Summary
细胞外DNA（ecDNA）在细胞死亡期间释放是消炎，并会导致炎症。在损伤部位测量ecDNA可以确定靶器官治疗的有效性。该协议描述了使用机器学习工具自动测量肾脏组织中 ecDNA。
Abstract
球状细胞死亡是骨髓过氧化物酶抗中性粒细胞质抗体相关血管炎（MPO-AAV）的病理特征。细胞外脱氧核糖核酸（ecDNA）在不同形式的细胞死亡期间释放，包括凋亡、坏死、坏死、中性粒细胞外陷阱（NETs）和肺气肿。测量这种细胞死亡是耗时与几个不同的生物标志物需要识别不同的生化形式的细胞死亡。ecDNA 的测量通常以血清和尿液作为肾损伤的代理进行，而不是发生在发生病理损伤的实际目标器官中。目前调查肾内肾肾脱氧核糖核酸的难点在于缺乏在实验和存档的人类肾脏活检中采用正式固定石蜡嵌组织（FFPE）的方法。该协议概述了在 FFPE 组织（人类和鼠）中染色 ecDNA 所需的步骤，使用公开提供的开源 ImageJ 插件可训练的 Weka 分段，在生成的图像中测量 ecDNA。可训练的Weka分段应用于球蛋白中的ecDNA，程序学习对ecDNA进行分类。此分类器应用于后续获得的肾脏图像，减少了对每个单个图像进行手动注释的需要。可训练韦卡分段的适应性在肾组织中进一步证明，从实验鼠抗MPO球状体炎（GN），以识别NET和ecMPO，抗MPO GN的常见病理贡献者。该方法对肾组织中的ecDNA进行了客观分析，明确证明了可训练的Weka分段程序能够区分正常肾组织和患病肾组织之间的疗效。该协议可以很容易地适应，以识别在其他器官的ecDNA，NET和ecMPO。
Introduction
骨髓环氧酶抗中性粒细胞质抗体相关血管炎（MPO-AAV）是一种自身免疫性疾病，导致肾功能衰竭的病理球状损伤与相当大的细胞死亡和脱氧核糖核酸（DNA）释放11，2。2DNA可以作为危险信号激活免疫系统。在正常健康条件下，DNA的核位置可以保护他们免受免疫系统的照射。自我DNA在致病过程或自身免疫过程中在细胞外释放，被免疫系统视为一种有效的亲炎损伤相关分子自蛋白（DAMP）3。额外的细胞DNA（ecDNA）通过几个不同的机制从垂死细胞中释放出来，这些机制受不同的生化途径控制，如凋亡、神经球菌外细胞陷阱形成（NET）、坏死或肺尘埃增多4,4、5、6、7、8。5,6,7,8
我们在此描述从死亡细胞释放的ecDNA的方法，从实验抗MPO GN和从MPO-AAV99，1010患者患者体内固定石蜡嵌入（FFPE）肾脏部分释放。从血清和尿液以及体外测定11，12,12检测中检测循环双链DNA（dsDNA）和DNA复合物的方法有多种。这些方法虽然准确确定ecDNA的含量，但不能确定在解剖学上释放ecDNA的位置。有一些方法描述了ecDNA的具体测量，如凋亡调谐器和细胞碎片的测量13，14。13,没有任何方法描述测量ecDNA在发生病理损伤的FFPE肾脏中所有形式的细胞死亡。这一点很重要，以确定实验性治疗是否正在清除从实际目标器官的病理损伤部位的ecDNA。
从肾脏样本中采集多个图像可创建大量数据，通常由一个用户进行分析。这耗费人力，耗时，由于用户偏见，其他用户可能会难以重现。可训练Weka分段是ImageJ的开源软件插件，它使用尖端的生物信息工具使用机器学习算法15、16,16对像素进行分类。此方法是"可训练"的，它根据用户对像素段的分类来学习，并将新学习的分类应用于其他图像。此方法依赖于 ImageJ 程序中的常见分析工具，这些工具用于将段中的每个像素"分类"为属于特定"类"。程序学习"分类器"后，可用于识别同一图像中的其他类似分类段。然后，此模型将保存并应用于同一实验中的其他图像集。
目前确定肾分部原位ecDNA的障碍是内源性自荧光，从正式固定在形式和劳动密集型分析的图像。我们在这里描述如何淬火这种自动荧光，检测ecDNA，并使用监督机器学习进行高通量测量ecDNA。我们之前已经发布了使用 ImageJ 中的宏进行的 NET 和细胞外 MPO （ecMPO） 的测量，现在我们演示了这些方法使用监督机器学习1的半自动化。我们演示了机器学习工具的适应性，以在同一图像中对 NET 和 ecMPO 的替代污渍进行分类。此处描述的这些染色方法用于检测 ecDNA、NET 和 ecMPO，可转换为其他固体器官和疾病，其中 ecDNA、NETS 和 ecMPO 在使类风湿性关节炎和狼疮等,疾病长期存在中发挥作用。
