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Biology

Medición de la absorción de glucosa estimulada por insulina y contracción en músculo esquelético maduro aislado e incubado de ratones

Published: May 16, 2021 doi: 10.3791/61398
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Section of Molecular Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports, University of Copenhagen, 2Section of Integrative Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports, University of Copenhagen

Summary

La regulación intacta de la absorción de glucosa muscular es importante para mantener la homeostasis de glucosa en todo el cuerpo. Este protocolo presenta una evaluación de la absorción de glucosa estimulada por la insulina y la contracción en el músculo esquelético maduro aislado e incubado al delinear el impacto de varias intervenciones fisiológicas en el metabolismo de la glucosa en todo el cuerpo.

Abstract

El músculo esquelético es un tejido sensible a la insulina y generalmente absorbe la mayor parte de la glucosa que ingresa a la sangre después de una comida. Además, se ha informado que el músculo esquelético puede aumentar la extracción de glucosa de la sangre hasta 50 veces durante el ejercicio en comparación con las condiciones de reposo. El aumento en la absorción de glucosa muscular durante el ejercicio y la estimulación de la insulina depende de la translocación del transportador de glucosa 4 (GLUT4) de los compartimentos intracelulares a la membrana de la superficie de la célula muscular, así como de la fosforilación de la glucosa a glucosa-6-fosfato por la hexoquinasa II. El aislamiento e incubación de músculos de ratón como m. soleus y m. extensor digitorum longus (EDL) es un modelo ex vivo apropiado para estudiar los efectos de la insulina y la contracción inducida eléctricamente (un modelo para el ejercicio) en la absorción de glucosa en el músculo esquelético maduro. Por lo tanto, el modelo ex vivo permite la evaluación de la sensibilidad a la insulina muscular y permite igualar la producción de fuerza muscular durante la contracción, asegurando un reclutamiento uniforme de las fibras musculares durante las mediciones de la absorción de glucosa muscular. Además, el modelo descrito es adecuado para pruebas farmacológicas de compuestos que pueden tener un impacto en la sensibilidad a la insulina muscular o pueden ser de ayuda cuando se trata de delinear la complejidad reguladora de la absorción de glucosa del músculo esquelético.

Aquí describimos y proporcionamos un protocolo detallado sobre cómo medir la absorción de glucosa estimulada por la insulina y la contracción en preparaciones musculares aisladas e incubadas de sóleo y EDL de ratones que utilizan [3H]2-desoxi-D-glucosa y [14C]manitol como marcador extracelular. Esto permite una evaluación precisa de la absorción de glucosa en el músculo esquelético maduro en ausencia de factores de confusión que puedan interferir en el modelo animal intacto. Además, proporcionamos información sobre la viabilidad metabólica del músculo esquelético de ratón incubado, lo que sugiere que el método aplicado posee algunas advertencias bajo ciertas condiciones al estudiar el metabolismo de la energía muscular.

Introduction

El músculo esquelético posee la capacidad de extraer grandes cantidades de glucosa del espacio extracelular en respuesta a la insulina y el ejercicio. Esto ayuda a mantener la homeostasis de glucosa en todo el cuerpo y asegura el suministro de glucosa durante los momentos de alta demanda de energía. Dado que se ha demostrado que la regulación intacta de la absorción de glucosa del músculo esquelético es importante para la salud general y el rendimiento físico 1,2, las mediciones de la absorción de glucosa muscular durante diversas afecciones han recibido mucha atención. En humanos y animales, la pinza hiperinsulinémica-euglucémica se ha utilizado como la técnica estándar de oro para evaluar la sensibilidad a la insulina in vivo 3,4. A diferencia de los hallazgos obtenidos de una prueba de tolerancia oral a la glucosa, la técnica de pinza hiperinsulinémica-euglucémica no requiere una función gastrointestinal intacta o la secreción de insulina del páncreas y, por lo tanto, permite comparar las respuestas a la insulina entre sujetos que exhiben variaciones en la función gastrointestinal y / o pancreática. Las mediciones de la absorción de glucosa muscular in vivo durante el ejercicio en humanos se han realizado con frecuencia desde la década de 19605. Primero mediante el uso de técnicas de equilibrio arteriovenoso6 y más tarde mediante el uso de imágenes de tomografía por emisión de positrones (PET) en combinación con un análogo de glucosa emisora de positrones, por ejemplo, 18F-fluoro-desoxi-glucosa7. En roedores, la absorción de glucosa muscular estimulada por el ejercicio in vivo se realiza típicamente mediante el uso de análogos de glucosa marcados con isótopos radiactivos o estables 8,9,10.

Un método complementario a las mediciones de la captación de glucosa muscular in vivo, es aislar e incubar músculos pequeños de roedores y posteriormente medir la absorción de glucosa utilizando análogos de glucosa marcados con isótopos radiactivos o estables 11,12,13. Este método permite una cuantificación precisa y confiable de las tasas de absorción de glucosa en el músculo esquelético maduro y se puede realizar en presencia de varias concentraciones de insulina y durante la contracción provocada por la estimulación eléctrica. Más importante aún, las mediciones de la absorción de glucosa en el músculo esquelético aislado e incubado son relevantes cuando se investiga el fenotipo metabólico muscular de ratones que se han sometido a diversas intervenciones (por ejemplo, nutrición, actividad física, infección, terapéutica). El modelo de músculo esquelético aislado es también una herramienta adecuada para las pruebas de compuestos farmacológicos que pueden afectar la absorción de glucosa per se y/o modificar la sensibilidad a la insulina12,14. De esta manera, la eficacia de los compuestos diseñados para regular el metabolismo de la glucosa muscular puede ser probada y evaluada en un entorno altamente controlado antes de las pruebas in vivo posteriores en modelos animales preclínicos.

Bajo algunas condiciones, la viabilidad metabólica puede plantear un desafío en el sistema modelo de músculo esquelético aislado e incubado. De hecho, la falta de un sistema circulatorio en los músculos incubados implica que la entrega de sustratos (por ejemplo, oxígeno y nutrientes) depende completamente de la difusión simple entre las fibras musculares y el entorno circundante. Con respecto a esto, es de importancia que los músculos incubados sean pequeños y delgados y, por lo tanto, representen menos barrera para la difusión de oxígeno durante la incubación15. Especialmente durante incubaciones prolongadas durante varias horas, se pueden desarrollar estados hipóxicos debido al suministro insuficiente de oxígeno que resulta en el agotamiento de la energía muscular15. Aunque varios marcadores de viabilidad metabólica en el músculo de rata incubado se han reportado previamente junto con la identificación de variables importantes que ayudan a mantener la viabilidad muscular dela rata 15, todavía se justifica una evaluación exhaustiva de la viabilidad metabólica en pequeños músculos de ratones incubados. Por lo tanto, en la actualidad, el contenido de glucógeno se ha utilizado principalmente como marcador de viabilidad metabólica en el músculo esquelético de ratón incubado16,17.

Aquí describimos un protocolo detallado para medir la absorción de glucosa basal, estimulada por la insulina y la contracción en el músculo sóleo y EDL aislado e incubado de ratones utilizando [3H]2-desoxi-D-glucosa y [14C]manitol como marcador extracelular. En el presente estudio, la absorción de glucosa se midió durante un período de 10 minutos y el método se presenta con el uso de concentraciones de insulina submáxima y máximamente efectivas, así como un protocolo de contracción único. Sin embargo, los protocolos descritos en este documento pueden modificarse fácilmente con respecto al tiempo de incubación, la dosis de insulina y el protocolo de estimulación eléctrica. Además, proporcionamos una caracterización exhaustiva de varios marcadores de viabilidad metabólica en el sóleo incubado y el músculo de ratón EDL. Los resultados indican que la suplementación con glucosa al tampón de incubación es esencial para preservar la viabilidad metabólica del músculo incubado durante 1 hora.

