Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Immunohistochemische technieken om cellulaire proliferatie en neurogenese bij ratten te analyseren met behulp van de Thymidine Analog BrdU

Published: September 9, 2020 doi: 10.3791/61483
Automatic Translation
*1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1, *1
1Laboratorio de Neurociencias, Departamento de Psicología, Universidad Iberoamericana Ciudad de México, 2Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma del Estado de México
* These authors contributed equally

Summary

Dit artikel presenteert vier van de meest voorkomende technieken voor het visualiseren van BrdU-positieve cellen om volwassen neurogenese bij ratten te meten. Dit werk omvat instructies voor reagenspreparaatatie, thymidine-analoge toediening, transcardiale perfusie, weefselvoorbereiding, peroxidase immunohistochemische reactie, immunofluorescentie, signaalversterking, counterstaining, microscopiebeeldvorming en celanalyse.

Abstract

Een van de belangrijkste dingen op het gebied van volwassen hippocampus neurogenese (AHN) is de identificatie van de nieuw gegenereerde cellen. De immunodetectie van thymidine-analogen (zoals 5-Bromo-2'-deoxyuridine (BrdU)) is een standaardtechniek die wordt gebruikt voor het visualiseren van deze nieuw gegenereerde cellen. Daarom wordt BrdU meestal intraperitoneaal geïnjecteerd bij kleine dieren, dus het thymidine-analoog wordt opgenomen in delende cellen tijdens dna-synthese. Detectie wordt uitgevoerd door immunohistochemische analyse van hersenplakken. Elke onderzoeksgroep die deze techniek heeft gebruikt, kan begrijpen dat het speciale aandacht vereist voor minuscule details om een succesvolle vlek te bereiken. Een belangrijke stap is bijvoorbeeld DNA-denaturatie met HCl, waardoor het de celkern kan bereiken om het te kleuren. De bestaande wetenschappelijke rapporten beschrijven echter zeer weinig van dergelijke stappen in detail. Daarom is het standaardiseren van de techniek een uitdaging voor nieuwe laboratoria, omdat het enkele maanden kan duren om positieve en succesvolle resultaten op te leveren. Het doel van dit werk is om de stappen voor het verkrijgen van positieve en succesvolle resultaten van de immunostaining-techniek in detail te beschrijven en uit te werken bij het werken met het thymidine-analoog BrdU. Het protocol omvat de reagensvoorbereiding en -opstelling, toediening van thymidine-analoog bij een knaagdier, transcardiale perfusie, weefselpreparaat, peroxidase immunohistochemische reactie, gebruik van avidine-biotinecomplex, immunofluorescentie, counterstaining, microscopiebeeldvorming en celanalyse.

Introduction

Het idee dat nieuwe neuronen gedurende de hele levensduur in het volwassen menselijke brein worden gegenereerd, fascineert de wetenschappelijke gemeenschap al tientallen jaren. De kennis dat de hersenen gedurende hun hele levensduur nieuwe neuronen genereren, werd verkregen door de detectie van cellen onder deling 1,2. Detectie van nieuw gegenereerde neuronen in de volwassen hersenen werd voor het eerst geïdentificeerd door het intracranieel injecteren van tritiated thymidine (thymidine-H3) bij ratten en het detecteren van cellen in de celcyclus door autoradiogrammen 1,2. Celdeling van glia en de aanwezigheid van neuroblasten werd gemeld, wat de eerste veelbelovende gegevens waren over de postnatale neurogenese1. Niettemin impliceerde het gebruik en de detectie van thymidine-H3 het gebruik van radioactiviteit, wat schadelijk kan zijn voor de mensen die het beheren. De eerste poging om de geschiktheid van BrdU-immunohistochemie te onderzoeken in de studie van proliferatie, migratie en oorsprong van cellen in het zenuwstelsel verscheen in 1988 door Miller en Nowakowski3. In 1998 toonde een paper gepubliceerd door Eriksson en collega's aan dat nieuwe neuronen postmortaal werden gevisualiseerd in het menselijke volwassen brein van patiënten geïnjecteerd met 5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU)4. Deze patiënten kregen de BrdU-injectie (250 mg intraveneus) om de groei van tumoren te labelen4. Deze techniek werd overgenomen in diermodellen. De introductie van deze methoden markeerde een mijlpaal voor het veld, omdat dit de detectie van nieuw gegenereerde cellen mogelijk maakte zonder het gebruik van radioactieve verbindingen. Deze procedure werd de gouden standaard om celproliferatie in volwassen hersenniches te meten om verder onderzoek in het veld te bevorderen.