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Protocol
这种方法能够检测来自所有形式细胞死亡的泛性ecDNA。相同的方法和抗体用于人类肾脏活检组织（从第4步）。所有动物和人类科目都获得莫纳什大学和莫纳什健康大学（维多利亚州克莱顿）的伦理批准。
1. 染色的ecDNA与DAPI和β-Actin
- 在8-10周大的C57/Bl6小鼠中诱导一个20天的抗骨髓性球菌病（抗MPO-GN）模型，对照9。
- 使用 CO2腔对小鼠进行人道安乐死。
- 用剪刀通过皮肤进行前中切口切除肾脏，然后小心地切下圆锥体，然后重新固定在解剖板上。使用钳子推开前肾筋膜和腹膜，通过切断肾骨盆的输尿管和血管（肾动脉和静脉）来切开肾脏。用钳子取出，用大小为22的手术刀将肾脏切成两半（下垂平面）。
- 在室温 （RT） 下，将肾脏固定（4% 缓冲形式）放置 16 小时。在加工前24小时将固定肾脏在30%乙醇中取出并浸泡。
- 使用标准的 6 小时周期处理肾脏：
70%乙醇15分钟
90%乙醇15分钟
100%乙醇15分钟
100%乙醇20分钟
100%乙醇25分钟
100%乙醇30分钟
二甲苯 20 分钟
二甲苯 30 分钟
二甲苯 40 分钟
蜡 30 分钟
蜡 35 分钟
蜡40分钟
注：这很重要，因为肾脏不应长时间暴露在蜡中的热量中，因为它会破坏感兴趣的抗原。 - 在微微镜上切割 3 μm 部分，并安装在商用玻璃显微镜幻灯片上，涂层为正电荷。允许干燥过夜。
- 将玻璃滑板放入滑架放入 60°C 烤箱中 60 分钟。
注：步骤 1.3 和 1.4 对于确保节在抗原检索步骤期间不会浮动至关重要。 - 将滑滑梯浸入两种溶剂（二甲苯或替代物）中，每次更换40分钟，并浸入烟头。
- 再水合物在100%乙醇、100%乙醇、70%乙醇中滑动，每次5分钟。用自来水洗5分钟。
- 将热板放入烟头，将抗原检索溶液（10 mM Tris，1 mM EDTA pH 9.0）放入压力锅中。一旦抗原检索溶液开始沸腾，使用一对钳子将幻灯片水平放入锅中并锁定盖子。在高（相当于 15 psi 或 103 kPa）上煮沸 10 分钟。
注：此步骤至关重要，因为它通过解蔽抗原表位（通过正式固定交叉链接）来检索感兴趣的抗原，从而允许表皮抗体特异性结合，而后续染色则无法没有它。 - 将压力锅从热中取出，并通过在水槽的盖子顶部运行冷水龙头，立即取下盖子。在抗原检索解决方案中将幻灯片保持平衡 20 分钟。
- 在轨道摇床上，在0.01 M磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）中洗涤滑动5分钟。
- 使用疏水笔在肾脏组织周围画圆圈，小心不要让任何组织在这个时候干涸。
- 在5%牛血清白蛋白（BSA）/PBS（pH 7.4，0.01 M）中块组织在10%鸡血清中30分钟，每节60μL。此步骤后不要洗涤，但使用 60 μL 移液器小心地拆下阻塞溶液，不要让部分干燥。
- 将原抗体鸡尾酒应用于稀释 1/1000 的 β-actin 1% BSA/PBS （pH 7.4， 0.01 M）， 每节 60 μL， 并在 4 °C 的湿度室中孵育过夜。
- 在轨道摇床上用PBS（pH 7.4，0.01 M）洗涤两次5分钟。
- 应用继发抗体，鸡抗兔488（1/200），60 μL每节稀释在1%BSA/PBS（pH 7.4，0.01 M）在RT40分钟。
- 在轨道摇床上用PBS（pH 7.4，0.01 M）将幻灯片洗涤两次5分钟。
- 将幻灯片浸入 0.3% 苏丹黑中，在 70% 乙醇中浸泡 30 分钟，在 Coplin 罐子中。
注：此步骤很重要，因为它可以解解由正式固定引起的自荧光。 - 在自来水中清洗滑轨以去除沉淀物，然后浸入 PBS （pH 7.4， 0.01 M） 中 10 分钟，以防止进一步的苏丹黑沉淀形成。