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Protocol

Los procedimientos en los que participen animales de investigación deben realizarse de conformidad con las directrices pertinentes y la legislación local. Todos los experimentos con animales utilizados para este estudio cumplieron con el Convenio Europeo para la Protección de los Animales Vertebrados utilizados para Fines Experimentales y otros Fines Científicos y fueron aprobados por la Inspección Danesa de Experimentación Animal.

1. Preparación del aparato experimental y de los bucles de sutura

NOTA: Para este estudio, utilice un sistema de miógrafo de tira muscular integrado con ganchos de incubación personalizados para incubar músculos esqueléticos de ratón aislados (Figura 1). Este sistema permite que el músculo se bañe en una solución fisiológica con oxigenación continua (95% O2 y 5% CO2) y a temperatura constante. El baño de tejido muscular está acoplado a un transductor de fuerza para la medición de la producción de fuerza muscular durante la contracción. Para obtener y registrar respuestas miomecánicas durante la contracción, emplee un estimulador de pulso eléctrico y un programa de recopilación de datos, respectivamente. Estimular los músculos incubados para que se contraigan mediante electrodos de platino colocados centralmente y a ambos lados del músculo.

  1. Encienda el sistema de miógrafo y caliente las cámaras a 30 °C. Software de recopilación de datos abiertos compatible con el sistema de miógrafo y calibrar transductores de fuerza para garantizar la comparabilidad entre conjuntos de datos.
  2. Comience cortando hebras de ~ 16 cm de sutura de nylon quirúrgico no absorbible. Use fórceps para crear un lazo de aproximadamente 0,4 cm de diámetro a partir de una sola hebra. Repita esto hasta que se hayan producido suficientes bucles. Cada músculo necesita dos asas: una para el tendón proximal y otra para el tendón distal.

2. Preparación de soluciones y medios de incubación

  1. Preparación de medios de incubación basal
    1. Preparar las siguientes soluciones madre: cloruro de sodio de 2,5 M (NaCl, 250 mL), bicarbonato de sodio de 0,5 M (NaHCO3, 250 mL), cloruro de potasio de 0,5 M (KCl, 50 mL), cloruro de calcio de 0,25 M (CaCl2, 50 mL), fosfato de dihidrógeno potásico de 0,25 M (KH2PO4, 50 mL), sulfato de magnesio de 0,25 M (MgSO4, 50 mL), piruvato de sodio de 110 mM (Na-Piruvato, 100 mL), 500 mM D-manitol (100 mL), 1 M 2-desoxi-D-glucosa (4 mL), solución al 15% de albúmina sérica bovina (BSA) dializada contra tampón Krebs-Ringer-Henseleit (KRH) (descrito a continuación en el paso 4) (100 ml).
      NOTA: Se requieren dos soluciones para medir la absorción de glucosa en reposo y estimulada por la contracción. Además, cada concentración de insulina utilizada para evaluar la absorción de glucosa estimulada por insulina requiere dos soluciones. Por lo tanto, en total se necesitan seis soluciones diferentes para medir la absorción de insulina basal, submáxima, insulina máxima y glucosa estimulada por la contracción en el músculo esquelético aislado del ratón. A continuación, "medios de incubación basal" se refiere a los medios sin insulina ni trazadores radiactivos. "Medios de incubación" se refiere a los medios que contienen insulina. «Medio de incubación de captación de glucosa»: medio que contiene 2-desoxi-D-glucosa y trazadores radiactivos, además de insulina, a una concentración idéntica a la utilizada en los «medios de incubación».
    2. Prepare un tampón KRH complementando agua ultrapura (ddH2O) con NaCl (117 mM), NaHCO3 (24.6 mM), KCl (4.7 mM), CaCl2 (2.5 mM), KH2PO4 (1.2 mM) y MgSO4 (1.2 mM). Posteriormente, gasee el tampón KRH con 95% de O2 y 5% de CO2 durante al menos 10 min. El pH deseado del tampón KRH debe estar entre 7.35-7.45 a 30 °C. Si el ajuste del pH se realiza a temperatura ambiente, el pH del tampón KRH debe estar entre 7.25-7.35.
    3. Agregue BSA (0.1%), Na-piruvato (2 mM) y D-manitol (8 mM) al tampón KRH gaseado y ajustado al pH para completar el medio de incubación basal. Almacene los medios de incubación basales en un recipiente sellado para minimizar la desgasificación de O2 y CO2 y coloque los medios a 30 °C.
      NOTA: Por lo general, la osmolaridad de los suplementos de KRH (es decir, Na-piruvato, D-manitol y D-glucosa) se mantiene constante a lo largo de todo un experimento para evitar la contracción o expansión de las células musculares. El protocolo descrito aquí utiliza una osmolaridad de 10 mM para los suplementos de KRH. Si se necesita un tampón que contenga glucosa, reemplace los suplementos de KRH para satisfacer las necesidades, por ejemplo, 5 mM de D-glucosa y 5 mM de D-manitol.
    4. Para evitar posibles contaminantes asociados a BSA en el tampón de incubación, dialice BSA contra KRH.
      1. Para hacer una solución madre de BSA al 15% dializada contra el tampón KRH, comience disolviendo 300 g de BSA libre de grasa de grado analítico en 900 ml de tampón KRH. A continuación, hierva el tubo de diálisis en agua redilada hasta que el tubo esté blando.
      2. Llene el tubo con la solución BSA-KRH y asegure los extremos del tubo. Coloque el tubo con BSA-KRH en 5 L de tampón KRH y déjelo durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, reemplace el tampón KRH y deje el tubo con BSA-KRH en el tampón KRH durante la noche a 4 ° C.
      3. Por último, recoja la solución BSA-KRH de la tubería y agregue el tampón KRH a un volumen final de 2 L (es decir, una solución madre BSA-KRH al 15%). Divida la solución madre de BSA-KRH al 15% en alícuotas y guárdela en el congelador a ~ -20 ° C.
  2. Preparación de medios de incubación que contienen insulina
    1. Para los medios de incubación que contienen una concentración de insulina submáximamente efectiva, agregue 1 μL de una solución madre de insulina de 100 mU/mL por ml de medio de incubación basal (100 μU/mL de insulina).
    2. Para los medios de incubación que contienen una concentración de insulina máxima efectiva, agregue 1 μL de una solución madre de insulina de 10 U / ml por ml de medio de incubación basal (10 ml / ml de insulina).
  3. Preparación de los medios de incubación de captación de glucosa
    PRECAUCIÓN: El manejo de material radiactivo solo está permitido en un área restringida y controlada por personal autorizado y algunas universidades, instituciones de investigación y empresas pueden requerir la adquisición de un "Permiso de Uso de Radiactividad". El material y los desechos deben manejarse de acuerdo con los procedimientos, directrices y legislación locales apropiados.
    1. Siga el mismo procedimiento descrito en la sección 2.1.2.
    2. Agregue BSA (0.1%), Na-piruvato (2 mM), D-manitol (7 mM) y 2-desoxi-D-glucosa (1 mM) al tampón KRH gaseado y ajustado al pH.
    3. Añadir [3H]2-desoxi-D-glucosa (0,028 MBq/mL) y [14C]manitol (0,0083 MBq/mL) al tampón KRH suplementado para completar el medio de incubación de la absorción de glucosa. Conservar a 30 °C. Si [3H]2-desoxi-D-glucosa y [14C]manitol se disuelven en etanol, elimine el etanol por evaporación mediada por N2 antes de su uso.
    4. Para los medios de incubación de captación de glucosa que contienen una concentración de insulina submáximamente efectiva, agregue 1 μL de una solución madre de insulina de 100 mU/mL por ml de medio de incubación de absorción de glucosa (100 μU/mL de insulina).
    5. Para los medios de incubación de captación de glucosa que contienen una concentración de insulina máximamente efectiva, agregue 1 μL de una solución madre de insulina de 10 U/mL por ml de medio de incubación de absorción de glucosa (10 mU/mL de insulina).

