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Mesure de l’absorption de glucose stimulée par l’insuline et la contraction dans le muscle squelettique mature isolé et incubé de souris

Published: May 16, 2021 doi: 10.3791/61398
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Section of Molecular Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports, University of Copenhagen, 2Section of Integrative Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports, University of Copenhagen

Summary

Une régulation intacte de l’absorption du glucose musculaire est importante pour maintenir l’homéostasie du glucose dans tout le corps. Ce protocole présente une évaluation de l’absorption de glucose stimulée par l’insuline et la contraction dans les muscles squelettiques matures isolés et incubés lors de la délimitation de l’impact de diverses interventions physiologiques sur le métabolisme du glucose dans tout le corps.

Abstract

Le muscle squelettique est un tissu sensible à l’insuline et absorbe généralement la majeure partie du glucose qui pénètre dans le sang après un repas. De plus, il a été rapporté que le muscle squelettique peut augmenter l’extraction du glucose du sang jusqu’à 50 fois pendant l’exercice par rapport aux conditions de repos. L’augmentation de l’absorption de glucose musculaire pendant l’exercice et la stimulation de l’insuline dépend de la translocation du transporteur de glucose 4 (GLUT4) des compartiments intracellulaires vers la membrane de surface des cellules musculaires, ainsi que de la phosphorylation du glucose en glucose-6-phosphate par l’hexokinase II. L’isolement et l’incubation des muscles de souris tels que m. soleus et m. extensor digitorum longus (EDL) est un modèle ex vivo approprié pour étudier les effets de l’insuline et de la contraction induite électriquement (un modèle pour l’exercice) sur l’absorption du glucose dans les muscles squelettiques matures. Ainsi, le modèle ex vivo permet d’évaluer la sensibilité musculaire à l’insuline et permet d’adapter la production de force musculaire pendant la contraction assurant un recrutement uniforme des fibres musculaires lors des mesures de l’absorption de glucose musculaire. De plus, le modèle décrit convient aux tests de composés pharmacologiques qui peuvent avoir un impact sur la sensibilité musculaire à l’insuline ou peuvent être utiles pour tenter de délimiter la complexité régulatrice de l’absorption du glucose dans les muscles squelettiques.

Ici, nous décrivons et fournissons un protocole détaillé sur la façon de mesurer l’absorption de glucose stimulée par l’insuline et la contraction dans les préparations musculaires isolées et incubées de soleus et d’EDL de souris utilisant le [3H]2-désoxy-D-glucose radiomarqué et le [14C]mannitol comme marqueur extracellulaire. Cela permet une évaluation précise de l’absorption du glucose dans le muscle squelettique mature en l’absence de facteurs de confusion pouvant interférer dans le modèle animal intact. En outre, nous fournissons des informations sur la viabilité métabolique du muscle squelettique de souris incubé, suggérant que la méthode appliquée possède certaines mises en garde dans certaines conditions lors de l’étude du métabolisme énergétique musculaire.

Introduction

Le muscle squelettique possède la capacité d’extraire de grandes quantités de glucose de l’espace extracellulaire en réponse à l’insuline et à l’exercice. Cela aide à maintenir l’homéostasie du glucose dans tout le corps et sécurise l’approvisionnement en glucose pendant les périodes de forte demande d’énergie. Étant donné qu’une régulation intacte de l’absorption du glucose dans les muscles squelettiques s’est avérée importante pour la santé globale et la performance physique 1,2, les mesures de l’absorption du glucose musculaire dans diverses conditions ont reçu beaucoup d’attention. Chez l’homme et l’animal, la pince hyperinsulinémique-euglycémique a été utilisée comme technique de référence pour évaluer la sensibilité à l’insuline in vivo 3,4. Contrairement aux résultats obtenus lors d’un test de tolérance au glucose par voie orale, la technique de la pince hyperinsulinémique-euglycémique ne nécessite pas de fonction gastro-intestinale intacte ou de sécrétion d’insuline par le pancréas et permet donc de comparer les réponses à l’insuline entre les sujets présentant des variations de la fonction gastro-intestinale et / ou pancréatique. Des mesures de l’absorption du glucose musculaire in vivo pendant l’exercice chez l’homme ont été effectuées fréquemment depuis les années 19605. D’abord par l’utilisation de techniques d’équilibre artérioveineux6 et plus tard par l’utilisation de l’imagerie par émission de positons (TEP) en combinaison avec un analogue du glucose émettant des positons, par exemple 18F-Fluoro-désoxy-glucose7. Chez les rongeurs, l’absorption de glucose musculaire stimulée par l’exercice in vivo est généralement réalisée par l’utilisation d’analogues du glucose marqués par des isotopes radioactifs ou stables 8,9,10.

Une méthode complémentaire aux mesures de l’absorption du glucose musculaire in vivo consiste à isoler et à incuber de petits muscles de rongeurs, puis à mesurer l’absorption de glucose à l’aide d’analogues du glucose marqués par des isotopes radioactifs ou stables 11,12,13. Cette méthode permet une quantification précise et fiable des taux d’absorption du glucose dans le muscle squelettique mature et peut être réalisée en présence de diverses concentrations d’insuline et lors de la contraction provoquée par stimulation électrique. Plus important encore, les mesures de l’absorption du glucose dans les muscles squelettiques isolés et incubés sont pertinentes lors de l’étude du phénotype métabolique musculaire de souris ayant subi diverses interventions (par exemple, nutrition, activité physique, infection, thérapeutique). Le modèle de muscle squelettique isolé est également un outil approprié pour les tests de composés pharmacologiques qui peuvent affecter l’absorption du glucose en soi et / ou modifier la sensibilité à l’insuline12,14. De cette façon, l’efficacité des composés conçus pour réguler le métabolisme du glucose musculaire peut être testée et évaluée dans un milieu hautement contrôlé avant des tests in vivo ultérieurs sur des modèles animaux précliniques.

Dans certaines conditions, la viabilité métabolique peut poser un défi dans le système de modèle musculaire squelettique isolé et incubé. En effet, l’absence de système circulatoire dans les muscles incubés implique que la livraison de substrats (par exemple l’oxygène et les nutriments) dépend entièrement de la simple diffusion entre les fibres musculaires et l’environnement environnant. À cet égard, il est important que les muscles incubés soient petits et minces et représentent donc moins une barrière pour la diffusion de l’oxygène pendant l’incubation15. Surtout pendant les incubations prolongées pendant plusieurs heures, des états hypoxiques peuvent se développer en raison d’un apport insuffisant en oxygène entraînant un épuisement de l’énergie musculaire15. Bien que divers marqueurs de la viabilité métabolique dans le muscle du rat incubé aient été rapportés précédemment parallèlement à l’identification de variables importantes qui aident à maintenir la viabilité du muscle du rat15, une évaluation complète de la viabilité métabolique dans les petits muscles de souris incubés est toujours justifiée. Par conséquent, à l’heure actuelle, la teneur en glycogène a principalement été utilisée comme marqueur de la viabilité métabolique dans le muscle squelettique de souris incubé16,17.

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour mesurer l’absorption basale, insulinique et stimulée par la contraction du glucose dans le soléus isolé et incubé et le muscle EDL de souris en utilisant le [3H]2-désoxy-D-glucose radiomarqué et le [14C]mannitol comme marqueur extracellulaire. Dans la présente étude, l’absorption de glucose a été mesurée pendant une période de 10 minutes et la méthode est présentée avec l’utilisation de concentrations d’insuline sous-maximales et maximalement efficaces ainsi que d’un seul protocole de contraction. Cependant, les protocoles décrits ici peuvent facilement être modifiés en ce qui concerne le temps d’incubation, le dosage de l’insuline et le protocole de stimulation électrique. En outre, nous fournissons une caractérisation approfondie de divers marqueurs de la viabilité métabolique dans le soléaire incubé et le muscle de la souris EDL. Les résultats indiquent que la supplémentation en glucose du tampon d’incubation est essentielle pour préserver la viabilité métabolique du muscle incubé pendant 1 heure.

