعات البشرية كعلامات المرض موضوع الدراسات الحديثة1,20,21,22. وتكمن أهمية هذه الأساليب في هذا المجال في تحديد النسبة النسبية من الأساليب التالية: ECDNA، وNETS، و ECMPO داخل الجهاز المستهدف، بطريقة قابلة للتكرار وأقل استهلاكا للوقت. في الختام أظهرنا أداة التعلم الآلي تحت إشراف تدريب Weka تجزئة شبه أتمتة تحليل مجموعات البيانات الكبيرة من الصور المكتسبة لecDNA، NETs وecMPO. استخدام هذه الأداة سوف يقلل من وقت تحليل الصور إلى حد كبير، ويمكن بسهولة تكييف التقنيات مع البقع الأخرى في الأجهزة الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لا شيء للكشف عنه.

Acknowledgments

ونحن نعترف موناش التصوير الصغرى لاستخدام نيكون C1 تستقيم مجهر الليزر confocal ومنصة الهستولوجيا موناش لمعالجة أنسجة الكلى.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin SIGMA A2153 5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed.
Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A-21468 Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail
Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647 ThermoFisher Scientific A-121468 Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail
Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-21441 Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail
Chicken sera SIGMA C5405 Made up in 1%BSA/PBS
Coverslips 24 x60 mm Azerscientific ES0107222 #1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy
EDTA 10mM SIGMA E6758 Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution
Ethanol 30%, 70% and 100% Chem Supply UN1170 Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water
Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin) TRAJAN NBF-500 Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood
Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mm TRAJAN J3800AM4 Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step
Goat anti human/mouse MPO antibody R&D AF3667 Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Histosol Clini Pure CPL HISTOSOL 08 Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood
Hydrophobic pen VECTOR Labs H-400 Use to draw circle around kidney tissue
Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4) ABCAM ab128086 Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope Coherent Scientific Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Phosphate Buffered Saline SIGMA P38135 0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time
Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless Tefal GSA-P2530738 Purchased at local homeware store
Prolong Gold DAPI Life Technologies P36962 Apply drops directly to coverslip
Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody ABCAM ab8227 Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody ABCAM ab5103 Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Staining rack 24 slides ProScitech H4465 Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven
Sudan Black B SIGMA 199664 0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature
Tris 10mM SIGMA T4661 Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution
Xylene Trajan XL005/20 Must be use used in a fume hood

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
  2. Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis. Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).
  3. Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. Programmed cell death as a defence against infection. Nat Rev Immunol. 17 (3), 151-164 (2017).
  4. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  5. Wyllie, A. H., Kerr, J. F., Currie, A. R. Cell death: the significance of apoptosis. International Review of Cytology. 68, 251-306 (1980).
  6. Fiers, W., Beyaert, R., Declercq, W., Vandenabeele, P. More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage. Oncogene. 18 (54), 7719-7730 (1999).
  7. Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
  8. Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cellular Microbiology. 8 (11), 1812-1825 (2006).
  9. Ooi, J. D., Gan, P. Y., Odobasic, D., Holdsworth, S. R., Kitching, A. R. T cell mediated autoimmune glomerular disease in mice. Current Protocols in Immunology. 107, 15.27.11-15.27.19 (2014).
  10. Ruth, A. J., et al. Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).
  11. Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).
  12. Burnham, P., et al. Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract. Nature Communications. 9 (1), 2412 (2018).
  13. Gobe, G. Identification of apoptosis in kidney tissue sections. Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).
  14. Olander, M., Handin, N., Artursson, P. Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis. Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).
  15. Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  17. Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases. Nature Reviews Rheumatology. 14 (8), 467-475 (2018).
  18. Chapman, E. A., et al. Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus. Frontiers in Immunology. 10, 423 (2019).
  19. Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histology & Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).
  20. Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).
  21. Schreiber, A., et al. Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).
  22. Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis. Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 160، التهاب الكلوميرولونفير، الحمض النووي خارج الخلية، الكلى، موت الخلايا، التعلم الآلي تحت الإشراف
تحت إشراف التعلم الآلي من أجل تحديد شبه كمي للحمض النووي خارج الخلية في التهاب الجلوميرولونية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

O'Sullivan, K. M., Creed, S., Gan,… More

O'Sullivan, K. M., Creed, S., Gan, P. Y., Holdsworth, S. R. Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis. J. Vis. Exp. (160), e61180, doi:10.3791/61180 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter