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Biology

इंसुलिन का माप- और संकुचन-प्रेरित ग्लूकोज चूहों से पृथक और ऊष्मायन परिपक्व कंकाल की मांसपेशी में अपटेक

Published: May 16, 2021 doi: 10.3791/61398
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Section of Molecular Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports, University of Copenhagen, 2Section of Integrative Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports, University of Copenhagen

Summary

पूरे शरीर के ग्लूकोज होमियोस्टैसिस को बनाए रखने के लिए मांसपेशियों के ग्लूकोज अपटेक का बरकरार विनियमन महत्वपूर्ण है। यह प्रोटोकॉल इंसुलिन का आकलन प्रस्तुत करता है- और संकुचन-प्रेरित ग्लूकोज अपटेक पृथक और इनक्यूबेटेड परिपक्व कंकाल की मांसपेशी में जब पूरे शरीर के ग्लूकोज चयापचय पर विभिन्न शारीरिक हस्तक्षेपों के प्रभाव को चित्रित करता है।

Abstract

कंकाल की मांसपेशी एक इंसुलिन-उत्तरदायी ऊतक है और आमतौर पर अधिकांश ग्लूकोज लेती है जो भोजन के बाद रक्त में प्रवेश करती है। इसके अलावा, यह बताया गया है कि कंकाल की मांसपेशी आराम की स्थिति की तुलना में व्यायाम के दौरान रक्त से ग्लूकोज के निष्कर्षण को 50 गुना तक बढ़ा सकती है। व्यायाम और इंसुलिन उत्तेजना के दौरान मांसपेशियों में ग्लूकोज अपटेक में वृद्धि इंट्रासेल्युलर डिब्बों से मांसपेशी कोशिका सतह झिल्ली तक ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर 4 (GLUT4) के स्थानांतरण पर निर्भर करती है, साथ ही साथ हेक्सोकाइनेज II द्वारा ग्लूकोज -6-फॉस्फेट के लिए ग्लूकोज के फॉस्फोराइलेशन पर निर्भर करती है। अलगाव और माउस की मांसपेशियों का इनक्यूबेशन जैसे कि m. soleus और m. extensor digitorum longus (EDL) परिपक्व कंकाल की मांसपेशियों में ग्लूकोज अपटेक पर इंसुलिन और विद्युत-प्रेरित संकुचन (व्यायाम के लिए एक मॉडल) के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त पूर्व विवो मॉडल है। इस प्रकार, पूर्व विवो मॉडल मांसपेशियों की इंसुलिन संवेदनशीलता के मूल्यांकन की अनुमति देता है और संकुचन के दौरान मांसपेशियों के बल उत्पादन से मेल खाना संभव बनाता है जो मांसपेशियों के ग्लूकोज अपटेक के माप के दौरान मांसपेशियों के तंतुओं की समान भर्ती सुनिश्चित करता है। इसके अलावा, वर्णित मॉडल औषधीय यौगिक परीक्षण के लिए उपयुक्त है जिसका मांसपेशियों की इंसुलिन संवेदनशीलता पर प्रभाव पड़ सकता है या कंकाल की मांसपेशी ग्लूकोज अपटेक की नियामक जटिलता को चित्रित करने की कोशिश करते समय मदद मिल सकती है।

यहां हम वर्णन करते हैं और एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं कि कैसे इंसुलिन को मापने के लिए- और संकुचन-प्रेरित ग्लूकोज अपटेक को अलग-थलग और इनक्यूबेटेड सोलस और ईडीएल मांसपेशियों की तैयारी में चूहों से रेडियोलेबल [3एच] 2-डीऑक्सी-डी-ग्लूकोज और [14सी] मैनिटोल का उपयोग करके एक एक्स्ट्रासेल्युलर मार्कर के रूप में। यह उलझन कारकों की अनुपस्थिति में परिपक्व कंकाल की मांसपेशियों में ग्लूकोज अपटेक के सटीक मूल्यांकन की अनुमति देता है जो बरकरार पशु मॉडल में हस्तक्षेप कर सकते हैं। इसके अलावा, हम इनक्यूबेटेड माउस कंकाल की मांसपेशियों की चयापचय व्यवहार्यता के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं जो यह सुझाव देते हैं कि लागू की गई विधि में मांसपेशियों की ऊर्जा चयापचय का अध्ययन करते समय कुछ शर्तों के तहत कुछ चेतावनी होती है।

Introduction

कंकाल की मांसपेशी में इंसुलिन और व्यायाम के जवाब में बाहरी स्थान से बड़ी मात्रा में ग्लूकोज निकालने की क्षमता होती है। यह पूरे शरीर के ग्लूकोज होमियोस्टैसिस को बनाए रखने में मदद करता है और उच्च ऊर्जा की मांग के समय के दौरान ग्लूकोज की आपूर्ति को सुरक्षित करता है। चूंकि कंकाल की मांसपेशी ग्लूकोज अपटेक के बरकरार विनियमन को समग्र स्वास्थ्य और शारीरिक प्रदर्शन 1,2 के लिए महत्वपूर्ण दिखाया गया है, इसलिए विभिन्न स्थितियों के दौरान मांसपेशियों के ग्लूकोज अपटेक के माप पर बहुत ध्यान दिया गया है। मनुष्यों और जानवरों में, हाइपरइन्सुलिनेमिक-यूग्लाइसेमिक क्लैंप का उपयोग विवो 3,4 में इंसुलिन संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए सोने की मानक तकनीक के रूप में किया गया है। एक मौखिक ग्लूकोज सहिष्णुता परीक्षण से प्राप्त निष्कर्षों के विपरीत, हाइपरइन्सुलिनेमिक-यूग्लाइसेमिक क्लैंप तकनीक को अग्न्याशय से बरकरार गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल फ़ंक्शन या इंसुलिन स्राव की आवश्यकता नहीं होती है और इस प्रकार इंसुलिन प्रतिक्रियाओं को उन विषयों के बीच तुलना करने की अनुमति देता है जो गैस्ट्रो-आंतों और / या अग्नाशय के कार्य में भिन्नता प्रदर्शित करते हैं। मनुष्यों में व्यायाम के दौरान विवो में मांसपेशियों के ग्लूकोज अपटेक के माप 1960 के दशक के बाद से अक्सर किए गएहैं। पहले धमनीशिरापरक संतुलन तकनीकों के उपयोग से6 और बाद में पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी) इमेजिंग के उपयोग से एक पॉज़िट्रॉन उत्सर्जक ग्लूकोज एनालॉग जैसे 18एफ-फ्लोरो-डीऑक्सी-ग्लूकोज7 के साथ संयोजन में। कृन्तकों में, विवो में व्यायाम-प्रेरित मांसपेशी ग्लूकोज अपटेक आमतौर पर रेडियोधर्मी या स्थिर आइसोटोप-लेबल ग्लूकोज एनालॉग्स 8,9,10 के उपयोग से किया जाता है।

विवो में मांसपेशियों के ग्लूकोज अपटेक के माप के लिए एक पूरक विधि, कृन्तकों से छोटी मांसपेशियों को अलग करना और इनक्यूबेट करना है और बाद में रेडियोधर्मी या स्थिर आइसोटोप-लेबल ग्लूकोज एनालॉग्स11,12,13 का उपयोग करके ग्लूकोज अपटेक को मापना है। यह विधि परिपक्व कंकाल की मांसपेशियों में ग्लूकोज अपटेक दरों के सटीक और विश्वसनीय परिमाणीकरण की अनुमति देती है और विभिन्न इंसुलिन सांद्रता की उपस्थिति में और विद्युत उत्तेजना द्वारा प्राप्त संकुचन के दौरान की जा सकती है। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि अलग-थलग और इनक्यूबेटेड कंकाल की मांसपेशियों में ग्लूकोज अपटेक के माप प्रासंगिक हैं जब चूहों की मांसपेशियों के चयापचय फेनोटाइप की जांच की जाती है जो विभिन्न हस्तक्षेपों (जैसे पोषण, शारीरिक गतिविधि, संक्रमण, चिकित्सीय) से गुजरचुके हैं। पृथक कंकाल मांसपेशी मॉडल भी औषधीय यौगिक परीक्षण के लिए एक उपयुक्त उपकरण है जो प्रति से ग्लूकोज अपटेक को प्रभावित कर सकता है और / या इंसुलिन संवेदनशीलता12,14 को संशोधित कर सकता है। इस तरह, मांसपेशियों के ग्लूकोज चयापचय को विनियमित करने के लिए डिज़ाइन किए गए यौगिकों की प्रभावकारिता का परीक्षण किया जा सकता है और पूर्व-नैदानिक पशु मॉडल में विवो परीक्षण में बाद में होने से पहले एक अत्यधिक नियंत्रित परिवेश में मूल्यांकन किया जा सकता है।

कुछ शर्तों के तहत, चयापचय व्यवहार्यता पृथक और ऊष्मायन कंकाल मांसपेशी मॉडल प्रणाली में एक चुनौती पैदा कर सकती है। दरअसल, इनक्यूबेटेड मांसपेशियों में एक संचार प्रणाली की कमी पर जोर देती है कि सब्सट्रेट (जैसे ऑक्सीजन और पोषक तत्व) का वितरण पूरी तरह से मांसपेशियों के तंतुओं और आसपास के वातावरण के बीच सरल प्रसार पर निर्भर करता है। इसके संबंध में, यह महत्वपूर्ण है कि इनक्यूबेटेड मांसपेशियां छोटी और पतली होती हैं और इस प्रकार,15 इनक्यूबेशन के दौरान ऑक्सीजन प्रसार के लिए एक बाधा का कम प्रतिनिधित्व करती हैं। विशेष रूप से कई घंटों के लिए लंबे समय तक ऊष्मायन के दौरान, हाइपोक्सिक राज्य अपर्याप्त ऑक्सीजन की आपूर्ति के कारण विकसित हो सकते हैं जिसके परिणामस्वरूप मांसपेशियों की ऊर्जा में कमीहोती है। यद्यपि इनक्यूबेटेड चूहे की मांसपेशियों में चयापचय व्यवहार्यता के विभिन्न मार्करों को पहले महत्वपूर्ण चर की पहचान के साथ रिपोर्ट किया गया है जो चूहे की मांसपेशियों की व्यवहार्यता को बनाए रखने में मदद करते हैं15, छोटे इनक्यूबेटेड माउस की मांसपेशियों में चयापचय व्यवहार्यता का एक व्यापक मूल्यांकन अभी भी वारंट किया गया है। इसलिए, वर्तमान में, ग्लाइकोजन सामग्री का उपयोग मुख्य रूप से इनक्यूबेटेड माउस कंकाल की मांसपेशी16,17 में चयापचय व्यवहार्यता के मार्कर के रूप में किया गया है।

यहां हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जो बेसल, इंसुलिन- और संकुचन-प्रेरित ग्लूकोज अपटेक को मापने के लिए अलग-थलग और इनक्यूबेटेड सोलस और ईडीएल मांसपेशी में रेडियोलेबल [3एच] 2-डीऑक्सी-डी-ग्लूकोज और [14सी] मैनिटोल का उपयोग करके चूहों से एक बाहरी मार्कर के रूप में उपयोग करता है। वर्तमान अध्ययन में, ग्लूकोज अपटेक को 10 मिनट की अवधि के दौरान मापा गया था और विधि को उप-अधिकतम और अधिकतम प्रभावी इंसुलिन सांद्रता के साथ-साथ एक एकल संकुचन प्रोटोकॉल के उपयोग के साथ प्रस्तुत किया गया है। हालांकि, यहां वर्णित प्रोटोकॉल को आसानी से इनक्यूबेशन समय, इंसुलिन-खुराक और विद्युत उत्तेजना प्रोटोकॉल के संबंध में संशोधित किया जा सकता है। इसके अलावा, हम incubated soleus और EDL माउस मांसपेशी में चयापचय व्यवहार्यता के विभिन्न मार्करों की एक पूरी तरह से लक्षण वर्णन प्रदान करते हैं। परिणामों से संकेत मिलता है कि इनक्यूबेशन बफर के लिए ग्लूकोज पूरकता 1 घंटे के लिए ऊष्मायन की मांसपेशियों की चयापचय व्यवहार्यता को संरक्षित करने के लिए आवश्यक है।