3. Animales y disección del sóleo de ratón y músculo EDL para incubación

NOTA: Los procedimientos que involucran animales de investigación deben realizarse de acuerdo con las directrices pertinentes y la legislación local. El procedimiento descrito se puede utilizar con ratones machos y hembras criados internamente o disponibles comercialmente de diversas cepas y antecedentes genéticos. El siguiente procedimiento se proporciona para ratones hembra C57Bl / 6J alimentados. En promedio, los ratones tenían 19 semanas de edad y pesaban 25 g. Los ratones se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h con acceso gratuito a chow de roedores estándar y agua. Los experimentos con animales se iniciaron a ~ 9:00 AM hora local y todos los animales fueron sacrificados en un período de 2 h.

  1. Agregue 4 ml de medios de incubación basal precalentados (30 ° C) a cada cámara de incubación y asegúrese de que los medios de incubación basal estén continuamente oxigenados con 95% de O2 y 5% de CO2.
  2. Anestesiar ratones con una inyección intraperitoneal de pentobarbital (10 mg/100 g de peso corporal) u otra anestesia disponible (por ejemplo, tribromoetanol).
    NOTA: Tenga en cuenta que en algunos países se puede requerir una licencia para manejar pentobarbital y otros medicamentos anestésicos. Antes de que se pueda iniciar la disección muscular, se debe inducir adecuadamente la anestesia de cada animal. Para garantizar esto, se prueban los reflejos de la cola y las piernas. Para obtener resultados óptimos, la disección debe practicarse bien para evitar dañar los músculos durante la extracción.
  3. Coloque los ratones anestesiados propensos en una bandeja de disección (por ejemplo, tapa de espuma de poliestireno) y fije las patas delanteras y traseras, según sea necesario, con una aguja.
  4. Retire la piel de la parte inferior de la pierna y asegúrese de que tanto el tendón de Aquiles como la articulación de la rodilla sean visibles.
    1. Para la disección del músculo sóleo, comience uniendo un solo asa de sutura al tendón de Aquiles. Asegure un pinza de guisante al tendón de Aquiles distalmente del asa de sutura y corte para liberar los músculos sóleo y gastrocnemio de la pata. Deslice cuidadosamente las pinzas de guisantes a través del ratón, exponiendo así el músculo sóleo.
    2. Fije las pinzas de guisantes y coloque un segundo lazo de sutura alrededor del tendón proximal del músculo sóleo. A continuación, corte el tendón proximal y diseccione el sóleo (incluidos los dos asas de sutura unidos) libre de músculo gastrocnemio. Coloque rápidamente el músculo sóleo en la cámara de incubación uniendo cada lazo de sutura a los ganchos respectivos.
  5. Retire la fascia que cubre el m. tibialis anterior (TA) con fórceps. Si se hace correctamente, los tendones distales de los músculos TA y EDL deben ser blancos claros y visibles; y separados el uno del otro.
  6. Cortar el tendón distal del músculo TA y diseccionar el músculo para análisis posteriores (por ejemplo, genotipado). Usando fórceps, libere suavemente el músculo EDL de los tejidos circundantes, pero deje el músculo intacto y no corte los tendones. Coloque un bucle de sutura alrededor del tendón distal y un segundo bucle de sutura alrededor del tendón proximal de EDL.
  7. A continuación, corte los tendones liberando el músculo EDL con dos asas de sutura unidas y coloque rápidamente el músculo en la cámara de incubación uniendo cada lazo de sutura a los ganchos respectivos. Para no perder tensión durante la incubación y especialmente durante la contracción inducida eléctricamente de los músculos sóleo y EDL, es de gran importancia fijar los bucles de sutura alrededor de los tendones con nudos apretados.
  8. Por último, sacrificar al animal mediante, por ejemplo, dislocación cervical.
  9. Cuando los músculos hayan sido diseccionados y colocados en cámaras de incubación, ajuste la tensión en reposo de cada músculo a ~ 5 mN y predicuba los músculos durante al menos 10 minutos antes de iniciar el protocolo experimental.

4. Absorción de glucosa estimulada por insulina en músculo esquelético aislado de ratón

  1. Después del paso 3.9, reemplace los medios de incubación basales con medios de incubación que no contengan insulina (medios de incubación basal), una concentración de insulina submáximamente efectiva o una concentración de insulina máximamente efectiva y déjelos en las cámaras de incubación durante 20 min. Espaciar cada cámara de incubación por 1 min, haciendo así tiempo para la posterior cosecha de músculos.
  2. Al final del período de estimulación de 20 minutos, reemplace el medio de incubación con el medio de incubación de absorción de glucosa que contiene una concentración idéntica de insulina y déjelo en las cámaras de incubación durante 10 minutos, nuevamente con un espacio de 1 minuto entre cada cámara de incubación.
  3. Después de 10 minutos de incubación en los medios de incubación de captación de glucosa, retire suavemente los músculos de las cámaras de incubación y lávelos en medios de incubación basales helados. Posteriormente, seque rápidamente los músculos en papel de filtro antes de que se eliminen los bucles de sutura y los músculos se congelen en nitrógeno líquido. Es imperativo que los músculos incubados se recolecten rápidamente si también se desea investigar varios metabolitos intracelulares y la señalización de proteínas, además de la absorción de glucosa.
  4. Recoger 100 μL del medio de incubación de captación de glucosa de cada cámara de incubación y almacenarlo a -20 °C. La cantidad de radiactividad en estas muestras se incluirá en el cálculo de la absorción de glucosa muscular.

5. Absorción de glucosa estimulada por contracción en músculo esquelético aislado de ratón

NOTA: Para inducir la contracción del músculo esquelético aislado del ratón utilice el siguiente protocolo: 1 tren/15 s, cada tren de 1 s de largo que consiste en pulsos de 0,2 ms entregados a 100 Hz. Sin embargo, otros protocolos similares que provocan la contracción del músculo esquelético aislado del ratón probablemente también funcionarán. Es importante destacar que el voltaje debe ajustarse para generar el máximo desarrollo de fuerza del músculo incubado, que depende de la configuración experimental. Si esto no está asegurado, puede correr el riesgo de que no todas las fibras del músculo se contraigan. A su vez, esto puede inducir sesgo en el conjunto de datos.

  1. Siguiendo el paso 3.9 coloque los electrodos de platino centralmente y a ambos lados de los músculos. Iniciar la contracción de los músculos inmediatamente después de reemplazar los medios de incubación basales con los medios de incubación de captación de glucosa. Si es posible, espacie cada cámara de incubación por 1 minuto, haciendo así tiempo para la posterior cosecha de músculos. Recuerde registrar la producción de fuerza de cada músculo incubado.
  2. Después de 10 minutos de contracción en el medio de incubación de captación de glucosa, retire los electrodos de platino, recoja suavemente los músculos de las cámaras de incubación y lávelos en medios de incubación basal helados. Posteriormente, seque rápidamente los músculos en papel de filtro antes de que se eliminen los bucles de sutura y los músculos se congelen en nitrógeno líquido. Todo el procedimiento de cosecha muscular debe realizarse lo más rápido posible.
  3. Recoger 100 μL del medio de incubación de captación de glucosa de cada cámara de incubación y almacenarlo a -20 °C. La cantidad de radiactividad en estas muestras se incluirá en el cálculo de la absorción de glucosa muscular.

6. Homogeneización y procesamiento del músculo esquelético

NOTA: El procedimiento que se da a continuación para la homogeneización muscular permite determinar tanto la absorción de glucosa como la señalización miocelular mediante western blotting en el mismo conjunto de muestras musculares.

