Summary
Hier wird ein chemisch definiertes Protokoll zur Ableitung menschlicher Nierenpodozyten aus induzierten pluripotenten Stammzellen mit hoher Effizienz (>90%) und unabhängig von genetischen Manipulationen oder Subpopulationsselektion vorgestellt. Dieses Protokoll erzeugt den gewünschten Zelltyp innerhalb von 26 Tagen und könnte für Nephrotoxizitätstests und Krankheitsmodellierung nützlich sein.
Abstract
Nierenerkrankungen betreffen mehr als 10% der Weltbevölkerung und kosten Milliarden von Dollar an Bundesausgaben. Die schwersten Formen der Nierenerkrankung und das eventuelle Nierenversagen im Endstadium werden oft durch die Schädigung der glomerulären Podozyten verursacht, bei denen es sich um die hochspezialisierten Epithelzellen handelt, die zusammen mit Endothelzellen und der glomerulären Basalmembran die Filtrationsbarriere der Niere bilden. Fortschritte in der Nierenmedizin wurden durch die begrenzte Verfügbarkeit von Primärgewebe und das Fehlen robuster Methoden zur Ableitung funktioneller menschlicher Nierenzellen wie Podozyten behindert. Die Fähigkeit, Podozyten aus erneuerbaren Quellen wie Stammzellen abzuleiten, könnte dazu beitragen, das aktuelle Verständnis der Mechanismen der menschlichen Nierenentwicklung und -krankheit zu verbessern und neue Werkzeuge für die therapeutische Entdeckung bereitzustellen. Ziel dieses Protokolls war es, eine Methode zu entwickeln, um reife, postmiotische Podozyten aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS) mit hoher Effizienz und Spezifität und unter chemisch definierten Bedingungen abzuleiten. Die mit dieser Methode produzierten hiPS-Zell-abgeleiteten Podozyten exprimieren linienspezifische Marker (einschließlich Nephrin, Podocin und Wilm-Tumor 1) und weisen die spezialisierten morphologischen Merkmale (einschließlich primärer und sekundärer Fußprozesse) auf, die mit reifen und funktionellen Podozyten verbunden sind. Interessanterweise fehlen diese spezialisierten Merkmale in der immortalisierten Podozytenzelllinie, die in diesem Bereich weit verbreitet ist, was darauf hindeutet, dass das hier beschriebene Protokoll menschliche Nierenpodozyten produziert, die einen entwicklungsreiferen Phänotyp aufweisen als die bestehenden Podozytenzelllinien, die typischerweise zur Untersuchung der menschlichen Nierenbiologie verwendet werden.
Introduction
Fortschritte in der humanen pluripotenten Stammzellkultur sind bereit, die regenerative Medizin, die Krankheitsmodellierung und das Drogenscreening zu revolutionieren, indem sie Forschern eine erneuerbare, skalierbare Quelle für biologisches Material zur Verfügung stellen, die entwickelt werden kann, um fast jeden Zelltyp im menschlichen Körper zu erhalten1. Diese Strategie ist besonders nützlich, um spezialisierte und funktionelle Zelltypen abzuleiten, die sonst schwer zu erhalten wären. Human induced pluripotent stem (hiPS) Zellen2,3,4,5 sind aufgrund ihrer somatischen Zellursprung und des Potenzials, das sie für die personalisierte Medizin darstellen, besonders attraktiv. Die Entwicklung von Methoden zur Ableitung anderer Zelllinien aus hiPS-Zellen bleibt jedoch aufgrund der häufigen Verwendung schlecht definierter Kulturbedingungen, die zu einer geringen Effizienz und unspezifischen Erzeugung heterogener Zellpopulationenführen,eine Herausforderung6,7.
Hier wird eine Methode zur Ableitung reifer Nierenpodozyten aus hiPS-Zellen mit Spezifität und hoher Effizienz unter chemisch definierten Bedingungen vorgestellt. Unter Berücksichtigung der Rolle mehrerer Faktoren innerhalb der zellulären Mikroumgebung wurde eine Stammzelldifferenzierungsstrategie entwickelt, die die Optimierung löslicher Faktoren im Zellkulturmedium sowie unlöslicher Faktoren wie extrazelluläre Matrixkomponenten oder adhäsive Substrate beinhaltete. Angesichts der Bedeutung der Integrinsignalisierung für die Entwicklung und Funktion von Podozyten wurde zunächst die Expression von Integrinrezeptoren auf der Zelloberfläche untersucht. β1-Integrine wurden nicht nur in hiPS-Zellen, sondern auch in ihren Derivaten einschließlich Mesoderm- und Intermesodermzellen stark exprimiert8,9,10. Nachfolgende Experimente bestätigten, dass Liganden, die an β1-Integrine binden (einschließlich Laminin 511 oder Laminin 511-E8-Fragment), die Adhäsion und Differenzierung von hiPS-Zellen in Podozyten unterstützen, wenn sie in Verbindung mit den unten beschriebenen löslichen induktiven Medien verwendet werden.