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Protocol

Les procédures impliquant des animaux de recherche doivent être effectuées conformément aux lignes directrices pertinentes et à la législation locale. Toutes les expériences sur les animaux utilisées pour cette étude étaient conformes à la Convention européenne pour la protection des animaux vertébrés utilisés à des fins expérimentales et à d’autres fins scientifiques et ont été approuvées par l’Inspection danoise de l’expérimentation animale.

1. Préparation de l’appareil expérimental et des boucles de suture

REMARQUE: Pour cette étude, utilisez un système de myographe à bande musculaire intégré avec des crochets d’incubation personnalisés pour incuber les muscles squelettiques isolés de la souris (Figure 1). Ce système permet au muscle de se baigner dans une solution physiologique avec oxygénation continue (95% O2 et 5% CO2) et à température constante. Le bain de tissu musculaire est couplé à un transducteur de force pour la mesure de la production de force musculaire pendant la contraction. Pour obtenir et enregistrer les réponses myomécaniques pendant la contraction, utilisez respectivement un stimulateur d’impulsions électriques et un programme de collecte de données. Stimulez les muscles incubés à se contracter par des électrodes de platine positionnées au centre et des deux côtés du muscle.

  1. Allumez le système myographique et les chambres chaudes à 30 °C. Logiciel de collecte de données ouvert compatible avec le système myographique et étalonner les capteurs de force pour assurer la comparabilité entre les ensembles de données.
  2. Commencez par couper des brins d’environ 16 cm de suture chirurgicale en nylon non résorbable. Utilisez des pinces pour créer une boucle d’environ 0,4 cm de diamètre à partir d’un seul brin. Répétez cette opération jusqu’à ce que suffisamment de boucles aient été produites. Chaque muscle a besoin de deux boucles - une pour le tendon proximal et une pour le tendon distal.

2. Préparation des solutions et des milieux d’incubation

  1. Préparation des milieux d’incubation basaux
    1. Préparer les solutions mères suivantes : 2,5 M de chlorure de sodium (NaCl, 250 mL), 0,5 M de bicarbonate de sodium (NaHCO3, 250 mL), 0,5 M de chlorure de potassium (KCl, 50 mL), 0,25 M de chlorure de calcium (CaCl2, 50 mL), 0,25 M de dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4, 50 mL), 0,25 M de sulfate de magnésium (MgSO4, 50 mL), 110 mM de pyruvate de sodium (Na-Pyruvate, 100 mL), 500 mM de D-mannitol (100 mL), 1 M 2-désoxy-D-glucose (4 mL), solution à 15 % d’albumine sérique bovine (BSA) dialysée contre un tampon krebs-Ringer-Henseleit (KRH) (décrit ci-dessous à l’étape 4) (100 mL).
      REMARQUE: Deux solutions sont nécessaires pour mesurer l’absorption de glucose stimulée par le repos et la contraction. De plus, chaque concentration d’insuline utilisée pour évaluer l’absorption de glucose stimulée par l’insuline nécessite deux solutions. Ainsi, au total, six solutions différentes sont nécessaires pour mesurer l’absorption basale, sous-maximale de l’insuline, de l’insuline maximale et de la contraction dans le muscle squelettique isolé de la souris. Dans ce qui suit, le terme « milieu d’incubation basal » désigne les milieux sans insuline ni traceurs radioactifs. Les « milieux d’incubation » désignent les milieux contenant de l’insuline. Les « milieux d’incubation d’absorption du glucose » désignent les milieux contenant du 2-désoxy-D-glucose et des traceurs radioactifs en plus de l’insuline à une concentration identique à celle utilisée dans les « milieux d’incubation ».
    2. Préparer un tampon KRH en complétant l’eau ultrapure (ddH2O) avec du NaCl (117 mM), du NaHCO3 (24,6 mM), du KCl (4,7 mM), du CaCl2 (2,5 mM), du KH2PO4 (1,2 mM) et du MgSO4 (1,2 mM). Par la suite, gazez le tampon KRH avec 95% O2 et 5% co2 pendant au moins 10 min. Le pH souhaité du tampon KRH doit être compris entre 7,35 et 7,45 à 30 °C. Si le réglage du pH est effectué à température ambiante, le pH du tampon KRH doit être compris entre 7,25 et 7,35.
    3. Ajouter le BSA (0,1 %), le Na-Pyruvate (2 mM) et le D-mannitol (8 mM) au tampon KRH gazé et ajusté au pH pour compléter le milieu d’incubation basal. Entreposer les milieux d’incubation basaux dans un récipient scellé pour minimiser le dégazage de l’O2 et duCO2 et placer les milieux à 30 °C.
      REMARQUE: En règle générale, l’osmolarité des suppléments de KRH (c’est-à-dire Na-Pyruvate, D-Mannitol et D-glucose) est maintenue constante tout au long d’une expérience pour éviter le rétrécissement ou l’expansion des cellules musculaires. Le protocole décrit ici utilise une osmolarité de 10 mM pour les suppléments krH. Si un tampon contenant du glucose est nécessaire, remplacez les suppléments de KRH pour répondre aux besoins, par exemple 5 mM de D-glucose et 5 mM de D-mannitol.
    4. Pour éviter d’éventuels contaminants associés à la BSA dans le tampon d’incubation, dialyze BSA contre KRH.
      1. Pour obtenir une solution mère de BSA à 15 % dialysée contre un tampon KRH, commencez par dissoudre 300 g de BSA sans gras de qualité analytique dans 900 mL de tampon KRH. Ensuite, faites bouillir le tube de dialyse dans de l’eau redistillée jusqu’à ce que le tube soit mou.
      2. Remplissez le tube avec la solution BSA-KRH et fixez les extrémités du tube. Placez le tube avec BSA-KRH dans 5 L de tampon KRH et laissez-le toute la nuit à 4 °C. Le lendemain, remplacez le tampon KRH et laissez le tube avec BSA-KRH dans le tampon KRH pendant la nuit à 4 °C.
      3. Enfin, prélever la solution BSA-KRH du tube et ajouter le tampon KRH à un volume final de 2 L (c’est-à-dire une solution mère BSA-KRH à 15 %). Diviser la solution mère à 15 % de BSA-KRH en aliquotes et conserver au congélateur à ~-20 °C.
  2. Préparation de milieux d’incubation contenant de l’insuline
    1. Pour les milieux d’incubation contenant une concentration d’insuline sous-maximale efficace, ajouter 1 μL d’une solution mère d’insuline de 100 mU/mL par mL de milieu d’incubation basal (100 μU/mL d’insuline).
    2. Pour les milieux d’incubation contenant une concentration d’insuline efficace maximale, ajouter 1 μL d’une solution mère d’insuline de 10 U/mL par mL de milieu d’incubation basal (10 mU/mL d’insuline).
  3. Préparation des milieux d’incubation d’absorption du glucose
    ATTENTION : La manipulation de matières radioactives n’est autorisée que dans une zone restreinte et contrôlée par le personnel autorisé et certaines universités, instituts de recherche et entreprises peuvent exiger l’acquisition d’un « permis d’utilisation de la radioactivité ». Les matériaux et les déchets doivent être manipulés conformément aux procédures, directives et législations locales appropriées.
    1. Suivez la même procédure que celle décrite à la section 2.1.2.
    2. Ajouter le BSA (0,1 %), le Na-Pyruvate (2 mM), le D-mannitol (7 mM) et le 2-désoxy-D-glucose (1 mM) au tampon KRH gazé et ajusté au pH.
    3. Ajouter [3H]2-désoxy-D-glucose (0,028 MBq/mL) et [14C]mannitol (0,0083 MBq/mL) au tampon KRH supplémenté pour compléter le milieu d’incubation de l’absorption du glucose. Conserver à 30 °C. Si [3H]2-désoxy-D-glucose et [14C]mannitol sont dissous dans l’éthanol, retirez l’éthanol par évaporation médiée parN2 avant utilisation.
    4. Pour les milieux d’incubation d’absorption du glucose contenant une concentration d’insuline sous-maximale efficace, ajouter 1 μL d’une solution mère d’insuline de 100 mU/mL par mL de milieu d’incubation absorbant le glucose (100 μU/mL d’insuline).
    5. Pour les milieux d’incubation d’absorption du glucose contenant une concentration d’insuline d’efficacité maximale, ajouter 1 μL d’une solution mère d’insuline de 10 U/mL par mL de milieu d’incubation d’absorption du glucose (10 mU/mL d’insuline).