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Protocol

अनुसंधान जानवरों से जुड़ी प्रक्रियाओं को प्रासंगिक दिशानिर्देशों और स्थानीय कानून के अनुसार किया जाना चाहिए। इस अध्ययन के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी पशु प्रयोगों ने प्रायोगिक और अन्य वैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए उपयोग किए जाने वाले कशेरुक जानवरों के संरक्षण के लिए यूरोपीय सम्मेलन का अनुपालन किया और डेनिश पशु प्रयोग निरीक्षक द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. प्रयोगात्मक उपकरण और टांका छोरों की तैयारी

नोट: इस अध्ययन के लिए, अलग-थलग माउस कंकाल की मांसपेशियों (चित्रा 1) को इनक्यूबेट करने के लिए अनुकूलित इनक्यूबेशन हुक के साथ एक एकीकृत मांसपेशी पट्टी मायोग्राफ सिस्टम का उपयोग करें। यह प्रणाली मांसपेशियों को निरंतर ऑक्सीकरण (95% O 2 और 5% CO 2) और स्थिर तापमान पर एक शारीरिक समाधान में स्नान करने की अनुमति देती है। मांसपेशियों के ऊतक स्नान को संकुचन के दौरान मांसपेशियों के बल उत्पादन के माप के लिए एक बल ट्रांसड्यूसर के साथ जोड़ा जाता है। संकुचन के दौरान मायो-मैकेनिकल प्रतिक्रियाओं को प्राप्त करने और रिकॉर्ड करने के लिए, क्रमशः एक विद्युत पल्स उत्तेजक और एक डेटा संग्रह कार्यक्रम को नियोजित करें। इनक्यूबेटेड मांसपेशियों को प्लैटिनम इलेक्ट्रोड द्वारा अनुबंधित करने के लिए उत्तेजित करें जो केंद्रीय रूप से और मांसपेशियों के दोनों किनारों पर स्थित हैं।

  1. 30 डिग्री सेल्सियस के लिए मायोग्राफ सिस्टम और गर्म कक्षों को चालू करें। मायोग्राफ सिस्टम के साथ संगत डेटा संग्रह सॉफ़्टवेयर खोलें और डेटासेट के बीच तुलनात्मकता सुनिश्चित करने के लिए बल ट्रांसड्यूसर को कैलिब्रेट करें।
  2. गैर अवशोषित सर्जिकल नायलॉन टांका के ~ 16 सेमी किस्में काटने से शुरू करो. एक एकल स्ट्रैंड से व्यास में लगभग 0.4 सेमी का लूप बनाने के लिए संदंश का उपयोग करें। इसे तब तक दोहराएं जब तक कि पर्याप्त छोरों का उत्पादन नहीं हो जाता है। प्रत्येक मांसपेशी को दो छोरों की आवश्यकता होती है - एक समीपस्थ के लिए और एक डिस्टल कण्डरा के लिए।

2. समाधान और इनक्यूबेशन मीडिया की तैयारी

  1. बेसल इनक्यूबेशन मीडिया की तैयारी
    1. निम्नलिखित स्टॉक समाधान तैयार करें: 2.5 एम सोडियम क्लोराइड (NaCl, 250 mL), 0.5 M सोडियम बाइकार्बोनेट (NaHCO3, 250 mL), 0.5 M पोटेशियम क्लोराइड (KCl, 50 mL), 0.25 M कैल्शियम क्लोराइड (CaCl2, 50 mL),0.25M पोटेशियम डाइहाइड्रोजन फॉस्फेट (KH 2 PO4, 50 mL), 0.25 M मैग्नीशियम सल्फेट (MgSO 4, 50 mL), 0.25 M मैग्नीशियम सल्फेट (MgSO 4, 50 mL), 0.25 M मैग्नीशियम सल्फेट (MgSO4, 50 mL) 100 mL), 500 mM D-mannitol (100 mL), 1 M 2-deoxy-D-glucose (4 mL), गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (BSA) का 15% समाधान क्रेब्स-रिंगर-हेन्सेलेट (KRH) बफर (चरण 4 में नीचे वर्णित) (100 mL) के खिलाफ डायलाइज़ किया गया।
      नोट: आराम और संकुचन-प्रेरित ग्लूकोज अपटेक को मापने के लिए दो समाधानों की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, इंसुलिन-प्रेरित ग्लूकोज अपटेक का आकलन करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रत्येक एकल इंसुलिन एकाग्रता को दो समाधानों की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, कुल छह अलग-अलग समाधानों में बेसल, सबमैक्सिमम इंसुलिन-, अधिकतम इंसुलिन-, और अलग-थलग माउस कंकाल की मांसपेशियों में संकुचन-प्रेरित ग्लूकोज अपटेक को मापने की आवश्यकता होती है। निम्नलिखित में, 'बेसल इनक्यूबेशन मीडिया' इंसुलिन या रेडियोधर्मी अनुरेखकों के बिना मीडिया को संदर्भित करता है। 'इनक्यूबेशन मीडिया' इंसुलिन युक्त मीडिया को संदर्भित करता है। 'ग्लूकोज अपटेक इनक्यूबेशन मीडिया' का तात्पर्य 'इनक्यूबेशन मीडिया' में उपयोग किए जाने वाले समान एकाग्रता पर इंसुलिन के अलावा 2-डीऑक्सी-डी-ग्लूकोज और रेडियोधर्मी अनुरेखक वाले मीडिया से है।
    2. NaCl (117 mM), NaHCO3 (24.6mM), KCl (4.7 mM), CaCl 2 (2.5 mM), KH2 PO4 (1.2 mM), और MgSO4 (1.2 mM) के साथ अल्ट्राप्योर पानी (ddH 2 O) के पूरक द्वारा एक KRH बफर तैयार करें। इसके बाद, कम से कम 10 मिनट के लिए 95% O2 और 5% CO2 के साथ KRH बफर को गैस करें। KRH बफर का वांछित pH 30 °C पर 7.35-7.45 के बीच होना चाहिए। यदि पीएच समायोजन कमरे के तापमान पर किया जाता है, तो केआरएच बफर का पीएच 7.25-7.35 के बीच होना चाहिए।
    3. बेसल इनक्यूबेशन मीडिया को पूरा करने के लिए गैसऔर पीएच-समायोजित केआरएच बफर में बीएसए (0.1%), ना-पाइरूवेट (2 एमएम), और डी-मैनिटोल (8 एमएम) जोड़ें। ओ 2और सीओ 2 के degasification को कम करने और 30 डिग्री सेल्सियस पर मीडिया रखने के लिए एक सील कंटेनर में बेसल इनक्यूबेशन मीडिया स्टोर करें।
      नोट: आमतौर पर, केआरएच की खुराक (यानी ना-पाइरूवेट, डी-मैनिटोल और डी-ग्लूकोज) की ऑस्मोलेरिटी को मांसपेशियों की कोशिकाओं के संकोचन या विस्तार से बचने के लिए एक पूरे प्रयोग में स्थिर रखा जाता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल केआरएच की खुराक के लिए 10 एमएम की एक ऑस्मोलेरिटी का उपयोग करता है। यदि ग्लूकोज युक्त बफर की आवश्यकता होती है, तो आवश्यकताओं को समायोजित करने के लिए केआरएच की खुराक को बदलें, उदाहरण के लिए 5 एमएम डी-ग्लूकोज और 5 एमएम डी-मैनिटोल।
    4. इनक्यूबेशन बफर में संभावित बीएसए-संबद्ध संदूषकों से बचने के लिए, केआरएच के खिलाफ बीएसए को डायलाइज़ करें।
      1. केआरएच बफर के खिलाफ 15% बीएसए स्टॉक समाधान डायलाइज़्ड बनाने के लिए, केआरएच बफर के 900 मिलीलीटर में विश्लेषणात्मक ग्रेड वसा मुक्त बीएसए के 300 ग्राम को भंग करके शुरू करें। इसके बाद, डायलिसिस ट्यूब को फिर से स्थापित पानी में तब तक उबालें जब तक कि टयूबिंग नरम न हो जाए।
      2. BSA-KRH समाधान के साथ टयूबिंग भरें और टयूबिंग सिरों को सुरक्षित करें। BSA-KRH के साथ टयूबिंग को KRH बफर के 5 L में रखें और इसे 4 °C पर रात भर छोड़ दें। अगले दिन KRH बफर को बदलें और 4 °C पर रात भर KRH बफर में BSA-KRH के साथ टयूबिंग छोड़ दें।
      3. अंत में, टयूबिंग से बीएसए-केआरएच समाधान एकत्र करें और 2 एल (यानी, 15% बीएसए-केआरएच स्टॉक समाधान) की अंतिम मात्रा में केआरएच बफर जोड़ें। 15% BSA-KRH स्टॉक समाधान को एलीकोट में विभाजित करें और फ्रीजर में ~ -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. इंसुलिन युक्त इनक्यूबेशन मीडिया की तैयारी
    1. एक submaximally प्रभावी इंसुलिन एकाग्रता युक्त इनक्यूबेशन मीडिया के लिए, बेसल इनक्यूबेशन मीडिया (100 μU / mL इंसुलिन) के प्रति mL प्रति mU / mL इंसुलिन स्टॉक समाधान के 1 μL जोड़ें।
    2. अधिकतम प्रभावी इंसुलिन एकाग्रता वाले इनक्यूबेशन मीडिया के लिए, बेसल इनक्यूबेशन मीडिया (10 mU / mL इंसुलिन) के प्रति एमएल 10 U / mL इंसुलिन स्टॉक समाधान का 1 μL जोड़ें।
  3. मीडिया इनक्यूबेशन ग्लूकोज अपटेक की तैयारी
    सावधानी: रेडियोधर्मी सामग्री की हैंडलिंग को केवल अधिकृत कर्मियों द्वारा एक प्रतिबंधित और नियंत्रित क्षेत्र में अनुमति दी जाती है और कुछ विश्वविद्यालयों, अनुसंधान संस्थानों और कंपनियों को "रेडियोधर्मिता उपयोग परमिट" के अधिग्रहण की आवश्यकता हो सकती है। सामग्री और अपशिष्ट को उचित स्थानीय प्रक्रियाओं, दिशानिर्देशों और कानून के अनुसार संभाला जाना चाहिए।
    1. अनुभाग 2.1.2 में वर्णित के रूप में एक ही प्रक्रिया का पालन करें।
    2. गैस और पीएच-समायोजित केआरएच बफर में बीएसए (0.1%), ना-पाइरूवेट (2 एमएम), डी-मैनिटोल (7 एमएम), और 2-डीऑक्सी-डी-ग्लूकोज (1 एमएम) जोड़ें।
    3. ग्लूकोज अपटेक इनक्यूबेशन मीडिया को पूरा करने के लिए पूरक केआरएच बफर में [3H]2-deoxy-D-glucose (0.028 MBq/mL) और [14C] mannitol (0.0083 MBq/mL) जोड़ें। 30 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। यदि [3H]2-deoxy-D-glucose और [14C] mannitol इथेनॉल में भंग कर रहे हैं, तो उपयोग से पहले N2 मध्यस्थता वाष्पीकरण द्वारा इथेनॉल को हटा दें।
    4. ग्लूकोज अपटेक इनक्यूबेशन मीडिया के लिए जिसमें एक submaximally प्रभावी इंसुलिन एकाग्रता होती है, एक 100 mU / mL इंसुलिन स्टॉक समाधान के 1 μL प्रति mL ग्लूकोज अपटेक इनक्यूबेशन मीडिया (100 μU / mL इंसुलिन) जोड़ें।
    5. अधिकतम प्रभावी इंसुलिन एकाग्रता वाले मीडिया इनक्यूबेशन ग्लूकोज अपटेक के लिए, ग्लूकोज अपटेक इनक्यूबेशन मीडिया (10 mU / mL इंसुलिन) के प्रति एमएल 10 यू / एमएल इंसुलिन स्टॉक समाधान का 1 μL जोड़ें।