Die Induktion der Zelllinienverpflichtung wurde eingeleitet, indem zunächst bestätigt wurde, dass hiPS-Zellen, die zwei Tage lang auf den lamininbeschichteten Oberflächen in Gegenwart eines Mediums kultiviert wurden, das Activin A, CHIR99021 und Y27632 Rock-Inhibitor enthält, sich in Zellen differenzieren können, die die frühen Mesodermmarker HAND1, Goosecoid und Brachyury8,11exprimieren. Die Behandlung der Mesodermzellen für 14 Tage mit einem Medium, das mit Knochenmorphogenetikprotein 7 (BMP-7) und CHIR99021 ergänzt wurde, ermöglichte die Ableitung von intermediären Mesodermzellen, die die Nephron-Vorläuferzellmarker Wilms Tumor 1 (WT1), odd-skipped related protein 1 (OSR1)8,11und paired box gene 2 protein (PAX2)12exprimierten. Um die reifen glomerulären Nierenpodozyten abzuleiten, wurden die intermediären Mesodermzellen 4–5 Tage lang mit einem neuartigen Medium behandelt, das aus BMP-7, Activin A, vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF),All-trans-Retinsäure und CHIR99021 besteht. Durchflusszytometrie und Immunfärbung wurden verwendet, um zu bestätigen, dass >90% der resultierenden Zellen die molekularen, morphologischen und funktionellen Eigenschaften des reifen Nierenpodozytenaufwiesen 8,11,13. Zu diesen Eigenschaften gehören die Entwicklung von primären und sekundären Fußprozessen; die Expression von Podozytenlinien-spezifischen Genen einschließlich SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 und die Expression von Proteinen wie Podocin, Nephrin und WT114,15,16. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die von hiPS-Zellen abgeleiteten Podozyten bis zu vier Wochen in vitro in Kultur gehalten werdenkönnen,indem ein kommerziell erhältliches Medium8,11 verwendet wird, das eine zusätzliche Flexibilität beim Timing nachgeschalteter Experimente bietet. Weitere Informationen zu den Durchflusszytometrie-Panels, die zur Bestimmung der Reinheit der hiPS-Podozyten verwendet werden, finden Sie in unserer vorherigen Publikation11.
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Protocol
1. Herstellung von Reagenzien
- Verdünnen Sie aufgetaute 5x hiPS Zellkulturmedien (CCM) Ergänzung in hiPS Zellkultur Basalmedium, um eine 1x Lösung von hiPS CCM zu erhalten.
HINWEIS: Gefrorene 5x hiPS CCM Ergänzung erfordert einen langsamen Auftauprozess, idealerweise bei 4 ° C für über Nacht. Aliquots des 1x hiPS CCM können bis zu 6 Monate bei -20 °C gelagert werden. - Herstellung von Basalmembran (BM) Matrix 1-beschichteten Platten für hiPS Zellkultur: BM Matrix 1 über Nacht auf Eis bei 4 °C auftauen. Nach dem Auftauen Aliquoten mit geeigneten Verdünnungsfaktoren vorbereiten, wie vom Hersteller vorgeschlagen.
HINWEIS: Typischerweise werden Aliquoten für die anschließende Verdünnung in 25 ml kaltem DMEM/F12 in einem konischen 50-ml-Röhrchen vorbereitet, gefolgt von einer gründlichen Mischung, um die BM-Matrix 1 vollständig aufzulösen und die Bildung von Restkristallen zu vermeiden. - 1 ml der BM-Matrix-1-Lösung in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte geben und bei 37 °C für 1-2 h oder bei 4 °C für mindestens 24 h inkubieren, in Paraffinfolie eingewickelt. Die BM matrix 1 -beschichteten Platten können bis zu 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden.
- Herstellung der Basalmembran (BM) Matrix 2 - beschichtete Platten: Verdünnen Sie geeignete Mengen bm matrix 2 in 9 mL sterilem destilliertem Wasser, um eine Endkonzentration von 5 μg/ml herzustellen. 700 μL der BM-Matrix-2-Lösung in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte geben und die Platte bei Raumtemperatur für 2 h oder über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- 100 μg/ml Stammlösungen von BMP7, Activin A und VEGF werden wie folgt zubereitet: BMP7 in sterilem destilliertem Wasser mit 0,1 % (Gew./Vol)BSA rekonstituieren und Activin A und VEGF separat in sterilem PBS mit 0,1 % (Gew./Vol) BSA rekonstituieren. Um häufige Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden, bereiten Sie 100 μL Aliquoten aus jeder Lagerlösung vor und lagern Sie sie bei -20 °C für bis zu 6 Monate.
- Bereiten Sie eine 10 mM Stammlösung von Y27632 vor, indem Sie 10 mg Y27632 in 3,079 ml sterilem destilliertem Wasser auflösen. Aliquot 100 μL aus dem Lager und lagern Sie bei -20 °C für bis zu 6 Monate.
- 2 mg CHIR99021 werden in 143,4 μL sterilem DMSO gelöst, um eine 30 mM Stammlösung zu erhalten. 5 μL Aliquoten vorbereiten und bei -20 °C bis zu 1 Monat lagern (oder nach Herstellerempfehlung).
- 10 mg Trans-Retinsäure in 3,33 ml sterilem DMSO auflösen. 500 μL Aliquoten vorbereiten und bei -20 °C bis zu 6 Monate lagern.
2. Vorbereitung von Kulturmedien
- Bereiten Sie das Mesodermdifferenzierungsmedium vor, indem Sie entsprechende Stammlösungen zu einer Endkonzentration von 100 ng/ ml Activin A, 3 μM CHIR99021, 10 μM Y27632 und 1x B27 serumfreie Ergänzung in einem geeigneten Volumen von DMEM/12 mit Glutaminpräparat rekonstituieren.
HINWEIS: Das Mesodermdifferenzierungsmedium sollte vor den Differenzierungsschritten und in einem für den Umfang des Experiments geeigneten Volumen frisch zubereitet werden (typischerweise sind 50 ml Medium für zwei 12-Well-Platten ausreichend). - Herstellung eines Intermesodermdifferenzierungsmediums, indem entsprechende Stammlösungen zu einer Endkonzentration von 100 ng/ml BMP7, 3 μM CHIR99021 und 1x B27 serumfreien Ergänzung in DMEM/F12 mit einem Glutaminpräparat rekonstituiert werden.
