Summary
Her beskrev vi en protokoll for kvantitativt å studere montering og struktur av axon innledende segmenter (AIS) av hippocampal nevroner som mangler forhåndsmontert AIS på grunn av fravær av en gigantisk ankyrin-G.
Abstract
Neuronal axon innledende segmenter (AIS) er steder for initiering av virkningspotensialer og har blitt grundig studert for deres molekylære struktur, montering og aktivitetsavhengig plastisitet. Giant ankyrin-G, hovedarrangøren av AIS, forbinder direkte med membran-spanning spenning gated natrium (VSVG) og kaliumkanaler (KCNQ2/3), samt 186 kDa neurofascin, en L1CAM celle vedheft molekyl. Giant ankyrin-G binder seg også til og rekrutterer cytoplasmatiske AIS-molekyler, inkludert beta-4-spectrin, og mikrotubulbindende proteiner, EB1/EB3 og Ndel1. Giant ankyrin-G er tilstrekkelig til å redde AIS-formasjon i ankyrin-G mangelfulle nevroner. Ankyrin-G inkluderer også en mindre 190 kDa isoform plassert ved dendritiske spines i stedet for AIS, som ikke er i stand til å målrette mot AIS eller redde AIS i ankyrin-G-mangelfulle nevroner. Her beskrev vi en protokoll ved hjelp av kultiverte hippocampale nevroner fra ANK3-E22/23-floxmus, som, når de ble transfektert med Cre-BFP, viser tap av all isoform av ankyrin-G og svekker dannelsen av AIS. Kombinert en modifisert Banker glia / neuron co-kultur system, utviklet vi en metode for å transfektere ankyrin-G null nevroner med en 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid, som er tilstrekkelig til å redde dannelsen av AIS. Vi bruker videre en kvantifiseringsmetode, utviklet av Salzer og kolleger for å håndtere variasjon i AIS-avstand fra nevroncellelegemene som forekommer i hippocampale nevronkulturer. Denne protokollen tillater kvantitative studier av de novo-samlingen og dynamisk oppførsel av AIS.
Introduction
Axon innledende segmentet er plassert på proksimal axon i de fleste virveldyr nevroner. Funksjonelt er AIS der handlingspotensialer igangsettes på grunn av den høye tettheten av spenningsporterte natriumkanaler i denne regionen. AIS av noen eksitatoriske nevroner er også målrettet av hemmende internuroner gjennom å danne GABAergic synapser1,2,3. Derfor er AIS et kritisk sted for å integrere cellesignalering og modulere eksitabiliteten til nevroner. AIS er normalt 20-60 μm i lengde og ligger innenfor 20 μm av cellekroppen. Lengden og posisjonen til AIS varierer i nevroner på tvers av hjerneregioner, så vel som i forskjellige utviklingsstadier av samme nevron4,5. Akkumulerte bevis antydet at sammensetningen og posisjonen til AIS er dynamiske i å svare på endringen av nevronaktivitet4,5,6,7.
480 kDa ankyrin-G er hovedarrangør av AIS. 480 kDa ankyrin-G er et membran assosiert adapterprotein som direkte binder seg til spenningsportede natriumkanaler samt andre store AIS-proteiner, inkludert beta4-spektrin, KCNQ2/3 kanaler som modulerer natriumkanalaktivitet8,9og 186 kDa neurofascin, en L1CAM som leder GABAergic synapses til AIS2,10. 480 kDa ankyrin-G deler kanoniske ankyrindomener som finnes i den korte 190 kDa ankyrin-G isoform (ANK repetisjoner, spectrin binding domene, regulatorisk domene), men er preget av en gigantisk exon som bare finnes i vertebrater og er spesielt uttrykt i nevroner (Figur 1A)11,12. Det 480 kDa ankyrin-G nevronspesifikke domenet (NSD) er nødvendig forAIS-formasjon 12. 190 kDa ankyrin-G fremmer ikke AIS-montering eller mål-AIS i ankyrin-G-null nevroner12. Imidlertid er 190 kDa ankyrin-G konsentrert ved AIS som inneholder 480 kDa ankyrin-G12. Denne evnen til 190 kDa ankyrin-G til å målrette forhåndsmontert AIS av wildtype nevroner har vært en kilde til forvirring i litteraturen og har bremset verdsettelsen av de kritiske spesialiserte funksjonene til 480 kDa ankyrin-G i AIS-forsamlingen. Derfor er det viktig å studere AIS-montering i ankyrin-G-null nevroner som mangler en forhåndsmontert AIS.
