Summary
Her beskrev vi en protokol til kvantitativt at studere samlingen og strukturen af axon indledende segmenter (AIS) af hippocampal neuroner, der mangler formonteret AIS på grund af fraværet af en kæmpe ankyrin-G.
Abstract
Neuronal axon indledende segmenter (AIS) er steder for indledning af handling potentialer og er blevet grundigt undersøgt for deres molekylære struktur, samling og aktivitet-afhængige plasticitet. Giant ankyrin-G, master arrangør af AIS, direkte forbinder med membran-spænder spænding gated natrium (VSVG) og kalium kanaler (KCNQ2/3), samt 186 kDa neurofascin, en L1CAM celle vedhæftning molekyle. Giant ankyrin-G binder sig også til og rekrutterer cytoplasmiske AIS molekyler, herunder beta-4-spectrin, og mikrotubule-bindende proteiner, EB1/EB3 og Ndel1. Giant ankyrin-G er tilstrækkelig til at redde AIS dannelse i ankyrin-G mangelfuld neuroner. Ankyrin-G indeholder også en mindre 190 kDa isoform placeret ved dendritiske rygsøjler i stedet for AIS, som er ude af stand til at målrette mod AIS eller redde AIS i ankyrin-G-mangelfuld neuroner. Her beskrev vi en protokol ved hjælp af dyrkede hippocampale neuroner fra ANK3-E22/23-flox mus, som, når de transfected med Cre-BFP udviser tab af alle isoform af ankyrin-G og forringe dannelsen af AIS. Kombineret en modificeret Banker glia / neuron co-kultur system, vi udviklet en metode til at transfekt ankyrin-G null neuroner med en 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid, hvilket er tilstrækkeligt til at redde dannelsen af AIS. Vi anvender desuden en kvantificeringsmetode, udviklet af Salzer og kolleger til at håndtere variation i AIS afstand fra de neuronale cellelegemer, der forekommer i hippocampale neuronkulturer. Denne protokol tillader kvantitative undersøgelser af de novo-samlingen og AIS's dynamiske adfærd.
Introduction
Axon indledende segment er placeret på den proksimale axon i de fleste hvirveldyr neuroner. Funktionelt er AIS, hvor handlingspotentialer indledes på grund af den høje tæthed af spændings-gated natriumkanaler i denne region. AIS af nogle excitatoriske neuroner er også målrettet mod hæmmende interneuroner ved at danne GABAergic synapser1,2,3. Derfor er AIS et kritisk sted at integrere cellesignalering og modulere neuronernes excitabilitet. AIS er normalt 20-60 μm i længden og placeret inden for 20 μm af cellekroppen. Længden og placeringen af AIS varierer i neuroner på tværs af hjerneregioner såvel som i forskellige udviklingsstadier af samme neuron4,5. Akkumuleret dokumentation tyder på , at AIS' sammensætning og position er dynamisk til at reagere på ændringen af neuronal aktivitet4,5,6,7.
480 kDa ankyrin-G er hovedarrangør af AIS. 480 kDa ankyrin-G er et membran associeret adapterprotein, der direkte binder sig til spændingsporterede natriumkanaler samt andre større AIS-proteiner, herunder beta4-spectrin, KCNQ2/3-kanaler, der modulerer natriumkanalaktivitet8,9og 186 kDa neurofascin, et L1CAM, der dirigerer GABAergic synapser til AIS2,10. 480 kDa ankyrin-G aksjer kanoniske ankyrin domæner findes i den korte 190 kDa ankyrin-G isoform (ANK gentager, spectrin bindende domæne, regulerende domæne), men er kendetegnet ved en kæmpe exon, der findes kun i hvirveldyr og er specifikt udtrykt i neuroner (Figur 1A)11,12. Det 480 kDa ankyrin-G neuron specifikke domæne (NSD) er påkrævet for AISformation 12. Den 190 kDa ankyrin-G fremmer ikke AIS forsamling eller mål AIS i ankyrin-G-null neuroner12. 190 kDa ankyrin-G er dog koncentreret på AIS, der indeholder 480 kDa ankyrin-G12. Denne evne til 190 kDa ankyrin-G til at målrette formonteret AIS af wildtype neuroner har været en kilde til forvirring i litteraturen og har bremset forståelsen af de kritiske specialiserede funktioner i 480 kDa ankyrin-G i AIS forsamling. Derfor er det vigtigt at studere AIS-samling i ankyrin-G-null neuroner, der mangler en formonteret AIS.