- 使用三个 60 μL 的安装解决方案，使用 DAPI 将滑轨安装到共焦玻璃盖玻片上，并通过在盖玻片周围涂抹，用指甲油密封盖玻片。
- 让幻灯片在 RT 处固化 24 小时（让 DAPI 穿透），然后在 4°C 下存储，防止光线照射。
注：重要的是保持在黑暗中，以防止荧光探头褪色。 - 使用附着在显微镜上的共聚焦激光扫描头进行图像幻灯片。使用用于 DAPI 的 405 激光和用于 Beta Actin 的 488 激光器的激发幻灯片。使用线顺序捕获和 4 行平均线捕获单平面 1024 x1024 像素图像，这对于检测 ecDNA 至关重要。使用 40x 1.0 NA 机油目标。
- 每个样本至少成像 20 个球状物。将图像保存为 ND2 文件。
2. DAPI 和 β-Actin 分析
- 安装映像J：https://imagej.net/Fiji/Downloads。
- 检查可训练 Weka 分段是否在插件下可用|细分 |可训练的韦卡分段。
- 将图像拖放到 ImageJ 工具栏上。单击图片 |颜色 |拆分通道。会出现一张DAPI为蓝色染色所有核的图像，并出现1张绿色为β-actin的图像，描绘球状物。
- 通过单击"颜色" 创建单个图像的合并文件，为 glomerulus 绘制感兴趣的区域 （ROI）合并通道。弹出框将要求为每个通道分配颜色。为每个通道指定颜色后，勾选"创建复合"框和"保持源图像"框，然后单击"确定"。将显示合并的合成图像。
- 使用 β-actin 染色作为指南，在球状塔夫周围绘制 ROI。保留此映像，以使用此协议末尾的 ROI。
- 在单个蓝色 DAPI 图像上执行高斯模糊。单击"流程" |过滤器 |高斯模糊，放入1-2.00。图像现在看起来有点模糊，但核现在光滑，背景软化。
注： 此步骤是预制的，用于消除噪声，以清除可能阻止分析图像属性的相关检测的伪影中的图像。 - 点击插件 |细分 |可训练的韦卡分段。
- 使用 ImageJ 工具栏上的线工具，首先使用自由手工具（有可选择的线、圆形和方形工具选项）跟踪完整的核，然后添加到"添加 1 类"框。
- 使用 ImageJ 中的工具栏上的线工具将背景区域描绘为2 类框。
- 单击 Weka 分段窗口中的"创建新类"按钮标签，并标注"ecDNA"。使用线工具（从 ImageJ 工具栏）来描绘 DAPI 染色的外核 DNA。
- 单击可训练 Weka 分段窗口中训练菜单中的"训练分类器"按钮。
注：停止按钮将代替列车分类器按钮，并保留直到培训完成。请勿在训练期间单击此按钮，因为该过程将中断。 - 单击"创建结果"按钮以创建包含所有分类组件的图像，该组件由完整的核、背景和已识别的 ecDNA 组成。
- 单击"获取概率"按钮。切换鼠标以提供所有类的黑白图像，选择对象以白色突出显示。
- 通过单击图像复制此图像 |重复。
- 使用包含 ecDNA 的鼠标按钮切换到屏幕。应用阈值，仅获取已标识为 ecDNA的内容。当阈值足够时，单击"应用"。
- 如果在阈值后，有更多的DNA区域不是ecDNA，返回到原始训练的图像，添加更多分类器，并重复步骤2.1-2.13。
- 单击图片 |图像调整 |使二进制。复制步骤 2.3 中做出的球形 ROI，然后单击Ctrl_Shift_E。按编辑激活 Weka 窗口|选择 |还原，恢复所选内容。单击"分析粒子"，该粒子将仅测量球状体内的 ecDNA 粒子。
注： 结果表的计算与粒子计数、面积、平均像素和包含 ecDNA 的球状物的百分比一起计算。这些结果可以导出到电子表格中并保存，以便以后进行统计分析。 - 通过单击选项菜单中的"保存分类器"到桌面上的 ImageJ 应用，将分类器保存为 ecDNA.分类器。然后单击"从选项菜单中保存数据"，然后以 ecDNA.arff 身份保存到 ImageJ 文件夹中。ROI 每次都必须手动添加，因为球状物的大小和形状将发生变化，但程序已经了解了 ecDNA 是什么。
- 要将模型重新应用于后续图像，请使用新图像重复步骤 2.1-2.5。单击选项菜单中的"负载分类器"，然后从步骤 2.16 中的 ImageJ 文件夹中单击 ecDNAmodel.分类器。日志菜单将弹出并运行模型。