3. जानवरों और माउस soleus और ईडीएल मांसपेशी के विच्छेदन के लिए इनक्यूबेशन

नोट: अनुसंधान जानवरों से जुड़ी प्रक्रियाओं को प्रासंगिक दिशानिर्देशों और स्थानीय कानून के अनुसार किया जाना चाहिए। वर्णित प्रक्रिया का उपयोग विभिन्न उपभेदों और आनुवंशिक पृष्ठभूमि के इन-हाउस नस्ल या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नर और मादा चूहों के साथ किया जा सकता है। खिलाया महिला C57Bl / 6J चूहों के लिए निम्नलिखित प्रक्रिया प्रदान की जाती है। औसतन, चूहे 19 सप्ताह के थे और उनका वजन 25 ग्राम था। चूहों को मानक कृंतक चाउ और पानी तक मुफ्त पहुंच के साथ 12: 12 घंटे के प्रकाश-अंधेरे चक्र पर बनाए रखा गया था। पशु प्रयोगों को स्थानीय समयानुसार सुबह 9:00 बजे शुरू किया गया था और सभी जानवरों को 2 घंटे की अवधि के भीतर बलिदान किया गया था।

  1. प्रत्येक इनक्यूबेशन कक्ष में 4 मिलीलीटर पूर्व-गर्म (30 डिग्री सेल्सियस) बेसल इनक्यूबेशन मीडिया जोड़ें और सुनिश्चित करें कि बेसल इनक्यूबेशन मीडिया 95% ओ 2 और 5% सीओ 2 के साथ लगातार ऑक्सीजन युक्त है।
  2. पेंटोबार्बिटल (10 मिलीग्राम / 100 ग्राम शरीर के वजन) या अन्य उपलब्ध एनेस्थीसिया (जैसे ट्राइब्रोमोएथेनॉल) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज़ करें।
    नोट: ध्यान रखें कि कुछ देशों में पेंटोबार्बिटल और अन्य संवेदनाहारी दवाओं को संभालने के लिए लाइसेंस की आवश्यकता हो सकती है। मांसपेशियों के विच्छेदन को शुरू करने से पहले, प्रत्येक जानवर के एनेस्थीसिया को ठीक से प्रेरित किया जाना चाहिए। यह सुनिश्चित करने के लिए, पूंछ और पैर की सजगता का परीक्षण किया जाता है। इष्टतम परिणामों के लिए विच्छेदन को हटाने के दौरान मांसपेशियों को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए अच्छी तरह से अभ्यास किया जाना चाहिए।
  3. एक विच्छेदन ट्रे (जैसे स्टायरोफोम ढक्कन) पर प्रवण एनेस्थेटाइज्ड चूहों को रखें और सुई का उपयोग करके आवश्यक रूप से सामने और हिंद पंजे को पिन करें।
  4. निचले पैर से त्वचा को हटा दें और सुनिश्चित करें कि अकिलीज़ कण्डरा और घुटने के जोड़ दोनों दिखाई दे रहे हैं।
    1. सोलस मांसपेशी के विच्छेदन के लिए, अकिलीज़ कण्डरा के लिए एक एकल सीवन लूप संलग्न करके शुरू करें। सीवन लूप के Achilles कण्डरा दूरस्थ रूप से करने के लिए एक pean संदंश सुरक्षित और पंजे से soleus और gastrocnemius मांसपेशियों को जारी करने के लिए कटौती। ध्यान से माउस भर में pean संदंश स्लाइड जिससे soleus मांसपेशी को उजागर.
    2. पीन संदंश नीचे पिन और soleus मांसपेशी के समीपस्थ कण्डरा के चारों ओर एक दूसरे टांका पाश जगह. इसके बाद, समीपस्थ कण्डरा में कटौती करें और गैस्ट्रोकेनेमियस मांसपेशी से मुक्त सोलस (दो संलग्न सिवनी छोरों सहित) को विच्छेदित करें। जल्दी से संबंधित हुक करने के लिए प्रत्येक सीवन पाश संलग्न द्वारा इनक्यूबेशन कक्ष में soleus मांसपेशी जगह.
  5. संदंश का उपयोग कर m. tibialis पूर्वकाल (टीए) को कवर प्रावरणी निकालें। यदि सही ढंग से किया जाता है, तो टीए और ईडीएल मांसपेशियों के डिस्टल टेंडन स्पष्ट सफेद और दृश्यमान होने चाहिए; और एक दूसरे से अलग हो गए।
  6. टीए मांसपेशी के डिस्टल कण्डरा में कटौती करें और बाद के विश्लेषण (जैसे जीनोटाइपिंग) के लिए मांसपेशियों को विच्छेदित करें। संदंश का उपयोग करके, धीरे-धीरे आसपास के ऊतकों से ईडीएल मांसपेशी को मुक्त करें लेकिन मांसपेशियों को बरकरार रखें और टेंडन को न काटें। डिस्टल कण्डरा के चारों ओर एक सीवन लूप और ईडीएल के समीपस्थ कण्डरा के चारों ओर एक दूसरा सीवन लूप रखें।
  7. इसके बाद, दो संलग्न सीवन छोरों के साथ ईडीएल मांसपेशी को जारी करने वाले टेंडन में कटौती करें और संबंधित हुक के लिए प्रत्येक सीवन लूप को संलग्न करके इनक्यूबेशन कक्ष में मांसपेशियों को जल्दी से रखें। इनक्यूबेशन के दौरान और विशेष रूप से सोलस और ईडीएल मांसपेशियों के विद्युत-प्रेरित संकुचन के दौरान तनाव नहीं खोने के लिए, तंग समुद्री मील के साथ कण्डरा के चारों ओर सिवनी छोरों को ठीक करना बहुत महत्वपूर्ण है।
  8. अंत में, गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन जैसे जानवर द्वारा euthanize.
  9. जब मांसपेशियों को विच्छेदित किया गया है और इनक्यूबेशन कक्षों में रखा गया है, तो प्रत्येक मांसपेशी के आराम के तनाव को ~ 5 mN में समायोजित करें और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले कम से कम 10 मिनट के लिए मांसपेशियों को पूर्व-इनक्यूबेट करें।

4. इंसुलिन-अलग माउस कंकाल की मांसपेशी में ग्लूकोज अपटेक प्रेरित

  1. निम्नलिखित चरण 3.9 बेसल इनक्यूबेशन मीडिया को इनक्यूबेशन मीडिया के साथ प्रतिस्थापित करें जिसमें कोई इंसुलिन (बेसल इनक्यूबेशन मीडिया), एक उप-अधिकतम प्रभावी इंसुलिन एकाग्रता या अधिकतम प्रभावी इंसुलिन एकाग्रता नहीं होती है और 20 मिनट के लिए इनक्यूबेशन कक्षों में छोड़ दिया जाता है। प्रत्येक इनक्यूबेशन कक्ष को 1 मिनट तक रखें, जिससे मांसपेशियों की बाद की फसल के लिए समय निकलता है।
  2. 20 मिनट की उत्तेजना अवधि के अंत में, इनक्यूबेशन मीडिया को ग्लूकोज अपटेक इनक्यूबेशन मीडिया के साथ बदलें जिसमें इंसुलिन की समान एकाग्रता होती है और 10 मिनट के लिए इनक्यूबेशन कक्षों में छोड़ दें, फिर से प्रत्येक इनक्यूबेशन कक्ष के बीच 1 मिनट की दूरी के साथ।
  3. ग्लूकोज अपटेक में इनक्यूबेशन के 10 मिनट के बाद मीडिया इनक्यूबेशन धीरे-धीरे इनक्यूबेशन कक्षों से मांसपेशियों को हटा दें और उन्हें बर्फ-ठंडे बेसल इनक्यूबेशन मीडिया में धोएं। बाद में, टांके के छोरों को हटाने और मांसपेशियों को तरल नाइट्रोजन में जमे होने से पहले फ़िल्टर पेपर पर मांसपेशियों को जल्दी से सुखा लें। यह जरूरी है कि इनक्यूबेटेड मांसपेशियों को जल्दी से काटा जाए यदि कोई ग्लूकोज अपटेक के अलावा विभिन्न इंट्रासेल्युलर मेटाबोलाइट्स और प्रोटीन सिग्नलिंग की जांच करना चाहता है।
  4. प्रत्येक इनक्यूबेशन कक्ष से ग्लूकोज अपटेक इनक्यूबेशन मीडिया के 100 μL एकत्र करें और इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। इन नमूनों में रेडियोधर्मिता की मात्रा को मांसपेशियों के ग्लूकोज अपटेक की गणना में शामिल किया जाएगा।

5. पृथक माउस कंकाल की मांसपेशी में संकुचन-प्रेरित ग्लूकोज अपटेक

नोट: अलग-थलग माउस कंकाल की मांसपेशी के संकुचन को प्रेरित करने के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करें: 1 ट्रेन / 15 एस, प्रत्येक ट्रेन 1 एस लंबी जिसमें 0.2 एमएस दालें शामिल हैं जो 100 हर्ट्ज पर वितरित की जाती हैं। हालांकि, अलग-थलग माउस कंकाल की मांसपेशी के संकुचन को प्राप्त करने वाले अन्य समान प्रोटोकॉल संभवतः भी काम करेंगे। महत्वपूर्ण रूप से, वोल्टेज को इनक्यूबेटेड मांसपेशी के अधिकतम बल विकास को उत्पन्न करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए, जो प्रयोगात्मक सेटअप पर निर्भर है। यदि यह सुनिश्चित नहीं किया जाता है, तो आप जोखिम उठा सकते हैं कि मांसपेशियों के सभी फाइबर अनुबंधित नहीं हो रहे हैं। बदले में, यह डेटासेट में पूर्वाग्रह को प्रेरित कर सकता है।