  1. Homogeneizar cada músculo en 400 μL de tampón helado con pH 7,5 que contiene 10% de glicerol, 20 mM de sodio-pirofosfato, 1% de IGEPAL CA-630 (NP-40), 2 mM de fenilmetilsulfonilfluoruro (disuelto en isopropanol), 150 mM de NaCl, 50 mM de HEPES, 20 mM de β-glicerofosfato, 10 mM de fluoruro de sodio (NaF), 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 1 mM de ácido glicoleterdiaminatetraacético (EGTA), 10 μg/ml de aprotinina, 10 μg/ml de leupeptina, 3 mM de benzamidina y 2 mM de ortovanadato de sodio utilizando perlas de acero y un alisador tisular (2 x 45 s a 30 Hz). Gire todos los homogeneizados de extremo a extremo durante 1 h a 4 °C, después de lo cual se centrifugan a 16.000 x g durante 20 min a 4 °C. Recoger el lisado (sobrenadante) que se utiliza para determinar la absorción de glucosa muscular.

7. Determinación de 2-desoxiglucosa radiomarcada y manitol

  1. Agregue 150 μL de cada lisado muscular y 25 μL de los medios de incubación de captación de glucosa de cada cámara de incubación para separar los viales de conteo de centelleo líquido que contienen 2 ml de líquido de centelleo líquido. Además, prepare dos viales de control ciegos que solo contengan 3 ml de líquido de centelleo. Cierre todos los viales y mezcle bien vórtice cada vial durante ~5 s.
  2. Coloque los viales en un contador de centelleo líquido y mida la radiactividad de [3H]2-desoxi-D-glucosa y [14C]manitol de acuerdo con las directrices del fabricante. Registre DPM (desintegraciones por minuto) para cada vial de centelleo líquido.

8. Cálculo de las tasas de absorción de glucosa muscular

  1. Use el lisado del paso 6.1 para medir la concentración total de proteínas en cada muestra muscular utilizando métodos estándar de cuantificación de proteínas (por ejemplo, ácido bicinconinico o ensayos de Bradford). Calcule la cantidad de proteína (mg) añadida a cada vial de centelleo.
    NOTA: La tasa de absorción de glucosa para cada muestra muscular se calcula restando la cantidad de [3H]2-desoxi-D-glucosa localizada en el espacio extracelular de la cantidad total de [3H]2-desoxi-D-glucosa en la muestra muscular utilizando [14C]manitol como marcador extracelular. Se supone que [3H]2-desoxi-D-glucosa y [14C]manitol exhiben propiedades de difusión similares dentro del tejido muscular durante la incubación. Realice los siguientes cálculos:
  2. Comience restando el DPM [3H] y [14C] de las muestras de control ciego de todas las muestras de músculos y medios.
  3. Determinar el espacio extracelular muscular en μL (μL-ECS):
    [14C] MúsculoDPM / ([14C]DPMmedia / Mvol)
  4. Calcule la cantidad de [3H]DPM en el espacio extracelular muscular ([3H]DPMECS):
    μL-ECS × ([3H]DPMmedia / Mvol)
  5. Calcule la cantidad de [3H]DPM en el espacio intracelular muscular ([3H]DPMICS):
    [3H] MúsculoDPM− [3H]DPMECS
  6. Calcular la tasa de absorción de glucosa muscular (μmol / g de proteína / hora):
    [3H] DPMICS / ([3H]DPMmedia / Mvol) / [2-desoxi-D-glucosa])) / mg de proteína) / Th
    NOTA: Para todas las ecuaciones anteriores,
    [14C] Elmúsculo DPM es la cantidad de [14C]radiactividad de manitol en una muestra muscular;
    [14C] Elmedio DPM es la cantidad de [14C]radiactividad de manitol en una muestra de medios;
    [3H] Elmúsculo DPM es la cantidad de [3H]2-desoxi-D-glucosa radiactividad en una muestra muscular;
    [3H] ElmedioDPM es la cantidad de [3H]2-desoxi-D-glucosa radiactividad en una muestra de medios;
    [3H] DPMECS es la cantidad de [3H]2-desoxi-D-glucosa radiactividad en el espacio extracelular muscular;
    [3H] DPMICS es la cantidad de [3H]2-desoxi-D-glucosa radiactividad en el espacio intracelular muscular;
    μL-ECS es el espacio extracelular muscular en μL;
    Mvol es el volumen (μL) de los medios de incubación utilizados para el conteo de centelleo (por ejemplo, '25' como se mencionó anteriormente);
    Th es el factor de tiempo utilizado para calcular las tasas de absorción por hora (es decir, '1/6' al incubar músculos con medios de absorción de glucosa durante 10 min)
  7. Tenga en cuenta este cálculo de ejemplo. El DPM [3H] y [14C] de las muestras de control ciego (17 y 6, respectivamente) se han restado de los valores de DPM mencionados a continuación.
    [14C] MúsculoDPM: 343
    [14C] MediosDPM: 11846
    [3H] MúsculoDPM: 4467
    [3H] MediosDPM: 39814
    Mvol: 25
    mg de proteína: 0,396 (en lisado de proteína muscular de 150 μL)
    [2-desoxi-D-glucosa]: 1 (mM)
    Th: 1/6 (h)
    μL-ECS = 343 DPM / (11846 DPM / 25 μL) = 0,724 μL
    [3H] DPMECS: 0,724 μL × (39814 DPM / 25 μL) = 1153 DPM
    [3H] DPMICS: 4467 DPM - 1153 DPM = 3314 DPM
    Absorción de glucosa: ((3314 DPM / (39814 DPM / 25 μL) / 1 mmol / L) / 0.396 mg de proteína) / (1/6 hora) = 31.53 μmol / g de proteína / hora

9. Análisis SDS-PAGE y western blot

  1. Preparar lisados musculares sóleo y EDL en tampón Laemmli y calentar durante 5 min a 96 °C.
  2. Separe cantidades iguales de proteína muscular por SDS-PAGE en geles auto-fundidos y transfiera las proteínas a las membranas de fluoruro de polivinilideno por sequedad semidry.
  3. Posteriormente, incubar membranas en solución salina tamponada con Tris que contenga 0,05% de tween 20 y 2% de leche descremada y sondear membranas con anticuerpos primarios y secundarios relevantes.
  4. Detectar proteínas con quimioluminiscencia y visualizarlas mediante un sistema de imagen digital.

10. Glucógeno muscular, nucleótidos, lactato, creatina y fosfocreatina

  1. Use ácido perclórico para extraer muestras de EDL y músculo sóleo.
  2. Posteriormente, neutralice las muestras y analícelas en busca de lactato, creatina y fosfocreatina como se describió anteriormente18.
  3. Analizar el contenido de nucleótidos en EDL y músculo sóleo mediante HPLC de fase inversa después de la extracción en ácido perclórico.
  4. Determinar el contenido de glucógeno muscular en el homogeneizado de todo el músculo como unidades de glicosilo después de la hidrólisis ácida por un método fluorométrico como se describió anteriormente18.

11. Estadísticas

  1. Realizar análisis estadísticos con software de análisis estadísticos.
  2. Utilice una prueba de análisis bidireccional de varianza (ANOVA) para evaluar las diferencias estadísticas entre los valores presentados en la Tabla 1.
  3. Utilice pruebas t de Student no emparejadas para evaluar las diferencias estadísticas en la absorción de glucosa entre EDL y soleus dentro de cada grupo presentado en la Figura 2. Presentar los datos como medias ± error estándar de la media (SEM). P < 0,05 se considera estadísticamente significativo.

