Summary
在这里，我们描述了一个协议，定量地研究海马神经元的轴向初始段 （AIS） 的组装和结构，由于没有一个巨大的安基林-G，缺乏预组装的 AIS。
Abstract
神经元轴星初始片段 （AIS） 是行动潜力的启动点，并对其分子结构、组装和活动依赖可塑性进行了广泛的研究。AIS的主要组织者巨型安基林-G直接与膜跨电压门控钠（VSVG）和钾通道（KCNQ2/3）以及186 kDa神经法辛（L1CAM细胞粘附分子）关联。巨型安基林-G还与细胞质AIS分子结合并招募，包括β-4-光谱素，以及微管结合蛋白EB1/EB3和Ndel1。巨型安基林-G足以在安基林-G缺乏神经元中拯救AIS的形成。Ankyrin-G 还包括一个较小的 190 kDa 等位体，位于树突状脊柱，而不是 AIS，它无法瞄准 AIS 或在安基林 - G 缺乏神经元中拯救 AIS。在这里，我们描述了一个协议，使用培养海马神经元从ANK3-E22/23-flox小鼠，当与Cre-BFP的传输显示失去所有同位素-G和损害AIS的形成。 结合经过改造的银行家胶质/神经元共培养系统，我们开发了一种用480 kDa安基林-G-GFP质粒来传输安基林-G空神经元的方法，这足以挽救AIS的形成。我们进一步采用了由Salzer及其同事开发的量化方法，以处理AIS与海马神经元培养物中发生的神经元细胞体距离的变化。该协议允许对 AIS 的无组件和动态行为进行定量研究。
Introduction
轴向初始段位于大多数脊椎动物神经元的近轴。在功能上，AIS 是由于该地区电压门钠通道的高密度而启动行动潜力的地方。一些兴奋神经元的AIS也通过形成GABAergic突触1，2，3成为抑制性内质体的目标。因此，AIS 是集成细胞信号和调节神经元兴奋性的关键站点。AIS 通常长度为 20-60 μm，位于细胞体的 20μm 范围内。AIS的长度和位置在大脑区域的神经元以及同一神经元4、5的不同发育阶段各不相同。累积的证据表明，AIS的组成和位置是动态的，以响应神经元活动的变化4，5，6，7。
480 kDa安基林-G是AIS的主要组织者。480 kDa 安基林-G 是一种膜相关适配器蛋白，直接与电压门控钠通道以及其他主要 AIS 蛋白质（包括β4-spectrin） 结合， KCNQ2/3 通道调节钠通道活性8、9和 186 kDa 神经法辛，L1CAM 将 GABAergic 突触导导到 AIS2、10。480 kDa 安基林-G 共享在短 190 kDa 安基林-G 等形形式 （ANK 重复， 幽灵绑定域， 监管域） 中发现的规范安基林域， 但由一个巨大的外显子区分， 只存在于脊椎动物中， 并特别表示在神经元 （图 1A）11，12。AIS形成12需要480 kDa安基林-G神经元特定域（NSD）。190 kDa 安基林-G 不促进 AIS 组装或目标 AIS 在安基林 - G - 空神经元12。然而，190 kDa安基林-G集中在AIS包含480千达安基林-G12。190 kDa 安基林-G 瞄准野生类型神经元预组装 AIS 的能力在文献中引起了混乱，并减缓了对 AIS 组装中 480 kDa ankyrin-G 关键专业功能的欣赏。因此，在缺乏预组装AIS的安基林-G-空神经元中研究AIS组件至关重要。
在这里，我们提出了一种方法，利用来自ANK3-E22/23-flox小鼠的培养海马神经元来研究AIS的组装和结构，该神经元消除了安基林-G13的所有等形形式（图1B）。通过在AIS组装之前用Cre-BFP结构传输神经元，我们生成了完全缺乏AIS的安基林-G缺乏神经元（图1B，图2）。AIS 的组装在与 Cre-BFP 质粒共同传输 480 kDa 安基林 - G - GFP 质粒后完全获救。此方法提供了在非预组装 AIS 环境中研究 AIS 装配的方法。我们还修改了Gary Banker的胶质-神经元共同培养系统，没有使用抗生素，以前为胚胎日18神经元设计，用于产后小鼠神经元，并调整AIS量数方法，平均AIS测量从多个神经元，以正常化AIS14，15的变化。
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Protocol