  1. चरण 3.9 के बाद प्लैटिनम इलेक्ट्रोड को केंद्रीय रूप से और मांसपेशियों के दोनों किनारों पर रखें। बेसल इनक्यूबेशन मीडिया को ग्लूकोज अपटेक इनक्यूबेशन मीडिया के साथ बदलने के तुरंत बाद मांसपेशियों के संकुचन को शुरू करें। यदि संभव हो, तो प्रत्येक इनक्यूबेशन कक्ष को 1 मिनट तक रखें, जिससे मांसपेशियों की बाद की फसल के लिए समय निकलेगा। प्रत्येक incubated मांसपेशी से बल उत्पादन रिकॉर्ड करने के लिए याद रखें।
  2. ग्लूकोज अपटेक इनक्यूबेशन मीडिया में संकुचन के 10 मिनट के बाद, प्लैटिनम इलेक्ट्रोड को हटा दें, धीरे से इनक्यूबेशन कक्षों से मांसपेशियों को इकट्ठा करें और उन्हें बर्फ-ठंडे बेसल इनक्यूबेशन मीडिया में धोएं। इसके बाद, सीवन छोरों को हटाने और तरल नाइट्रोजन में जमे हुए मांसपेशियों से पहले फ़िल्टर पेपर पर मांसपेशियों को जल्दी से सुखाएं। पूरी मांसपेशी फसल प्रक्रिया जितनी जल्दी हो सके की जानी चाहिए।
  3. प्रत्येक इनक्यूबेशन कक्ष से ग्लूकोज अपटेक इनक्यूबेशन मीडिया के 100 μL एकत्र करें और इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। इन नमूनों में रेडियोधर्मिता की मात्रा को मांसपेशियों के ग्लूकोज अपटेक की गणना में शामिल किया जाएगा।

6. कंकाल की मांसपेशी homogenization और प्रसंस्करण

नोट: मांसपेशियों homogenization के लिए नीचे दी गई प्रक्रिया मांसपेशियों के नमूनों के एक ही सेट में पश्चिमी blotting द्वारा ग्लूकोज अपटेक और मायोसेलुलर सिग्नलिंग दोनों को निर्धारित करना संभव बनाता है।

  1. 400 μL बर्फ-ठंडे बफर में प्रत्येक मांसपेशी को pH 7.5 के साथ homogenize 10% ग्लिसरॉल, 20 mM सोडियम-पाइरोफॉस्फेट, 1% IGEPAL CA-630 (NP-40), 2 mM phenylmethylsulfonylfluoride (isopropanol में भंग), 150 mM NaCl, 50 mM HEPES, 20 mM β-ग्लिसरोफस्फेट, 10 mM सोडियम फ्लोराइड (NaF), 10 mM सोडियम फ्लोराइड (NaF), 10 mM सोडियम फ्लोराइड (NaF), 10 mM सोडियम फ्लोराइड (NaF), 10 mM सोडियम फ्लोराइड (NaF), 10 mM सोडियम फ्लोराइड (NaF), 10 mM सोडियम फ्लोराइड (NaF), 10 mM 10 μg / mL leupeptin, 3 mM benzamidine, और 2mM सोडियम-orthovanadate स्टील मोतियों और एक टिश्यूलिसर (30 हर्ट्ज पर 2 x 45 s) का उपयोग करके। सभी होमोजेनेट्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एंड-ओवर-एंड घुमाएं, जिसके बाद उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 16,000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज किया जाता है। लिसेट (supernatant) जो मांसपेशियों ग्लूकोज अपटेक निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है इकट्ठा करें।

7. रेडियोलेबल 2-deoxyglucose और mannitol का निर्धारण

  1. प्रत्येक मांसपेशी lysate के 150 μL और ग्लूकोज अपटेक इनक्यूबेशन मीडिया के 25 μL जोड़ें प्रत्येक इनक्यूबेशन कक्ष से तरल scintillation गिनती शीशियों तरल पदार्थ के 2 mL युक्त तरल scintillation गिनती शीशियों को अलग करने के लिए। इसके अलावा, दो अंधा नियंत्रण शीशियों को तैयार करें जिसमें केवल 3 मिलीलीटर तरल पदार्थ होता है। सभी शीशियों को बंद करें और ~ 5 एस के लिए प्रत्येक शीशी को भंवर करके अच्छी तरह से मिलाएं।
  2. शीशियों को एक तरल सिंटिलेशन काउंटर में रखें और निर्माता के दिशानिर्देशों के अनुसार [3एच] 2-डीऑक्सी-डी-ग्लूकोज और [14सी] मैनीटोल की रेडियोधर्मिता को मापें। प्रत्येक तरल sinttillation शीशी के लिए रिकॉर्ड DPM (disintegrations प्रति मिनट) .

8. मांसपेशी ग्लूकोज अपटेक दर की गणना

  1. मानक प्रोटीन परिमाणीकरण विधियों (उदाहरण के लिए, Bicinchoninic एसिड या ब्रैडफोर्ड assays) का उपयोग करके प्रत्येक मांसपेशी नमूने में कुल प्रोटीन एकाग्रता को मापने के लिए चरण 6.1 से lysate का उपयोग करें। प्रत्येक सिंटिलेशन शीशी में जोड़े गए प्रोटीन (मिलीग्राम) की मात्रा की गणना करें।
    नोट: प्रत्येक मांसपेशी नमूने के लिए ग्लूकोज अपटेक की दर की गणना [3एच] 2-डीऑक्सी-डी-ग्लूकोज की मात्रा को घटाकर की जाती है जो मांसपेशियों के नमूने में [3एच] 2-डीऑक्सी-डी-ग्लूकोज की कुल मात्रा से बाहरी अंतरिक्ष में स्थित है, जिसमें [14सी] मैनीटोल का उपयोग करके एक बाह्य कोशिकीय मार्कर के रूप में उपयोग किया जाता है। यह माना जाता है कि [3एच] 2-डीऑक्सी-डी-ग्लूकोज और [14सी] मैनिटोल इनक्यूबेशन के दौरान मांसपेशियों के ऊतकों के भीतर समान प्रसार गुणों का प्रदर्शन करते हैं। निम्न परिकलन निष्पादित करें:
  2. सभी मांसपेशियों और मीडिया नमूनों से अंधे नियंत्रण नमूनों के [3एच] और [14सी] डीपीएम को घटाकर शुरू करें।
  3. μL (μL-ECS) में मांसपेशी बाह्य कोशिकीय स्थान निर्धारित करें:
    [14C] DPMमांसपेशी / ([14C]DPMमीडिया / Mvol)
  4. मांसपेशी बाह्य कोशिकीय स्थान ([3H]DPMECS) में [3H]DPM की मात्रा की गणना करें:
    μL-ECS × ([3H]DPMमीडिया /
  5. मांसपेशी इंट्रासेल्युलर स्थान ([3H]DPMICS) में [3H]DPM की मात्रा की गणना करें:
    [3H] DPMमांसपेशी− [3H]DPMECS
  6. मांसपेशियों ग्लूकोज अपटेक दर (μmol / g प्रोटीन / घंटा) की गणना करें:
    [3H] DPMICS / ([3H]DPMमीडिया / Mvol) / [2-deoxy-D-glucose])) / mg protein) / Th
    नोट: ऊपर दिए गए सभी समीकरणों के लिए,
    [14C] DPMमांसपेशी एक मांसपेशी नमूने में [14C] mannitol रेडियोधर्मिता की मात्रा है;
    [14C] DPMमीडिया एक मीडिया नमूने में [14C] mannitol रेडियोधर्मिता की मात्रा है;
    [3H] DPMमांसपेशी एक मांसपेशी के नमूने में [3H]2-deoxy-D-ग्लूकोज रेडियोधर्मिता की मात्रा है;
    [3H] डीपीएममीडिया एक मीडियानमूने में [3एच] 2-डीऑक्सी-डी-ग्लूकोज रेडियोधर्मिता की मात्रा है;
    [3H] DPMECS [3H] 2-deoxy-D-glucose रेडियोधर्मिता की मात्रा है जो मांसपेशियों के बाह्य कोशिकीय स्थान में होती है;
    [3H] DPMआईसीएस मांसपेशियों इंट्रासेल्युलर अंतरिक्ष में [3H]2-deoxy-D-glucose रेडियोधर्मिता की मात्रा है;
    μL-ECS μL में मांसपेशी बाह्य कोशिकीय स्थान है;
    एमवॉल्यूम इनक्यूबेशन मीडिया की मात्रा (μL) है जिसका उपयोग सिंटिलेशन गिनती के लिए किया जाता है (उदाहरण के लिए '25'जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है);
    टीएच प्रति घंटे अपटेक दरों की गणना करने के लिए उपयोग किया जाने वाला समय कारक है (यानी, '1/6' जब 10 मिनट के लिए ग्लूकोज अपटेक मीडिया के साथ मांसपेशियों को इनक्यूबेट करते हैं)
  7. इस उदाहरण की गणना को ध्यान में रखें। [3H] और [14C] अंधा नियंत्रण नमूनों (क्रमशः 17 और 6) के DPM को नीचे उल्लिखित DPM मानों से घटाया गया है।
    [14C] DPMमांसपेशी: 343
    [14C] DPMमीडिया: 11846
    [3H] DPMमांसपेशी: 4467
    [3H] DPMमीडिया: 39814
    एमvol: 25
    मिलीग्राम प्रोटीन: 0.396 (150 μL मांसपेशी प्रोटीन लिसेट में)
    [2-डीऑक्सी-डी-ग्लूकोज]: 1 (mM)
    Th: 1/6 (h)
    μL-ECS = 343 DPM / (11846 DPM / 25 μL) = 0.724 μL
    [3H] DPMECS: 0.724 μL × (39814 DPM / 25 μL) = 1153 DPM
    [3H] DPMआईसीएस: 4467 DPM - 1153 DPM = 3314 DPM
    ग्लूकोज अपटेक: ((3314 DPM / (39814 DPM / 25 μL) / 1 mmol / L) / 0.396 मिलीग्राम प्रोटीन) / (1/6 घंटे) = 31.53 μmol / g प्रोटीन / घंटा

9. SDS-पृष्ठ और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण

  1. Laemmli बफर में soleus और EDL मांसपेशी lysates तैयार करें और 96 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए गर्मी।
  2. स्व-कास्ट जैल पर एसडीएस-पेज द्वारा मांसपेशी प्रोटीन की समान मात्रा को अलग करें और प्रोटीन को सेमीड्री ब्लोटिंग द्वारा पॉलीविनाइलिडीन फ्लोराइड झिल्ली में स्थानांतरित करें।
  3. इसके बाद, ट्राइस-बफ़र्ड खारा में झिल्ली को इनक्यूबेट करें जिसमें 0.05% ट्वीन 20 और 2% स्किम दूध और प्रासंगिक प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ जांच झिल्ली होती है।
  4. chemiluminescence के साथ प्रोटीन का पता लगाएं और उन्हें एक डिजिटल इमेजिंग प्रणाली द्वारा कल्पना।

10. मांसपेशी ग्लाइकोजन, न्यूक्लियोटाइड, लैक्टेट, क्रिएटिन, और फॉस्फोक्रिएटिन

  1. ईडीएल और सोलस मांसपेशियों के नमूने निकालने के लिए परक्लोरिक एसिड का उपयोग करें।
  2. इसके बाद, नमूनों को बेअसर करें और लैक्टेट, क्रिएटिन और फॉस्फोक्रिएटिन के लिए उनका विश्लेषण करें जैसा कि पहलेवर्णित किया गया था।
  3. परक्लोरिक एसिड में निष्कर्षण के बाद रिवर्स-फेज एचपीएलसी द्वारा ईडीएल और सोलस मांसपेशी में न्यूक्लियोटाइड सामग्री का विश्लेषण करें।
  4. एक फ्लोरोमेट्रिक विधि द्वारा एसिड हाइड्रोलिसिस के बाद ग्लाइकोसिल इकाइयों के रूप में पूरे मांसपेशी होमोजेनेट में मांसपेशी ग्लाइकोजन सामग्री निर्धारित करें जैसा कि पहलेवर्णित 18 था।