Her presenterer vi en metode for å studere monteringen og strukturen til AIS ved hjelp av dyrkede hippocampale nevroner fra ANK3-E22/23-floxmus som eliminerer alle isoformer av ankyrin-G13 (Figur 1B). Ved å transfektere nevroner med en Cre-BFP-konstruksjon før AIS er montert, genererte vi ankyrin-G-mangelfulle nevroner som helt manglet en AIS (Figur 1B, Figur 2). Monteringen av AIS er fullt reddet etter co-transfection av 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid med en Cre-BFP plasmid. Med denne metoden kan du studere AIS-samlingen i et ikke-forhåndsmontert AIS-miljø. Vi modifiserte også glia-neuron co-kultursystemet fra Gary Banker uten å bruke antibiotika, tidligere designet for embryonale dag 18 nevroner, for søknad om postnatal mus nevroner og tilpasset en AIS-kvantitetsmetode for å gjennomsnittlige AIS-målinger fra flere nevroner for å normalisere variasjonen av AIS14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Denne kulturmetoden for hippocampale nevroner fra postnatal 0-dagers ANK3-E22/23f/f mus er tilpasset Gary Bankers glia/neuron co-kultursystem. Derfor er det viktig å utføre alle trinn etter disseksjon i en ren hette ved hjelp av steriliserte verktøy. Denne protokollen tar opptil 1 måned. Arbeidsflyten vises i figur 3. Protokollen følger dyreretningslinjene til Duke University.
1. Forberedelse av deksler og nevronale plating retter
- Minst en uke før kulturdagen, last dekkerlips på coverlip rack og suge den i salpetersyre (70% W / W) over natten (kan forlenges i flere dager).
- Vask salpetersyrebehandlede deksler med destillert vann på en lavhastighets shaker i en glassburk 2 ganger, 1 time hver.
- Inkubere deksler i mettet KOH oppløst i 100% etanol over natten. Tilsett KOH i etanol til den ikke lenger er oppløst.
- Gjenta vasketrinnet med destillert vann. Skyll deksler med 100% etanol en gang i 10 minutter.
- Overfør deksler fra stativet til et glassbeger. Dekk begeret med aluminiumsfolie. Stek deksler i en ovn på 225 °C over natten for å sterilisere dekslene. (Deksler kan lagres i begeret i flere uker).
- Legg deksler i en Petri-tallerken og påfør deretter 3-4 voks prikker på dekslenelip for å tjene som føtter. Bruk en Pasteur pipette til å dyppe i kokt voks i en glassflaske. Trykk deretter raskt på dekslene for å lage en prikk. En 60 mm Petri-tallerken kan inneholde 4 deksler. En 10 mm Petri-tallerken kan inneholde ~10 deksler.
- 2 dager før kulturdagen dekker frakk (siden med voks prikker) med filter sterilisert 1 mg / ml poly-L-lysin i 0,1 M borsyre (pH 8,5) i minst 6 timer og skyll med vann 2 ganger, 1 time hver gang. Deksler forblir i samme Petri-tallerken.
- Tilsett plating medium (MEM supplert med glukose 0,6% (wt / vol) og 10% (vol / vol) hesteserum) til plater sakte uten forstyrrende deksler. Sett plater i inkubatoren til kulturdagen for å frø nevroner.
2. Forbereder glia cellematerretter (2 uker før kulturdagen)
- Disseker cortex fra en postnatal 1-dagers gammel mushjerne og skrell av meningene.
- Hakk cortexvevet så fint som mulig med en ren saks i en ren Petri-tallerken i en ren benk.
- Overfør det hakkede vevet til 12 ml HBSS og tilsett 1,5 ml 2,5% trypsin og 1% (wt/vol) DNase. Inkuber i et 37 °C vannbad i 15 min, sving hvert 5. Godt fordøyd vev blir klebrig og danner en stor klynge. Triturat 10-15 ganger med en 10 ml pipette for å bryte vevet ned og få bedre fordøyelse.