注：这种产后0天ANK3-E22/23f/f小鼠的海马神经元培养方法改编自加里·班克的胶质/神经元共同培养系统。因此，使用消毒工具在清洁罩中进行解剖后执行所有步骤至关重要。此协议最多需要 1 个月。工作流程显示在图3 中。该协议遵循杜克大学的动物指南。
1. 准备盖片和神经元电镀菜肴
- 在文化日前至少一周，盖片架上的负载盖片，并浸泡在硝酸（70%W/W）过夜（可延长数天）。
- 在玻璃罐中的低速摇床上用蒸馏水清洗硝酸处理的盖片 2 次，每次 1 小时。
- 在饱和的KOH中孵化盖片，在100%乙醇中溶解过夜。将KOH加入乙醇中，直到乙醇不再溶解。
- 用蒸馏水重复洗涤步骤。用100%乙醇冲洗一次，每次10分钟。
- 将盖片从机架转移到玻璃烧杯上。用铝箔盖住烧嘴。在 225 °C 烤箱中烘烤盖片过夜，以消毒盖片。（盖片可以储存在烧嘴中数周）。
- 将盖片放在培养皿中，然后在盖片上涂抹 3-4 个蜡点作为脚。使用巴斯德移液器浸入玻璃瓶中的煮蜡中。然后快速触摸盖滑以创建点。一个60毫米的培养皿可以容纳4个盖片。一个10毫米的培养皿可以容纳约10盖片。
- 在培养日前2天，涂层盖（带蜡点的侧面），滤芯在0.1 M玻酸（pH 8.5）中消毒1毫克/毫升聚L-lysine，最少6小时，每次用水冲洗2次，1小时。盖片仍保留在同一个培养皿中。
- 将电镀介质（MEM 辅以葡萄糖 0.6% （wt/vol） 和 10% （vol/vol） 马血清）缓慢添加到板中，而不会干扰盖片。将盘子放入孵化器中，直到培养日播种神经元。
2. 准备胶质细胞喂食器菜肴（文化日前2周）
- 从产后1天大的老鼠大脑中分离皮层，剥去脑膜。
- 在干净的培养皿中用干净的剪刀在干净的长凳上尽可能精细地切开皮层组织。
- 将切碎的组织转移到 12 mL 的 HBSS 中，并添加 1.5 mL 的 2.5% trypsin 和 1% （wt/vol） DNase。在37°C的水浴中孵化15分钟，每5分钟摆动一次。消化良好的组织变得粘稠，形成一个大集群。用10mL移液器修剪10-15次，分解组织，获得更好的消化。
- 用 5 mL 移液器对消化良好的组织进行 10-15 次修剪，直到大多数块消失，介质变成多云。通过细胞过滤器去除剩余的块，并添加15mL的胶质介质（最小基本介质（MEM），辅以葡萄糖（0.6%wt/vol），10%（vol/vol）马血清和青霉素-链霉素（1x），以阻止消化。
- 以120 x g 的离心力将细胞分化5分钟，并吸气超自然。在细胞培养皿中用新鲜的胶质介质和种子（约105 个细胞/厘米2）补充细胞颗粒。
- 第二天用新鲜胶质介质替换介质，以去除未连接的细胞。
- 每3-4天用新鲜的胶质中等喂养一次格利亚菜肴。用手拍打烧瓶 5-10 次，在更换介质之前拆开松散连接的细胞。
- 经过10天的培养，胶质细胞应该几乎汇合。分离胶质细胞与0.25%的三氯辛-EDTA和种子约105 细胞在一个新的60毫米细胞培养盘。剩余的细胞可以冷冻供将来使用。
- 在文化日前3天，将胶质介质更改为神经元培养介质（神经巴沙-A介质，1x谷胱甘肽-I和1x B27补充剂）。
3. 文化海马神经元
注：所有步骤均在室温下执行。
- 解剖 6-8 海马从产后 1 天大的幼崽从 ANK3- E22/23f/f 小鼠与 HBSS 介质在房间温带的培养皿.用解剖剪刀将海马切成更小的碎片。将海马从培养皿转移到 15 mL 管。
- 用5mL的HBSS在管中清洗海马2倍。洗完后将海马放在 4.5 mL 的 1x HBSS 中。
- 将 0.5 mL 的 2.5% trypsin 添加到 4.5 mL 的 HBSS 中，并在 37 °C 的水浴中孵育 15 分钟。每5分钟倒置一次管子。消化良好的海马应该变得粘稠，并形成一个集群。如果需要，再延长消化5分钟。
- 用 HBSS 清洗海马 3 次，每次 5 分钟。 不要 使用真空来去除 HBSS。这是很容易删除海马。
- 洗涤后加入 2 mL 的 Hbss， 用巴斯德移液器上下吹海马 15 次。
- 用火抛光的巴斯德移液器（开口的直径缩小一半）对组织进行10次修剪。即使还剩下大块， 也不要 超过 10 倍。过度谢林会杀死神经元。