- 模型运行后，单击选项菜单中的"加载数据"，然后从步骤 2.16 中选择保存在 ImageJ 文件夹中的 ecDNA.arff 文件。单击"创建结果"。如果生成的图像未能选取所有核、背景或 ecDNA，请单击重新训练分类器并添加更多分类器并保存新模型。通过重复步骤 2.9-2.16 完成分析过程。
注：可以使用多个图像生成用于检测 ecDNA 的最终模型。这是通过将模型应用于后续图像、添加更多分类器并将新模型和数据保存到 ImageJ 文件夹中来实现的。当不同的样本具有较高的背景时，这一点尤其重要。Weka 分段程序还与 ImageJ 宏语言兼容，它使许多命令能够宏录制，从而自动执行某些步骤。
3. 中性粒细胞外陷阱和ecMPO的测量
注：此方法通过细胞外DNA、西特鲁林特组蛋白酶蛋白酶4（PAD4）和MPO的共定位来识别NET。
- 在8-10周大的C57/Bl6小鼠中诱导一个20天的抗骨髓性球菌病（抗MPO-GN）模型，对照9。
- 使用 CO2腔对小鼠进行人道安乐死。
- 用剪刀通过皮肤进行前中切口切除肾脏，然后小心地切下圆锥体，然后重新固定在解剖板上。使用钳子推开前肾筋膜和腹膜，通过切断肾骨盆的输尿管和血管（肾动脉和静脉）来切开肾脏。用钳子取出，用大小为22的手术刀将肾脏切成两半（下垂平面）。
- 在室温 （RT） 下，将肾脏固定（4% 缓冲形式）放置 16 小时。在加工前24小时将固定肾脏在30%乙醇中取出并浸泡。
- 使用标准的 6 小时周期处理肾脏：
70%乙醇15分钟
90%乙醇15分钟
100%乙醇15分钟
100%乙醇20分钟
100%乙醇25分钟
100%乙醇30分钟
二甲苯 20 分钟
二甲苯 30 分钟
二甲苯 40 分钟
蜡 30 分钟
蜡 35 分钟
蜡40分钟
注：肾脏不应长时间暴露在蜡中的热量中，因为它会破坏感兴趣的抗原。 - 在微微镜上切割 3 μm 部分，并安装在商用玻璃显微镜幻灯片上，涂层为正电荷。允许隔夜干燥
- 将玻璃滑板放入滑架放入 60°C 烤箱中 60 分钟。
注：步骤 3.3-3.4 对于确保在抗原检索步骤期间不会浮动部分至关重要。 - 将滑滑梯浸入两种溶剂（二甲苯或替代物）中，每次更换40分钟，并浸入烟头。
- 再水合物在100%乙醇、100%乙醇、70%乙醇中滑动，每次5分钟。
- 用自来水洗5分钟。
- 将热板放入烟头，将抗原回收溶液（10 mM Tris-1 mM EDTA pH 9.0）放入压力锅中。一旦抗原检索溶液开始沸腾，使用一对钳子将幻灯片水平放在锅中并锁定盖子。在高（相当于 15 psi 或 103 kPa）上煮沸 10 分钟。
注：此步骤通过解蔽抗原表位（通过正式固定交叉链接）来检索感兴趣的抗原，以允许表皮抗体特异性结合，没有此步骤，后续染色将不起作用。 - 从热中取出压力锅，通过运行水槽盖顶部的冷水龙头，立即取下盖子。在抗原检索解决方案中将幻灯片保持平衡 20 分钟。
- 在轨道摇床上用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） （PBS） （pH 7.4， 0.01 M） 冲洗两次 5 分钟。
- 使用疏水笔在肾脏组织周围画圆圈，小心不要让任何组织在这个时候干涸。
- 在5%牛血清白蛋白（BSA）/PBS（pH 7.4，0.01 M）中块组织在10%鸡血清中30分钟，每节60μL。此步骤后请勿清洗，但使用 60 μL 移液器小心地拆下阻塞溶液。不要让部分干涸。
- 在 1 管中稀释 1%BSA/PBS（pH 7.4，0.01 M）的主抗体的鸡尾酒。每个肾脏部分应用 60 μL。主要抗体的浓度如下：
兔子抗人/鼠 H3Cit 1/100
鼠标防人/鼠标 PAD4 1/50
山羊抗人/鼠 MPO 1/200 - 在湿度室中孵育在4°C下过夜。
- 在轨道摇床上用PBS（pH 7.4，0.01 M）洗涤两次5分钟。
- 在1管中制作二次抗体的鸡尾酒。二次抗体在1%BSA/PBS中应用，每节60μL，如下所示：
鸡防兔 488 1/200.