- Triturat det godt fordøyde vevet 10-15 ganger med en 5 ml pipette til de fleste biter forsvinner og mediet blir overskyet. Gå gjennom en cellesil for å fjerne gjenværende biter og tilsett 15 ml glia medium (Minimalt viktig medium (MEM) supplert med glukose (0,6% wt / vol), 10% (vol / vol) hesteserum og Penicillin-Streptomycin (1x) for å stoppe fordøyelsen.
- Sentrifuger cellene ved 120 x g i 5 minutter og aspirer supernatanten. Resuspend cellepellet med frisk glia medium og frø i cellekultur retter (ca 105 celler / cm2).
- Erstatt medium med frisk glia medium neste dag for å fjerne uattrliggende celler.
- Fôr glia-rettene hver 3-4 dager med frisk glia medium. Slå kolben 5-10 ganger med en hånd for å løsne løst vedlagte celler før du skifter medium.
- Etter 10 dager med kultur bør gliaceller være nesten sammenfallende. Løsne gliaceller med 0,25% trypsin-EDTA og frø ca 105 celler i en ny 60 mm cellekulturrett. Gjenværende celler kan fryses for fremtidig bruk.
- 3 dager før kulturdagen, endre glia medium til neuronal kultur medium (Neurobasal-A Medium med 1x GlutaMAX-I og 1x B27 supplement).
3. Kultur hippocampal nevroner
MERK: Alle trinn utføres ved romtemperatur.
- Disseker 6-8 hippocampi fra postnatal 1-dagers gamle valper fra ANK3-E22/23f/f mus med HBSS medium i en Petri-tallerken på rommet temperert. Hakk hippocampi med disseksjon saks til mindre stykker. Overfør hippocampi fra Petri-parabolen til et 15 ml rør.
- Vask hippocampi 2x med 5 ml HBSS i røret. La hippocampi i 4,5 ml 1x HBSS etter vask.
- Tilsett 0,5 ml 2,5% trypsin i 4,5 ml HBSS og inkuber i et 37 °C vannbad i 15 minutter. Snu røret hvert 5. Godt fordøyd hippocampi bør bli klebrig og danne en klynge. Om nødvendig, utvid fordøyelsen i 5 minutter.
- Vask hippocampi med HBSS 3 ganger i 5 minutter hver. Ikke bruk vakuum til å fjerne HBSS. Det er veldig enkelt å fjerne hippocampi.
- Tilsett 2 ml HBSS etter vask og pipette hippocampi opp og ned med en Pasteur pipette 15 ganger.
- Triturer vevet med en brannpolert Pasteur pipette (diameteren på det åpne er innsnevret med halvparten) 10 ganger. Ikke gå utover 10 ganger, selv om det fortsatt er biter igjen. Overhør dreper nevroner.
- Hvil røret i 5 minutter til alle biter er satt til bunnen. Bruk forsiktig en 1 ml pipettespiss for å overføre supernatanten som inneholder de dissosierte nevronene til å plate retter (105 celler / 60 mm tallerken). Legg den direkte til det forhåndsinkuberte platingmediet og rist platen forsiktig.
- Gjenta trinn 3.6-3.7 med de resterende delene til de fleste klumpene har forsvunnet.
- 2-4 timer etter sådd, sjekk plating retter med et lett mikroskop. Flertallet av nevroner skal ha festet seg til dekslene. Vedlagte celler er runde og lyse. Vend deksler med en fin spiss tang til glia cellemater retter med prekondisjonert neuronal kultur medium med voks prikker side vendt nedover.
- Nevroner kan vokse i glia cellematerretter i opptil 1 måned. Fôr nevroner hver 7.
- Valgfritt trinn: 1 uke etter sådd, legg cytosin arabinoside (1-β-D-arabinofuranosylcytosin) til en endelig konsentrasjon på 5 μM for å dempe glial spredning.
4. Forstyrrelse av AIS ved knockout av Ankyrin-G på tidligere stadium av nevronutvikling
- På 3 div (dag in vitro), snu dekslene med voks prikker side vendt opp til en glia cellemater tallerken med betinget nevronkultur medium.