- 将管子休息5分钟，直到所有块设置到底部。轻轻使用 1 mL 移液器尖端将含有分离神经元的超自然分子转移到电镀盘（105 个细胞/60 mm 盘）。直接将其添加到预孵化电镀介质中，轻轻摇动板。
- 重复步骤 3.6-3.7 与剩余的块，直到大多数块消失。
- 播种后2-4小时，用光显微镜检查电镀盘。大多数神经元应该附着在盖唇上。附加的细胞是圆的和明亮的。翻转盖片使用精细的尖钳到胶质细胞馈线菜肴与预先有条件的神经元培养介质与蜡点侧朝下。
- 神经元可以在胶质细胞喂食器中生长长达1个月。每7天用1mL的新鲜神经元培养介质喂养神经元。
- 可选步骤：播种后1周，将细胞辛阿拉比诺赛德（1-β-阿拉比诺富拉诺西洛西托辛）加入最终浓度为5μM，以抑制胶质增殖。
4. 在神经元发育的早期阶段， 安基林 - G 被击倒对 Ais 的破坏
- 在3分（ 体外日），翻转盖片与蜡点侧面朝上到胶质细胞馈线盘与条件神经元培养介质。
- 将 0.25 μg Cre-BFP DNA 与 0.5μg 的安基林 G-GFP （WT/突变）DNA 混合在 1.7 mL 管中，以传输 4 个盖片（DNA 拷贝编号的比例为 2：1）。添加 100 μL 的文化介质（例如，Opti-MEM），混合并放在架子上。如果只有 Cre-BFP 被转染，GFP 质粒骨干用于匹配 DNA 的总量。
- 在新的 1.7 mL 管中将 3μL 的转染试剂（例如 2000 年脂质胺）（DNA 的 3 倍）与 100μL 培养介质混合。在 RT 孵化 5 分钟。
- 将步骤 4.2 中的 100 μL DNA 溶液与步骤 4.3 中的 100 μL 的传染试剂混合。在机架上休息5-10分钟。
- 通过在不接触盖片的情况下插入介质正下方的尖端，从每个盖片顶部的步骤 4.4 中添加 50 μL 的 DNA 混合。缓慢地进行移液，以避免DNA混合物的传播。
- 慢慢地将菜带回孵化器，孵育30-45分钟。
- 翻转盖片回到家庭胶质喂食盘与蜡点侧朝下，并把盘子放回孵化器。
5. 轴向初始段的量化
- 按照标准免疫细胞化学协议修复7-10分的神经元，并使用AIS标记染色，以获得有趣的蛋白质。
- 用所需的显微镜收集荧光图片。
- 以 Z 系列部分来收集整个 AIS 的信号。对于所有图片保持相同的 Z 深度。
- 调整激光强度以达到最佳像素强度动态范围。
- 确保所有 AIS 图片都在同一显微镜设置上拍摄。
- 始终检查克里-BFP的信号。
- AIS量化
- 与斐济（https://fiji.sc）的开放图片。
- 生成 Z 系列图像的最大投影。
- 从图像中减去空盖滑动背景信号。
- 沿着 AIS 画一条线。线的宽度应完全覆盖 AIS。在AIS信号在背景上方升起之前启动线路，并在它下降到后台后停止。
- 仅测量线的平均像素强度并导出到电子表格（需要 10-15 AIS）。
- 使用根据伯杰等人改编的 MATLAB 脚本生成 AIS 的平均强度曲线。
- 对于每个实验，包括仅克里和克里加野生型480 kDa安基林-G变形神经元作为负和正控制，以确保AIS的淘汰是有效的，救援是成功的。
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Representative Results
一整套实验应包括Cre-BFP仅将转染为负控制，Cre-BFP加480 kDa安基林-G共同变质作为正对照，将非转染条件作为技术控制。在Cre-BFP中，仅控制，变质神经元缺乏AIS标记的积累，包括安基林-G（安克格）、β4-光谱素（β4-光谱素）、神经法辛（Nf）和电压门控钠通道（VSVG）（图4A）16。相比之下，Cre 和 480 kDa 安基林-G 共同传输的神经元已经完全组装了 AIS，该神经元由 AIS 标记（图 4B）显示。与未变质的菜肴进行比较，确认文化质量非常重要。不健康的神经元往往显示异常的AIS结构，如停产或异位AIS（图4C）。