De beperking van de thymidine-analoge techniek is dat het niet mogelijk is om de cellulaire identiteit voor de nieuw gegenereerde cellen te bepalen. Immunohistochemie stelt ons echter in staat om een dubbele of drievoudige etiketteringstechniek van dezelfde cel uit te voeren, die het cellulaire lot van de nieuw gegenereerde cellen en zelfs hun stadia van rijping valideert, wat leidt tot verdere evolutie van het veld. Deze methode werd gekarakteriseerd om nieuw gegenereerde cellen te differentiëren in glia, ongedifferentieerde neuronen of een volledig volwassen korrelige cel, en zelfs om te bepalen of ze actief deelnemen aan het circuit. Een andere doorbraak in het veld was het gebruik van transgene modellen om ongedifferentieerde cellen onder het domein van nestine te identificeren. De nestin-GFP transgene muizen drukken een versterkt groen fluorescerend eiwit (GFP) uit, dat onder controle staat van de nestin-promotor. Nestin is een intermediair filament dat wordt gekenmerkt door voorlopercellen5. De nestin-GFP transgene muizen maakten het mogelijk om vroege ontwikkelingsstappen vast te stellen die betrokken zijn bij neurogenese6. Een belangrijke beperking is echter om een nestin-GFP transgene muizenkolonie onder speciale omstandigheden in een laboratoriumfaciliteit te kunnen onderhouden die kosteneffectief wordt voor sommige wetenschappelijke groepen, vooral die uit ontwikkelingslanden.

De hierboven genoemde technieken hebben voor- en nadelen. Identificatie van prolifererende cellen door immunohistochemie (IHC) en de mogelijkheid om dubbele of drievoudige etiketteringstechniek uit te voeren door immunofluorescentie om het celrijpingsstadium of het lot van cellen te identificeren, is tot nu toe echter de meest haalbare manier om volwassen neurogenese te meten. Het identificatieproces met behulp van immunohistochemie bestaat uit het labelen van eiwitten, eiwitdomein of nucleotiden met een specifiek antilichaam dat hun herkenning mogelijk maakt, bekend als primair antilichaam. Dit laatste wordt herkend door het secundaire antilichaam, dat is gemarkeerd met een chromogeen (bijv. Mierikswortelperoxidase) of een fluorochroom (bijv. FITC) in combinatie met het secundaire antilichaam. Microscopen kunnen zowel chromogenen als fluorchromensignalen detecteren. Met behulp van IHC is het mogelijk om membraaneiwitten, cytoskeleteiwitten of nucleaire componenten zoals BrdU te identificeren. Aan de andere kant kan BrdU worden gevonden in de cellulaire kern, omdat het tijdens de S-fase door competitie in het DNA wordt opgenomen. Daarom is een cruciale stap de DNA-denaturatie met HCl, die DNA-bindingen opent om het BrdU-antilichaam toegang te geven tot BrdU in het DNA. Het is essentieel om te weten dat BrdU aanwezig is in een verzadigde concentratie in muizen en rattenserum gedurende respectievelijk 15 en 60 minuten, na intraperitoneale toediening, en vervolgens snel daalt tot niet-detecteerbare niveaus na respectievelijk 60 en 120 minuten7.