- Bland 0,25 μg Cre-BFP DNA med 0,5 μg ankyrin-G-GFP (WT/mutant) DNA i et 1,7 ml rør for å transfektere 4 deksler (~ 2:1-forholdet mellom DNA-kopinummer). Legg til 100 μL kulturmedium (f.eks. Opti-MEM), bland og hvil på et stativ. Hvis bare Cre-BFP er transfektert, brukes GFP plasmid ryggraden til å matche den totale mengden DNA.
- Bland 3 μL transfeksjonsreagens (f.eks. lipofektamin 2000) (~ 3 ganger DNA) med 100 μL kulturmedium i et nytt 1,7 ml rør. Inkuber i 5 minutter på RT.
- Bland 100 μL DNA-løsning fra trinn 4.2 med 100 μL transfeksjonsreagens fra trinn 4.3. Hvil i 5-10 minutter på et stativ.
- Tilsett 50 μL DNA-blanding fra trinn 4.4 rett på toppen av hver deksleslip ved å sette spissen like under mediet uten å berøre dekslene. Pipette sakte for å unngå spredning av DNA-blanding.
- Ta parabolen sakte tilbake til inkubatoren og inkuber i 30-45 minutter.
- Vend dekslene tilbake til gliamaterfatet hjemme med voks prikker side vendt ned og legg platen tilbake til inkubatoren.
5. Kvantifisering av akson innledende segment
- Fest nevroner på 7-10 div og flekk med AIS-markør etter standard immunocytokjemiprotokoll for protein av interessant.
- Samle fluorescerende bilder med ønsket mikroskopi.
- Ta Z-serie seksjoner for å samle signalet fra hele AIS. Behold samme Z-dybde for alle bilder.
- Juster laserintensiteten for å nå det beste dynamiske området for pikselintensitet.
- Kontroller at alle AIS-bilder er tatt på samme mikroskopoppsett.
- Kontroller alltid signalet til Cre-BFP.
- AIS-kvantifisering
- Åpent bilde med Fiji (https://fiji.sc).
- Generer maksimal projeksjon av bilder i Z-serien.
- Trekk det tomme bakgrunnssignalet for omslag fra bildet.
- Tegn en linje langs AIS. Bredden på linjen skal dekke AIS fullstendig. Start linjen før AIS-signalet heves over bakgrunnen og stoppes etter at det faller til bakgrunnen.
- Mål den gjennomsnittlige pikselintensiteten alene linjen og eksporter til et regneark (~ 10-15 AIS er nødvendig).
- Generer gjennomsnittlig intensitetskurve for AIS ved hjelp av MATLAB-skriptet tilpasset fra Berger et al.15.
- For hvert eksperiment inkluderer du Bare Cre og Cre pluss wildtype 480 kDa ankyrin-G transfected neuroner som negative og positive kontroller for å sikre at knockout av AIS er effektivitet og redning er vellykket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et komplett sett med eksperimenter bør inkludere Cre-BFP bare transfeksjon som negativ kontroll, Cre-BFP pluss 480 kDa ankyrin-G co-transfection som positiv kontroll og en ikke-transfektet tilstand som teknikkkontroll. I Cre-BFP bare kontroll mangler transfekterte nevroner akkumulering av AIS-markører, inkludert ankyrin-G (ankG), beta4-spectrin (β4), neurofascin (Nf) og spenningsporterte natriumkanaler (VSVG) (Figur 4A)16. Cre og 480 kDa ankyrin-G co-transfekerte nevroner har derimot fullstendig montert AIS avslørt ved nåtiden av AIS-markører (Figur 4B). Det er viktig å bekrefte kvaliteten på kulturen ved å sammenligne med de ikke-transfekterte rettene. Usunne nevroner har en tendens til å vise unormal AIS-struktur, som utgått eller ektopisk AIS (Figur 4C).