3. Animaux et dissection du soléaire de la souris et du muscle EDL pour l’incubation

REMARQUE: Les procédures impliquant des animaux de recherche doivent être effectuées conformément aux lignes directrices pertinentes et à la législation locale. La procédure décrite peut être utilisée avec des souris mâles et femelles élevées en interne ou disponibles dans le commerce de diverses souches et origines génétiques. La procédure suivante est prévue pour les souris femelles C57Bl/6J nourries. En moyenne, les souris avaient 19 semaines et pesaient 25 g. Les souris ont été maintenues sur un cycle clair-sombre de 12:12 h avec un accès libre au chow et à l’eau standard des rongeurs. Les expériences sur les animaux ont été lancées à ~ 9h00 heure locale et tous les animaux ont été sacrifiés dans un délai de 2 h.

  1. Ajouter 4 mL de milieu d’incubation basal préchauffé (30 °C) à chaque chambre d’incubation et s’assurer que le milieu d’incubation basal est continuellement oxygéné avec 95 % O2 et 5 % de CO2.
  2. Anesthésier les souris avec une injection intrapéritonéale de pentobarbital (10 mg/100 g de poids corporel) ou d’autres anesthésies disponibles (p. ex. tribromoéthanol).
    REMARQUE: Sachez que dans certains pays, une licence pour manipuler le pentobarbital et d’autres médicaments anesthésiques peut être requise. Avant que la dissection musculaire puisse être initiée, l’anesthésie de chaque animal doit être correctement induite. Pour s’en assurer, les réflexes de la queue et des jambes sont testés. Pour des résultats optimaux, la dissection doit être bien pratiquée pour éviter d’endommager les muscles lors du retrait.
  3. Placez les souris anesthésiées sujettes sur un plateau de dissection (p. ex. couvercle en polystyrène) et épinglez les pattes avant et postérieures, au besoin, à l’aide d’une aiguille.
  4. Retirez la peau de la jambe inférieure et assurez-vous que le tendon d’Achille et l’articulation du genou sont visibles.
    1. Pour la dissection du muscle soléaire, commencez par attacher une seule boucle de suture au tendon d’Achille. Fixez une pince pean au tendon d’Achille distalement de la boucle de suture et coupez pour libérer les muscles soléaire et gastrocnémien de la patte. Faites glisser délicatement la pince pean sur la souris, exposant ainsi le muscle soléaire.
    2. Épinglez les pinces pean et placez une deuxième boucle de suture autour du tendon proximal du muscle soléaire. Ensuite, coupez le tendon proximal et disséquez le soléaire (y compris les deux boucles de suture attachées) sans muscle gastrocnémien. Placez rapidement le muscle soléaire dans la chambre d’incubation en attachant chaque boucle de suture aux crochets respectifs.
  5. Retirer le fascia recouvrant le m. tibialis antérieur (TA) à l’aide d’une pince. Si cela est fait correctement, les tendons distaux des muscles TA et EDL doivent être blancs clairs et visibles; et séparés les uns des autres.
  6. Coupez le tendon distal du muscle TA et disséquez le muscle pour des analyses ultérieures (par exemple, génotypage). À l’aide d’une pince, libérez doucement le muscle EDL des tissus environnants, mais laissez le muscle intact et ne coupez pas les tendons. Placez une boucle de suture autour du tendon distal et une deuxième boucle de suture autour du tendon proximal de l’EDL.
  7. Ensuite, coupez les tendons libérant le muscle EDL avec deux boucles de suture attachées et placez rapidement le muscle dans la chambre d’incubation en attachant chaque boucle de suture aux crochets respectifs. Afin de ne pas perdre de tension pendant l’incubation et en particulier lors de la contraction électrique des muscles soléaire et EDL, il est d’une grande importance de fixer les boucles de suture autour des tendons avec des nœuds serrés.
  8. Enfin, euthanasier l’animal par exemple par luxation cervicale.
  9. Lorsque les muscles ont été disséqués et placés dans des chambres d’incubation, ajuster la tension au repos de chaque muscle à ~5 mN et pré-incuber les muscles pendant au moins 10 minutes avant d’initier le protocole expérimental.

4. Absorption de glucose stimulée par l’insuline dans le muscle squelettique isolé de la souris

  1. Après l’étape 3.9, remplacer le milieu d’incubation basal par un milieu d’incubation ne contenant pas d’insuline (milieu d’incubation basal), une concentration d’insuline sous-maximale efficace ou une concentration d’insuline d’efficacité maximale et laisser dans les chambres d’incubation pendant 20 min. Espacez chaque chambre d’incubation de 1 min, ce qui laisse le temps pour la récolte ultérieure des muscles.
  2. À la fin de la période de stimulation de 20 minutes, remplacez le milieu d’incubation par le milieu d’incubation d’absorption du glucose contenant une concentration identique d’insuline et laissez dans les chambres d’incubation pendant 10 minutes, toujours avec un espacement de 1 minute entre chaque chambre d’incubation.
  3. Après 10 min d’incubation dans le milieu d’incubation de l’absorption du glucose, retirez doucement les muscles des chambres d’incubation et lavez-les dans un milieu d’incubation basal glacé. Par la suite, séchez rapidement les muscles sur du papier filtre avant que les boucles de suture ne soient retirées et que les muscles ne soient congelés dans de l’azote liquide. Il est impératif que les muscles incubés soient récoltés rapidement si l’on souhaite également étudier divers métabolites intracellulaires et la signalisation des protéines en plus de l’absorption du glucose.
  4. Prélever 100 μL du milieu d’incubation de l’absorption du glucose dans chaque chambre d’incubation et le stocker à -20 °C. La quantité de radioactivité dans ces échantillons sera incluse dans le calcul de l’absorption de glucose musculaire.

5. Absorption de glucose stimulée par la contraction dans le muscle squelettique isolé de la souris

REMARQUE: Pour induire la contraction du muscle squelettique isolé de la souris, utilisez le protocole suivant: 1 train / 15 s, chaque train de 1 s de long composé d’impulsions de 0,2 ms délivrées à 100 Hz. Cependant, d’autres protocoles similaires provoquant la contraction du muscle squelettique isolé de la souris fonctionneront probablement aussi bien. Il est important de noter que la tension doit être ajustée pour générer un développement maximal de la force du muscle incubé, qui dépend de la configuration expérimentale. Si cela n’est pas assuré, vous risquez que toutes les fibres du muscle ne se contractent pas. À son tour, cela peut induire un biais dans l’ensemble de données.

  1. Après l’étape 3.9, placez les électrodes de platine au centre et des deux côtés des muscles. Initier la contraction des muscles immédiatement après avoir remplacé le milieu d’incubation basal par le milieu d’incubation d’absorption du glucose. Si possible, espacez chaque chambre d’incubation de 1 min, ce qui laisse le temps pour la récolte ultérieure des muscles. N’oubliez pas d’enregistrer la production de force de chaque muscle incubé.
  2. Après 10 min de contraction dans le milieu d’incubation de l’absorption du glucose, retirez les électrodes de platine, recueillez doucement les muscles des chambres d’incubation et lavez-les dans des milieux d’incubation basaux glacés. Par la suite, séchez rapidement les muscles sur du papier filtre avant que les boucles de suture ne soient enlevées et que les muscles ne soient congelés dans de l’azote liquide. Toute la procédure de récolte musculaire doit être effectuée le plus rapidement possible.
  3. Prélever 100 μL du milieu d’incubation de l’absorption du glucose dans chaque chambre d’incubation et le stocker à -20 °C. La quantité de radioactivité dans ces échantillons sera incluse dans le calcul de l’absorption de glucose musculaire.

6. Homogénéisation et traitement des muscles squelettiques

REMARQUE: La procédure donnée ci-dessous pour l’homogénéisation musculaire permet de déterminer à la fois l’absorption du glucose et la signalisation myocellulaire par transfert western dans le même ensemble d’échantillons musculaires.