然后，我们展示了一个评估安基林-G人类神经发育障碍突变（ankG-K2864N）如何影响AIS组装（图5）的例子。3 div ANK3-E22/23f/f 神经元与 Cre-BFP 和野生类型 480 kDa 安基林 -G （安克格 - WT） 或 480 kda 安基林 - G 禁止人类突变 （ankG -K2864） 。神经元固定在div7，并染色为安基林-G。图像从10-15个变形神经元和10-15个控制神经元收集在同一盖片上，并以最大强度投影处理。然后，我们在 AIS 上画一条线，如图所示，并测量整个线的平均强度。平均AIS强度后，我们绘制AIS强度从索马到沮丧的轴。AIS 富含蛋白质通常显示来自近轴的信号快速增加，向离轴轴发出的信号缓慢减少。由安基林-G与人类突变体组装的AIS显示信号的增减。但是，当与未变形 AIS 对齐时，突变曲线更宽，曲线峰值较低，表示 AIS 的结构变化。野生类型安基林-G组装AIS与未受感染的AIS紧密对齐。
图1：ANK3-E22/23-弗洛克斯的基因组编辑。 （A） 3 个安基林-G 等位素的蛋白质域的示意图表示。在规范域中，exon 22 和 23 编码区域的位置由行句行记录线指向。（B） 在 ANK3-E22/23-氟化物小鼠中 LoxP 站点的位置由三角形表示。在Cre重组的当前状态下，exon 22 和 23 被删除，并导致安基林 -G 的所有 3 个等形的表达丢失。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：在Cre重组酶的当下，ANK3-E22/23-氟化物神经元中的AIS丢失。 图显示了安基林-G表达和AIS组装在野生类型神经元与ANK3-E22/23f/f神经元的时间框架与Cre变电在3分。
图3：协议的工作流程。请单击此处查看此图的较大版本。
图4：在ANK3-E22/23-氟化物神经元中，由480kda安克格对AIS进行全面救援。3 分神经元的 ANK3-E22/23f/f小鼠被转染为 Cre-BFP （A）或与 Cre-BFP 和野生类型 480 kDa 安基林 G-GFP （B）。神经元固定在7分，染色为安基林-G（安克格）、+4-光谱素（+4）、神经脂素（Nf）和电压门控钠通道（VSVG）。白色箭头指向一个变相神经元的AIS。比例栏为 20 μm。这个数字改编自杨等人16。（C）显示两个不健康的神经元与 tdTM 和 480 kDa 安基林 - G - Gfp 相感染。聚合物的形成（以白色圆和扩大）是不健康神经元的标志。顶部： 480 kda 安基林 - G 出现在非 AIS 区域 （由白色箭头指向。底部：神经元在索马形成3个AIS和异位积累的安基林-G。比例栏为 20 μm。请单击此处查看此图的较大版本。
图5：AIS结构变化的量化。ANK3-E22/23f/f小鼠的 div3 神经元与 Cre-BFP 和野生类型 480 kDa 安基林-G 或 480 kDa 安基林-G-K2864N 发生感染。在7分，神经元被固定和染色为安基林-G。代表性图像显示 AIS 的安基林 -G 信号。绿线和黄线指示绘制AIS强度测量线的位置。白色破折号线绕着转染神经元的细胞体转。比例栏为 20 μm。这两种情况的平均AIS强度单独绘制距离，并与未受感染的细胞（n=10）对齐。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
AIS 的大会由 480 kDa 安基林 - G 组织。然而，安基林-G具有较短的等形，可以瞄准野生型神经元的AIS，这可能导致难以解释AIS装配的结构功能分析。在这里，我们介绍了一种使用来自ANK3-E22/23-flox小鼠的神经元的方法，允许研究AIS的无结。 通过在 3 分与 Cre-BFP 传输，我们消除了安基林-G 的所有内源同位素。我们也可以共同翻译 480 kda 安基林 - G， 以拯救 Ais 的形成。这允许在一个干净的系统中研究AIS的形成。通过进一步采用 Banker 培养系统，在不出现胶质细胞过度生长并发症的情况下提高生存能力，我们可以达到很高的转染效率，这为我们提供了足够的神经元来定量测量 AIS 维度。