鸡防鼠647 1/200。
鸡防山羊 594 1/200. - 在RT孵育40分钟。
- 在轨道摇床上用PBS（pH 7.4，0.01 M）洗涤两次5分钟。
- 在 RT 60 μL 每节 RT 60 μL 下，在 1%BSA/PBS（pH 7.4，0.01 M） 中应用二次抗体 1：200，40 分钟。
- 在轨道摇床上用PBS（pH 7.4，0.01 M）洗涤两次5分钟。
- 浸入 0.3% 苏丹黑色在 70% 乙醇 30 分钟。
- 在自来水中清洗滑轨以去除沉淀物，然后浸入 PBS （pH 7.4， 0.01 M） 中 10 分钟，以防止进一步的苏丹黑沉淀形成。
- 使用三个 60 μL 的安装解决方案，使用 DAPI 将滑轨安装到共焦玻璃盖玻片上。通过在盖玻片的周围涂抹，用指甲油密封盖玻片。
- 让幻灯片在 RT 处固化 24 小时（让 DAPI 穿透），然后在 4°C 下存储，防止光线照射。保持在黑暗中，以防止荧光探头褪色。
- 使用附着在显微镜上的共聚焦激光扫描头进行图像幻灯片。使用 405 激光用于 DAPI 和 488 激光的 H3Cit、561 MPO 和 647 用于 PAD4 的激发幻灯片。使用线顺序捕获和 4 线平均，捕获单平面 1024x1024 像素图像，这对于检测 ecDNA 至关重要。使用 40x 1.0 NA 机油目标。每个样本至少成像 20 个球状物。将图像保存为 ND2 文件。
4. 嗜中性细胞外陷阱和ecMPO分析
- 安装映像J：https://imagej.net/Fiji/Downloads。
- 检查可训练 Weka 分段是否在插件下可用|细分 |可训练的韦卡分段。
- 将图像放入 ImageJ 中。单击图片 |颜色 |拆分通道。将显示一张 DAPI 为蓝色染色所有核的图像，一张以绿色显示 H3Cit 的图像，一张红色 MPO 图像，以及一张以白色显示 PAD4 的图像。
- 通过单击"颜色" 创建单个图像的合并文件，为 glomerulus 绘制 ROI合并通道。弹出框将要求为每个通道分配颜色。为每个通道指定颜色后，勾选"创建复合"框和"保持源图像"框，然后单击"确定"。将显示合并的图像。与之前的 ecDNA 协议不同，我们将使用复合图像执行其余步骤。
- 对合成图像执行高斯模糊。这允许平滑核。单击"流程" |过滤器 |高斯模糊，放入1.00-2.00。图像现在看起来有点模糊，但核现在光滑，背景软化。
注： 此步骤是预制的，用于消除噪声，以清除可能阻止分析图像属性的相关检测的伪影中的图像。 - 点击插件 |细分 |可训练的韦卡分段。将显示一个全新的窗口，其中将分析图像，Weka 将特定菜单工具进行细分。
- 使用工具栏上的线工具（在 ImageJ 中），首先使用自由手工具跟踪所有 4 个 NET 组件（MPO、PAD4、DAPI 和 H3Cit）未为正的完整核，然后添加到添加 1 类框。
- 使用 ImageJ 工具栏上的线工具将背景区域描绘为2 类框。
- 单击标签菜单中的"创建新类"按钮标签，并标注"NET"。使用线工具将标识为共同本地化 DAPI（蓝色）、MPO（红色）、PAD4（白色）和分叉组（绿色）的 NETS 进行划定。
- 单击标签菜单中的"创建新类"按钮标签，并标注"ecMPO"。使用线工具划定无细胞的 MPO（红色）。
- 单击"可训练 Weka 细分"窗口中训练菜单中的"训练分类器"按钮。
注：停止按钮将代替列车分类器按钮，并保留直到培训完成。在训练期间不要单击此按钮，该过程将中断。 - 单击"在训练菜单中创建结果"按钮，创建包含所有分类组件的图像，该组件由完整的核、背景和标识为 ecMPO 的内容组成。
- 单击"获取训练菜单中的概率"按钮。切换鼠标以提供所有类的黑白图像，选择对象以白色突出显示。
- 通过单击图像来复制 NET 概率和 ecMPO 概率图像 |重复。
- 使用包含 NET 的鼠标按钮切换到屏幕。应用阈值以确保仅突出显示已识别的 NET。在 ImageJ 菜单工具栏上，单击"图像 " |调整 |阈值。移动滑动切换条，直到 NET 组件上高亮显示。对阈值满意时单击"应用"。对 ecMPO 重复相同的步骤。
- 如果在阈值后仍有检测 ecMPO 或 NET 的区域，请返回原始训练的图像并添加更多分类器并重新应用步骤 4.1-4.14。
- 单击图片 |图像调整 |使二进制。复制步骤 4.3 中做出的球形 ROI，单击Ctrl_Shift_E。按编辑激活 Weka 窗口|选择 |还原，恢复所选内容。单击"分析粒子"仅测量球形中的 NET 粒子。
- 使用包含 ecMPO 的鼠标按钮切换到屏幕。应用阈值以确保仅获得标识的 ecMPO。对阈值满意时单击"应用"。重复上面的步骤 4.16。
注： 结果表的计算与粒子计数、面积、平均像素和包含 NET 和 ecMPO 的球状体的百分比一起计算。这些结果然后可以放入电子表格并保存，以便以后进行统计分析。 - 通过单击选项菜单中的"保存分类器"并将文件保存到桌面上的 ImageJ 应用（ImageJ 文件夹），将分类器保存为 NET.分类器。然后单击"从选项菜单中保存数据"，然后另存为 NET.arff 文件。glomerular ROI 每次都必须手动添加，因为球状物的大小和形状将发生变化，但程序已经了解了 NET 和 ecMPO 是什么。
- 要将模型重新应用于后续图像，请使用新图像重复步骤 4.1-4.5。单击选项菜单中的"负载分类器"。单击 ImageJ 文件夹中的Nets.分类器。日志菜单将弹出并运行模型，一旦模型运行，单击选项菜单中的"加载数据"并选择 NETs.arff 文件。
- 单击"创建结果"。如果生成的图像未能选取所有核、背景或 ecDNA，请单击重新训练分类器并添加更多分类器并保存新模型。通过重复步骤 4.11-4.19 完成分析过程。
注：可以使用多个图像生成用于检测 ecDNA、ecMPO 和 NET 的最终模型。这是通过将模型应用于后续图像、添加更多分类器并将新模型和数据保存到 ImageJ 文件夹中来实现的。当不同的样本具有较高的背景时，这一点尤其重要。Weka 分段程序与 ImageJ 宏语言兼容，它使许多命令能够宏录制，从而自动执行某些步骤。
- 单击"创建结果"。如果生成的图像未能选取所有核、背景或 ecDNA，请单击重新训练分类器并添加更多分类器并保存新模型。通过重复步骤 4.11-4.19 完成分析过程。