Her præsenterer vi en metode til at studere AIS's samling og struktur ved hjælp af dyrkede hippocampale neuroner fra ANK3-E22/23-flox mus, der eliminerer alle isoformer af ankyrin-G13 (Figur 1B). Ved at transfektere neuroner med en Cre-BFP-konstruktion, før AIS samles, genererede vi ankyrin-G-mangelfulde neuroner, der helt manglede en AIS (Figur 1B, Figur 2). Samlingen af AIS er fuldt reddet efter co-transfection af 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid med en Cre-BFP plasmid. Denne metode gør det at studere AIS-samlingen i et ikke-formonteret AIS-miljø. Vi har også ændret glia-neuron co-kultur system fra Gary Banker uden at bruge antibiotika, tidligere designet til embryonale dag 18 neuroner, til anvendelse til postnatal mus neuroner og tilpasset en AIS quantitation metode til gennemsnitlige AIS målinger fra flere neuroner til at normalisere variationen af AIS14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Denne kultur metode hippocampal neuroner fra postnatal 0-dages ANK3-E22/23f / f mus er tilpasset fra Gary Banker's glia / neuron co-kultur system. Derfor er det vigtigt at udføre alle trin efter dissektion i en ren hætte ved hjælp af steriliseret værktøj. Denne protokol tager op til 1 måned. Arbejdsprocessen vises i Figur 3. Protokollen følger Duke Universitys retningslinjer for dyr.
1. Tilberedning af coverslips og neuronale plating retter
- Mindst en uge før kulturdagen, belastning coverslips på coverslip rack og suge det i salpetersyre (70% W / W) natten (kunne forlænges i dagevis).
- Vask salpetersyrebehandlede coverslips med destilleret vand på en lav hastighed shaker i en glasburk 2 gange, 1 time hver.
- Inkuber coverslips i mættet KOH opløst i 100% ethanol natten over. Tilsæt KOH i ethanol, indtil det ikke længere er opløst.
- Gentag vasketrinnet med destilleret vand. Skyl coverslips med 100% ethanol en gang i 10 minutter.
- Overfør coverslips fra stativet til et glasbæger. Dæk bægeret med aluminiumsfolie. Bag coverslips i en 225 °C ovn natten over for at sterilisere coverslips. (Coverslips kan opbevares i bægeret i ugevis).
- Placer coverslips i en petriskål og derefter anvende 3-4 voks prikker på coverslip at tjene som fødder. Brug en Pasteur pipette til at dyppe i kogt voks i en glasflaske. Derefter hurtigt røre coverlip at skabe en prik. En 60 mm petriskål kan rumme 4 coverslips. En 10 mm petriskål kan rumme ~10 coverslips.
- 2 dage før kulturdagen, pels coverslips (den side med voks prikker) med filter steriliseret 1 mg/mL poly-L-lysin i 0,1 M borsyre (pH 8,5) i mindst 6 timer og skyl med vand 2 gange, 1 time hver gang. Coverslips forbliver i samme petriskål.
- Der tilsættes forgyldningsmedium (MEM suppleret med glucose 0,6% (wt/vol.) og 10% (vol/vol) hesteserum) til plader langsomt uden at forstyrre dækslet. Sæt plader i inkubatoren indtil kulturdagen til frøneuroner.
2. Forberedelse glia celle feeder retter (2 uger før kultur dag)
- Disseker cortex fra en postnatal 1-dages gamle mus hjerne og skræl af meninges.
- Hak cortexvævet så fint som muligt med en ren saks i en ren petriskål i en ren bænk.
- Det hakkede væv overføres til 12 mL HBSS, og der tilsættes 1,5 mL på 2,5% trypsin og 1% (wt/vol) DNase. Inkuber i et 37 °C vandbad i 15 minutter, sving hvert 5. minut. Godt fordøjet væv bliver klæbrigt og danner en stor klynge. Triturat 10-15 gange med en 10 mL pipette for at bryde vævet ned og få bedre fordøjelse.