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Representative Results

Como se muestra en la Figura 2, las tasas de absorción de glucosa basal fueron similares entre el sóleo aislado y el músculo EDL de ratones hembra. Esto también se ha reportado varias veces antesde 12,13,19,20. La absorción de glucosa aumentó en ~ 0.8 y ~ 0.6 veces alcanzando 12 y 9 μmol / g de proteína / h en el músculo sóleo y EDL, respectivamente, en respuesta a una concentración de insulina submáximamente efectiva (100 μU / ml). Este aumento fue aún mayor (~ 4 y ~ 2 veces alcanzando 33 y 19 μmol / g de proteína / h en el músculo sóleo y EDL, respectivamente) cuando los músculos fueron estimulados con una concentración de insulina máximamente efectiva (10 mU / mL). Además, tanto la absorción de glucosa submáxima como la máxima estimulada por insulina fueron significativamente mayores en el músculo sóleo, lo que indica que el músculo sóleo exhibe una mayor sensibilidad a la insulina y capacidad de respuesta en comparación con el músculo EDL. Esto puede estar relacionado con la mayor expresión del transportador de glucosa 4 (GLUT4), así como de la proteína quinasa B (Akt) transductora de señalización de insulina en el músculo sóleo en comparación con el músculo EDL 10,21,22,23,24.

La absorción de glucosa inducida por la contracción fue significativamente mayor en el músculo EDL en comparación con el músculo sóleo (Figura 2), como también se informó anteriormente13,19. Por lo tanto, la absorción de glucosa aumentó en ~ 2 y ~ 2.5 veces alcanzando 14 y 22 μmol / g de proteína / h en el músculo sóleo y EDL, respectivamente, en respuesta a las contracciones inducidas eléctricamente. La Figura 3 muestra la producción máxima de fuerza muscular en el músculo sóleo y EDL durante el período de estimulación de 10 minutos. Como se ha visto y reportado anteriormente19, el músculo EDL genera más fuerza (225 mN en EDL vs. 150 mN en sóleo) durante la parte inicial del período de estimulación. Por otro lado, el músculo EDL exhibe una disminución más rápida en la producción de fuerza en comparación con el músculo sóleo más adelante en el período de estimulación. Estos hallazgos probablemente se deban a la diferencia en la distribución del tipo de fibra entre el músculo sóleo (tipo 1 > tipo 2) y EDL (tipo 2 > tipo 1)25, ya que las fibras tipo 2 generan más fuerza pero fatigan más rápido en comparación con las fibras tipo 126,27.

Para evaluar el efecto de la insulina y la contracción sobre la señalización intracelular en músculo sóleo y EDL aislados, la fosforilación de Akt Thr308, miembro de la familia del dominio TBC1 4 (TBC1D4) Ser588, AMPKα Thr172 y acetil-CoA carboxilasa (ACC) Ser212 se realizó mediante la técnica de western blotting (Figura 4). Como era de esperar, la concentración de insulina submáxima y máximamente efectiva indujo un aumento en la fosforilación de Akt Thr308 y TBC1D4 Ser588, mientras que la contracción indujo un aumento en la fosforilación de AMPKα Thr172 y ACC Ser212. Ni la insulina ni la contracción condujeron a un cambio en el contenido total de proteínas de Akt2, TBC1D4, AMPKα2 y ACC en el músculo sóleo y EDL (Figura 4).

Al examinar varios marcadores de viabilidad metabólica del sóleo incubado y el músculo EDL, observamos una reducción general en los niveles de nucleótidos de adenosina (ATP, ADP, AMP) (~ 15-25%) y creatina (~ 10-35%) independientemente de si los músculos se incubaron en presencia de piruvato o glucosa en comparación con los músculos no incubados (Tabla 1 ). Por otro lado, la caída en los niveles de glucógeno observada en los músculos sóleo y EDL incubados con piruvato se evitó si los músculos se incubaron con glucosa. Curiosamente, sin embargo, observamos que los niveles de monofosfato de inosina (IMP) aumentaron varias veces, pero solo en el músculo sóleo incubado. Los niveles de IMP generalmente aumentan en el músculo durante el estrés metabólico severo a medida que el músculo intenta prevenir la acumulación de AMP convirtiendo AMP en IMP para mantener la relación ATP / ADP28. Esto indica que el músculo sóleo está algo más estresado metabólicamente en comparación con el músculo EDL durante la incubación. Esta noción también está respaldada por los hallazgos de fosforilación elevada de AMPKα Thr172 y ACC Ser212 en el músculo sóleo incubado con piruvato (Figura 5). Es importante destacar que el aumento observado en los niveles de IMP, así como la fosforilación de AMPKα Thr172 y ACC Ser212 disminuyen cuando el músculo sóleo se incuba con glucosa. Por lo tanto, parece ventajoso incubar músculo esquelético aislado en un tampón que contenga glucosa para minimizar las fluctuaciones en los nucleótidos de adenosina y evitar una caída en el glucógeno muscular cuando los músculos se incuban durante un período prolongado de tiempo. Con respecto a la absorción de 2-desoxiglucosa, tenemos evidencia que sugiere que la incubación de los músculos durante 6 a 8 h en presencia de piruvato aumentará las tasas de absorción de glucosa basal / en reposo. La incubación de los músculos en un medio que contiene glucosa parece prevenir dicho aumento en la absorción de glucosa (datos no publicados).

Figure 1
Figura 1: Sistema de incubación. (A) Sistema de miógrafo con cuatro cámaras de incubación individuales. (B) Ganchos de incubación personalizados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Absorción de glucosa en músculo esquelético maduro aislado de ratones. La absorción de 2-desoxiglucosa se determinó en músculos aislados de sóleo (barras negras) y EDL (barras grises) en respuesta a una concentración de insulina submáximamente efectiva (100 μU / mL), una concentración de insulina máximamente efectiva (10 mU / ml) y contracciones inducidas eléctricamente (pulso de 0.2 ms, 100 Hz, 1 s / 15s, 30 V, 10 min). Los datos fueron analizados por la prueba t de Students dentro de cada grupo. ###p<0.001, ##p<0.01 vs. músculo sóleo. Los valores son medias ± SEM. n = 4-6 por grupo. h, hora. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Curvas de fuerza muscular en respuesta a contracciones inducidas eléctricamente. La producción máxima de fuerza durante la estimulación eléctrica se calculó para el músculo sóleo (puntos negros) y EDL (puntos grises). Cada valor individual corresponde a un promedio de los últimos 500 ms de cada período de estimulación de 1-s. Los valores son medias ± SEM. n = 5-6 por grupo. s, segundo. mN, mili-Newton. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Manchas occidentales representativas de la fosforilación Akt Thr308, TBC1D4 Ser588, AMPKα Thr172 y ACC Ser212, así como de la proteína Akt2, TBC1D4, AMPKα2 y ACC. Los análisis de Western blot se realizaron en las muestras de músculo sóleo y EDL del ratón descritas en la Figura 2. B, basal. S, insulina submáximamente efectiva. M, insulina de máxima eficacia. C, contracción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Manchas occidentales representativas de la fosforilación AMPKα Thr172 y ACC Ser212, así como de la proteína AMPKα2 y ACC. Los análisis de Western blot se realizaron en las muestras de músculo sóleo y EDL de ratón descritas en la Tabla 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