HINWEIS: Bei Bedarf kann das Medium mit 1% (vol/vol) Penicillin-Streptomycin ergänzt werden. Stellen Sie die Lautstärke des Mediums ein, indem Sie DMEM / F12 mit Glutaminpräparat verwenden. Dieses Medium kann in großen Chargen hergestellt werden; Es wird jedoch empfohlen, in kleineren Aliquoten (z. B. 45 ml in konischen 50 ml Röhrchen) zu lagern, um wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden. Diese Medien können bis zu 3 Monate bei -20 °C gelagert und vor Gebrauch über Nacht bei 4 °C aufgetaut werden. - Bereiten Sie das Podozyteninduktionsmedium vor, indem Sie es auf eine Endkonzentration von 100 ng / ml BMP7, 100 ng / ml Aktivin A, 50 ng / ml VEGF, 3 μM CHIR99021, 1x B27 serumfreie Ergänzung und 0,1 μM All-trans-Retinsäure in DMEM / F12 mit Glutaminpräparat rekonstituieren. Medium vor Licht schützen (z.B. durch Einwickeln des Behälters mit Folienpapier).
HINWEIS: Dieses Medium kann in großen Chargen zubereitet und im Dunkeln bei -20 °C bis zu 3 Monate gelagert werden. Gefrorene Aliquoten sollten vor Gebrauch über Nacht bei 4 °C aufgetaut werden. - Bereiten Sie 25 ml Trypsin-Neutralisationslösung vor, indem Sie 10% (vol / vol) wärmeinaktiviertes FBS in DMEM / F12 hinzufügen und unter sterilen Bedingungen filtern.
- Für die Aufrechterhaltung der aus Stammzellen gewonnenen Podozyten nach der Differenzierung bereiten Sie Complete Medium mit Podozyten-Erhaltungsmedien vor, indem Sie das Supplement gemäß den Richtlinien des Herstellers zum Basalmedium hinzufügen und bei 4 °C bis zu zwei Wochen lagern.
3. Feederfreie hiPS-Zellkultur mit hiPS-Zellkulturmedium
- Die Restlösung der BM-Matrix 1 von den vorbeschichteten Platten absaugen und die Vertiefungen 3 mal mit 1 bis 2 ml erwärmtem DMEM/F12 waschen.
- Saugen Sie verbrauchtes hiPS CCM aus den hiPS-Zellen und spülen Sie die Zellen 3 mal mit erwärmtem DMEM / F12. Fügen Sie 1 ml warme Zellablösungslösung hinzu und inkubieren Sie sie für 1 minute bei 37 ° C, um die Zellen zu dissoziieren. Führen Sie eine visuelle Inspektion der Zellen unter einem Gewebekulturmikroskop durch und stellen Sie sicher, dass die Ränder der Zellkolonien abgerundet erscheinen, und saugen Sie dann schnell die Zellablösungslösung von den Zellen ab (um sicherzustellen, dass die Zellkolonien immer noch an der Platte befestigt sind, wenn auch locker). Spülen Sie die Zellen einmal vorsichtig mit DMEM/F12 ab, um die Zellablösungslösung zu entfernen.
- Fügen Sie 3 ml hiPS CCM zu den hiPS-Zellen (in jeder Vertiefung einer 6-Well-Platte) hinzu, die mit der Zellablösungslösung behandelt wurden. Kratzen Sie Kolonien mit einem Zelllifter und pipetetten Sie die Zellsuspension vorsichtig nach oben und unten, um die lose anhaftenden Zellen zu lösen. Waschen Sie den Teller gründlich, um sicherzustellen, dass alle Zellen geerntet werden.
HINWEIS: Die Verwendung einer 5-ml-Pipette wird empfohlen, um eine übermäßige Scherung der Zellen zu vermeiden. - 0,5 ml der Zellsuspension werden in jede Vertiefung einer neuen BM-Matrix-1-beschichteten 6-Well-Platte mit 2 ml hiPS-CCM pro Vertiefung übertragen. Bewegen Sie die Platte in Figur-Acht-Manier, um Zellkolonien in Vertiefungen zu verteilen und bei 37 °C in einem 5 % CO 2-Inkubatorzu inkubieren. Das Medium täglich auffrischen, bis die Zellen bereit sind, durchzufahren oder für das Differenzierungsexperiment verwendet zu werden (ca. 70 % Konfluenz).
HINWEIS: Die ideale Koloniegröße für das routinemäßige Passieren von iPSCs liegt zwischen 200-500 μm unter feederfreien Bedingungen mit hiPS CCM (ohne ROCK-Inhibitor). Werden Zellen während der Behandlung mit Dissoziationsenzymen oder Puffern individualisiert, kann das hiPS CCM mit ROCK-Inhibitor (z.B. 10 μM Y27632) ergänzt werden, um die Zelllebensfähigkeit zu verbessern.
4. Differenzierung von hiPS-Zellen in Mesodermzellen (Tage 0-2)
- Während sich die hiPS-Zellkulturen in der exponentiellen Wachstumsphase befinden (etwa innerhalb von 4 Tagen nach der Kultur nach dem Passaging und etwa 70% Konfluenz), untersuchen Sie visuell auf das Vorhandensein spontan differenzierter Zellen innerhalb und um die Ränder der Kolonien. Bei Bedarf Differenzierungsbereiche aseptisch abkratzen.
- Saugen Sie hiPS CCM aus hiPS-Zellen und spülen Sie die Zellen 3 mal mit warmem DMEM/F12. Inkubieren Sie die Zellen mit 1 ml enzymfreiem Zelldissoziationspuffer für 10 min bei 37 °C und überprüfen Sie die Dissoziation unter einem Mikroskop. Aufgrund inhärenter Unterschiede zwischen verschiedenen hiPS-Zelllinien muss die tatsächliche Inkubationszeit für den Zelldissoziationspuffer für eine bestimmte Zelllinie bestimmt werden.
- Kratzen Sie den Brunnen vorsichtig mit einem Zelllifter ab, um lose anhaftende Zellen zu lösen, und übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 mL konisches Rohr, gefolgt von mehrmaligem Pipettieren auf und ab, um die hiPS-Zellen zu individualisieren.