- Triturat det godt fordøjede væv 10-15 gange med en 5 mL pipette, indtil de fleste stykker forsvinder, og mediet bliver overskyet. Gå gennem en celle si for at fjerne de resterende stykker og tilsæt 15 ml glia medium (Minimal essentielt medium (MEM) suppleret med glukose (0,6% wt/ vol),10% (vol/ vol) hesteserum og Penicillin-Streptomycin (1x) for at stoppe fordøjelsen.
- Centrifuge cellerne ved 120 x g i 5 minutter og indsug supernatanten. Genbrug cellepillen med frisk glia medium og frø i cellekulturretter (ca. 105 celler/cm2).
- Udskift medium med frisk glia medium den næste dag for at fjerne ikke-vedhæftede celler.
- Foder glia retter hver 3-4 dage med frisk glia medium. Slap kolben 5-10 gange med en hånd for at løsne løst fastgjorte celler, før du skifter medium.
- Efter 10 dages kultur, bør glia celler være næsten sammenflydende. Løsrive glia celler med 0,25% trypsin-EDTA og frø omkring 105 celler i en ny 60 mm cellekultur parabol. Resterende celler kan fryses til fremtidig brug.
- 3 dage før kulturdagen skal du ændre glia medium til neuronal kultur medium (Neurobasal-A Medium med 1x GlutaMAX-I og 1x B27 supplement).
3. Kultur hippocampal neuroner
BEMÆRK: Alle trin udføres ved stuetemperatur.
- Disseker 6-8 hippocampi fra postnatal 1-dages gamle hvalpe fra ANK3-E22/23f/f mus med HBSS medium i en petriskål på værelset tempereret. Hak hippocampi med dissektion saks til mindre stykker. Overfør hippocampi fra petriskålen til et 15 mL rør.
- Vask hippocampi 2x med 5 mL HBSS i røret. Forlad hippocampi i 4,5 mL 1x HBSS efter vask.
- Der tilsættes 0,5 mL på 2,5% trypsin til 4,5 mL HBSS og inkuberes i et 37 °C vandbad i 15 minutter. Vend røret hvert 5. minut. Godt fordøjet hippocampi skal blive klæbrig og danne en klynge. Hvis det er nødvendigt, skal fordøjelsen forlænges i yderligere 5 minutter.
- Vask hippocampi med HBSS 3 gange i 5 minutter hver. Brug ikke et vakuum til at fjerne HBSS. Det er meget nemt at fjerne hippocampi.
- Tilsæt 2 mL HBSS efter vask og pipette hippocampi op og ned med en Pasteur pipette 15 gange.
- Triturat vævet med en brandpoleret Pasteur pipette (diameteren af det åbne er indsnævret med halvdelen) 10 gange. Gå ikke ud over 10 gange, selvom der stadig er stykker tilbage. Overshearing dræber neuroner.
- Hvil røret i 5 minutter, indtil alle stykker er sat til bunden. Brug forsigtigt en 1 mL pipettespids til at overføre supernatanten, der indeholder de dissociated neuroner, til plating retter (105 celler/60 mm skål). Tilsæt det direkte til det forinkuberede plating medium og ryst pladen forsigtigt.
- Gentag trin 3.6-3.7 med de resterende stykker, indtil de fleste af stykkerne er forsvundet.
- 2-4 timer efter såning skal du kontrollere plating-retterne med et let mikroskop. De fleste neuroner burde have knyttet til coverlip. Vedhæftede celler er runde og lyse. Flip coverslips ved hjælp af en fin spids pincet til glia celle feeder retter med forkonditioneret neuronal kultur medium med voks prikker side vender nedad.
- Neuroner kan vokse i glia celle feeder retter i op til 1 måned. Foder neuroner hver 7. dag med 1 mL frisk neuronal kultur medium.
- Valgfrit trin: 1 uge efter såning tilsættes cytosin arabinoside (1-β-D-arabinofuranosylcytosin) til en endelig koncentration på 5 μM for at bremse glialspredning.
4. Afbrydelse af AIS ved Knockout af Ankyrin-G på tidligere stadium af neuron udvikling
- På 3 div (dag in vitro), flip coverlips med voks prikker side vender op til en glia celle feeder parabol med konditioneret neuronal kultur medium.