no incubados Incubado 1h con piruvato Incubado 1h con glucosa Efectos principales Interacción
Sóleo EDL Sóleo EDL Sóleo EDL
Lactato 1.00 ± 0.01 1.00 ± 0.02 0,96 ± 0,03 0,98 ± 0,02 1,05 ± 0,01 0,99 ± 0,01 - -
Cr 1.00 ± 0.04 1.00 ± 0.06 0,64 ± 0,07 ### 0,76 ± 0,05 ### 0,76 ± 0,07 ## 0,88 ± 0,09 ## p < 0,001 -
PCR 1.00 ± 0.19 1.00 ± 0.06 0,80 ± 0,12 1,13 ± 0,14 0,65 ± 0,31 0,75 ± 0,08 - -
PCr/(Cr + PCr) 1.00 ± 0.20 1.00 ± 0.07 1,17 ± 0,11 1,25 ± 0,12 0,78 ± 0,36 0,92 ± 0,11 - -
ATP 1.00 ± 0.03 1.00 ± 0.02 0,72 ± 0,03 ###,§§§ 0,99 ± 0,03 * 0,81 ± 0,06 ### 0,85 ± 0,04 ## - p < 0,001
ADP 1.00 ± 0.04 1.00 ± 0.04 0,75 ± 0,05 ### 0,92 ± 0,03 ### 0,84 ± 0,04 ## 0,86 ± 0,03 ## p < 0,001 -
AMPERIO 1.00 ± 0.11 1.00 ± 0.12 0,85 ± 0,15 0,79 ± 0,13 0,84 ± 0,18 0,75 ± 0,13 - -
DUENDE 1.00 ± 0.17 1.00 ± 0.30 4.43 ± 0.67 ###,§§§ 0,72 ± 0,29 3.33 ± 1.25 ##,§ 1,08 ± 0,01 - p < 0,001
Relación AMP/ATP 1.00 ± 0.12 1.00 ± 0.13 1,18 ± 0,22 0,81 ± 0,16 1,06 ± 0,23 0,90 ± 0,19 - -
Glucógeno 1.00 ± 0.08 1.00 ± 0.12 0,74 ± 0,07 (#),* 0.80 ± 0.12 (#),* 1,12 ± 0,10 1,10 ± 0,03 p = 0,035 -
pAMPK Thr172 / AMPKα2 1.00 ± 0.10 1.00 ± 0.12 3.26 ± 0.58 ###,***,§§§ 1,55 ± 0,27 1,68 ± 0,19 # 1,36 ± 0,19 - p = 0,002
pACC Ser212 / ACC 1.00 ± 0.18 1.00 ± 0.12 2.22 ± 0.58 ###,**,§§ 0,96 ± 0,21 0,99 ± 0,15 0,83 ± 0,09 - p = 0,030

Tabla 1: Comparación de la viabilidad metabólica de los músculos sóleo y EDL de ratón incubados durante 1 hora en presencia de piruvato de 2 mM o glucosa de 5 mM. Los músculos no incubados fueron diseccionados de animales anestesiados y alimentados antes de ser congelados en nitrógeno líquido. Se incubaron músculos separados durante 1 h en tampón KRH suplementado con BSA (0,1%), Na-piruvato (2 mM) y D-manitol (8 mM), mientras que otros se incubaron durante 1 h en tampón KRH suplementado con BSA (0,1%), D-glucosa (5 mM) y D-manitol (5 mM) antes de congelarse en nitrógeno líquido. Los datos se convirtieron en unidades relativas para resaltar los cambios observados en varios marcadores de viabilidad metabólica. Los valores absolutos de los músculos sóleos y EDL de ratón no incubados se dan a continuación. Lactato (mmol/kg p.p.): 137,53soleus; 139,05EDL. Cr (mmol/kg w.w): 9,35soleus; 8.98EDL. PCr (mmol/kg w.w): 1,50soleus; 5.20EDL. PCr/(PCr+Cr): 13,98soleus; 37.30EDL. ATP (mmol/kg w.w): 3,07soleus; 4.24EDL. ADP (mmol/kg w.w): 0,60soleus; 0,51EDL. AMP (mmol/kg w.w): 0,18soleus; 0,08EDL. IMP (mmol/kg w.w): 0,07soleus; 0,14EDL. Relación AMP/ATP: 0,06soleus; 0,02EDL. Glucógeno (proteína pmol/μg): 77,01soleus; 67,56EDL. Los datos fueron analizados por un ANOVA bidireccional dentro de cada grupo. ###p<0.001, ##p<0.01 y #p<0.05 vs. no incubados. p<0.001, **p<0.01 y *p<0.05 vs incubado 1 h con glucosa. §§§p<0.001, §§p<0.01 y §p<0.05 vs EDL. Los valores son medias ± SEM. n = 12 en el grupo no incubado, n = 4-6 en los grupos incubados. Cr, Creatina; PCr, Fosfocreatina; w.w, peso húmedo; h, hora.

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Discussion

La regulación intacta de la absorción de glucosa en el músculo esquelético es importante para preservar la salud general1. Por lo tanto, la investigación de la absorción de glucosa muscular a menudo sirve como una lectura primaria al evaluar varias intervenciones que alteran la salud. Aquí describimos un método ex vivo para medir la absorción de glucosa en el músculo sóleo y EDL aislado e incubado de ratones en respuesta a la insulina y las contracciones inducidas eléctricamente. El método es rápido y confiable y permite un control preciso del entorno circundante del músculo incubado que permite investigaciones precisas de las tasas de absorción de glucosa muscular aisladas de la influencia potencialmente confusa de las hormonas y sustratos que se pueden encontrar en la sangre. El método se ha utilizado durante varios años en muchos estudios y es ampliamente adoptado por la comunidad de investigación muscular.

El modelo de incubación ex vivo generalmente se ha considerado un método para evaluar la capacidad de transporte de glucosa en lugar de la absorción de glucosa en el músculo esquelético. La capacidad de transporte de glucosa en el músculo incubado se puede determinar midiendo la D-glucosa acumulada durante un período de tiempo. Sin embargo, esto plantea un problema ya que la D-glucosa se metaboliza rápidamente en la célula muscular después de la absorción. Para evitar este problema, el análogo de glucosa 3-O-Metil-D-glucosa (3-MG) se ha utilizado ampliamente para evaluar la capacidad de transporte de glucosa, ya que 3-MG no se metaboliza más dentro de la célula después de ser transportado a través de la membrana de la superficie celular. Por lo tanto, la tasa inicial de 3-MG acumulado intracelular sirve como un índice de capacidad de transporte de glucosa celular per se porque no se ve afectada por otros pasos en las vías metabólicas de la glucosa. Sin embargo, el uso de 3-MG puede constituir un problema ya que 3-MG se acumulará, reduciendo así el gradiente transmembrana para 3-MG y posteriormente reducirá una mayor absorción. Por lo tanto, para obtener una medida de la capacidad de transporte de la membrana, se debe estimar la tasa inicial de absorción de 3 MG. En particular, cuando la capacidad de transporte es alta, esto puede plantear un problema debido al eflujo de 3-MG del músculo29,30. El problema potencial con el eflujo de 3 MG se puede evitar utilizando 2-desoxi-D-glucosa (2-DG). Después del transporte al músculo esquelético, 2-DG es fosforilado por la hexoquinasa II a 2-desoxi-D-glucosa-6-fosfato (2-DG-6P). Como el músculo esquelético carece de glucosa-6-fosfatasa y GLUT4 no puede transportar 2-DG fosforilado, 2-DG-6P quedará atrapado dentro de la célula muscular. A diferencia de la glucosa-6-fosfato, 2-DG-6P es un inhibidor alostérico muy débil de la hexoquinasa II30 que ayuda a mantener el gradiente transmembrana para 2-DG. Por lo tanto, las observaciones han demostrado que la absorción de 2-DG en el músculo incubado (rata) permanece lineal hasta que la concentración intracelular de 2-DG-6P supera los 30 mM, una concentración que reduce la actividad de la hexoquinasa II30. Además, en el músculo esquelético de ratón incubado, la absorción de 2-DG permanece lineal durante ~ 30 minutos cuando las temperaturas de los tampones de incubación son de 37 ° C o menos31. Esto sugiere que 2-DG se puede utilizar para medir la capacidad de transporte de glucosa en lugar de la absorción de glucosa en el músculo incubado, excepto en situaciones en las que las concentraciones de 2-DG-6P se vuelven muy altas (por ejemplo, observadas durante las incubaciones >2 horas con 1 mM 2-DG y una concentración máxima de insulina29,30). La idea de que la absorción de 2-DG probablemente refleja la capacidad de transporte de glucosa también está respaldada por hallazgos que muestran que la absorción máxima de 2-DG estimulada por insulina es similar en el músculo incubado de ratones de tipo salvaje y ratones que sobreexpresan la hexoquinasa II32. Una preocupación potencial cuando se usa 2-DG para mediciones de transporte de glucosa muscular durante la contracción es un aumento en la concentración intracelular de glucosa-6-fosfato debido a una tasa elevada de glucogenólisis. Sin embargo, dado que se observa un aumento lineal en la absorción de 2-DG del músculo (rata) durante la contracción a lo largo del tiempo29, esto indica que la acumulación de glucosa-6-fosfato de la descomposición del glucógeno durante la contracción no interfiere con la actividad de la hexoquinasa II y, por lo tanto, con las tasas de absorción de 2-DG. En base a esto, 2-DG parece muy adecuado para las mediciones del transporte de glucosa en el músculo esquelético aislado durante la insulina y la contracción teniendo en cuenta las limitaciones de 3-MG.