11. सांख्यिकी

  1. सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के साथ सांख्यिकीय विश्लेषण करें।
  2. तालिका 1 में प्रस्तुत मानों के बीच सांख्यिकीय अंतर का आकलन करने के लिए विचरण (एनोवा) परीक्षण के दो-तरफ़ा विश्लेषण का उपयोग करें।
  3. चित्रा 2 में प्रस्तुत प्रत्येक समूह के भीतर ईडीएल और सोलस के बीच ग्लूकोज अपटेक में सांख्यिकीय अंतर का आकलन करने के लिए अनपेयर्ड स्टूडेंट टी परीक्षणों का उपयोग करें। माध्य (SEM) ± मानक त्रुटि के रूप में डेटा प्रस्तुत करें। पी < 0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता है।

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Representative Results

जैसा कि चित्रा 2 में दिखाया गया है, बेसल ग्लूकोज अपटेक दर मादा चूहों से अलग-थलग सोलस और ईडीएल मांसपेशियों के बीच समान थी। 12,13,19,20 से पहले भी कई बार ऐसा सामने आ चुका है। ग्लूकोज अपटेक में ~ 0.8 और ~ 0.6 गुना की वृद्धि हुई है, जो क्रमशः सोलस और ईडीएल मांसपेशी में 12 और 9 μmol / g प्रोटीन / एच तक पहुंच ती है, एक उप-अधिकतम प्रभावी इंसुलिन एकाग्रता (100 μU / mL) के जवाब में। यह वृद्धि और भी अधिक थी (~ 4 और ~ 2 गुना क्रमशः सोलस और ईडीएल मांसपेशियों में 33 और 19 μmol / g प्रोटीन / एच तक पहुंचते हुए) जब मांसपेशियों को अधिकतम प्रभावी इंसुलिन एकाग्रता (10 mU / mL) के साथ उत्तेजित किया गया था। इसके अलावा, दोनों submaximal और अधिकतम इंसुलिन-प्रेरित ग्लूकोज अपटेक सोलस मांसपेशी में काफी अधिक थे, यह दर्शाता है कि सोलस मांसपेशी ईडीएल मांसपेशियों की तुलना में बढ़ी हुई इंसुलिन संवेदनशीलता और जवाबदेही प्रदर्शित करती है। यह ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर 4 (GLUT4) की उच्च अभिव्यक्ति के साथ-साथ ईडीएल मांसपेशी10,21,22,23,24 की तुलना में सोलस मांसपेशी में इंसुलिन सिग्नलिंग ट्रांसड्यूसर प्रोटीन किनेज बी (एकेटी) से संबंधित हो सकता है।

संकुचन-प्रेरित ग्लूकोज अपटेक सोलस मांसपेशी (चित्रा 2) की तुलना में ईडीएल मांसपेशियों में काफी अधिक था, जैसा कि पहलेभी 13,19 की सूचना दी गई थी। इस प्रकार, ग्लूकोज अपटेक ~ 2 और ~ 2.5 गुना बढ़ गया, जो विद्युत-प्रेरित संकुचन के जवाब में क्रमशः सोलस और ईडीएल मांसपेशी में 14 और 22 μmol / g प्रोटीन / एच तक पहुंच गया। चित्रा 3 10 मिनट की उत्तेजना अवधि के दौरान सोलस और ईडीएल मांसपेशी में अधिकतम मांसपेशी बल उत्पादन दिखाता है। जैसा कि देखा गया है और पहले19 की सूचना दी गई थी, ईडीएल मांसपेशी उत्तेजना अवधि के प्रारंभिक भाग के दौरान अधिक बल (ईडीएल बनाम सोलस में 150 एमएन में 225 एमएन) उत्पन्न करती है। दूसरी ओर, ईडीएल मांसपेशी उत्तेजना अवधि में बाद में सोलस मांसपेशी की तुलना में बल उत्पादन में तेजी से गिरावट प्रदर्शित करती है। इन निष्कर्षों की संभावना सोलस (टाइप 1 > टाइप 2) और ईडीएल (टाइप 2 > टाइप 1) मांसपेशी25 के बीच फाइबर प्रकार वितरण में अंतर के कारण होती है क्योंकि टाइप 2 फाइबर अधिक बल उत्पन्न करते हैं लेकिन टाइप 1 फाइबर26,27 की तुलना में तेजी से थकान होती है।

पृथक सोलस और ईडीएल मांसपेशी में इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग पर इंसुलिन और संकुचन के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, Akt Thr308, TBC1 डोमेन परिवार के सदस्य 4 (TBC1D4) Ser588, AMPKα Thr172 और एसिटाइल-सीओए कार्बोक्सिलेस (ACC) Ser212 के फॉस्फोराइलेशन को पश्चिमी ब्लोटिंग तकनीक (चित्रा 4) द्वारा किया गया था। जैसा कि अपेक्षित था, submaximally और अधिकतम प्रभावी इंसुलिन एकाग्रता Akt Thr308 और TBC1D4 Ser588 के फॉस्फोराइलेशन में वृद्धि को प्रेरित करती है, जबकि संकुचन ने AMPKα Thr172 और ACC Ser212 के फॉस्फोराइलेशन में वृद्धि को प्रेरित किया। न तो इंसुलिन और न ही संकुचन ने एकेटी 2, टीबीसी 1 डी 4, एएमपीकेα2 और एसीसी की कुल प्रोटीन सामग्री में बदलाव का नेतृत्व किया सोलस और ईडीएल मांसपेशी (चित्रा 4)।

इनक्यूबेटेड सोलस और ईडीएल मांसपेशी की चयापचय व्यवहार्यता के विभिन्न मार्करों की जांच करते हुए, हमने एडेनोसिन न्यूक्लियोटाइड्स (एटीपी, एडीपी, एएमपी) (~ 15-25%) के स्तर में समग्र कमी देखी और साथ ही क्रिएटिन (~ 10-35%) इस बात की परवाह किए बिना कि मांसपेशियों को गैर-इनक्यूबेटेड मांसपेशियों की तुलना में पाइरूवेट या ग्लूकोज की उपस्थिति में इनक्यूबेट किया गया था या नहीं (तालिका 1) ). दूसरी ओर, पाइरूवेट के साथ इनक्यूबेट किए गए सोलस और ईडीएल मांसपेशियों में देखे गए ग्लाइकोजन के स्तर में गिरावट को रोका गया था यदि मांसपेशियों को ग्लूकोज के साथ इनक्यूबेट किया गया था। दिलचस्प बात यह है कि हालांकि, हमने देखा कि इनोसिन मोनोफॉस्फेट (आईएमपी) का स्तर कई गुना बढ़ गया है, लेकिन केवल इनक्यूबेटेड सोलस मांसपेशी में। आईएमपी का स्तर आमतौर पर गंभीर चयापचय तनाव के दौरान मांसपेशियों में वृद्धि होती है क्योंकि मांसपेशियों एटीपी / एडीपी अनुपात28 को बनाए रखने के लिए एएमपी को आईएमपी में परिवर्तित करके एएमपी संचय को रोकने का प्रयास करती है। यह इंगित करता है कि सोलस मांसपेशी इनक्यूबेशन के दौरान ईडीएल मांसपेशी की तुलना में कुछ अधिक चयापचय रूप से तनावग्रस्त है। इस धारणा को पाइरूवेट (चित्रा 5) के साथ इनक्यूबेट किए गए सोलस मांसपेशी में उन्नत AMPKα Thr172 और ACC Ser212 फॉस्फोराइलेशन के निष्कर्षों द्वारा भी समर्थित किया गया है। महत्वपूर्ण रूप से, आईएमपी के स्तर के साथ-साथ AMPKα Thr172 और ACC Ser212 फॉस्फोराइलेशन में देखी गई वृद्धि कम हो जाती है जब सोलस मांसपेशी ग्लूकोज के साथ ऊष्मायन होती है। इसलिए, एडेनोसिन न्यूक्लियोटाइड्स में उतार-चढ़ाव को कम करने और मांसपेशियों के ग्लाइकोजन में गिरावट को रोकने के लिए ग्लूकोज युक्त बफर में अलग-थलग कंकाल की मांसपेशियों को इनक्यूबेट करना फायदेमंद लगता है जब मांसपेशियों को लंबे समय तक ऊष्मायन किया जाता है। 2-deoxyglucose uptake के संबंध में, हमारे पास यह सुझाव देने के लिए सबूत हैं कि पाइरूवेट की उपस्थिति में 6 से 8 घंटे के लिए मांसपेशियों को इनक्यूबेट करने से बेसल / आराम करने वाले ग्लूकोज अपटेक दरों में वृद्धि होगी। ग्लूकोज युक्त एक मीडिया में मांसपेशियों को इनक्यूबेट करना ग्लूकोज अपटेक (अप्रकाशित डेटा) में इस तरह की वृद्धि को रोकने के लिए लगता है।

Figure 1
चित्रा 1: इनक्यूबेशन प्रणाली( A) चार एकल इनक्यूबेशन कक्षों के साथ मायोग्राफ प्रणाली। (बी) अनुकूलित इनक्यूबेशन हुक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: चूहों से अलग-थलग परिपक्व कंकाल की मांसपेशी में ग्लूकोज अपटेक। 2-डीऑक्सीग्लूकोज अपटेक को एक उप-अधिकतम प्रभावी इंसुलिन एकाग्रता (100 μU / mL), एक अधिकतम प्रभावी इंसुलिन एकाग्रता (10 mU / mL), और विद्युत-प्रेरित संकुचन (0.2 एमएस पल्स, 100 हर्ट्ज, 1 s / 15s) के जवाब में अलग-थलग सोलस (काली सलाखों) और ईडीएल (ग्रे सलाखों) मांसपेशियों में निर्धारित किया गया था। 30 वोल्ट, 10 मिनट)। डेटा का विश्लेषण प्रत्येक समूह के भीतर छात्रों द्वारा टी परीक्षण किया गया था। ####p<0.001, ##p<0.01 बनाम सोलस मांसपेशी। मान SEM ± मतलब है। n = 4-6 प्रति समूह। ज, घंटा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: विद्युत रूप से प्रेरित संकुचन के जवाब में मांसपेशी बल घटता है। विद्युत उत्तेजना के दौरान पीक बल उत्पादन की गणना सोलस (काले डॉट्स) और ईडीएल (ग्रे डॉट्स) मांसपेशी के लिए की गई थी। प्रत्येक एकल मान प्रत्येक 1-s उत्तेजना अवधि के अंतिम 500 ms के औसत से मेल खाता है। मान SEM ± मतलब है। n = 5-6 प्रति समूह। एस, दूसरा। mN, milli-Newton. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: Akt Thr308, TBC1D4 Ser588, AMPKα Thr172 और ACC Ser212 फॉस्फोराइलेशन के साथ-साथ Akt2, TBC1D4, AMPKα2 और ACC प्रोटीन के प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बे। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण माउस soleus और EDL मांसपेशी के नमूनों चित्रा 2 में वर्णित पर किया गया था. बी, बेसल। एस, submaximally प्रभावी इंसुलिन. एम, अधिकतम प्रभावी इंसुलिन। सी, संकुचन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: AMPKα Thr172 और ACC Ser212 फॉस्फोराइलेशन के साथ-साथ AMPKα2 और ACC प्रोटीन के प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बे। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण माउस सोलस और ईडीएल मांसपेशियों के नमूनों पर किया गया था जो तालिका 1 में वर्णित हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अउष्मायनित पाइरूवेट के साथ incubated 1h ग्लूकोज के साथ incubated 1h मुख्य प्रभाव बातचीत
सोलस EDL सोलस EDL सोलस EDL
लैक्टेट 1.00 ± 0.01 1.00 ± 0.02 0.96 ± 0.03 0.98 ± 0.02 1.05 ± 0.01 0.99 ± 0.01 - -
सीआर 1.00 ± 0.04 1.00 ± 0.06 0.64 ± 0.07 ### 0.76 ± 0.05 ### 0.76 ± 0.07 ## 0.88 ± 0.09 ## पी < 0.001 -
PCr 1.00 ± 0.19 1.00 ± 0.06 0.80 ± 0.12 1.13 ± 0.14 0.65 ± 0.31 0.75 ± 0.08 - -
PCr/(Cr + PCr) 1.00 ± 0.20 1.00 ± 0.07 1.17 ± 0.11 1.25 ± 0.12 0.78 ± 0.36 0.92 ± 0.11 - -
एटीपी 1.00 ± 0.03 1.00 ± 0.02 0.72 ± 0.03 ###,§§§ 0.99 ± 0.03 * 0.81 ± 0.06 ### 0.85 ± 0.04 ## - पी < 0.001
ADP 1.00 ± 0.04 1.00 ± 0.04 0.75 ± 0.05 ### 0.92 ± 0.03 ### 0.84 ± 0.04 ## 0.86 ± 0.03 ## पी < 0.001 -
एएमपी 1.00 ± 0.11 1.00 ± 0.12 0.85 ± 0.15 0.79 ± 0.13 0.84 ± 0.18 0.75 ± 0.13 - -
IMP 1.00 ± 0.17 1.00 ± 0.30 4.43 ± 0.67 ###,§§§ 0.72 ± 0.29 3.33 ± 1.25 ##,§ 1.08 ± 0.01 - पी < 0.001
एएमपी/एटीपी अनुपात 1.00 ± 0.12 1.00 ± 0.13 1.18 ± 0.22 0.81 ± 0.16 1.06 ± 0.23 0.90 ± 0.19 - -
ग्लाइकोजन 1.00 ± 0.08 1.00 ± 0.12 0.74 ± 0.07 (#), * 0.80 ± 0.12 (#),* 1.12 ± 0.10 1.10 ± 0.03 p = 0.035 -
pAMPK Thr172 / 1.00 ± 0.10 1.00 ± 0.12 3.26 ± 0.58 ###,***,§§§ 1.55 ± 0.27 1.68 ± 0.19 # 1.36 ± 0.19 - p = 0.002
pACC Ser212 / ACC 1.00 ± 0.18 1.00 ± 0.12 2.22 ± 0.58 ###,**,§§ 0.96 ± 0.21 0.99 ± 0.15 0.83 ± 0.09 - p = 0.030