- Zellsuspension mit warmem DMEM/F12 und Zentrifuge für 5 min bei 290 x g bei Raumtemperatur auf das 15 mL Volumen bringen.
- Saugen Sie vorsichtig den Überstand an und reanimieren Sie die Zellen mit warmem DMEM / F12 für eine weitere Runde der Zentrifugation, um restierende BM-Matrix 1- und Dissoziationspufferkomponenten zu entfernen.
- Saugen Sie die überstandenden und resuspendierten Zellen in 1 ml Mesoderm-Induktionsmedium ab, wie oben beschrieben. Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen mit einem Hämozytometer oder einem Zähler, um das geeignete Volumen des Mesodermdifferenzierungsmediums zu bestimmen, das erforderlich ist, um eine Konzentration von 1 x 105 Zellen / ml zu erreichen.
- Saugen Sie ECM-Lösung aus den BM matrix 2-beschichteten Platten an und spülen Sie die Platten zweimal mit warmem DMEM/F12 ab. Mischen Sie die hiPS-Zellsuspension vorsichtig durch einige Male pipettieren. 1 ml der Zellsuspension auf jede Vertiefung der BM-Matrix 2-beschichteten 12-Well-Platten geben und dann die Platten vorsichtig schütteln, um die Zellen gleichmäßiger zu verteilen.
- Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C in einem 5% CO2 Inkubator. Erfrischen Sie das Mesoderm-Induktionsmedium am nächsten Tag.
HINWEIS: Nach 2 Tagen wären hiPS-Zell-abgeleitete Mesodermzellen bereit für die intermediäre Mesoderminduktion.
5. Differenzierung von hiPS-Zell-abgeleiteten Mesodermzellen in intermediäre Mesodermzellen (Tage 2-16)
- Am Tag 2 des Differenzierungsprotokolls mesoderm-Induktionsmedium absaugen und mit 1 ml pro Vertiefung intermediäres Mesoderm-Induktionsmedium auffüllen.
- Aktualisieren Sie das Medium jeden Tag, um eine genaue Schwelle von Wachstumsfaktoren und kleinen Molekülen für die metabolisch aktiven Zellen aufrechtzuerhalten. Bei erheblichem Zellwachstum und rascher Erschöpfung der Mediennährstoffe (angezeigt durch die Gelbfärbung des Mediums) kann das Volumen des zwischengeschalteten Mesodermdifferenzierungsmediums auf 1,3 ml pro Vertiefung der 12 Wellplatten erhöht werden.
- Kulturzellen für weitere 14 Tage, um intermediäre Mesodermzellen zu erhalten. Bis zum 16. Tag können diese Zellen für die spätere Verwendung kryokonserviert werden.
6. Differenzierung von hiPS-Zell-abgeleiteten zwischenmesodermzellen in Podozyten (Tage 16 bis 21)
- Spülen Sie die zwischengeschalteten Mesodermzellen mit warmem DMEM/F12, gefolgt von einer Inkubation der Zellen mit 0,5 ml pro Vertiefung von 0,05 % Trypsin-EDTA für 3 min bei 37 °C. Führen Sie eine visuelle Inspektion durch, um sicherzustellen, dass die Zellen beginnen, sich zu dissoziieren.
- Kratzen Sie Zellen mit einem Zelllifter und pipetieren Sie die Zellsuspension mehrmals mit einer 1.000 μL Pipettenspitze, um individualisierte (oder kleine Klumpen von) Zellen zu erhalten.
HINWEIS: Stellen Sie in diesem Stadium sicher, dass die Zellen vollständig dissoziiert sind, da aggregierte Zellen möglicherweise keinen terminal differenzierten Phänotyp innerhalb der Zeitleiste des Protokolls erwerben. - Fügen Sie etwa 2 ml pro Vertiefung Trypsin neutralisierende Lösung hinzu, um die Aktivität von Trypsin zu stoppen.
- Übertragen Sie die Zellen in ein konisches 50-ml-Rohr und bringen Sie das Volumen mit DMEM/ F12 auf 50 ml und zentrifugieren Sie dann die Zellsuspension für 5 min bei 201 x g bei Raumtemperatur.
- Saugen Sie die überstandenden und resuspendierten Zellen im Podozyteninduktionsmedium ab. Für optimale Ergebnisse stellen Sie eine endgültige Aussaatdichte von etwa 100.000 Zellen / Vertiefung einer 12-Well-Platte sicher. Fügen Sie die Zellsuspension zu den 2-beschichteten BM-Matrix-Platten hinzu und schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die Zellen gleichmäßiger zu verteilen.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5% CO2 und erfrischen Sie das Medium täglich für bis zu 5 Tage, um bis zum 21. Tag Podozyten zu erhalten.
HINWEIS: Die resultierenden hiPS-Zell-abgeleiteten Podozyten können für 2-4 zusätzliche Wochen in Kultur gehalten werden, indem ein vollständiges Medium mit Podozyten-Erhaltungsmedien verwendet wird. Einmal in Podozyten-Erhaltungsmedien, können die Zellen jeden zweiten Tag gefüttert werden und können für nachfolgende Studien oder nachgeschaltete Analysen verwendet werden.