Deretter viste vi et eksempel på å evaluere hvordan en ankyrin-G human nevrodevelopmental lidelse mutasjon (ankG-K2864N) påvirker AIS-montering (Figur 5). 3 div ANK3-E22/23f/f nevroner ble transfektert med Cre-BFP og wildtype 480 kDa ankyrin-G (ankG-WT) eller 480 kDa ankyrin-G baring menneskelig mutasjon (ankG-K2864). Nevroner ble festet ved div7 og farget for ankyrin-G. Bilder ble samlet inn fra 10-15 transfekterte nevroner og 10-15 kontrollnevroner på samme coverlips og behandlet med maksimal intensitetsprojeksjon. Deretter tegner vi en linje på AIS som vist og måler gjennomsnittsintensiteten over linjen. Etter å ha gjennomsnittlig AIS-intensiteten, plotter vi AIS-intensiteten fra soma til den distale axonen. AIS-beriket protein viste normalt en rask økning av signalet fra den proksimale axonen og en langsom reduksjon av signalet til den distale axonen. AIS montert av ankyrin-G med human mutant viste en økning og reduksjon av signalet. Men når den er justert etter den ikke-transfekterte AIS-en, er mutantkurven bredere, og toppen av kurven er lavere, noe som tyder på en strukturendring av AIS. Den ville typen ankyrin-G montert AIS tett på linje med den ikke-transfected en.
Figur 1: Genomisk redigering av ANK3-E22/23-flox. (A) Skjematisk representasjon av proteindomener for 3 ankyrin-G isoformer. Plasseringen av exon 22 og 23 kodede områder i kanonisk domene pekes av bindestreklinjen. (B) Plasseringen av LoxP-steder i ANK3-E22/23-floxmus er indikert ved trekant. I nåtiden av Cre recombinase, exon 22 og 23 er slettet og forårsaker tap uttrykket av alle 3 isoforms av ankyrin-G. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Tap av AIS i ANK3-E22/23-flox nevroner i nåtiden av Cre rekombininase. Et diagram viser tidsrammen for ankyrin-G-uttrykk og AIS-montering i villtype nevroner kontra i ANK3-E22/23f/f nevroner med Cre-transfeksjon ved 3 div. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Protokollarbeidsflyt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: En full redning av AIS av 480kDa AnkG i ANK3-E22/23-flox nevroner transfektert med Cre. 3 div nevroner av ANK3-E22/23f/f mus ble transfektert med Cre-BFP (A) eller med en Cre-BFP og wild type 480 kDa ankyrin-G-GFP (B). Nevroner ble festet ved 7 div og farget for ankyrin-G (ankG), β4-spectrin (β4), neurofascin (Nf) og spenningsporterte natriumkanaler (VSVG). Hvitt pilhode peker mot AIS for en transfektert nevron. Skalalinjen er 20 μm. Denne figuren ble tilpasset fra Yang et al16. (C) To usunne nevroner transfektert med tdTM og 480 kDa ankyrin-G-GFP ble vist. Dannelsen av aggregater (sirklet i hvitt og forstørret) er et tegn på usunne nevroner. Topp: 480 kDa ankyrin-G dukker opp i ikke-AIS-regionen (spiss av hvite pilhoder. Bunn: Neuron dannet 3 AIS og ektopisk akkumulering av ankyrin-G på soma. Skalalinjen er 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Kvantifisering av strukturendring i AIS. div3 nevroner av ANK3-E22/23f/f mus ble transfektert med Cre-BFP og vill type 480 kDa ankyrin-G eller 480 kDa ankyrin-G-K2864N. Ved 7 div ble nevroner festet og farget for ankyrin-G. Representative bilder viser ankyrin-G-signalet på AIS. Den grønne linjen og den gule linjen angir hvor linjen for AIS-intensitetsmåling ble tegnet. Hvit streklinje sirklet rundt cellekroppen til den transfekterte nevronen. Skalalinjen er 20 μm. Gjennomsnittlig AIS-intensitet for begge betingelsene tegnes inn aleneavstand og justeres etter ikke-transfekterte celler (n=10). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Samlingen av AIS er organisert av 480 kDa ankyrin-G. Ankyrin-G har imidlertid kortere isoformer som kan rette seg mot AIS av wildtype-nevroner, noe som kan føre til vanskeligheter med tolkning av strukturfunksjonsanalyser av AIS-montering. Her presenterer vi en metode ved hjelp av nevroner fra ANK3-E22/23-flox mus som tillater studie av de novo montering av AIS. Ved å transfektere med Cre-BFP ved 3 div, eliminerer vi alle endogene isoformer av ankyrin-G. Vi kunne også co-transfekt 480 kDa ankyrin-G for å redde dannelsen av AIS. Dette gjør det mulig å studere AIS-formasjon i et rent system. Ved å ta i bruk bankkultursystemet ytterligere som forbedrer levedyktigheten uten komplikasjoner av glialcelleovervekst, kan vi nå en høy transfeksjonseffektivitet, som gir oss nok nevroner til kvantitativ måling av AIS-dimensjoner.