  1. Homogénéiser chaque muscle dans 400 μL de tampon glacé avec un pH de 7,5 contenant 10 % de glycérol, 20 mM de pyrophosphate de sodium, 1 % d’IGEPAL CA-630 (NP-40), 2 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (dissous dans de l’isopropanol), 150 mM de NaCl, 50 mM d’HEPES, 20 mM de β-glycérophosphate, 10 mM de fluorure de sodium (NaF), 1 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 1 mM d’acide glycolétherdiaminetétraacétique (EGTA), 10 μg/ml d’aprotinine, 10 μg/mL de leupéptine, 3 mM de benzamidine et 2 mM d’orthovanadate de sodium à l’aide de billes d’acier et d’un tissu (2 x 45 s à 30 Hz). Faire pivoter tous les homogénats bout à bout pendant 1 h à 4 °C, après quoi ils sont centrifugés à 16 000 x g pendant 20 min à 4 °C. Recueillir le lysat (surnageant) qui est utilisé pour déterminer l’absorption du glucose musculaire.

7. Dosage du 2-désoxyglucose radiomarqué et du mannitol

  1. Ajouter 150 μL de chaque lysat musculaire et 25 μL du milieu d’incubation de l’absorption du glucose de chaque chambre d’incubation pour séparer les flacons de comptage de scintillation liquide contenant 2 mL de liquide de scintillation. De plus, préparez deux flacons de contrôle aveugles ne contenant que 3 mL de liquide de scintillation liquide. Fermez tous les flacons et mélangez bien en tourbillonnant chaque flacon pendant environ 5 s.
  2. Placer les flacons dans un compteur de scintillation liquide et mesurer la radioactivité de [3H]2-désoxy-D-glucose et [14C]mannitol conformément aux directives du fabricant. Enregistrer les DPM (désintégrations par minute) pour chaque flacon de scintillation liquide.

8. Calcul des taux d’absorption du glucose musculaire

  1. Utilisez le lysat de l’étape 6.1 pour mesurer la concentration totale de protéines dans chaque échantillon musculaire à l’aide de méthodes standard de quantification des protéines (p. ex., acide bicinchoninique ou essais de Bradford). Calculez la quantité de protéines (mg) ajoutée à chaque flacon de scintillation.
    REMARQUE: Le taux d’absorption du glucose pour chaque échantillon musculaire est calculé en soustrayant la quantité de [3H]2-désoxy-D-glucose située dans l’espace extracellulaire de la quantité totale de [3H]2-désoxy-D-glucose dans l’échantillon musculaire en utilisant [14C]mannitol comme marqueur extracellulaire. On suppose que le [3H]2-désoxy-D-glucose et le [14C]mannitol présentent des propriétés de diffusion similaires dans le tissu musculaire pendant l’incubation. Effectuez les calculs suivants :
  2. Commencez par soustraire le [3H] et [14C] DPM des échantillons de contrôle aveugles de tous les échantillons de muscles et de milieux.
  3. Déterminer l’espace extracellulaire musculaire en μL (μL-ECS) :
    [14C] MuscleDPM / ([14C]DPMmedia / Mvol)
  4. Calculer la quantité de [3H]DPM dans l’espace extracellulaire musculaire ([3H]DPMECS) :
    μL-ECS × ([3H]DPMmedia / Mvol)
  5. Calculer la quantité de [3H]DPM dans l’espace intracellulaire musculaire ([3H]DPMICS) :
    [3H] MuscleDPM− [3H]DPMECS
  6. Calculer le taux d’absorption du glucose musculaire (μmol / g de protéines / heure):
    [3H] DPMICS / ([3H]DPMmedia / Mvol) / [2-désoxy-D-glucose])) / mg protéine) / Th
    REMARQUE: Pour toutes les équations ci-dessus,
    [14C] Lemuscle DPM est la quantité de radioactivité du [14C]mannitol dans un échantillon musculaire;
    [14C] Lemilieu DPM est la quantité de radioactivité du mannitol [14C] dans un échantillon de milieu;
    [3H] Lemuscle DPM est la quantité de radioactivité [3H]2-désoxy-D-glucose dans un échantillon musculaire;
    [3H] LemilieuDPM est la quantité de radioactivité [3H]2-désoxy-D-glucose dans un échantillon de milieu;
    [3H] DPMECS est la quantité de radioactivité [3H]2-désoxy-D-glucose dans l’espace extracellulaire musculaire;
    [3H] DPMICS est la quantité de radioactivité [3H]2-désoxy-D-glucose dans l’espace intracellulaire musculaire;
    μL-ECS est l’espace extracellulaire musculaire en μL;
    Mvol est le volume (μL) des milieux d’incubation utilisés pour le comptage de la scintillation (par exemple, « 25 » comme mentionné ci-dessus);
    Th est le facteur de temps utilisé pour calculer les taux d’absorption par heure (c.-à-d. « 1/6 » lors de l’incubation des muscles avec un milieu absorbant le glucose pendant 10 minutes)
  7. Prenez en considération cet exemple de calcul. Les [3H] et [14C] DPM des échantillons témoins aveugles (17 et 6, respectivement) ont été soustraits des valeurs DPM mentionnées ci-dessous.
    [14C] MuscleDPM: 343
    [14C] SupportsDPM : 11846
    [3H] MuscleDPM: 4467
    [3H] MédiaDPM : 39814
    Mvol: 25
    mg de protéines : 0,396 (dans 150 μL de lysat de protéines musculaires)
    [2-désoxy-D-glucose]: 1 (mM)
    Th: 1/6 (h)
    μL-ECS = 343 DPM / (11846 DPM / 25 μL) = 0,724 μL
    [3H] ECS DPM : 0,724 μL × (39814 DPM / 25 μL) = 1153 DPM
    [3H] DPMICS: 4467 DPM - 1153 DPM = 3314 DPM
    Absorption de glucose: ((3314 DPM / (39814 DPM / 25 μL) / 1 mmol / L) / 0,396 mg de protéines) / (1/6 heure) = 31,53 μmol / g de protéines / heure

9. Analyses SDS-PAGE et Western Blot

  1. Préparer les lysats musculaires soléaire et EDL dans un tampon laemmli et chauffer pendant 5 min à 96 °C.
  2. Séparez des quantités égales de protéines musculaires par SDS-PAGE sur des gels auto-moulés et transférez les protéines dans les membranes de fluorure de polyvinylidène par buvard semi-sec.
  3. Par la suite, incuber des membranes dans une solution saline tamponnée Tris contenant 0,05 % de lait écrémé Tween 20 et 2 % et des membranes sondeuses avec des anticorps primaires et secondaires pertinents.
  4. Détectez les protéines avec chimiluminescence et visualisez-les par un système d’imagerie numérique.

10. Glycogène musculaire, nucléotides, lactate, créatine et phosphocréatine

  1. Utilisez de l’acide perchlorique pour extraire des échantillons de muscle EDL et soleus.
  2. Par la suite, neutralisez les échantillons et analysez-les pour le lactate, la créatine et la phosphocréatine comme décrit précédemment18.
  3. Analyser la teneur en nucléotides dans l’EDL et le muscle soléaire par CLHP en phase inverse après extraction dans l’acide perchlorique.
  4. Déterminer la teneur en glycogène musculaire dans l’homogénat musculaire entier sous forme d’unités glycosyliques après hydrolyse acide par une méthode fluorométrique décrite précédemment18.

11. Statistiques

  1. Effectuer des analyses statistiques avec un logiciel d’analyses statistiques.
  2. Utilisez un test d’analyse bidirectionnelle de la variance (ANOVA) pour évaluer les différences statistiques entre les valeurs présentées dans le tableau 1.
  3. Utilisez des tests t d’étudiant non appariés pour évaluer les différences statistiques dans l’absorption du glucose entre l’EDL et le soléaire au sein de chaque groupe présenté à la figure 2. Présenter les données comme moyens ±'erreur-type de la moyenne (SEM). P < 0,05 est considéré comme statistiquement significatif.