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Representative Results
Ziel dieses Protokolls war es zu zeigen, dass reife menschliche Podozyten unter chemisch definierten Bedingungen aus hiPS-Zellen gewonnen werden können. Die in diesem Manuskript vorgestellten Daten wurden unter Verwendung der DU11 hiPS-Zelllinie17generiert, die zuerst getestet wurde und sich als frei von Mykoplasmen erwiesen hat. Es wurde auch eine Chromosomenanalyse durchgeführt, und die Zellen erwiesen sich als karyotypisch normal. Ausgehend von den undifferenzierten DU11 hiPS-Zellen wurde die in diesem Bericht skizzierte Differenzierungsstrategie (Abbildung 1) verwendet, um die Stammzellen (Abbildung 2A) zunächst in Mesodermzellen zu differenzieren, die Brachyury (T) exprimieren (Abbildung 1B und Abbildung 2B), gefolgt von der Differenzierung in PAX2-positive intermediäre Mesodermzellen (Abbildung 2C) und schließlich in reife nierengloomeruläre Podozyten (Abbildung 1B. Abbildung 2D, Abbildung 3Dund Abbildung 4). Mesodermzellen wurden bis Tag 2 des Differenzierungsprotokolls erhalten, intermediäre Mesodermzellen wurden bis Tag 16 erzeugt und die reifen Podozyten wurden bis Tag 21 des Differenzierungsprotokolls erhalten. Die resultierenden Podozyten waren etwa 150-200 μm groß, wenn sie an einer flachen Gewebekulturoberfläche hafteten, wie die lamininbeschichteten Platten, die in diesem Experiment verwendet wurden. Die von hiPS-Zellen abgeleiteten Podozyten weisen zahlreiche fußprozessähnliche Erweiterungen auf, die mit mehreren komplementären Techniken visualisiert wurden, darunter Phasenkontrastmikroskopie (Abbildung 1), Immunfluoreszenzmikroskopie (Abbildung 4) und Rasterelektronenmikroskopie8,11. Die stammzellbasierten Podozyten färbten sich ebenfalls positiv fürWT1 15 (Abbildung 2D) sowie den Abstammungsidentifikationsmarker Nephrin14 (Abbildung 4). Interessanterweise war die subzelluläre Lokalisation von Nephrin überwiegend in den Podozytenfußprozessen und im Zellzytoplasma, konsistent mit einem reifen Podozytenphänotyp (Abbildung 2D und Abbildung 4A,B). Während der Entwicklung und in der Podozytenphysiologie wird das Protein Nephrin zwischen dem Zellkern und dem Zytoplasma transportiert, aber Nephrin wird überwiegend in den Zytoplasma- und Fußprozessen exprimiert, wenn Podozyten reifen und einen funktionellen Phänotyp18erwerben. Daher unterstreicht die Beobachtung, dass die podozyten, die unter Verwendung des hier beschriebenen Differenzierungsprotokolls produziert werden, Nephrin weitgehend in den zytoplasma- und fußprozessähnlichen Strukturen exprimieren, den Nutzen dieses Protokolls für die Erzeugung reiferer oder spezialisierter Podozyten. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von hiPS-Zell-abgeleiteten Podozyten zeigen die Verzweigung der primären und sekundären Fußprozesse in den hiPS-Zell-abgeleitetenPodozyten,wie zuvor von unserer Gruppe8,11berichtet. Da WT1 an sich kein definitiver Marker für Nierenpodozyten ist, wird dringend empfohlen, dass Forscher ihre Zellen auch für die gleichzeitige Expression von podozytenspezifischen Markern wie Podocin und Nephrin charakterisieren. Es wurde zuvor gezeigt, dass terminal differenzierte Podozyten, die mit dieser Methode gewonnen wurden, positiv für Podocin, Nephrin und WT1 sind, mit einer entsprechenden Abnahme der Expression des Vorläuferzellmarkers PAX28,11. Zusammen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die mit diesem Protokoll abgeleiteten Podozyten entwicklungsreif oder spezialisiert sind, wie es für einen funktionellen glomerulären Podozyten der menschlichen Niere erforderlich ist.
Bei der Optimierung der Bedingungen für die Differenzierungsmethode wurden Fälle beobachtet, in denen die zwischengeschalteten Mesodermzellen unzureichend dissoziiert waren. Zellen, die mit Dichten ausgesät wurden, die die empfohlene Dichte von 100.000 Zellen/Well einer 12-Well-Platte (vor dem letzten Podozyteninduktionsschritt) signifikant überschritten, führten zu großen Zellclustern, denen der erwartete morphologische Phänotyp reifer Podozyten innerhalb der Standardzeitleiste des Protokolls fehlte (Abbildung 3A, B). Aus diesen Gründen wird empfohlen, dass Forscher die in diesem Protokoll empfohlenen Aussaatdichten (Abbildung 3C, D) verwenden, bevor sie mit anderen Bedingungen experimentieren, die für bestimmte nachgelagerte Anwendungen wünschenswert sein können. Zusammen stellen diese Ergebnisse die gezielte Differenzierung von hiPS-Zellen in nierengloomeruläre Podozyten innerhalb von drei Wochen unter Verwendung der oben beschriebenen chemisch definierten Medien dar.
Abbildung 1: Differenzierung von hiPS-Zellen zu Podozyten.
(A) Schematische Darstellung der Methode zur gezielten Differenzierung von hiPS-Zellen in Podozyten. BMP7, knochenmorphogenetisches Protein 7; RA, Retinsäure; VEGF, vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor. Diese Zahl wurde von Referenz11geändert. (B) Repräsentative Bilder von hiPS-Zellen in jeder Phase der Differenzierung. Von links nach rechts zeigen die Bilder die charakteristischen menschlichen iPS-Zellkolonien vor der Dissoziation zur Differenzierung am Tag 0, gefolgt von Mesodermzellen nach 2 Tagen Differenzierung, dann intermediären Mesodermzellen nach etwa 10 Tagen der Differenzierung und schließlich den terminal differenzierten Podozyten am Tag 22. Maßstabsleiste, 100 μm für alle Bilder (in Panel B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Immunfluoreszierende Bilder von hiPS-Zellen und ihren differenzierten Derivaten, die die Expression von linienspezifischen Markern und nuklearen Gegenfärbungen während der Differenzierungszeitleiste zeigen.