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Representative Results
这些图像表示成功使用可训练 Weka 分段所需的多个步骤，以尽量减少从具有诱导抗 MPO GN 的小鼠荧光染色的 FFPE 肾脏组织中对 ecDNA 的劳动密集型人工测量。这些步骤在图 1和图2中总结，其中图像直接取自 Weka 分段程序，概述了分析过程中的每一个步骤。然后，图 3显示了该分析的测量结果，演示了程序在控制组织中确定沉积在球状物中的不同数量的 ecDNA 的能力，而无需诱导抗 MPO GN。图4表明，ecDNA模型可以适应，以识别来自对照病人的肾脏活检标本中的ecDNA（最小变化疾病患者在组织水平上表现出的最小球状损伤），并与MPO-AAV患者的肾脏活检模型进行比较。图 5演示了此程序对肾脏组织内其他污渍的转化能力。我们使用具有诱导实验抗MPO GN的小鼠肾脏的代表性样本为NET和ecMPO染色。然后，使用可训练的 Weka 分段程序在同一图像中标识 NETS 和 ecMPO。图 6表明，在由两个独立用户分析的同一数据集上，结果结果没有显著差异，这些数据集创建了 2 种旨在半定量的 ecDNA 模型。
图1：使用可训练Weka分段从实验MPO-ANCA GN中说明小鼠肾球状细胞外DNA分类的图像。（A） 演示 DAPI 的单通道图像，以染色 DNA（蓝色）、β 行为蛋白（绿色）以描绘球状区域，以及具有感兴趣区域 （ROI） 的复合文件，指示要测量的球状区域。（B） 完整核分类以开发模型（粉红色）和未分类核（蓝色）。（C） 分类什么被认为是背景（绿色）。（D） 分类什么被认为是 ecDNA （紫色）.（E） 可训练韦卡分段生成的模型，以红色显示核，背景为绿色，紫绿色区域为 ecDNA 区域。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 2：演示模型受监督组件以减少误差的图像。Weka 模型生成识别未分类组件中的每个分类器的概率。（A） 模型生成了完整核的分类。（B） 模型生成了所认为背景的分类。（C） 模型生成什么 ecDNA 被考虑.（D） 说明未阈值的分类 ecDNA 的图像。（E） 显示阈值的调整，以排除已识别为 ecDNA 的任何错误，识别为红色所示的 ecDNA。（F） 阈值应用于图像，并制成用于粒子分析的二进制图像。（G） 球状 ROI 叠加在图像上，因此仅分析球状异体。（H） 显示分析生成的结果摘要。请点击此处查看此图形的较大版本。
图3：说明控制小鼠小鼠小鼠肾球状细胞外DNA分类的图像，无需诱导实验MPO-ANCA GN，使用可训练的Weka分段。（A） 显示原始合并的图像与要分析的球状区域、训练和经过训练的模型结果（背景绿色、核红色和紫色标识的 ecDNA）。（B） 显示了识别、核、背景和 ecDNA 的模型概率。（C） 模型分类和识别为 ecDNA 的结果，以任意单位显示。请点击此处查看此图形的较大版本。
图4：图像说明可训练的Weka分段适用于分析人类肾脏活检中的ecDNA从最低变化疾病患者和MPO-ANCA血管炎患者。（A） 说明使用可训练韦卡分段完整核（红色）、背景（绿色）和 ecDNA（紫色）检测出最小 ecDNA。（B） 在患者肾脏活检中，从 MPO-ANCA 血管炎完整核（红色）、背景（绿色）和紫紫紫的肾活检中演示大量 ecDNA。结果表明，与有活性MPO ANCA血管炎（180个颗粒）的患者相比，在患有MCD的患者球状区域中发现了8个ecDNA颗粒。请点击此处查看此图形的较大版本。
图5：可训练的Weka分段可用于识别来自实验MPO-ANCA GN的小鼠肾脏组织中的NETS和ecMPO。（A） 与 NET 共同定位 （西特鲁林组音 3）、红色 （MPO） DAPI （核） 和 PAD4 （白色）] 演示一个球状物。ecMPO 被认为是无细胞的。（B） 识别分类器、红色（完整核）、绿色（背景）、紫色（NET）和黄色 （ecDNA））的培训]。（C） 可训练韦卡分段模型用于对 NET 和 ecMPO、红色（完整核）、绿色（背景）、紫色（NET）和黄色 （ecDNA） 进行分类。（D） 模型确定为 NET 的粒子分析。（E） 模型确定为 ecMPO 的粒子分析。（F） NET 和 ecDNA 的粒子分析结果表。请点击此处查看此图形的较大版本。
图6：在设计检测ecDNA模型时，比较2个独立用户。（A） 原始图像，显示要分析的 DAPI、Beta Actin 和合并图像。（B） 2个独立用户之间培训模型、分类器、阈值和球形 ROI 的比较。黄色箭头表示用户 2 必须重新训练模型以删除背景。（C） 生成的结果显示了 2 个用户之间的 ecDNA 计数、总面积、百分比和周长的比较。（D） 结果显示，两名独立研究人员在球蛋白内检测到的ecDNA数量与%面积之间没有显著差异。使用曼-惠特尼 U 测试进行的统计分析，显著性设置为 <0.05。样本大小为 n=6。请点击此处查看此图形的较大版本。
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Discussion
存在多种方案，用于测量肾上腺炎患者和小鼠模型血清和尿液中的消炎标记物。这种所述协议允许直接分析球状体内的细胞死亡产物（ecDNA、NET和ecMPO）。该协议中最重要的步骤是组织准备和成像。使用荧光染色方法进行分析的主要限制因素是组织自荧光。形式内固定石蜡组织受到自荧光，可以掩盖特定的荧光染色。染色方法的最后一步，其中幻灯片浸入苏丹黑色，衰减组织的自荧光，并允许通过降低信号与噪声比19来照亮抗体特定的染色。组织成像必须至少用40倍的油放大倍率进行，才能检测出小片的ecDNA和MPO。当获得成像时，至关重要的是，它以一行顺序的方式完成，以确保一个标记的荧光不会渗到另一个标记。