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Representative Results

Comme le montre la figure 2, les taux d’absorption du glucose basal étaient similaires entre le soléaire isolé et le muscle EDL de souris femelles. Cela a également été signalé plusieurs fois avant 12,13,19,20. L’absorption de glucose a augmenté d’environ 0,8 et ~0,6 fois, atteignant 12 et 9 μmol / g de protéines / h dans le soléaire et le muscle EDL, respectivement, en réponse à une concentration d’insuline sous-maximale efficace (100 μU / mL). Cette augmentation était encore plus élevée (~4 et ~2 fois atteignant 33 et 19 μmol/g de protéines/h dans le soléus et le muscle EDL, respectivement) lorsque les muscles étaient stimulés avec une concentration d’insuline maximale efficace (10 mU/mL). De plus, l’absorption sous-maximale et maximale de glucose stimulé par l’insuline était significativement plus élevée dans le muscle soléaire, ce qui indique que le muscle soléaire présente une sensibilité et une réactivité accrues à l’insuline par rapport au muscle EDL. Cela peut être lié à l’expression plus élevée du transporteur de glucose 4 (GLUT4) ainsi qu’au transducteur de signalisation de l’insuline protéine kinase B (Akt) dans le muscle soléaire par rapport au muscle EDL 10,21,22,23,24.

L’absorption de glucose induite par la contraction était significativement plus élevée dans le muscle EDL que dans le muscle soléaire (Figure 2), comme indiqué précédemment13,19. Ainsi, l’absorption de glucose a augmenté de ~2 et ~2,5 fois atteignant 14 et 22 μmol / g de protéines / h dans le soléaire et le muscle EDL, respectivement, en réponse à des contractions induites électriquement. La figure 3 montre la production maximale de force musculaire dans le soléaire et le muscle EDL pendant la période de stimulation de 10 minutes. Comme vu et rapporté précédemment19, le muscle EDL génère plus de force (225 mN dans EDL contre 150 mN dans soleus) pendant la partie initiale de la période de stimulation. D’autre part, le muscle EDL présente une baisse plus rapide de la production de force par rapport au muscle soléaire plus tard dans la période de stimulation. Ces résultats sont probablement dus à la différence de distribution du type de fibre entre le soléaire (type 1 > type 2) et le muscle EDL (type 2 > type 1)25, car les fibres de type 2 génèrent plus de force mais la fatigue plus rapidement que les fibres de type 126,27.

Pour évaluer l’effet de l’insuline et de la contraction sur la signalisation intracellulaire dans le soléaire isolé et le muscle EDL, la phosphorylation d’Akt Thr308, du membre 4 de la famille de domaine TBC1 (TBC1D4) Ser588, de l’AMPKα Thr172 et de l’acétyl-CoA carboxylase (ACC) Ser212 a été réalisée par la technique de transfert western (Figure 4). Comme prévu, la concentration d’insuline sous-maximale et maximalement efficace a induit une augmentation de la phosphorylation d’Akt Thr308 et de TBC1D4 Ser588 tandis que la contraction a induit une augmentation de la phosphorylation d’AMPKα Thr172 et d’ACC Ser212. Ni l’insuline ni la contraction n’ont entraîné de modification de la teneur totale en protéines d’Akt2, TBC1D4, AMPKα2 et ACC dans le soléus et le muscle EDL (Figure 4).

En examinant divers marqueurs de la viabilité métabolique du soléaire incubé et du muscle EDL, nous avons observé une réduction globale des niveaux de nucléotides d’adénosine (ATP, ADP, AMP) (~15-25%) ainsi que de créatine (~10-35%), que les muscles aient été incubés en présence de pyruvate ou de glucose par rapport aux muscles non incubés (Tableau 1 ). D’autre part, la baisse des niveaux de glycogène observée dans les muscles soléaires et EDL incubés avec du pyruvate a été évitée si les muscles étaient incubés avec du glucose. Fait intéressant cependant, nous avons observé que les niveaux d’inosine monophosphate (IMP) ont augmenté de plusieurs fois, mais seulement dans le muscle soléaire incubé. Les niveaux de IMP augmentent généralement dans le muscle pendant un stress métabolique sévère lorsque le muscle tente d’empêcher l’accumulation d’AMP en convertissant l’AMP en IMP afin de maintenir le rapport ATP / ADP28. Cela indique que le muscle soléaire est un peu plus sollicité métaboliquement que le muscle EDL pendant l’incubation. Cette notion est également étayée par les résultats d’une phosphorylation élevée d’AMPKα Thr172 et d’ACC Ser212 dans le muscle soléaire incubé avec du pyruvate (Figure 5). Il est important de noter que l’augmentation observée des niveaux d’IMP ainsi que la phosphorylation AMPKα Thr172 et ACC Ser212 diminuent lorsque le muscle soléaire est incubé avec du glucose. Par conséquent, il semble avantageux d’incuber le muscle squelettique isolé dans un tampon contenant du glucose pour minimiser les fluctuations des nucléotides d’adénosine et prévenir une baisse du glycogène musculaire lorsque les muscles sont incubés pendant une période prolongée. En ce qui concerne l’absorption de 2-désoxyglucose, nous avons des preuves suggérant que l’incubation des muscles pendant 6 à 8 h en présence de pyruvate augmentera les taux d’absorption du glucose basal / au repos. L’incubation des muscles dans un milieu contenant du glucose semble empêcher une telle augmentation de l’absorption de glucose (données non publiées).

Figure 1
Figure 1: Système d’incubation. (A) Système myographique avec quatre chambres d’incubation simples. (B) Crochets d’incubation personnalisés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Absorption du glucose dans le muscle squelettique mature isolé de souris. L’absorption de 2-désoxyglucose a été déterminée dans les muscles isolés du soléus (barres noires) et de l’EDL (barres grises) en réponse à une concentration d’insuline sous-maximale efficace (100 μU/mL), à une concentration d’insuline efficace maximale (10 mU/mL) et à des contractions induites électriquement (pouls de 0,2 ms, 100 Hz, 1 s/15s, 30 V, 10 min). Les données ont été analysées par le test des élèves au sein de chaque groupe. ###p<0.001, ##p<0.01 vs. muscle soléaire. Les valeurs sont des moyennes ± SEM. n = 4-6 par groupe. h, heure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Courbes de force musculaire en réponse à des contractions induites électriquement. La production de force maximale pendant la stimulation électrique a été calculée pour le muscle soleus (points noirs) et EDL (points gris). Chaque valeur correspond à une moyenne des 500 dernières ms de chaque période de stimulation de 1 s. Les valeurs sont des moyennes ± SEM. n = 5-6 par groupe. deuxièmement. mN, milli-Newton. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Transferts occidentaux représentatifs de la phosphorylation Akt Thr308, TBC1D4 Ser588, AMPKα Thr172 et ACC Ser212 ainsi que des protéines Akt2, TBC1D4, AMPKα2 et ACC. Des analyses par transfert western ont été effectuées sur les échantillons de muscles soléaire et EDL de souris décrits à la figure 2. B, basal. S, insuline sous-maximale efficace. M, insuline d’efficacité maximale. C, contraction. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Transferts occidentaux représentatifs de la phosphorylation AMPKα Thr172 et ACC Ser212 ainsi que des protéines AMPKα2 et ACC. Des analyses par transfert western ont été effectuées sur les échantillons de muscle soleus et EDL de souris décrits dans le tableau 1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