- 0,25 μg Cre-BFP DNA blandes med 0,5 μg ankyrin-G-GFP (WT/mutant) DNA i et 1,7 mL rør for at transfektere 4 coverlips (~ 2:1 forholdet mellem DNA-kopinummer). Tilsæt 100 μL kulturmedium (f.eks. Opti-MEM), bland og hvil på et stativ. Hvis kun Cre-BFP transfected, GFP plasmid rygraden bruges til at matche den samlede mængde DNA.
- 3 μL transfektreagens (f.eks. Lipofectamin 2000) (~ 3 gange DNA) blandes med 100 μL dyrkningsmedium i et nyt 1,7 mL rør. Inkuber i 5 minutter på RT.
- 100 μL DNA-opløsning blandes fra trin 4.2 med 100 μL transfektreagens fra trin 4.3. Hvil i 5-10 minutter på et stativ.
- Der tilsættes 50 μL DNA-blanding fra trin 4.4 til højre oven på hver coverlip ved at indsætte spidsen lige under mediet uden at røre ved coverlips. Pipette langsomt for at undgå spredning af DNA-mix.
- Bring langsomt skålen tilbage til inkubatoren og inkubat i 30-45 minutter.
- Vend coverslips tilbage til hjemmet glia feeder fad med voks prikker side vender ned og sætte pladen tilbage til inkubatoren.
5. Kvantificering af det oprindelige axonsegment
- Fix neuroner på 7-10 div og plet med AIS markør efter standard immunocytochemistry protokol for protein af interessante.
- Saml fluorescerende billeder med den ønskede mikroskopi.
- Tag Z-serie sektioner for at indsamle signalet fra hele AIS. Hold den samme Z-dybde for alle billeder.
- Juster laserintensiteten for at nå det bedste dynamiske område med pixelintensitet.
- Sørg for, at alle AIS-billeder er taget på den samme mikroskopopsætning.
- Tjek altid signalet fra Cre-BFP.
- AIS-kvantificering
- Åbent billede med Fiji (https://fiji.sc).
- Generer maksimal projektion af Z-serie billeder.
- Træk det tomme coverlip baggrundssignal fra billedet.
- Tegn en streg langs AIS. Stregens bredde skal dække AIS fuldt ud. Start linjen, før AIS-signalet hæves over baggrunden, og stop, når det falder til baggrunden.
- Mål den gennemsnitlige pixelintensitet alene linjen, og eksporter til et regneark (~10-15 AS'er er nødvendige).
- Generer den gennemsnitlige intensitetskurve for AIS ved hjælp af MATLAB-scriptet tilpasset fra Berger et al.15.
- For hvert eksperiment, omfatter Cre kun og Cre plus wildtype 480 kDa ankyrin-G transfected neuroner som negative og positive kontroller for at sikre, at knockout af AIS er effektivitet og redning er vellykket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et komplet sæt af eksperiment bør omfatte Cre-BFP kun transfekt som negativ kontrol, Cre-BFP plus 480 kDa ankyrin-G co-transfection som positiv kontrol og en ikke-transfected tilstand som teknik kontrol. I Cre-BFP mangler transfected neuroner kun akkumulering af AIS-markører, herunder ankyrin-G (ankG), beta4-spectrin (β4), neurofascin (Nf) og spænding gated natriumkanaler (VSVG) (Figur 4A)16. I modsætning hertil har Cre og 480 kDa ankyrin-G co-transfected neuroner fuldt samlet AIS afsløret af den nuværende AIS markører (Figur 4B). Det er vigtigt at bekræfte kulturens kvalitet ved at sammenligne med de ikke-transfected retter. Usunde neuroner har en tendens til at vise unormal AIS-struktur, som udgået eller ektopisk AIS(Figur 4C).