此协议中有几个关键步骤。第一个关键步骤是考虑进行转染的最佳时间窗口，这需要足够早，以防止 AIS 的组装，并且足够晚，以达到最高的转染效率。我们尝试了 0 分电波传输， 这给了约 10% 的传输效率与 Cre - bfp 只， 但我们从来没有能够传输 480 kda 安基林 - G 在 0 div 。我们怀疑这是由于质粒的大尺寸（约20kb）。初级培养海马神经元有一个狭窄的转染窗口，这是3-5天之间。AIS 中安基林 -G 的积累从 3 div 开始。当我们在3分时传输Cre-BFP时，在变形神经元（图4A）中未看到AIS形成。我们可以从一个 18 毫米的盖片中得到 10 - 20 个神经元与 480 kda 安基林 - G 的变形。此外，对于共输血救援实验，所有DNA必须在同一促进者下生成，并且必须匹配Cre-BFP和480 kDa安基林-G-GFP的比例。在这个实验中，我们使用了鸡β-actin促进器。
另一个关键步骤是改变银行家文化。银行家文化是为培育胚胎老鼠神经元而发展起来的。为了更好地支持更敏感的小鼠产后海马神经元，我们包括将海马切成小块的步骤，以提高尝试化效率。硝酸治疗后加入KOH治疗进一步降低了玻璃盖片的毒性，帮助神经元连接和生长更好。
剩下的挑战是如何控制安基林-G的表达水平。剂量屏幕有助于确定用于转染的质粒的最佳量。今后，最好使用神经元特异性促进器来控制表达水平。目前的数据分析没有衡量 AIS 的位置。此功能应包含在将来。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢加里·班克博士对神经元培养协议的建议。这项工作得到了霍华德·休斯医学研究所、美国国家卫生研究院的资助和乔治·巴特·盖勒教授职位（V.B）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10xHBSS | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 18mm coverglass (1.5D) | Fisher Scientific | 12-545-84-1D | |
| 190kDa ankyrin-G-GFP | Addgene | #31059 | |
| 2.5% Tripsin without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 480kDa ankyrin-G-GFP | lab made | Provide upon request | |
| ANK3-E22/23f/f mice | JAX | Stock No: 029797 | B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J; |
| B27 serum-free supplement | Thermo Fisher Scientific | A3582801 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cell strainer with 70-mm mesh | BD Biosciences | 352350 | |
| Ceramic coverslip-staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Cre-BFP | Addgene | #128174 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995073 | |
| GlutaMAX-I supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668030 | |
| MEM with Earle’s salts and L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
| Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Poly-L-lysine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 26124-78-7 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 |
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