(A) Menschliche iPS-Zellen, die den Pluripotenzmarker Oct4 exprimieren; (B) Mesodermzellen, die Brachyury (T) exprimieren; C) Zwischenmesodermzellen, die PAX2 exprimieren; und (D) die von hiPS-Zellen abgeleiteten Podozyten, die den Abstammungsidentifikationsmarker Nephrin und den zugehörigen Marker WT1 exprimieren. Scale Bar, 100 μm für alle Bilder. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Auswirkungen der suboptimalen Aussaatdichte auf das Differenzierungspotenzial von Intermesodermzellen, die aus der DU11 hiPS-Zelllinie gewonnen werden.
(A) Wenn die anfängliche Zellaussaatdichte zu hoch ist (ca. 500.000 Zellen/Vertiefung einer 12-Well-Platte), können Zellen während der Podozyteninduktionsphase dichte Aggregate (B) bilden. (C) Empfohlene Aussaatdichten, um eine Verklumpung zu verhindern (100.000 Zellen/Vertiefung einer 12-Well-Platte) und zur mikroskopischen Beobachtung der (D) Ausdehnung fußprozessähnlicher Strukturen während der Podozytendifferenzierungsphase (Inset). Maßstabsleiste, 200 μm für A-D; und 100 μm für den Einschub in D. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: hiPS-Zell-abgeleitete Podozyten weisen morphologisch ausgereiften Phänotyp in vitro auf.
(A) Immunfärbung von hiPS-Zell-abgeleiteten Podozyten für Nephrin und (B) höheres Vergrößerungsbild von Podozytenfußprozessen, das primäre und sekundäre Prozesse (weiße Pfeile) sowie die Expression von Nephrin in diesen spezialisierten Zellstrukturen zeigt. Maßstabsleiste, 100 μm (A); 50 μm (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
In diesem Bericht beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von glomerulären Nierenpodozyten aus hiPS-Zellen. Die von hiPS-Zellen abgeleiteten Podozyten weisen morphologische und molekulare Merkmale auf, die mit dem reifen Nierenpodozytenphänotyp13assoziiert sind. In früheren Veröffentlichungen haben wir gezeigt, dass die von hiPS-Zellen abgeleiteten Podozyten die Struktur und selektive Filtrationsfunktion des Nierenglomerulus nachahmen können, wenn sie mit glomerulären mikrovaskulären Endothelzellen in einem perfusablen mikrofluidischen Organ-on-a-Chip-Gerät kokultiviert werden8,11.
Die folgenden kritischen Schritte sollten von Forschern in Betracht gezogen werden, die an der Anpassung dieses Protokolls interessiert sind. Erstens ist die Aussaat von hiPS-Zellen auf lamininbeschichteten Platten zur Induktion von Mesodermzellen ein entscheidender Schritt. Während eine Aussaatdichte von 100.000 Zellen / Brunnen empfohlen wird, können die Forscher die anfängliche Zellaussaatdichte in Abhängigkeit von der Replikationsrate der für die Studie verwendeten Stammzelllinie anpassen. Falls erforderlich, stellt diese Optimierung eine ausreichende Zelldichte während der Mesoderminduktionsphase sicher und verhindert die Bildung von Zellaggregaten oder sehr großen Klumpen, die möglicherweise die Qualität des Mesoderm-, Zwischenmesoderm- oder Podozytenphänotyps beeinträchtigen könnten (Abbildung 3). Es ist auch wichtig zu beachten, dass Unterschiede in den Herstellerspezifikationen für einige Reagenzien wie CHIR99021 die Qualität differenzierter Zellen beeinflussen können. Daher ist es ratsam, Reagenzien von verschiedenen Chargennummern oder Lieferanten und Lieferanten auf ihre biologische Aktivität und Konsistenz zwischen unabhängigen Experimenten zu testen. Außerdem ist es wichtig, eine übermäßige Exposition von hiPS-Zellen gegenüber Dissoziationsenzymen zu vermeiden, da dies zu einer unerwünschten Ablösung von der Adhäsivmatrix und einem möglichen Verlust von Zellen während der mittleren Aspiration führen kann. Ein weiterer wichtiger Schritt, der bemerkenswert ist, besteht darin, sicherzustellen, dass das Podozyteninduktionsmedium vor Licht geschützt ist, um eine photoinduzierte Inaktivierung von Retinsäure zu verhindern.
Im Vergleich zu bisherigen Methoden zur Differenzierung menschlicher Nierenpodozyten verwendet die hier beschriebene Methode chemisch definierte Faktoren (einschließlich kleiner Moleküle, Wachstumsfaktoren und spezifischer Isoformen von Basalmembranproteinen in gewünschten Konzentrationen), um spezifische Zellsignalwege zu regulieren, die an der Nierenentwicklung und der Podozytenfunktion beteiligt sind. Insbesondere die Erzeugung von Mesodermzellen aus hiPS-Zellen beinhaltete die Aktivierung des kanonischen Wnt-Signalwegs, der unter Verwendung des kleinen Moleküls CHIR9902119erfolgt. Es ist bekannt, dass der kanonische Wnt-Signalweg die Transkriptionsaktivität von Genen reguliert, die an der Gewebeentwicklung und -musterung in vivo beteiligt sind, sowie die Zellproliferation und-migration 20,21. Das in diesem Protokoll verwendete Zellinduktionsmedium ermöglicht die Ableitung von Podozyten aus iPS-Zell-abgeleiteten Intermesodermzellen. Dieses Podozyten-Induktionsmedium besteht aus Activin A, BMP7, VEGF, Retinsäure und CHIR99021. Bemerkenswerterweise benötigt dieses Podozyteninduktionsmedium keine undefinierten Serumkomponenten wie fetales Rinderserum, was die Beiträge spezifischer Faktoren verschleiern und die Anwendung anderer Zelldifferenzierungsmethoden für mechanistische Studien der Gewebeentwicklung und -krankheit einschränken kann, wodurch es sich von denen unterscheidet, die bei früheren Versuchen zur Erzeugung von Nierenzelltypen22verwendet wurden. Zusätzlich wurde beobachtet, dass FGF2 und FGF9 für die Differenzierung von Nierenpodozyten aus hiPS-Zellen 6,7,22nicht erforderlich sind. Während bisherige Methoden von der Bildung mehrzelliger Aggregate wie embryoiden Körpern und Organoiden abhängig waren, produziert die hier beschriebene Methode Zellen, die sowohl morphologisch als auch durch die Expression von linienspezifischen Markern wie Nephrin und Podocin und die Herunterregulierung von Vorläuferzellmarkern wie PAX2 einen ausgereiften Phänotyp aufweisen. Es wird erwartet, dass das Wissen über die in diesem Protokoll verwendeten chemischen Komponenten in Zukunft mechanistische Studien der Entwicklung von menschlichem Nierengewebe, der Spezifikation der Podozytenlinie und der Krankheitspathogenese erleichtern kann.