Så viste vi et eksempel på at evaluere, hvordan en ankyrin-G human neuroudviklingsforstyrrelse mutation (ankG-K2864N) påvirker AIS forsamling (Figur 5). 3 div ANK3-E22/23f/f neuroner blev transfected med Cre-BFP og wildtype 480 kDa ankyrin-G (ankG-WT) eller 480 kDa ankyrin-G baring menneskelig mutation (ankG-K2864). Neuroner blev fastsat på div7 og farves for ankyrin-G. Billeder blev indsamlet fra 10-15 transfected neuroner og 10-15 kontrol neuroner på samme coverslips og behandles med maksimal intensitet projektion. Derefter tegner vi en linje ved AIS som vist og måler middelintensiteten på tværs af linjen. Efter gennemsnittet af AIS intensitet, plot vi AIS intensitet fra soma til distal axon. AIS beriget protein viste normalt en hurtig stigning i signalet fra den proksimale axon og et langsomt fald i signalet til distal axon. AIS samlet af ankyrin-G med human mutant viste en stigning og fald i signalet. Men når den er justeret med den ikke-transfected AIS, er den mutante kurve bredere, og toppen af kurven er lavere, hvilket tyder på en strukturændring af AIS. Den vilde type ankyrin-G samlet AIS tæt på linje med den ikke-transfected en.
Figur 1: Den genomiske redigering af ANK3-E22/23-flox. (A) Skematisk repræsentation af proteindomæner for 3 ankyrin-G-isoformer. Placeringen af exon 22 og 23 kodede områder i kanonisk domæne peges af bindestreglinjen. (B) Placeringen af LoxP-steder i ANK3-E22/23-flox-mus er angivet med trekant. I cre rekombinisses nuværende form udgår exon 22 og 23, og udtrykket af alle 3 isoformer af ankyrin-G fortabes. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Tab af AIS i ANK3-E22/23-flox neuroner i den nuværende Af Cre rekombininase. Et diagram viser tidsrammen for ankyrin-G udtryk og AIS samling i vilde type neuroner versus i ANK3-E22/23f / f neuroner med Cre transfection på 3 div. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Protokolarbejdsgang. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: En fuld redning af AIS med 480kDa AnkG i ANK3-E22/23-flox neuroner transfected med Cre. 3 div neuroner af ANK3-E22/23f/f mus blev transfected med Cre-BFP (A) eller med en Cre-BFP og vilde type 480 kDa ankyrin-G-GFP (B). Neuroner blev fastsat til 7 div og farves for ankyrin-G (ankG), β4-spectrin (β4), neurofascin (Nf) og spænding gated natriumkanaler (VSVG). Hvid pilespids peger på AIS af en transfected neuron. Skalabjælken er 20 μm. Dette tal blev tilpasset fra Yang etal. 16. (C) To usunde neuroner transfected med tdTM og 480 kDa ankyrin-G-GFP blev vist. Dannelsen af aggregater (cirkel i hvid og forstørret) er et tegn på usunde neuroner. Øverst: 480 kDa ankyrin-G dukker op i ikke-AIS-regionen (peget af hvide pilespidser. Nederst: Neuron dannede 3 AIS og ektopisk akkumulering af ankyrin-G på soma. Skalabjælken er 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Kvantificering af strukturændringer i AIS. div3 neuroner af ANK3-E22/23f/f mus blev transfected med Cre-BFP og vilde type 480 kDa ankyrin-G eller 480 kDa ankyrin-G-K2864N. Ved 7 div blev neuroner fastgjort og farvet til ankyrin-G. Repræsentative billeder viser ankyrin-G-signalet på AIS. Den grønne linje og den gule linje angiver, hvor linjen for AIS-intensitetsmåling blev tegnet. Hvid bindestreg kredsede cellekroppen af den transfected neuron. Skalabjælken er 20 μm. Den gennemsnitlige AIS-intensitet for begge forhold afbildes aleneafstand og justeres med ikke-transficerede celler (n=10). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Samlingen af AIS er organiseret af 480 kDa ankyrin-G. Ankyrin-G har dog kortere isoformer, der kan målrettes mod AIS af wildtype neuroner, hvilket kan føre til vanskeligheder med fortolkning af strukturfunktionsanalyser af AIS-samling. Her præsenterer vi en metode ved hjælp af neuroner fra ANK3-E22/23-flox mus, der gør det muligt at studere de novo samling af AIS. Ved at transfectere med Cre-BFP ved 3 div eliminerer vi alle endogene isoformer af ankyrin-G. Vi kunne også co-transfect 480 kDa ankyrin-G for at redde dannelsen af AIS. Dette gør det muligt at studere AIS-dannelse i et rent system. Ved yderligere at vedtage Banker kultur system, som forbedrer levedygtigheden uden komplikationer af glial celle over-vækst, kunne vi nå en høj transfekt effektivitet, som giver os nok neuroner til kvantitativ måling af AIS dimensioner.