तालिका 1: माउस सोलस और ईडीएल मांसपेशियों की चयापचय व्यवहार्यता की तुलना 2 एमएम पाइरूवेट या 5 एमएम ग्लूकोज की उपस्थिति में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट की गई। गैर-इनक्यूबेटेड मांसपेशियों को तरल नाइट्रोजन में जमे होने से पहले एनेस्थेटाइज्ड और खिलाए गए जानवरों से विच्छेदित किया गया था। बीएसए (0.1%), ना-पाइरूवेट (2 एमएम) और डी-मैनिटोल (8 एमएम) के साथ पूरक केआरएच बफर में अलग-अलग मांसपेशियों को 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया था, जबकि अन्य को केआरएच बफर में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया था, जो बीएसए (0.1%), डी-ग्लूकोज (5 एमएम) और डी-मैनिटोल (5 एमएम) के साथ पूरक था तरल नाइट्रोजन में जमे हुए होने से पहले। डेटा को चयापचय व्यवहार्यता के विभिन्न मार्करों में देखे गए परिवर्तनों को उजागर करने के लिए सापेक्ष इकाइयों में परिवर्तित किया गया था। गैर-इनक्यूबेटेड माउस सोलस और ईडीएल मांसपेशियों से निरपेक्ष मान नीचे दिए गए हैं। लैक्टेट (mmol / kg w.w): 137.53soleus; 139.05ईडीएल। Cr (mmol/kg w.w): 9.35soleus; 8.98ईडीएल। PCr (mmol / kg w.w): 1.50soleus; 5.20ईडीएल। PCr /(PCr+Cr): 13.98soleus; 37.30ईडीएल। एटीपी (mmol / kg w.w): 3.07soleus; 4.24ईडीएल। ADP (mmol/kg w.w): 0.60soleus; 0.51ईडीएल। AMP (mmol / kg w.w): 0.18soleus; 0.08ईडीएल. आईएमपी (mmol / kg w.w): 0.07soleus; 0.14ईडीएल। AMP/ATP अनुपात: 0.06soleus; 0.02ईडीएल. ग्लाइकोजन (pmol / μg प्रोटीन): 77.01soleus; 67.56ईडीएल। डेटा का विश्लेषण प्रत्येक समूह के भीतर दो-तरफ़ा एनोवा द्वारा किया गया था। ####p<0.001, ##p<0.01, और #p<0.05 बनाम गैर-इनक्यूबेटेड। p<0.001, ** p<0.01, और * p<0.05 बनाम ग्लूकोज के साथ incubated 1 ज. §§§p<0.001, §§p<0.01, और §p<0.05 बनाम EDL. मान SEM ± मतलब है। n = 12 गैर-इनक्यूबेटेड समूह में, n = 4-6 इनक्यूबेटेड समूहों में। सीआर, क्रिएटिन; PCr, Phosphocreatine; w.w, गीला वजन; ज, घंटा।

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Discussion

कंकाल की मांसपेशियों में ग्लूकोज अपटेक का बरकरार विनियमन समग्र स्वास्थ्य1 को संरक्षित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, मांसपेशियों के ग्लूकोज अपटेक की जांच अक्सर विभिन्न स्वास्थ्य-परिवर्तन हस्तक्षेपों का मूल्यांकन करते समय प्राथमिक रीडआउट के रूप में कार्य करती है। यहां हम इंसुलिन और विद्युत रूप से प्रेरित संकुचन के जवाब में चूहों से अलग और इनक्यूबेटेड सोलस और ईडीएल मांसपेशियों में ग्लूकोज अपटेक को मापने के लिए एक पूर्व विवो विधि का वर्णन करते हैं। विधि त्वरित और विश्वसनीय है और इनक्यूबेटेड मांसपेशी के आसपास के परिवेश के सटीक नियंत्रण की अनुमति देती है जो मांसपेशियों के ग्लूकोज अपटेक दरों की सटीक जांच की अनुमति देती है जो हार्मोन और सब्सट्रेट के संभावित रूप से भ्रमित प्रभाव से अलग होती है जो रक्त में पाया जा सकता है। इस विधि का उपयोग कई अध्ययनों में कई वर्षों से किया गया है और मांसपेशियों के अनुसंधान समुदाय द्वारा व्यापक रूप से अपनाया जाता है।

पूर्व विवो इनक्यूबेशन मॉडल को आम तौर पर कंकाल की मांसपेशियों में ग्लूकोज अपटेक के बजाय ग्लूकोज परिवहन क्षमता का आकलन करने के लिए एक विधि माना जाता है। ऊष्मायन मांसपेशियों में ग्लूकोज परिवहन क्षमता को समय की अवधि में संचित डी-ग्लूकोज को मापकर निर्धारित किया जा सकता है। हालांकि, यह एक समस्या पैदा करता है क्योंकि डी-ग्लूकोज को मांसपेशियों की कोशिका में जल्दी से चयापचय किया जाता है। इस समस्या को दरकिनार करने के लिए, ग्लूकोज एनालॉग 3-ओ-मिथाइल-डी-ग्लूकोज (3-एमजी) का व्यापक रूप से ग्लूकोज परिवहन क्षमता का आकलन करने के लिए उपयोग किया गया है, क्योंकि सेल सतह झिल्ली में ले जाने के बाद 3-एमजी को सेल के अंदर चयापचय नहीं किया जाता है। इस प्रकार, इंट्रासेल्युलर संचित 3-एमजी की प्रारंभिक दर प्रति से सेलुलर ग्लूकोज परिवहन क्षमता के सूचकांक के रूप में कार्य करती है क्योंकि यह ग्लूकोज चयापचय मार्गों में अन्य चरणों से प्रभावित नहीं होती है। हालांकि, 3-एमजी का उपयोग एक समस्या का गठन कर सकता है क्योंकि 3-एमजी जमा हो जाएगा जिससे 3-एमजी के लिए ट्रांसमेम्ब्रेन ग्रेडिएंट कम हो जाएगा और बाद में आगे बढ़ने को कम किया जा सकता है। इस प्रकार, झिल्ली परिवहन क्षमता का एक उपाय प्राप्त करने के लिए, 3-MG अपटेक की प्रारंभिक दर का अनुमान लगाया जाना चाहिए। विशेष रूप से जब परिवहन क्षमता अधिक होती है तो यह मांसपेशियों29,30 से 3-एमजी के एफीलैक्स के कारण एक समस्या पैदा कर सकता है। 3-एमजी एफीलेक्स के साथ संभावित समस्या को 2-डीऑक्सी-डी-ग्लूकोज (2-डीजी) का उपयोग करके टाला जा सकता है। कंकाल की मांसपेशी में परिवहन के बाद, 2-डीजी को हेक्सोकिनेज II द्वारा 2-डीऑक्सी-डी-ग्लूकोज-6-फॉस्फेट (2-डीजी-6पी) तक फॉस्फोराइलेट किया जाता है। जैसा कि कंकाल की मांसपेशियों में ग्लूकोज -6-फोफाटेज की कमी होती है और GLUT4 फॉस्फोराइलेटेड 2-डीजी का परिवहन नहीं कर सकता है, 2-डीजी -6 पी मांसपेशी कोशिका के भीतर फंस जाएगा। ग्लूकोज-6-फॉस्फेट के विपरीत, 2-डीजी-6पी हेक्सोकिनेज II30 का एक बहुत ही कमजोर एलोस्टेरिक अवरोधक है जो 2-डीजी के लिए ट्रांसमेम्ब्रेन ग्रेडिएंट को बनाए रखने में मदद करता है। इस प्रकार, टिप्पणियों से पता चला है कि इनक्यूबेटेड (चूहे) मांसपेशी में 2-डीजी अपटेक रैखिक रहता है जब तक कि इंट्रासेल्युलर 2-डीजी -6 पी एकाग्रता 30 एमएम से अधिक नहीं हो जाती है, एक एकाग्रता जो हेक्सोकिनेज II गतिविधि30 को कम करती है। इसके अलावा, इनक्यूबेटेड माउस कंकाल की मांसपेशी में 2-डीजी अपटेक ~ 30 मिनट के लिए रैखिक रहता है जब इनक्यूबेशन बफर का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस याउससे कम 31 होता है। इससे पता चलता है कि 2-डीजी का उपयोग इनक्यूबेटेड मांसपेशियों में ग्लूकोज अपटेक के बजाय ग्लूकोज परिवहन क्षमता को मापने के लिए किया जा सकता है, सिवाय उन स्थितियों के जहां 2-डीजी -6 पी सांद्रता बहुत अधिक हो जाती है (उदाहरण के लिए ऊष्मायन के दौरान मनाया जाता है >1 एमएम 2-डीजी के साथ 2 घंटे और एक अधिकतम इंसुलिन एकाग्रता29,30)। यह विचार कि 2-डीजी अपटेक संभवतः ग्लूकोज परिवहन क्षमता को दर्शाता है, यह भी निष्कर्षों द्वारा समर्थित है कि अधिकतम इंसुलिन-प्रेरित 2-डीजी अपटेक जंगली-प्रकार के चूहों और चूहों से इनक्यूबेटेड मांसपेशियों में समान है जो हेक्सोकाइनेज II32 को ओवरएक्सप्रेस करते हैं। संकुचन के दौरान मांसपेशियों के ग्लूकोज परिवहन माप के लिए 2-डीजी का उपयोग करते समय एक संभावित चिंता ग्लाइकोजेनोलिसिस की उच्च दर के कारण इंट्रासेल्युलर ग्लूकोज -6-फॉस्फेट एकाग्रता में वृद्धि है। हालांकि, चूंकि (चूहे) मांसपेशी 2-डीजी अपटेक में एक रैखिक वृद्धि समय29 के साथ संकुचन के दौरान देखी जाती है, यह इंगित करता है कि संकुचन के दौरान ग्लाइकोजन के टूटने से ग्लूकोज -6-फॉस्फेट का संचय हेक्सोकिनेज II गतिविधि में हस्तक्षेप नहीं करता है और इस प्रकार 2-डीजी अपटेक दर। इसके आधार पर, 2-डीजी 3-एमजी की सीमाओं पर विचार करते हुए इंसुलिन और संकुचन के दौरान अलग-थलग कंकाल की मांसपेशी में ग्लूकोज परिवहन के माप के लिए अच्छी तरह से अनुकूल लगता है।