non incubé Incubé 1h avec du pyruvate Incubé 1h avec du glucose Principaux effets Interaction
Soléaire EDL Soléaire EDL Soléaire EDL
Lactate 1,00 ± 0,01 1,00 ± 0,02 0,96 ± 0,03 0,98 ± 0,02 1,05 ± 0,01 0,99 ± 0,01 - -
Cr 1,00 ± 0,04 1,00 ± 0,06 0,64 ± 0,07 ### 0,76 ± 0,05 ### 0,76 ± 0,07 ## 0,88 ± 0,09 ## p < 0,001 -
PCr 1,00 ± 0,19 1,00 ± 0,06 0,80 ± 0,12 1,13 ± 0,14 0,65 ± 0,31 0,75 ± 0,08 - -
PCr/(Cr + PCr) 1,00 ± 0,20 1,00 ± 0,07 1,17 ± 0,11 1,25 ± 0,12 0,78 ± 0,36 0,92 ± 0,11 - -
ATP 1,00 ± 0,03 1,00 ± 0,02 0.72 ± 0.03 ###,§§§ 0,99 ± 0,03 * 0,81 ± 0,06 ### 0,85 ± 0,04 ## - p < 0,001
ADP 1,00 ± 0,04 1,00 ± 0,04 0,75 ± 0,05 ### 0,92 ± 0,03 ### 0,84 ± 0,04 ## 0,86 ± 0,03 ## p < 0,001 -
AMPÈRE 1,00 ± 0,11 1,00 ± 0,12 0,85 ± 0,15 0,79 ± 0,13 0,84 ± 0,18 0,75 ± 0,13 - -
LUTIN 1,00 ± 0,17 1,00 ± 0,30 4.43 ± 0.67 ###,§§§ 0,72 ± 0,29 3.33 ± 1.25 ##,§ 1,08 ± 0,01 - p < 0,001
Rapport AMP/ATP 1,00 ± 0,12 1,00 ± 0,13 1,18 ± 0,22 0,81 ± 0,16 1,06 ± 0,23 0,90 ± 0,19 - -
Glycogène 1,00 ± 0,08 1,00 ± 0,12 0,74 ± 0,07 (#),* 0,80 ± 0,12 (#),* 1,12 ± 0,10 1,10 ± 0,03 p = 0,035 -
pAMPK Thr172 / AMPKα2 1,00 ± 0,10 1,00 ± 0,12 3.26 ± 0.58 ###,***,§§§ 1,55 ± 0,27 1,68 ± 0,19 # 1,36 ± 0,19 - p = 0,002
pACC Ser212 / ACC 1,00 ± 0,18 1,00 ± 0,12 2.22 ± 0.58 ###,**,§§ 0,96 ± 0,21 0,99 ± 0,15 0,83 ± 0,09 - p = 0,030

Tableau 1 : Comparaison de la viabilité métabolique des muscles soléaire et EDL de souris incubés pendant 1 heure en présence de 2 mM de pyruvate ou de 5 mM de glucose. Les muscles non incubés ont été disséqués à partir d’animaux anesthésiés et nourris avant d’être congelés dans de l’azote liquide. Des muscles séparés ont été incubés pendant 1 h dans un tampon KRH complété par du BSA (0,1%), du Na-pyruvate (2 mM) et du D-mannitol (8 mM) tandis que d’autres ont été incubés pendant 1 h dans un tampon KRH complété par du BSA (0,1%), du D-glucose (5 mM) et du D-mannitol (5 mM) avant d’être congelés dans de l’azote liquide. Les données ont été converties en unités relatives pour mettre en évidence les changements observés dans divers marqueurs de la viabilité métabolique. Les valeurs absolues des muscles soléaires et EDL de souris non incubés sont données ci-dessous. Lactate (mmol/kg l.c): 137,53soleus; 139.05EDL. Cr (mmol/kg l.w): 9,35soleus; 8.98EDL. PCr (mmol/kg l.c): 1,50soleus; 5.20EDL. PCr/(PCr+Cr) : 13,98soleus ; 37.30EDL. ATP (mmol/kg l.w): 3,07soleus; 4.24EDL. ADP (mmol/kg l.w): 0,60soleus; 0,51EDL. AMP (mmol/kg l.c): 0,18soleus; 0,08EDL. IMP (mmol/kg l.w): 0,07soleus; 0,14EDL. Rapport AMP/ATP : 0,06soleus ; 0,02EDL. Glycogène (protéine pmol/μg) : 77,01soleus ; 67,56EDL. Les données ont été analysées par une ANOVA bidirectionnelle au sein de chaque groupe. ###p<0.001, ##p<0.01 et #p<0.05 vs non incubé. p<0,001, **p<0,01 et *p<0,05 vs incubé 1 h avec du glucose. §§§p<0.001, §§p<0.01 et §p<0.05 vs EDL. Les valeurs sont des moyennes ± SEM. n = 12 dans le groupe non incubé, n = 4-6 dans les groupes incubés. Cr, créatine; PCr, Phosphocréatine; w.w, poids humide; h, heure.

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Discussion

Une régulation intacte de l’absorption du glucose dans le muscle squelettique est importante pour préserver la santé globale1. Ainsi, l’étude de l’absorption du glucose musculaire sert souvent de lecture primaire lors de l’évaluation de diverses interventions altérant la santé. Nous décrivons ici une méthode ex vivo pour mesurer l’absorption du glucose dans le soléus isolé et incubé et le muscle EDL de souris en réponse à l’insuline et aux contractions induites électriquement. La méthode est rapide et fiable et permet un contrôle précis du milieu environnant du muscle incubé qui permet des investigations précises des taux d’absorption de glucose musculaire isolés de l’influence potentiellement confondante des hormones et des substrats qui peuvent être trouvés dans le sang. La méthode est utilisée depuis plusieurs années dans de nombreuses études et est largement adoptée par la communauté de la recherche musculaire.

Le modèle d’incubation ex vivo a généralement été considéré comme une méthode pour évaluer la capacité de transport du glucose plutôt que l’absorption du glucose dans le muscle squelettique. La capacité de transport du glucose dans le muscle incubé peut être déterminée en mesurant le D-glucose accumulé sur une période de temps. Cependant, cela pose un problème car le D-glucose est rapidement métabolisé dans la cellule musculaire après absorption. Pour contourner ce problème, l’analogue du glucose 3-O-méthyl-D-glucose (3-MG) a été largement utilisé pour évaluer la capacité de transport du glucose, car le 3-MG n’est pas métabolisé à l’intérieur de la cellule après avoir été transporté à travers la membrane de surface cellulaire. Ainsi, le taux initial de 3-MG intracellulaire accumulé sert d’indice de la capacité de transport cellulaire du glucose en soi, car il n’est pas affecté par d’autres étapes des voies métaboliques du glucose. Cependant, l’utilisation du 3-MG peut constituer un problème car le 3-MG s’accumulera, réduisant ainsi le gradient transmembranaire pour le 3-MG et réduisant par la suite l’absorption ultérieure. Ainsi, pour obtenir une mesure de la capacité de transport membranaire, le taux initial d’absorption du 3-MG doit être estimé. En particulier lorsque la capacité de transport est élevée, cela peut poser un problème en raison de l’efflux de 3-MG du muscle29,30. Le problème potentiel avec l’efflux de 3-MG peut être évité en utilisant le 2-désoxy-D-glucose (2-DG). Après transport dans le muscle squelettique, le 2-DG est phosphorylé par l’hexokinase II en 2-désoxy-D-glucose-6-phosphate (2-DG-6P). Comme le muscle squelettique manque de glucose-6-phophatase et que GLUT4 ne peut pas transporter le 2-DG phosphorylé, le 2-DG-6P sera piégé dans la cellule musculaire. Contrairement au glucose-6-phosphate, le 2-DG-6P est un inhibiteur allostérique très faible de l’hexokinase II30 qui aide à maintenir le gradient transmembranaire de la 2-DG. Ainsi, les observations ont montré que l’absorption de 2-DG dans le muscle incubé (rat) reste linéaire jusqu’à ce que la concentration intracellulaire de 2-DG-6P dépasse 30 mM, une concentration qui abaisse l’activité de l’hexokinase II30. De plus, dans le muscle squelettique de souris incubé, l’absorption de 2-DG reste linéaire pendant environ 30 minutes lorsque les températures des tampons d’incubation sont de 37 ° C ou moins31. Cela suggère que le 2-DG peut être utilisé pour mesurer la capacité de transport du glucose plutôt que l’absorption du glucose dans les muscles incubés, sauf dans les situations où les concentrations de 2-DG-6P deviennent très élevées (par exemple, observées pendant les incubations >2 heures avec 1 mM 2-DG et une concentration maximale d’insuline29,30). L’idée que l’absorption de 2-DG reflète probablement la capacité de transport du glucose est également soutenue par des résultats montrant que l’absorption maximale de 2-DG stimulée par l’insuline est similaire dans les muscles incubés de souris de type sauvage et de souris qui surexpriment l’hexokinase II32. Une préoccupation potentielle lors de l’utilisation de 2-DG pour les mesures de transport du glucose musculaire pendant la contraction est une augmentation de la concentration intracellulaire de glucose-6-phosphate en raison d’un taux élevé de glycogénolyse. Cependant, étant donné qu’une augmentation linéaire de l’absorption du muscle (rat) 2-DG est observée pendant la contraction au cours du temps29, cela indique que l’accumulation de glucose-6-phosphate à partir de la dégradation du glycogène pendant la contraction n’interfère pas avec l’activité de l’hexokinase II et donc les taux d’absorption de 2-DG. Sur cette base, le 2-DG semble bien adapté aux mesures du transport du glucose dans le muscle squelettique isolé pendant l’insuline et la contraction compte tenu des limites du 3-MG.