Der er flere kritiske trin i denne protokol. Det første kritiske skridt er at overveje det bedste tidsvindue til at udføre transfekten, som skal være tidligt nok til at forhindre samling af AIS og sent nok til at nå den højeste transfekteffektivitet. Vi prøvede kun 0 div elektroporationstransfekt, hvilket gav ca. 10% transfekteffektivitet med Cre - BFP, men vi var aldrig i stand til at transfect 480 kDa Ankyrin - G ved 0 div. Vi formoder, at det skyldes plasmidets store størrelse (ca. 20 kb). Primære dyrkede hippocampale neuroner har et smalt vindue til transfekt, som er mellem 3-5 dage. Akkumuleringen af ankyrin-G på AIS starter fra 3 div. Da vi transfekt Cre-BFP ved 3 div, ingen AIS dannelse blev set i transfected neuroner (Figur 4A). Vi kunne få 10-20 neuroner transfected med 480 kDa ankyrin-G fra en 18 mm coverslip. For co-transfection redningseksperimentet skal alt DNA også genereres under samme promotor, og forholdet mellem Cre-BFP og 480 kDa ankyrin-G-GFP skal matches. I dette eksperiment brugte vi kylling beta-actin promotor.
Et andet kritisk skridt er ændringen af Banker kultur. Bankkulturen blev udviklet til dyrkning af embryonale rotteneuroner. For bedre at understøtte den mere følsomme mus postnatal hippocampal neuron, inkluderer vi et trin til at hakke hippocampi i mindre stykker for at forbedre trypsiniseringseffektiviteten. Tilføjelse koh behandling efter salpetersyre behandling yderligere reduceret toksiciteten fra glasset coverslips, som hjælper neuroner vedhæfte og vokse bedre.
En resterende udfordring er, hvordan man styrer udtryksniveauet for ankyrin-G. En doseringsskærm hjalp med at bestemme den optimale mængde plasmid, der bruges til transfekt. Fremadrettet er det bedre at bruge en neuron-specifik promotor til at kontrollere udtryksniveauet. Den aktuelle dataanalyse målede ikke AIS' stilling. Denne funktion bør indgå i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Gary Banker for forslag om neuronal kultur protokol. Dette arbejde er støttet af Howard Hughes Medical Institute, et tilskud fra NIH, og en George Barth Geller begavet professorat (V.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10xHBSS | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 18mm coverglass (1.5D) | Fisher Scientific | 12-545-84-1D | |
| 190kDa ankyrin-G-GFP | Addgene | #31059 | |
| 2.5% Tripsin without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 480kDa ankyrin-G-GFP | lab made | Provide upon request | |
| ANK3-E22/23f/f mice | JAX | Stock No: 029797 | B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J; |
| B27 serum-free supplement | Thermo Fisher Scientific | A3582801 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cell strainer with 70-mm mesh | BD Biosciences | 352350 | |
| Ceramic coverslip-staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Cre-BFP | Addgene | #128174 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995073 | |
| GlutaMAX-I supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668030 | |
| MEM with Earle’s salts and L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
| Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Poly-L-lysine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 26124-78-7 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 |
References
- Nelson, A. D., et al. Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP. Molecular Psychiatry. , (2019).
- Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).
- Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM. Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).
- Hofflin, F., et al. Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332 (2017).
- Schluter, A., et al. Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development. Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).
- Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment. Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).
- Grubb, M. S., Burrone, J. Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability. Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).
- Pan, Z., et al. A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).
- Cooper, E. C. Made for "anchorin": Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).
- Zhou, D., et al. AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing. The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).
- Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier. Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).
- Jenkins, P. M., et al. Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).
- Jenkins, P. M., et al. E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin. Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).
- Kaech, S., Banker, G.
- Berger, S. L., et al. Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment. Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).
- Yang, R., et al. Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).