हालांकि यह आम तौर पर माना जाता है कि हेक्सोकिनेज II द्वारा फॉस्फोराइलेशन के बाद 2-डीजी को आगे चयापचय नहीं किया जाता है, यह बताया गया है कि कुछ 2-डीजी को मांसपेशियों के ग्लाइकोजन की ओर निर्देशित और शामिल किया जाता है। इस प्रकार, चूहों में एक 2 एच normoglycemic hyperinsulinemic क्लैंप के दौरान ~ कंकाल की मांसपेशी द्वारा उठाए गए 2-डीजी का 30% ग्लाइकोजन33 में शामिल किया गया है। इसलिए, यह तर्क दिया जा सकता है कि इनक्यूबेटेड कंकाल की मांसपेशियों में इंसुलिन-प्रेरित 2-डीजी अपटेक की दरों को कम करके आंका जाता है यदि ग्लाइकोजन में 2-डीजी के संचय की उपेक्षा की जाती है। हमने निर्धारित किया है कि पहले इनक्यूबेटेड कंकाल की मांसपेशी में 2-डीजी अपटेक दरों के बाद के विश्लेषण के लिए मांसपेशियों के लिसेट (supernatant) को तैयार करने के तरीके पर वर्णित प्रोटोकॉल ग्लाइकोजन में 2-डीजी के संभावित निगमन से प्रभावित नहीं होता है। यह तर्क दिया जा सकता है कि ग्लाइकोजन छर्रे में जमा होता है जब पूरे मांसपेशी होमोजेनेट को 2-डीजी अपटेक माप के लिए लिसेट उत्पन्न करने के लिए सेंट्रीफ्यूज किया जाता है। हालांकि, इंसुलिन-प्रेरित पूरे मांसपेशी होमोजेनेट बनाम लिसेट में रेडियोधर्मिता के स्तर की तुलना करते समय हम किसी भी महत्वपूर्ण अंतर (अप्रकाशित डेटा) का पता नहीं लगाते हैं। इससे पता चलता है कि 2-डीजी के 1 एमएम में 10 मिनट के लिए माउस की मांसपेशियों को इनक्यूबेट करने से ग्लाइकोजन में 2-डीजी का पता लगाने योग्य संचय नहीं होता है।

कंकाल की मांसपेशी 2-डीजी अपटेक का निर्धारण इस बात पर विचार किए बिना कि 2-डीजी को अतिरिक्त और इंट्रासेल्युलर स्पेस दोनों में वितरित किया जाता है, 2-डीजी अपटेक का एक अतिरेक होगा। इसे दरकिनार करने के लिए, एल-ग्लूकोज का उपयोग एक बाह्य कोशिकीय मार्कर के रूप में किया जाना चाहिए क्योंकि यह कोशिका झिल्ली में नहीं ले जाया जाता है, लेकिन अन्यथा द्रव्यमान, घुलनशीलता, निष्क्रिय प्रसार, बंधन, आदि सहित डी-ग्लूकोज के समान गुणों को प्रदर्शित करता है। विनिर्माण की अत्यधिक लागत और इस प्रकार एल-ग्लूकोज खरीदने के कारण, मैनिटोल का उपयोग आमतौर पर एक बाहरी मार्कर के रूप में किया जाता है क्योंकि मैनिटोल को मांसपेशी कोशिका द्वारा नहीं लिया जाता है, अपेक्षाकृत सस्ती है और इसका अनुमान है कि ग्लूकोज और 2-डीजी34 के रूप में कुछ हद तक समान बाह्य कोशिकीय वितरण मात्रा है।

आंतरिक सेलुलर और आणविक घड़ियां पूरे शरीर के चयापचय और ऊर्जा होमियोस्टैसिस35 के विनियमन के लिए एक आवश्यक भूमिका निभाती हैं। यह देखा गया है कि कोर घड़ी जीन Bmal1 की मांसपेशी-विशिष्ट नॉकआउट अलग-थलग माउस कंकाल की मांसपेशी36 में इंसुलिन-प्रेरित ग्लूकोज अपटेक को बाधित करता है। इसके अलावा, अलग-थलग कंकाल की मांसपेशियों के उप-अधिकतम इंसुलिन-प्रेरित ग्लूकोज अपटेक क्रमशः प्रकाश और अंधेरे चरण के बीच में सबसे कम और उच्चतम इंसुलिन प्रतिक्रिया के साथ सर्कैडियन लय प्रदर्शित करताहै। इन निष्कर्षों के आधार पर, इसलिए डेटा की पुनरुत्पादकता को बढ़ाने के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन में पशु बलि के समय को शामिल करना महत्वपूर्ण है।

पूर्व विवो विधि का एक प्रमुख नुकसान पृथक मांसपेशी में केशिका प्रवाह की कमी है। इसका मतलब यह है कि वितरण और विभिन्न substrates को हटाने पूरी तरह से मांसपेशियों के तंतुओं और आसपास के वातावरण के बीच सरल प्रसार पर निर्भर करता है। नतीजतन, अलग-थलग मांसपेशी इनक्यूबेटेड पूर्व विवो की चयापचय व्यवहार्यता का सत्यापन सतही के साथ-साथ गहरे मांसपेशियों के तंतुओं के लिए ऑक्सीजन की प्रसार सीमाओं पर केंद्रित है। इस प्रकार, इनक्यूबेटेड मांसपेशी, विशेष रूप से अत्यधिक चयापचय माउस मांसपेशी, हाइपोक्सिक कोर विकसित करती है जिसमें ग्लाइकोजन का टूटना16,17,38 होता है। बोनेन और सहयोगियों15 द्वारा एक विस्तृत समीक्षा में, यह सुझाव दिया गया था कि इनक्यूबेटेड मांसपेशियों के हाइपोक्सिक कोर की संभावना तब विकसित होती है जब मांसपेशियों को ठीक से ऑक्सीजनयुक्त होने के लिए बहुत मोटी ऊष्मायन किया जाता है, खासकर जब ≥ 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर ऊष्मायन किया जाता है। इसने सिफारिश की कि केवल पतली और बेलनाकार माउस की मांसपेशियों, जैसे कि सोलस और ईडीएल, का उपयोग हाइपोक्सिक कोर के विकास से बचने के लिए 25-30 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के लिए किया जाना चाहिए। यह इंगित करता है कि द्रव्यमान के बजाय मोटाई और ज्यामिति माउस कंकाल की मांसपेशियों को इनक्यूबेट करते समय विचार करने के लिए महत्वपूर्ण कारक हैं। इसके अलावा, यह सिफारिश की गई थी कि इनक्यूबेशन तापमान, मांसपेशियों की मोटाई के साथ-साथ एटीपी, फॉस्फोक्रिएटिन, और ग्लाइकोजन सामग्री और / या लैक्टेट की रिहाई को मापा जाना चाहिए और इनक्यूबेटेड मांसपेशी15 की व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए नियमित रूप से रिपोर्ट किया जाना चाहिए। हमारे ज्ञान के लिए, इनक्यूबेटेड मांसपेशी के इस तरह के पूर्ण विश्लेषण मुख्य रूप से चूहे की मांसपेशियों के लिए 39,40,41,42 की सूचना दी गई है और केवल माउस की मांसपेशियों के लिए एक सीमित सीमा तक रिपोर्ट की गई है 16,17। इनक्यूबेटेड माउस कंकाल की मांसपेशियों में व्यवहार्यता के विभिन्न चयापचय मार्करों में अंतर्दृष्टि बढ़ाने के लिए, हमने ग्लूकोज- या पाइरूवेट-पूरक केआरएच बफर में 1 घंटे के इनक्यूबेशन के बाद लैक्टेट, क्रिएटिन, फॉस्फोक्रिएटिन, एडेनोसिन न्यूक्लियोटाइड्स, ग्लाइकोजन और एएमपीके सिग्नलिंग की इंट्रासेल्युलर सामग्री में संभावित परिवर्तनों का आकलन किया। इनक्यूबेटेड माउस सोलस और ईडीएल मांसपेशी17 में पिछले निष्कर्षों के समान, हमने देखा कि ग्लाइकोजन का स्तर कम हो गया जब मांसपेशियों को ग्लूकोज मुक्त मीडिया में इनक्यूबेट किया गया था। यह इंगित करता है कि इनक्यूबेशन के दौरान ग्लूकोज की अनुपस्थिति ग्लाइकोजन टूटने और ग्लाइकोलाइसिस में ग्लूकोज -6-फॉस्फेट के बाद के प्रवेश को बढ़ावा देती है जो विशेष रूप से एटीपी उत्पादन को सुरक्षित करने के लिए कार्य कर सकती है यदि ऑक्सीजन की आपूर्ति अपर्याप्त है। इसके अलावा, हमने इनक्यूबेटेड सोलस और ईडीएल मांसपेशी में एटीपी और एडीपी न्यूक्लियोटाइड पूल में समग्र कमी पाई। इसका मतलब यह हो सकता है कि ऑक्सीजन की आपूर्ति ग्लूकोज की उपस्थिति और अनुपस्थिति दोनों में इनक्यूबेटेड माउस मांसपेशी की मांग को पूरा करने के लिए पूरी तरह से पर्याप्त नहीं है। चूंकि ऑक्सीडेटिव सोलस मांसपेशी ग्लाइकोलाइटिक ईडीएल मांसपेशी की तुलना में एटीपी उत्पादन के लिए ऑक्सीजन पर अधिक निर्भर करती है, इसलिए यह सुझाव देगा कि सोलस मांसपेशी इनक्यूबेशन प्रक्रिया से काफी हद तक प्रभावित होती है। समझौते में, हमने पाया कि आईएमपी के इंट्रासेल्युलर स्तर के साथ-साथ एएमपीके सिग्नलिंग को ग्लूकोज की अनुपस्थिति में इनक्यूबेट किए जाने पर ईडीएल मांसपेशी की तुलना में सोलस में स्पष्ट रूप से वृद्धि हुई थी। यह दर्शाता है कि सोलस मांसपेशी इनक्यूबेशन के दौरान चयापचय तनाव की एक उच्च डिग्री प्रदर्शित करती है, जिसे पूर्व विवो माउस मांसपेशी मॉडल से डेटा का मूल्यांकन करते समय ध्यान में रखा जाना चाहिए।