Det er flere kritiske trinn i denne protokollen. Det første kritiske trinnet vurderer det beste tidsvinduet for å gjøre transfeksjonen, som må være tidlig nok til å forhindre montering av AIS og sent nok til å nå den høyeste transfeksjonseffektiviteten. Vi prøvde 0 div elektroporasjon transfeksjon, som ga ca 10% transfeksjon effektivitet med Cre-BFP bare, men vi var aldri i stand til å transfektere 480 kDa Ankyrin-G på 0 div. Vi mistenker at det skyldes den store størrelsen på plasmidet (ca. 20 kb). Primærkulturerte hippocampale nevroner har et smalt vindu for transfeksjon, som er mellom 3-5 dager. Akkumuleringen av ankyrin-G ved AIS starter fra 3 div. Når vi transfekterer Cre-BFP ved 3 div, ble det ikke sett noen AIS-formasjon i transfekterte nevroner (figur 4A). Vi kunne få 10-20 nevroner transfektert med 480 kDa ankyrin-G fra en 18 mm coverlip. Også for co-transfection redningseksperimentet må alt DNA genereres under samme promotor, og forholdet mellom Cre-BFP og 480 kDa ankyrin-G-GFP må matches. I dette eksperimentet brukte vi kylling beta-actin promotør.
Et annet kritisk skritt er modifikasjonen av bankerkulturen. Bankerkulturen ble utviklet for å dyrke embryonale rottenevroner. For bedre å støtte den mer følsomme musen postnatal hippocampal neuron, inkluderer vi et skritt for å hakke hippocampi i mindre biter for å forbedre trypsiniseringseffektiviteten. Legge koh behandling etter salpetersyre behandling ytterligere redusert toksisitet fra glass dekkerlips, som hjelper nevroner feste og vokse bedre.
En gjenværende utfordring er hvordan man kontrollerer uttrykksnivået til ankyrin-G. En doseringsskjerm bidro til å bestemme den optimale mengden plasmid som brukes til transfeksjon. Fremover er det bedre å bruke en nevronspesifikk promotor for å kontrollere uttrykksnivået. Gjeldende dataanalyse målte ikke plasseringen av AIS. Denne funksjonen bør inkluderes i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Gary Banker for forslag om nevronkulturprotokoll. Dette arbeidet støttes av Howard Hughes Medical Institute, et stipend fra NIH, og et George Barth Geller-begavet professorat (V.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10xHBSS | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 18mm coverglass (1.5D) | Fisher Scientific | 12-545-84-1D | |
| 190kDa ankyrin-G-GFP | Addgene | #31059 | |
| 2.5% Tripsin without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 480kDa ankyrin-G-GFP | lab made | Provide upon request | |
| ANK3-E22/23f/f mice | JAX | Stock No: 029797 | B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J; |
| B27 serum-free supplement | Thermo Fisher Scientific | A3582801 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cell strainer with 70-mm mesh | BD Biosciences | 352350 | |
| Ceramic coverslip-staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Cre-BFP | Addgene | #128174 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995073 | |
| GlutaMAX-I supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668030 | |
| MEM with Earle’s salts and L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
| Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Poly-L-lysine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 26124-78-7 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 |
References
- Nelson, A. D., et al. Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP. Molecular Psychiatry. , (2019).
- Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).
- Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM. Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).
- Hofflin, F., et al. Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332 (2017).
- Schluter, A., et al. Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development. Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).
- Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment. Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).
- Grubb, M. S., Burrone, J. Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability. Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).
- Pan, Z., et al. A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).
- Cooper, E. C. Made for "anchorin": Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).
- Zhou, D., et al. AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing. The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).
- Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier. Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).
- Jenkins, P. M., et al. Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).
- Jenkins, P. M., et al. E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin. Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).
- Kaech, S., Banker, G.
- Berger, S. L., et al. Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment. Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).
- Yang, R., et al. Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).