Diese Methode zur hiPS-Zelldifferenzierung ermöglicht auch die Erzeugung von reifen, postbiotischen und funktionellen Podozyten mit einem Wirkungsgrad von mehr als 90%, ohne Subpopulationsselektion, genetische Manipulationen oder Xenotransplantation. Dies unterscheidet sich deutlich von früheren Versuchen, bei denen eine hohe zelluläre Heterogenität6,7,23 den Einsatz der Stammzelldifferenzierungsmethoden für translationale medizinische Anwendungen einschränkte. Diese Methode stellt auch einen bedeutenden Fortschritt für das Feld dar, da die Verfügbarkeit menschlicher Nierenpodozyten aus anderen Quellen wie Primärgewebe oder Organoiden extrem begrenzt ist. Zu den Herausforderungen gehören niedrige Ableitungseffizienzen von weniger als 1%, wenn Methoden verwendet werden, die auf der Bildung von embryoiden Körpern oder Organoiden beruhen6,7.
Eine Einschränkung dieses Protokolls sind die relativ hohen Kosten der Reagenzien, die für die Stammzellkultur und Differenzierungsschritte benötigt werden, was die Implementierung in einigen Labors oder Forschungsgruppen behindern kann. Da eine Menge Optimierungen für mehrere Faktoren in der Mikroumgebung der Zelle (d. H. Sowohl lösliche als auch unlösliche oder adhäsive Hinweise) beteiligt waren, empfehlen wir, dass das Protokoll wie beschrieben befolgt wird. Ein häufiger Fehler, der von anderen festgestellt wurde, die an der Verwendung dieser Podozytendifferenzierungsmethode interessiert waren, war die Verwendung ungeeigneter Zelladhäsionsmatrizen wie BM-Matrix 1 oder anderer schlecht definierter tierischer Proteine. Sobald das Protokoll wie beschrieben befolgt wird, können weitere Experimente durchgeführt werden, um die Wirksamkeit anderer Änderungen am Protokoll zu untersuchen. Darüber hinaus ist es aufgrund der inhärenten Unterschiede zwischen verschiedenen menschlichen Stammzelllinien erwähnenswert, dass einige Aspekte der Differenzierungsmethode, z. B. der Zeitpunkt der Exposition gegenüber Differenzierungsmedium oder Zelldissoziationsmedium und Zellaussaatdichten, möglicherweise optimiert werden müssen. Diese Bedingungen wurden jedoch für die bisher getesteten hiPS-Zelllinien und embryonalen Stammzelllinien nicht geändert. Diese Podozytendifferenzierungsmethode funktioniert über mehrere hiPS-Zelllinien, einschließlich PGP1, IMR-90-1 und IISH3i-CB6 sowie der embryonalen H9-Stammzelllinie8,11. In diesem Bericht demonstrieren wir auch die erfolgreiche Differenzierung der DU11 hiPS-Zelllinie mit demselben Protokoll (Abbildung 1 und Abbildung 2). Angesichts der Konsistenz dieser Methode über verschiedene Zelllinien hinweg, einschließlich der Ergebnisse unveröffentlichter Arbeiten anderer unabhängiger Forschungslabors (Vorveröffentlichung), erwarten wir, dass dieses Differenzierungsprotokoll für die Ableitung von Nierenpodozyten aus einer Vielzahl von hiPS-Zelllinien nützlich sein wird und daher nicht auf die in diesem Protokoll verwendete beschränkt ist.
Angesichts der Fähigkeit von hiPS-Zellen, sich auf unbestimmte Zeit selbst zu erneuern, könnte diese Differenzierungsmethode verwendet werden, um Forschern eine leicht verfügbare Quelle für menschliche Nierenpodozyten zur Verfügung zu stellen. Dies könnte dazu beitragen, das aktuelle Verständnis der menschlichen Nierenbiologie und -krankheit24 voranzutreiben und die Entwicklung neuer In-vitro-Nierensysteme zur Modellierung der menschlichen Nierenfunktion und der Reaktionen auf Therapeutika zu ermöglichen. Zum Beispiel wurde das hier beschriebene Protokoll kürzlich verwendet und in ein mikrofluidisches Organ-on-a-Chip-System integriert, um ein funktionelles In-vitro-Modell der glomerulären Kapillarwand der menschlichen Niere zu entwickeln. Dieser glomeruläre Chip filterte selektiv zirkulierende Moleküle und rekapitulierte die medikamenteninduzierte Nephrotoxizität, wenn er dem Chemotherapeutikum Adriamycin8ausgesetzt wurde. In Zukunft könnten diese Ergebnisse möglicherweise in 3D-Bioprinting-Technologien integriert werden, um komplexere In-vitro-Modelle der menschlichen Niere zu entwickeln. Solche Fortschritte könnten neuartige Plattformen für die Bewertung von Arzneimittelkandidaten bieten, insbesondere solche, die auf die Formen von Nierenerkrankungen abzielen, die sich aus der Dysfunktion glomerulärer Podozyten ergeben. Dies ist besonders wichtig, da die artspezifischen Unterschiede von Tiermodellen und das Fehlen von Funktionalitäten auf Organebene, die typischerweise in Standard-Gewebekulturmethoden beobachtet werden, die Entwicklung gezielter Therapeutika für verschiedene Formen menschlicher Nierenerkrankungen behindern können25. So könnte dieses Protokoll eines Tages Möglichkeiten bieten, die Signalwege zu entschlüsseln, die an der Entwicklung der menschlichen Niere beteiligt sind, sowie die Pathogenese von Krankheiten.