用于分析的协议的一个优点是，它可以通过ImageJ开放访问，任何人都可以访问16。我们在这里已经证明，该方法可以很容易地适应测量肾脏组织内不同的荧光标记。确定可训练 Weka 分段中的模型后，可以应用于没有偏差的后续图像，并且以完全相同的方式分析每个图像。分析的监督性质允许通过阈值"已训练"图像或重新训练程序并添加更多分类器的其他步骤来调整分段中的任何错误。这个程序的优点是，两个不同的用户将使用相同的模型获得类似的结果，只要他们准确地划定球状塔夫。两个不同的最终用户在可重复性方面最大的不准确是由人们在球状束周围追踪的不同方式造成的。例如，如果一个人在球状圆环周围画了一个粗糙的圆圈，而另一个用户仔细绘制了最外层毛细管环，则所检查的区域会有所不同（如结果所示）。因此，必须同时培训两个用户以相同的方式识别球状塔夫。此程序的实际应用是让两个用户在多个映像上一起设计模型，以构建一个可靠的模型，以应用于进一步的数据集。用于训练分类器的图像越多，模型就越准确。
该协议的局限性是测量比共聚焦显微镜可以检测到的更小的ecDNA片段。通过使用超高分辨率显微镜方法捕获图像并将可训练的 Weka 分段应用于这些图像，可以克服这一点。机器学习的监督组件增加了额外的步骤，并降低了批处理大型图像集的能力。然而，正如我们在结果中证明的，无监督模型降低了准确性，引入监督组件大大降低了误差。
我们以前曾发表过，除了产生细胞外陷阱的嗜中性粒细胞外，还观察到单核细胞/巨噬细胞在人类ANCA血管炎中产生细胞外陷阱（称为METs），但比例较小1。本文所述的当前方法没有区分中性粒细胞或单核细胞/巨噬细胞产生的细胞外陷阱。这是很难实现的，因为大多数共聚焦显微镜受激光数量的限制。识别 NET 需要 4 种不同的激光，因此限制了通过标准共聚焦成像处理的细胞标记的数量。如果需要 MPO 正源细胞，第二个序列部分可以沾上中性粒细胞或巨噬细胞/单细胞标记，以识别产生细胞外陷阱的细胞类型。
MPO-ANCA血管炎的病理特征包括ecDNA、NETS和ecMPO在肾脏20的球状体内的沉积。最近的研究是：1、20、21、22，20,21,以治疗性靶向非核生物及ecMPO内的DNA，以及在人类活检1中测量DNA作为疾病标记。22这些方法在这一领域的意义是准确确定目标器官内ecDNA、NET和ecMPO的相对比例，以可重复、更耗时的方式。最后，我们展示了一个可训练的机器学习工具 Weka 分段，以半自动分析用于 ecDNA、NET 和 ecMPO 的大型获取图像数据集。此工具的使用将大大减少图像分析时间，并且该技术可以很容易地适应其他器官的其他污渍。
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Disclosures
没什么可透露的
Acknowledgments
我们承认莫纳什微成像用于使用尼康C1直立共聚焦激光扫描显微镜和莫纳什组织学平台处理肾脏组织。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A2153 | 5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed. |
| Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-21468 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-121468 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-21441 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken sera | SIGMA | C5405 | Made up in 1%BSA/PBS |
| Coverslips 24 x60 mm | Azerscientific | ES0107222 | #1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy |
| EDTA 10mM | SIGMA | E6758 | Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution |
| Ethanol 30%, 70% and 100% | Chem Supply | UN1170 | Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water |
| Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin) | TRAJAN | NBF-500 | Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood |
| Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mm | TRAJAN | J3800AM4 | Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step |
| Goat anti human/mouse MPO antibody | R&D | AF3667 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Histosol | Clini Pure | CPL HISTOSOL 08 | Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood |
| Hydrophobic pen | VECTOR Labs | H-400 | Use to draw circle around kidney tissue |
| Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4) | ABCAM | ab128086 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope | Coherent Scientific | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA | P38135 | 0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time |
| Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless | Tefal | GSA-P2530738 | Purchased at local homeware store |