Aunque generalmente se asume que el 2-DG no se metaboliza más después de la fosforilación por la hexoquinasa II, se ha informado que algunos 2-DG se dirigen e incorporan al glucógeno muscular. Por lo tanto, durante una pinza hiperinsulinémica normoglucémica de 2 h en ratas ~ 30% del 2-DG absorbido por el músculo esquelético se incorpora al glucógeno33. Por lo tanto, se podría razonar que las tasas de absorción de 2-DG estimulada por insulina en el músculo esquelético incubado se subestiman si se descuida la acumulación de 2-DG en el glucógeno. Hemos determinado que el protocolo aquí descrito sobre cómo preparar lisados musculares (sobrenadante) para análisis posteriores de las tasas de absorción de 2-DG en el músculo esquelético incubado anteriormente no se ve afectado por la posible incorporación de 2-DG en el glucógeno. Se podría argumentar que el glucógeno se acumula en el pellet al centrifugar todo el músculo homogeneizado para generar lisado para las mediciones de captación de 2-DG. Sin embargo, al comparar los niveles de radiactividad en el homogeneizado muscular entero estimulado por insulina frente al lisado no se detecta ninguna diferencia significativa (datos no publicados). Esto sugiere que la incubación del músculo del ratón durante 10 min en 1 mM de 2-DG no causa una acumulación detectable de 2-DG en el glucógeno.

La determinación de la absorción de 2-DG del músculo esquelético sin considerar que 2-DG se distribuye tanto en el espacio extracelular como en el intracelular conducirá a una sobreestimación de la absorción de 2-DG. Para eludir esto, la L-glucosa debe usarse como un marcador extracelular, ya que no se transporta a través de la membrana celular, sino que exhibe propiedades similares a la D-glucosa, incluida la masa, la solubilidad, la difusión pasiva, la unión, etc. Debido a los costos excesivos de fabricación y, por lo tanto, de compra de L-glucosa, el manitol se usa típicamente como un marcador extracelular ya que el manitol no es absorbido por la célula muscular, es relativamente barato y se estima que tiene un volumen de distribución extracelular algo similar al de la glucosa y 2-DG34.

Los relojes celulares y moleculares intrínsecos parecen desempeñar un papel esencial para la regulación del metabolismo de todo el cuerpo y la homeostasis energética35. Se ha observado que el knockout específico del músculo del gen del reloj central Bmal1 afecta la absorción de glucosa estimulada por insulina en el músculo esquelético aislado del ratón36. Además, la absorción de glucosa submáxima estimulada por insulina del músculo esquelético aislado exhibe ritmo circadiano con la respuesta de insulina más baja y más alta en medio de la fase de luz y oscuridad, respectivamente37. Sobre la base de estos hallazgos, por lo tanto, es importante incorporar el tiempo de sacrificio de animales en el diseño experimental para aumentar la reproducibilidad de los datos.

Una desventaja importante del método ex vivo es la falta de flujo capilar en el músculo aislado. Esto significa que la entrega y eliminación de varios sustratos dependen completamente de la difusión simple entre las fibras musculares y el entorno circundante. En consecuencia, la validación de la viabilidad metabólica del músculo aislado incubado ex vivo se ha centrado en las limitaciones de difusión de oxígeno a las fibras musculares superficiales y profundas. Así, el músculo incubado, particularmente el músculo de ratón altamente metabólico, tiende a desarrollar núcleos hipóxicos en los que se produce la descomposición del glucógeno 16,17,38. En una revisión detallada realizada por Bonen y sus colegas15, se sugirió que los núcleos hipóxicos del músculo incubado probablemente se desarrollan cuando se incuba un músculo demasiado grueso para oxigenarse adecuadamente, especialmente cuando se incuba a temperaturas de ≥ 37 ° C. Esto llevó a la recomendación de que solo los músculos delgados y cilíndricos del ratón, como el sóleo y el EDL, deberían usarse para incubaciones a 25-30 ° C para evitar el desarrollo de núcleos hipóxicos. Esto indica que el grosor y la geometría en lugar de la masa son factores importantes a considerar al incubar los músculos esqueléticos del ratón. Además, se recomendó que la temperatura de incubación, el grosor muscular, así como el contenido de ATP, fosfocreatina y glucógeno y/o la liberación de lactato se midieran e informaran de forma rutinaria para evaluar la viabilidad del músculo incubado15. Hasta donde sabemos, tales análisis completos del músculo incubado se han reportado principalmente parael músculo de la rata 39,40,41,42 y solo en una medida limitada se han reportado para el músculo del ratón16,17. Para aumentar la comprensión de varios marcadores metabólicos de viabilidad en el músculo esquelético de ratón incubado, evaluamos posibles cambios en el contenido intracelular de lactato, creatina, fosfocreatina, nucleótidos de adenosina, glucógeno y señalización de AMPK en el sóleo y el músculo EDL después de 1 hora de incubación en tampón KRH suplementado con glucosa o piruvato. De manera similar a los hallazgos anteriores en el sóleo de ratón incubado y el músculo EDL17, observamos que los niveles de glucógeno disminuyeron cuando los músculos se incubaron en medios libres de glucosa. Esto indica que la ausencia de glucosa durante la incubación promueve la descomposición del glucógeno y la posterior entrada de glucosa-6-fosfato en la glucólisis que puede actuar para asegurar la producción de ATP, en particular si el suministro de oxígeno es inadecuado. Además, encontramos una reducción general en las reservas de nucleótidos ATP y ADP en el sóleo incubado y el músculo EDL. Esto puede implicar que el suministro de oxígeno no es del todo suficiente para satisfacer la demanda de músculo de ratón incubado tanto en presencia como en ausencia de glucosa. Dado que el músculo sóleo oxidativo depende más del oxígeno para la producción de ATP en comparación con el músculo glicolítico EDL, esto sugeriría que el músculo sóleo se ve afectado en mayor medida por el procedimiento de incubación. De acuerdo, encontramos que los niveles intracelulares de IMP, así como la señalización de AMPK, aumentaron notablemente en el sóleo en comparación con el músculo EDL cuando se incubaron en ausencia de glucosa. Esto significa que el músculo sóleo exhibe un mayor grado de estrés metabólico durante la incubación, que debe tenerse en cuenta al evaluar los datos del modelo muscular de ratón ex vivo.