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Disclosures
S.M. ist Autor eines zum Patent angemeldeten Patents für Verfahren zur Erzeugung von Nierenpodozyten aus pluripotenten Stammzellen (US-Patentanmeldung 14/950859). Die übrigen Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Pratt School of Engineering an der Duke University, der Division of Nephrology an der Duke Medical School, dem A Chair's Research Award des Department of Medicine der Duke University und einem Burroughs Wellcome Fund PDEP Career Transition Ad Hoc Award an S.M unterstützt. M.B wurde durch das Graduate Research Fellowship Program der National Science Foundation unterstützt. Wir danken dem Bursac Lab für die großzügige Bereitstellung der DU11-Stammzelllinie und dem Varghese Lab an der Duke University für die vorübergehende Freigabe ihrer Gewebekultureinrichtung mit unserer Gruppe. Diese Publikation ist Prof. Laura L. Kiessling, Novartis Professorin für Chemie am Massachusetts Institute of Technology, anlässlich ihres 60.Geburtstages gewidmet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| DU11 human iPS cells | The DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal. | ||
| Growth Factors and Media Supplements | |||
| All-trans retinoic acid (500 mg) | 72262 | Stem Cell Technologies | |
| B27 serum-free supplement | 17504044 | Thermo/Life Technologies | |
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | May show lot-to-lot variation |
| Complete Medium Kit with CultureBoost-R | 4Z0-500-R | Cell Systems | Podocyte maintenance media |
| DMEM/F12 | 12634028 | Thermo/Life Technologies | |
| DMEM/F12 with GlutaMAX supplement | 10565042 | Thermo/Life Technologies | DMEM/F12 with glutamine supplement |
| Heat-inactivated FBS | 10082147 | Thermo/Life Technologies | |
| Human activin A | PHC9564 | Thermo/Life Technologies | |
| Human BMP7 | PHC9544 | Thermo/Life Technologies | |
| Human VEGF | PHC9394 | Thermo/Life Technologies | |
| mTeSR1 medium | 05850 | Stem Cell Technologies | hiPS cell culture media (CCM) |
| Penicillin–streptomycin, liquid (100×) | 15140-163 | Thermo/Life Technologies | |
| Y27632 ROCK inhibitor | 1254 | Tocris | |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488– and Alexa Fluor 594–conjugated secondary antibodies | A32744; A32754; A-11076; A32790 | Thermo/Life Technologies | |
| Brachyury(T) | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R&D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| ECM Molecules | |||
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment | N-892012 | Iwai North America | Basement membrane (BM) matrix 2 |
| Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial | 354277 | BD Biosciences | Basement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation |
| Enzymes and Other Reagents | |||
| Accutase | A1110501 | Thermo/Life Technologies | Cell detachment solution |
| BSA | A9418 | Sigma-Aldrich | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D2438 | Sigma-Aldrich | DMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood |
| Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank’s balanced salt | 13150016 | Thermo/Life Technologies | |
| Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade | 97065-058 | VWR | Ethanol is flammable and toxic |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldehyde (PFA) | 28906 | Thermo/Life Technologies | PFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | 14190-250 | Thermo/Life Technologies | |
| Sterile Distilled Water | 15230162 | Thermo/Life Technologies | |
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% | 25300-120 | Thermo/Life Technologies | |
| Equipment | |||
| Aspirating pipettes, individually wrapped | 29442-462 | Corning | |
| Avanti J-15R Centrifuge | B99516 | Beckman Coulter | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | 352097 | Corning | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | 352098 | Corning | |
| Cryoboxes | 3395465 | Thermo/Life Technologies | For storing frozen aliquots |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo/Life Technologies | Flourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives |
| Hemocytometer | 100503-092 | VWR | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | 51030403 | Thermo/Life Technologies | For the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives |
| Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera | 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera) | Carl Zeiss Microscopy | Used to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation |
| Kimberly-Clark nitrile gloves | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes, large | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes, small | 21905-026 | VWR | |
| P10 precision barrier pipette tips | P1096-FR | Denville Scientific | |
| P100 barrier pipette tips | P1125 | Denville Scientific | |
| P1000 barrier pipette tips | P1126 | Denville Scientific | |
| P20 barrier pipette tips | P1121 | Denville Scientific | |
| P200 barrier pipette tips | P1122 | Denville Scientific | |
| Serological pipette, 10 mL, individually wrapped | 356551 | Corning | |
| Serological pipette, 25 mL, individually wrapped | 356525 | Corning | |
| Serological pipette, 5 mL, individually wrapped | 356543 | Corning | |
| Steriflip, 0.22 μm, PES | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes | 1138W14 | Thomas Scientific | For aliquoting growth factors |
| Tissue culture–treated 12-well plates | 353043 | Corning | |
| Tissue culture–treated six-well plates | 353046 | Corning | |
| VWR white techuni lab coat | 10141-342 | VWR | |
| Wide-beveled cell lifter | 3008 | Corning |
References
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