अमर L6 और C2C12 के साथ-साथ प्राथमिक मानव मायोट्यूब सहित सुसंस्कृत मांसपेशी कोशिकाओं को आमतौर पर इंसुलिन-प्रेरित मांसपेशी ग्लूकोज अपटेक पर विभिन्न आनुवंशिक और औषधीय जोड़तोड़ के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए परिपक्व कंकाल की मांसपेशी के लिए एक सरोगेट के रूप में उपयोग किया जाता है। हालांकि, कई मायनों में सुसंस्कृत मांसपेशी कोशिकाएं परिपक्व कंकाल की मांसपेशियों के समान नहीं होती हैं और जब दो मॉडल प्रणालियों की तुलना करते हैं तो कई अंतर स्पष्ट हो जाते हैं। इनमें प्रोटीन अभिव्यक्ति, आयामी संरचना, आसपास के वातावरण, प्रसार और भेदभाव की स्थिति, फाइबर प्रकार की संरचना, चयापचय प्रक्रियाओं औरकार्यात्मक गुणों में अंतर शामिल हैं, जिनमें से सभी प्रभावित कर सकते हैं कि मांसपेशी कोशिका विभिन्न उत्तेजनाओं के जवाब में ग्लूकोज अपटेक को कैसे नियंत्रित करती है। आमतौर पर, सुसंस्कृत मांसपेशी कोशिकाओं44 की तुलना में परिपक्व कंकाल की मांसपेशियों में ग्लूकोज अपटेक दरों पर इंसुलिन के अधिक सापेक्ष प्रभाव देखे जाते हैं, जो यह संकेत दे सकते हैं कि सुसंस्कृत मांसपेशी कोशिकाओं में कुछ हद तक ग्लूकोज अपटेक दरों को विनियमित करने के लिए जिम्मेदार मशीनरी की कमी होती है, जिसमें इंसुलिन-संवेदनशील ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर GLUT4 43 की अभिव्यक्ति का एक उच्च स्तर भी शामिलहै। . या तो सुसंस्कृत मांसपेशी कोशिकाओं और अलग कंकाल की मांसपेशियों के उपयोग से जुड़ी सीमाओं और चेतावनियों को ध्यान में रखते हुए, इसलिए ग्लूकोज अपटेक जैसी विभिन्न मांसपेशियों की चयापचय प्रक्रियाओं का अध्ययन करते समय संयुक्त दृष्टिकोण लेना फायदेमंद है।

सोलस और ईडीएल मांसपेशियों को आमतौर पर क्रमशः धीमी और तेज-चिकोटी मांसपेशियों के प्रतिनिधि के रूप में माना जाता है। इसलिए, ये मांसपेशी प्रकार यांत्रिक अध्ययनों के लिए आदर्श हैं जो मांसपेशियों के बल और थकान के विकास को प्रभावित करने वाले हस्तक्षेपों की जांच करने की मांग करते हैं। इसके अलावा, सोलस मांसपेशी को आमतौर पर ईडीएल मांसपेशियों की तुलना में इंसुलिन संवेदनशीलता और जवाबदेही में वृद्धि होने की सूचना दी जाती है और इस प्रकार, मांसपेशियों की इंसुलिन संवेदनशीलता को लक्षित करने वाले हस्तक्षेप सोलस और ईडीएल को अलग-अलग प्रभावित कर सकते हैं। इसके अलावा, विभिन्न एएमपीके परिसरों का सापेक्ष वितरण सोलस और ईडीएल मांसपेशी के बीच भिन्न होता है जो मांसपेशियों के ग्लूकोज को बढ़ाने के लिए एएमपीके सक्रिय यौगिकों की क्षमता को प्रभावित करता है। इस प्रकार, मांसपेशियों के ग्लूकोज अपटेक के विनियमन में सबसे बड़ी अंतर्दृष्टि संभवतः प्राप्त की जाती है यदि सोलस और ईडीएल मांसपेशियों दोनों का उपयोग पूर्व विवो इनक्यूबेशन मॉडल के साथ प्रयोग के दौरान किया जाता है।

इसमें वर्णित विधि समरूपता के बाद प्रत्येक मांसपेशी नमूने में निर्धारित कुल प्रोटीन बहुतायत की मात्रा से ग्लूकोज अपटेक से संबंधित है। यह हमारा अनुभव है कि मांसपेशियों के वजन (अप्रकाशित डेटा) के बजाय मांसपेशी प्रोटीन की प्रति मात्रा में ग्लूकोज अपटेक से संबंधित होने पर भिन्नता कम हो जाती है। इसके अलावा, विभिन्न जैव रासायनिक assays के लिए उपयोग किए जाने वाले बफर में मांसपेशियों के नमूनों का समरूपता एक ही नमूना तैयारी45,46 में ग्लूकोज अपटेक, मायोसेलुलर सिग्नलिंग और एंजाइम गतिविधियों दोनों को निर्धारित करना संभव बनाता है। यह अक्सर एक अध्ययन के लिए उपयोग किए जाने वाले चूहों की मात्रा को कम कर देगा। फिर भी, ग्लूकोज अपटेक को कंकाल की मांसपेशियों के नमूनों में आसानी से निर्धारित किया जा सकता है जो सोडियम हाइड्रॉक्साइड (NaOH) में हीटिंग द्वारा भंग कर दिए जाते हैं, जिसके बाद हाइड्रोजन क्लोराइड20 के साथ न्यूट्रलाइजेशन होता है। चूंकि NaOH के साथ मांसपेशियों का उपचार कुल मांसपेशी प्रोटीन एकाग्रता के माप के साथ हस्तक्षेप करता है, इस प्रक्रिया द्वारा मापा गया ग्लूकोज परिवहन मांसपेशियों के वजन से संबंधित होना चाहिए।

विभिन्न अनुकूलनों के आधार पर, बफर इनक्यूबेशन हमारे ग्लूकोज अपटेक में [3H] 2-deoxy-D-glucose और 0.0083 MBq/mL की 0.028 MBq/mL की एक विशिष्ट गतिविधि शामिल है[14C]Mannitol। एक तरफ, यह पर्याप्त और विश्वसनीय रेडियोधर्मिता माप प्राप्त करने के लिए आवश्यक लिसेट (400 μL में से 150) की मात्रा को कम करता है। दूसरी ओर, यह रेडियोधर्मी [3एच] 2-डीऑक्सी-डी-ग्लूकोज और [14सी] मैनिटोल की मात्रा को बढ़ाता है, जो प्रत्येक प्रयोग के लिए आवश्यक है, जो प्रयोगात्मक लागत को बढ़ाता है। इस प्रकार, किसी भी प्रयोगात्मक सेटअप के लिए विशिष्ट आवश्यकताओं को फिट करने के लिए ग्लूकोज अपटेक इनक्यूबेशन मीडिया में उपयोग की जाने वाली रेडियोधर्मिता की मात्रा को विनियमित करना संभव है। हालांकि, इस बात का ध्यान रखा जाना चाहिए कि इनक्यूबेशन बफर में रेडियोधर्मिता की मात्रा को एक हद तक कम न किया जाए जो रेडियोधर्मिता माप को अविश्वसनीय बनाता है। यह नमूनों में रेडियोधर्मिता को उपयोग की जाने वाली तरल सिंटिलेशन गिनती मशीनरी की निर्दिष्ट पहचान सीमा से अधिक रखकर सुनिश्चित किया जाता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है

Acknowledgments

इस काम को डेनिश काउंसिल फॉर इंडिपेंडेंट रिसर्च - मेडिकल साइंसेज (FSS8020-00288B) और नोवो नॉरडिस्क फाउंडेशन (NNF160C0023046) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। इस काम को डेनिश मधुमेह अकादमी से रासमस Kjøbsted को एक शोध अनुदान द्वारा भी समर्थित किया गया था, जिसे नोवो नॉरडिस्क फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया जाता है, अनुदान संख्या NNF17SA0031406। लेखकों को उनकी कुशल तकनीकी सहायता के लिए करीना ओल्सन, Betina Bolmgren, और Irene Bech Nielsen (पोषण, व्यायाम और खेल विभाग, विज्ञान संकाय, कोपेनहेगन विश्वविद्यालय) को धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[14C]D-mannitol American Radiolabeled Chemicals, Inc. ARC 0127
[3H]2-deoxy-D-glucose  American Radiolabeled Chemicals, Inc. ART 0103A
2-Deoxy-D-glucose Sigma D8375
4-0 USP non-sterile surgical nylon suture Harvard Apparatus 51-7698
Streptavidin/HRP (Conjugate) DAKO P0397 Used to detect ACC protein
Akt2 antibody Cell Signaling 3063
AMPKα2 antibody Santa Cruz SC-19131
aprotinin Sigma A1153
benzamidine Sigma B6505
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7030
CaCl2 Merck 1020831000
Calibration kit (force) Danish Myo Technology A/S 300041
Chemiluminescence Millipore WBLUF0500
D-Glucose Merck 1084180100
D-Mannitol Sigma M4125
Data collection program National Instruments LabVIEW software version 7.1
Dialysis tubing Visking DTV.12000.09 Size No.9
Digital imaging system BioRad ChemiDoc MP
EDTA Sigma EDS E9884
EGTA Sigma E4378
Electrical Pulse Stimulator Digitimer D330 MultiStim System
Glycerol Sigma G7757
HEPES Sigma H7637
IGEPAL CA-630  Sigma I8896
Insulin Novo Nordisk Actrapid, 100 IE/mL
KCl Merck 1049361000
KH2PO4 Merck 104873025
leupeptin Sigma L2884
MgSO4 Merck 1058860500
Muscle Strip Myograph System Danish Myo Technology A/S Model 820MS
Na-Orthovanadate Sigma S6508
Na-Pyrophosphate Sigma 221368
Na-Pyruvate Sigma P2256
NaCl Merck 106041000
NaF Sigma S1504
NaHCO3 VWR 27778260
pACC Ser212 antibody Cell Signaling 3661
pAkt Thr308 antibody Cell Signaling 9275
pAMPK Thr172 antibody Cell Signaling 2531
phenylmethylsulfonylfluoride Sigma P7626
Platinum electrodes Danish Myo Technology A/S 300145
pTBC1D4 Ser588 antibody Cell Signaling 8730
Scintillation counter Perkin Elmer Tri-Carb-2910TR
Scintillation fluid  Perkin Elmer 6013329
Statistical analyses software Systat SigmaPlot version 14
TBC1D4 antibody Abcam ab189890
TissueLyser II  Qiagen 85300
Ultrapure water Merck Milli-Q Reference A+ System
β-glycerophosphate Sigma G9422

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References

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जीव विज्ञान अंक 171 कंकाल की मांसपेशी ग्लूकोज परिवहन ग्लूकोज अपटेक इंसुलिन संवेदनशीलता संकुचन स्पष्टीकरण पूर्व विवो इन विट्रो इनक्यूबेशन रेडियोधर्मी ग्लूकोज अनुरेखक 2-डीऑक्सी-डी-ग्लूकोज
इंसुलिन का माप- और संकुचन-प्रेरित ग्लूकोज चूहों से पृथक और ऊष्मायन परिपक्व कंकाल की मांसपेशी में अपटेक
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Kjøbsted, R., Kido, K., Larsen, … More

Kjøbsted, R., Kido, K., Larsen, J. K., Jørgensen, N. O., Birk, J. B., Hellsten, Y., Wojtaszewski, J. F. P. Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice. J. Vis. Exp. (171), e61398, doi:10.3791/61398 (2021).

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