Las células musculares cultivadas, incluyendo L6 y C2C12 inmortalizados, así como los miotubos humanos primarios, se usan comúnmente como sustituto del músculo esquelético maduro para estudiar los efectos de diversas manipulaciones genéticas y farmacológicas en la absorción de glucosa muscular estimulada por insulina. Sin embargo, de varias maneras las células musculares cultivadas no se parecen al músculo esquelético maduro y al comparar los dos sistemas modelo se hacen evidentes numerosas diferencias. Estos incluyen diferencias en la expresión de proteínas, la estructura dimensional, el entorno circundante, el estado de proliferación y diferenciación, la composición del tipo de fibra, los procesos metabólicos y las propiedades funcionales43 , todo lo cual puede afectar la forma en que la célula muscular regula la absorción de glucosa en respuesta a diversos estímulos. Por lo general, se observan mayores efectos relativos de la insulina sobre las tasas de absorción de glucosa en el músculo esquelético maduro en comparación con las células musculares cultivadas44 , lo que puede indicar que las células musculares cultivadas carecen en cierta medida de la maquinaria responsable de regular las tasas de absorción de glucosa, incluido un alto nivel de expresión del transportador de glucosa sensible a la insulina GLUT443 . Teniendo en cuenta las limitaciones y advertencias asociadas con el uso de células musculares cultivadas y músculo esquelético aislado, por lo tanto, es probable que sea ventajoso adoptar un enfoque combinado al estudiar varios procesos metabólicos musculares, como la absorción de glucosa.

Los músculos sóleo y EDL se consideran típicamente como representativos de los músculos de contracción lenta y rápida, respectivamente. Por lo tanto, estos tipos de músculo son ideales para estudios mecánicos que buscan investigar intervenciones que afectan la fuerza muscular y el desarrollo de la fatiga. Además, se informa típicamente que el músculo sóleo tiene una mayor sensibilidad a la insulina y capacidad de respuesta en comparación con el músculo EDL y, por lo tanto, las intervenciones que se dirigen a la sensibilidad a la insulina muscular pueden afectar al sóleo y al EDL de manera diferente. Además, la distribución relativa de los diferentes complejos AMPK difiere entre el sóleo y el músculo EDL que parece afectar la capacidad de los compuestos activadores de AMPK para aumentar la absorción de glucosa muscular. Por lo tanto, es probable que la mayor comprensión de la regulación de la absorción de glucosa muscular se logre si se utilizan los músculos sóleo y EDL durante la experimentación con el modelo de incubación ex vivo.

El método aquí descrito relaciona la absorción de glucosa con la cantidad de abundancia total de proteínas determinada en cada muestra muscular después de la homogeneización. Es nuestra experiencia que la variación disminuye cuando se relaciona la absorción de glucosa por cantidad de proteína muscular en lugar del peso muscular (datos no publicados). Además, la homogeneización de muestras musculares en un tampón utilizado para diversos ensayos bioquímicos permite determinar tanto la captación de glucosa, la señalización miocelular y las actividades enzimáticas en la misma preparación demuestras 45,46. Esto a menudo disminuirá la cantidad de ratones utilizados para un estudio. Sin embargo, la absorción de glucosa se puede determinar fácilmente en muestras de músculo esquelético que se disuelven por calentamiento en hidróxido de sodio (NaOH) seguido de neutralización con cloruro de hidrógeno20. Dado que el tratamiento del músculo con NaOH interfiere con las mediciones de la concentración total de proteínas musculares, el transporte de glucosa medido por este procedimiento debe estar relacionado con el peso muscular.

Basado en varias optimizaciones, nuestro tampón de incubación de absorción de glucosa contiene una actividad específica de 0.028 MBq/mL de [3H]2-desoxi-D-glucosa y 0.0083 MBq/mL de [14C]Manitol. Por un lado, esto reduce la cantidad de lisado (150 de 400 μL) necesaria para obtener mediciones de radiactividad suficientes y confiables. Por otro lado, aumenta la cantidad de [3H]2-desoxi-D-glucosa radiactiva y [14C]manitol necesarios para cada experimento, lo que aumenta los costos experimentales. Por lo tanto, para cualquier configuración experimental es posible regular la cantidad de radiactividad utilizada en los medios de incubación de captación de glucosa para adaptarse a requisitos específicos. Sin embargo, se debe tener cuidado de no disminuir la cantidad de radiactividad en el tampón de incubación en una medida que haga que las mediciones de radiactividad no sean confiables. Esto se garantiza manteniendo la radiactividad en las muestras por encima de los límites de detección especificados de la maquinaria de conteo de centelleo líquido utilizada.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Consejo Danés para la Investigación Independiente - Ciencias Médicas (FSS8020-00288B) y la Fundación Novo Nordisk (NNF160C0023046). Este trabajo también fue apoyado por una beca de investigación a Rasmus Kjøbsted de la Academia Danesa de Diabetes, que está financiada por la Fundación Novo Nordisk, número de subvención NNF17SA0031406. Los autores desean agradecer a Karina Olsen, Betina Bolmgren e Irene Bech Nielsen (Departamento de Nutrición, Ejercicio y Deportes, Facultad de Ciencias, Universidad de Copenhague) por su hábil asistencia técnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[14C]D-mannitol American Radiolabeled Chemicals, Inc. ARC 0127
[3H]2-deoxy-D-glucose  American Radiolabeled Chemicals, Inc. ART 0103A
2-Deoxy-D-glucose Sigma D8375
4-0 USP non-sterile surgical nylon suture Harvard Apparatus 51-7698
Streptavidin/HRP (Conjugate) DAKO P0397 Used to detect ACC protein
Akt2 antibody Cell Signaling 3063
AMPKα2 antibody Santa Cruz SC-19131
aprotinin Sigma A1153
benzamidine Sigma B6505
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7030
CaCl2 Merck 1020831000
Calibration kit (force) Danish Myo Technology A/S 300041
Chemiluminescence Millipore WBLUF0500
D-Glucose Merck 1084180100
D-Mannitol Sigma M4125
Data collection program National Instruments LabVIEW software version 7.1
Dialysis tubing Visking DTV.12000.09 Size No.9
Digital imaging system BioRad ChemiDoc MP
EDTA Sigma EDS E9884
EGTA Sigma E4378
Electrical Pulse Stimulator Digitimer D330 MultiStim System
Glycerol Sigma G7757
HEPES Sigma H7637
IGEPAL CA-630  Sigma I8896
Insulin Novo Nordisk Actrapid, 100 IE/mL
KCl Merck 1049361000
KH2PO4 Merck 104873025
leupeptin Sigma L2884
MgSO4 Merck 1058860500
Muscle Strip Myograph System Danish Myo Technology A/S Model 820MS
Na-Orthovanadate Sigma S6508
Na-Pyrophosphate Sigma 221368
Na-Pyruvate Sigma P2256
NaCl Merck 106041000
NaF Sigma S1504
NaHCO3 VWR 27778260
pACC Ser212 antibody Cell Signaling 3661
pAkt Thr308 antibody Cell Signaling 9275
pAMPK Thr172 antibody Cell Signaling 2531
phenylmethylsulfonylfluoride Sigma P7626
Platinum electrodes Danish Myo Technology A/S 300145
pTBC1D4 Ser588 antibody Cell Signaling 8730
Scintillation counter Perkin Elmer Tri-Carb-2910TR
Scintillation fluid  Perkin Elmer 6013329
Statistical analyses software Systat SigmaPlot version 14
TBC1D4 antibody Abcam ab189890
TissueLyser II  Qiagen 85300
Ultrapure water Merck Milli-Q Reference A+ System
β-glycerophosphate Sigma G9422

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References

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Biología Número 171 músculo esquelético transporte de glucosa absorción de glucosa sensibilidad a la insulina contracción explante ex vivo in vitro incubación trazadores de glucosa radiactivos 2-desoxi-D-glucosa
Medición de la absorción de glucosa estimulada por insulina y contracción en músculo esquelético maduro aislado e incubado de ratones
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Kjøbsted, R., Kido, K., Larsen, … More

Kjøbsted, R., Kido, K., Larsen, J. K., Jørgensen, N. O., Birk, J. B., Hellsten, Y., Wojtaszewski, J. F. P. Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice. J. Vis. Exp. (171), e61398, doi:10.3791/61398 (2021).

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