Bien qu’il soit généralement supposé que le 2-DG n’est pas métabolisé après la phosphorylation par l’hexokinase II, il a été rapporté qu’une partie du 2-DG est dirigée vers et incorporée dans le glycogène musculaire. Ainsi, au cours d’une pince hyperinsulinémique normoglycémique de 2 h chez le rat ~ 30% du 2-DG absorbé par le muscle squelettique est incorporé dans le glycogène33. Par conséquent, on pourrait penser que les taux d’absorption de 2-DG stimulés par l’insuline dans le muscle squelettique incubé sont sous-estimés si l’accumulation de 2-DG dans le glycogène est négligée. Nous avons déterminé que le protocole décrit ici sur la façon de préparer les lysats musculaires (surnageants) pour des analyses ultérieures des taux d’absorption du 2-DG dans le muscle squelettique incubé antérieurement n’est pas affecté par l’incorporation potentielle de 2-DG dans le glycogène. On pourrait soutenir que le glycogène s’accumule dans la pastille lors de la centrifugation de l’homogénat musculaire entier pour générer du lysat pour les mesures d’absorption de 2-DG. Cependant, lorsque nous comparons les niveaux de radioactivité dans l’homogénat musculaire entier stimulé par l’insuline par rapport au lysat, nous ne détectons aucune différence significative (données non publiées). Cela suggère que l’incubation du muscle de la souris pendant 10 min dans 1 mM de 2-DG ne provoque pas une accumulation détectable de 2-DG dans le glycogène.

La détermination de l’absorption du muscle squelettique 2-DG sans tenir compte du fait que le 2-DG est distribué à la fois dans l’espace extra- et intracellulaire conduira à une surestimation de l’absorption du 2-DG. Pour contourner cela, le L-glucose doit être utilisé comme marqueur extracellulaire car il n’est pas transporté à travers la membrane cellulaire mais présente des propriétés similaires à celles du D-glucose, notamment la masse, la solubilité, la diffusion passive, la liaison, etc. En raison des coûts excessifs de fabrication et donc d’achat de L-glucose, le mannitol est généralement utilisé comme marqueur extracellulaire puisque le mannitol n’est pas absorbé par la cellule musculaire, est relativement peu coûteux et on estime qu’il a un volume de distribution extracellulaire quelque peu similaire à celui du glucose et du 2-DG34.

Les horloges cellulaires et moléculaires intrinsèques semblent jouer un rôle essentiel pour la régulation du métabolisme du corps entier et de l’homéostasie énergétique35. Il a été observé que l’élimination spécifique au muscle du gène de l’horloge centrale Bmal1 altère l’absorption du glucose stimulé par l’insuline dans le muscle squelettique isolé de la souris36. En outre, l’absorption sous-maximale de glucose stimulée par l’insuline du muscle squelettique isolé présente un rythme circadien avec la réponse à l’insuline la plus faible et la plus élevée au milieu de la phase claire et de la phase sombre, respectivement37. Sur la base de ces résultats, il est donc important d’intégrer le temps de sacrifice des animaux dans la conception expérimentale afin d’augmenter la reproductibilité des données.

Un inconvénient majeur de la méthode ex vivo est le manque de flux capillaire dans le muscle isolé. Cela signifie que l’administration et l’élimination de divers substrats dépendent entièrement d’une simple diffusion entre les fibres musculaires et l’environnement environnant. Par conséquent, la validation de la viabilité métabolique des muscles isolés incubés ex vivo s’est concentrée sur les limitations de diffusion de l’oxygène vers les fibres musculaires superficielles et profondes. Ainsi, le muscle incubé, en particulier le muscle de souris hautement métabolique, a tendance à développer des noyaux hypoxiques dans lesquels la dégradation du glycogène se produit 16,17,38. Dans un examen détaillé par Bonen et ses collègues15, il a été suggéré que les noyaux hypoxiques du muscle incubé se développent probablement lors de l’incubation d’un muscle trop épais pour être correctement oxygéné, en particulier lors de l’incubation à des températures de ≥ 37 ° C. Cela a conduit à la recommandation que seuls les muscles minces et cylindriques de la souris, tels que le soléaire et l’EDL, devraient être utilisés pour les incubations à 25-30 ° C afin d’éviter le développement de noyaux hypoxiques. Cela indique que l’épaisseur et la géométrie plutôt que la masse sont des facteurs importants à prendre en compte lors de l’incubation des muscles squelettiques de souris. En outre, il a été recommandé de mesurer la température d’incubation, l’épaisseur musculaire ainsi que la teneur en ATP, en phosphocréatine et en glycogène et/ou la libération de lactate afin d’évaluer la viabilité du muscle incubé15. À notre connaissance, de telles analyses complètes du muscle incubé ont principalement été rapportées pour le muscle rat 39,40,41,42 et seulement dans une mesure limitée rapportées pour le muscle de souris 16,17. Pour mieux comprendre divers marqueurs métaboliques de la viabilité dans le muscle squelettique de souris incubé, nous avons évalué les changements possibles dans le contenu intracellulaire du lactate, de la créatine, de la phosphocréatine, des nucléotides d’adénosine, du glycogène et de la signalisation AMPK dans le soléaire et le muscle EDL après 1 heure d’incubation dans un tampon KRH supplémenté en glucose ou en pyruvate. Semblable aux résultats précédents dans le soléaire de souris incubé et le muscle EDL17, nous avons observé que les niveaux de glycogène diminuaient lorsque les muscles étaient incubés dans des milieux sans glucose. Cela indique que l’absence de glucose pendant l’incubation favorise la dégradation du glycogène et l’entrée ultérieure du glucose-6-phosphate dans la glycolyse qui peut agir pour sécuriser la production d’ATP en particulier si l’apport en oxygène est insuffisant. De plus, nous avons constaté une réduction globale des pools de nucléotides ATP et ADP dans le soléaire incubé et le muscle EDL. Cela peut impliquer que l’apport en oxygène n’est pas entièrement suffisant pour répondre à la demande de muscle de souris incubé à la fois en présence et en absence de glucose. Étant donné que le muscle oxydatif du soléaire dépend davantage de l’oxygène pour la production d’ATP que le muscle glycolytique EDL, cela suggère que le muscle soléaire est affecté dans une plus grande mesure par la procédure d’incubation. En accord, nous avons constaté que les niveaux intracellulaires d’IMP ainsi que la signalisation AMPK étaient nettement augmentés dans le soléaire par rapport au muscle EDL lorsqu’il était incubé en l’absence de glucose. Cela signifie que le muscle soléaire présente un degré plus élevé de stress métabolique pendant l’incubation, ce qui doit être pris en considération lors de l’évaluation des données du modèle musculaire de souris ex vivo.