| Prolong Gold DAPI | Life Technologies | P36962 | Apply drops directly to coverslip |
| Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody | ABCAM | ab8227 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody | ABCAM | ab5103 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Staining rack 24 slides | ProScitech | H4465 | Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven |
| Sudan Black B | SIGMA | 199664 | 0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature |
| Tris 10mM | SIGMA | T4661 | Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution |
| Xylene | Trajan | XL005/20 | Must be use used in a fume hood |
References
- O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
- Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis. Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).
- Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. Programmed cell death as a defence against infection. Nat Rev Immunol. 17 (3), 151-164 (2017).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Wyllie, A. H., Kerr, J. F., Currie, A. R.
- Fiers, W., Beyaert, R., Declercq, W., Vandenabeele, P. More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage. Oncogene. 18 (54), 7719-7730 (1999).
- Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
- Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cellular Microbiology. 8 (11), 1812-1825 (2006).
- Ooi, J. D., Gan, P. Y., Odobasic, D., Holdsworth, S. R., Kitching, A. R. T cell mediated autoimmune glomerular disease in mice. Current Protocols in Immunology. 107, 15.27.11-15.27.19 (2014).
- Ruth, A. J., et al. Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).
- Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).
- Burnham, P., et al. Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract. Nature Communications. 9 (1), 2412 (2018).
- Gobe, G. Identification of apoptosis in kidney tissue sections. Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).
- Olander, M., Handin, N., Artursson, P. Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis. Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).
- Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases. Nature Reviews Rheumatology. 14 (8), 467-475 (2018).
- Chapman, E. A., et al. Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus. Frontiers in Immunology. 10, 423 (2019).
- Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histology & Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).
- Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).
- Schreiber, A., et al. Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).
- Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis. Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).