Les cellules musculaires cultivées, y compris les L6 et C2C12 immortalisés, ainsi que les myotubes humains primaires, sont couramment utilisées comme substitut du muscle squelettique mature pour étudier les effets de diverses manipulations génétiques et pharmacologiques sur l’absorption de glucose musculaire stimulé par l’insuline. Cependant, à plusieurs égards, les cellules musculaires cultivées ne ressemblent pas au muscle squelettique mature et, lors de la comparaison des deux systèmes modèles, de nombreuses différences deviennent apparentes. Ceux-ci incluent des différences dans l’expression des protéines, la structure dimensionnelle, l’environnement environnant, l’état de prolifération et de différenciation, la composition du type de fibre, les processus métaboliques et les propriétés fonctionnelles43 qui peuvent tous affecter la façon dont la cellule musculaire régule l’absorption du glucose en réponse à divers stimuli. En règle générale, des effets relatifs plus importants de l’insuline sur les taux d’absorption du glucose sont observés dans les muscles squelettiques matures par rapport aux cellules musculaires cultivées44 , ce qui peut indiquer que les cellules musculaires cultivées manquent dans une certaine mesure de la machinerie responsable de la régulation des taux d’absorption du glucose, y compris un niveau élevé d’expression du transporteur de glucose sensible à l’insuline GLUT443 . Compte tenu des limites et des mises en garde associées à l’utilisation de cellules musculaires cultivées et de muscles squelettiques isolés, il est donc probablement avantageux d’adopter une approche combinée lors de l’étude de divers processus métaboliques musculaires tels que l’absorption du glucose.

Les muscles soléaires et EDL sont généralement considérés comme représentatifs des muscles à contraction lente et rapide, respectivement. Par conséquent, ces types de muscles sont idéaux pour les études mécaniques qui cherchent à étudier les interventions qui affectent la force musculaire et le développement de la fatigue. De plus, le muscle soléaire est généralement signalé pour avoir une sensibilité et une réactivité à l’insuline améliorées par rapport au muscle EDL et, par conséquent, les interventions qui ciblent la sensibilité musculaire à l’insuline peuvent affecter le soléaire et l’EDL différemment. En outre, la distribution relative des différents complexes AMPK diffère entre le soléaire et le muscle EDL, ce qui semble affecter la capacité des composés activateurs AMPK à augmenter l’absorption du glucose musculaire. Ainsi, la meilleure compréhension de la régulation de l’absorption du glucose musculaire est probablement obtenue si les muscles soléaire et EDL sont utilisés lors de l’expérimentation avec le modèle d’incubation ex vivo.

La méthode décrite ici relie l’absorption du glucose à la quantité d’abondance totale de protéines déterminée dans chaque échantillon musculaire après homogénéisation. D’après notre expérience, la variation diminue lorsqu’on associe l’absorption de glucose par quantité de protéines musculaires au lieu du poids musculaire (données non publiées). De plus, l’homogénéisation d’échantillons musculaires dans un tampon utilisé pour divers tests biochimiques permet de déterminer à la fois l’absorption du glucose, la signalisation myocellulaire et les activités enzymatiques dans la même préparation d’échantillon45,46. Cela diminuera souvent la quantité de souris utilisées pour une étude. Néanmoins, l’absorption du glucose peut facilement être déterminée dans les échantillons de muscles squelettiques qui sont dissous par chauffage dans de l’hydroxyde de sodium (NaOH) suivi d’une neutralisation avec du chlorure d’hydrogène20. Étant donné que le traitement du muscle avec NaOH interfère avec les mesures de la concentration totale en protéines musculaires, le transport du glucose mesuré par cette procédure doit être lié au poids musculaire.

Sur la base de diverses optimisations, notre tampon d’incubation d’absorption du glucose contient une activité spécifique de 0,028 MBq/mL de [3H]2-désoxy-D-glucose et de 0,0083 MBq/mL de [14C]Mannitol. D’une part, cela réduit la quantité de lysat (150 sur 400 μL) nécessaire pour obtenir des mesures de radioactivité suffisantes et fiables. D’autre part, il augmente la quantité de [3H]2-désoxy-D-glucose radioactif et de [14C]mannitol nécessaires pour chaque expérience, ce qui augmente les coûts expérimentaux. Ainsi, pour toute installation expérimentale, il est possible de réguler la quantité de radioactivité utilisée dans le milieu d’incubation de l’absorption du glucose pour répondre à des exigences spécifiques. Cependant, il faut veiller à ne pas diminuer la quantité de radioactivité dans le tampon d’incubation dans une mesure qui rend les mesures de la radioactivité peu fiables. Ceci est assuré en maintenant la radioactivité dans les échantillons au-dessus des limites de détection spécifiées de la machine de comptage de scintillation liquide utilisée.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions du Conseil danois pour la recherche indépendante - Sciences médicales (FSS8020-00288B) et de la Fondation Novo Nordisk (NNF160C0023046). Ce travail a également été soutenu par une subvention de recherche à Rasmus Kjøbsted de l’Académie danoise du diabète, qui est financée par la Fondation Novo Nordisk, numéro de subvention NNF17SA0031406. Les auteurs tiennent à remercier Karina Olsen, Betina Bolmgren et Irene Bech Nielsen (Département de nutrition, d’exercice et de sport, Faculté des sciences, Université de Copenhague) pour leur assistance technique qualifiée.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[14C]D-mannitol American Radiolabeled Chemicals, Inc. ARC 0127
[3H]2-deoxy-D-glucose  American Radiolabeled Chemicals, Inc. ART 0103A
2-Deoxy-D-glucose Sigma D8375
4-0 USP non-sterile surgical nylon suture Harvard Apparatus 51-7698
Streptavidin/HRP (Conjugate) DAKO P0397 Used to detect ACC protein
Akt2 antibody Cell Signaling 3063
AMPKα2 antibody Santa Cruz SC-19131
aprotinin Sigma A1153
benzamidine Sigma B6505
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7030
CaCl2 Merck 1020831000
Calibration kit (force) Danish Myo Technology A/S 300041
Chemiluminescence Millipore WBLUF0500
D-Glucose Merck 1084180100
D-Mannitol Sigma M4125
Data collection program National Instruments LabVIEW software version 7.1
Dialysis tubing Visking DTV.12000.09 Size No.9
Digital imaging system BioRad ChemiDoc MP
EDTA Sigma EDS E9884
EGTA Sigma E4378
Electrical Pulse Stimulator Digitimer D330 MultiStim System
Glycerol Sigma G7757
HEPES Sigma H7637
IGEPAL CA-630  Sigma I8896
Insulin Novo Nordisk Actrapid, 100 IE/mL
KCl Merck 1049361000
KH2PO4 Merck 104873025
leupeptin Sigma L2884
MgSO4 Merck 1058860500
Muscle Strip Myograph System Danish Myo Technology A/S Model 820MS
Na-Orthovanadate Sigma S6508
Na-Pyrophosphate Sigma 221368
Na-Pyruvate Sigma P2256
NaCl Merck 106041000
NaF Sigma S1504
NaHCO3 VWR 27778260
pACC Ser212 antibody Cell Signaling 3661
pAkt Thr308 antibody Cell Signaling 9275
pAMPK Thr172 antibody Cell Signaling 2531
phenylmethylsulfonylfluoride Sigma P7626
Platinum electrodes Danish Myo Technology A/S 300145
pTBC1D4 Ser588 antibody Cell Signaling 8730
Scintillation counter Perkin Elmer Tri-Carb-2910TR
Scintillation fluid  Perkin Elmer 6013329
Statistical analyses software Systat SigmaPlot version 14
TBC1D4 antibody Abcam ab189890
TissueLyser II  Qiagen 85300
Ultrapure water Merck Milli-Q Reference A+ System
β-glycerophosphate Sigma G9422

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Biologie numéro 171 muscle squelettique transport du glucose absorption du glucose sensibilité à l’insuline contraction explantation ex vivo in vitro incubation traceurs de glucose radioactifs 2-désoxy-D-glucose
Mesure de l’absorption de glucose stimulée par l’insuline et la contraction dans le muscle squelettique mature isolé et incubé de souris
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Kjøbsted, R., Kido, K., Larsen, … More

Kjøbsted, R., Kido, K., Larsen, J. K., Jørgensen, N. O., Birk, J. B., Hellsten, Y., Wojtaszewski, J. F. P. Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice. J. Vis. Exp. (171), e61398, doi:10.3791/61398 (2021).

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