Hier beschrijven we vier verschillende maar nauw verwante IHC-technieken: chromogene indirecte detectie met behulp van mierikswortelperoxidase (HRP) reactie met DAB (3,3'-diaminobenzidine) sans signaalversterking (stap 4.1), avidine-biotine complex (ABC) amplificatie (stap 4.1), indirecte immunofluorescentiedetectie zonder signaalversterking (stap 4.4) en gelabelde streptavidin-biotine (LSAB) amplificatie (stap 4.3). Elke methode heeft voor- en nadelen en kan nuttig zijn voor specifieke weefselvereisten (zie tabel 1). We hebben besloten om indirecte ICH-methoden te volgen vanwege hun betaalbaarheid en eenvoud om wijzigingen aan te brengen van chromogene naar fluorescerende detectiemethoden bij het gebruik van niet-geconjugeerde primaire antilichamen. De HRP-aanpak is een veelgebruikte IHC-methode vanwege de betaalbaarheid, hoge stabiliteit, hoge omloopsnelheid en volledige beschikbaarheid van substraten. Niettemin raden we aan een positieve controle te gebruiken om te bevestigen dat de kleuringsmethode nauwkeurig werkt en het gebruik van negatieve controle om de antilichaamfunctie effectief te testen. Meerdere immunostainings of multiplex IHC-methoden (zie stap 6) zijn krachtige hulpmiddelen om grote hoeveelheden gegevens uit de weefselsectie in één experiment te verkrijgen. Deze techniek is vooral belangrijk wanneer de beschikbaarheid van monsters beperkt is. Een ander voordeel is de mogelijkheid om tegelijkertijd specifieke eiwitten te identificeren die samen tot expressie komen in dezelfde cellulaire ruimte met behoud van de weefselintegriteit. Multiplex maakt het mogelijk om verschillende markers te kleuren die tot expressie komen tijdens specifieke proliferatieve stadia (bijv. Nestin, GFAP, DCX, Ki-67), waardoor we een meer gedetailleerd proliferatie- en differentiatieonderzoek kunnen bereiken8. Het is cruciaal om antilichamen te kiezen die compatibel zijn met de fixatietechniek die wordt gebruikt om kruisreactiviteit te voorkomen. We raden aan om elk nieuw antilichaam (inclusief BrdU) afzonderlijk te testen om de methode aan te passen en te verfijnen. Introduceer vervolgens de dubbele sequentiële kleuring en start ten slotte het gelijktijdige immunostainingproces wanneer de sequentiële methode volledig wordt gedomineerd. Het is cruciaal om geschikte secundaire antilichamen voor deze methode te kiezen.

Methode Specifieke methode Voordelen Nadelen
Indirecte detectiemethode Peroxidasereactie met DAB 1. Hogere gevoeligheid dan de directe detectie- en indirecte fluorescentiemethode.
2. Hogere weerstand tegen photobleaching dan fluorochromen.
3. Lagere kosten dan fluorescentiedetectiemethode		 1. Moeilijk voor multiplexing met minder kleurkleurstoffen.
2. Ingewikkeld voor co-uitgedrukte doelen in dezelfde cellulaire ruimte.
3. Verminderd dynamisch bereik voor gelijktijdig schaarse en hoge overvloedige doelen op hetzelfde weefsel.
Fluorescentie 1. Beste en gemakkelijkste voor multiplexen met meer kleurkleurstoffen.
2. Het beste voor Co-uitgedrukte doelen in dezelfde cellulaire ruimte.
3. Beter dynamisch bereik voor gelijktijdig schaarse en hoge overvloedige doelen op hetzelfde weefsel.
4. Geen extra stappen.		 1. Lagere gevoeligheid dan de indirecte peroxidasereactie met DAB-methode.
2. Zwakke weerstand tegen Photobleaching in de loop van de tijd.
3. Duurder.
Signaalversterkingsmethode Avidin-Biotine Complex (ABC) 1. Hogere gevoeligheid dan de directe en indirecte detectiemethode.
2. Achtergrond verminderen		 1. Aanvullende stappen.
2. Duurder dan niet versterken.
Gelabeld Streptavidin-Biotine (LSAB) 1. Hogere gevoeligheid dan de directe en indirecte detectiemethode.
2. Meer substantiële weefselpenetratie dan de ABC-methode.
3. Achtergrond verminderen		 1. Aanvullende stappen.
2. Duurder dan de ABC-methode.
Geen aanvullende versterkingsmethode 1. Lagere kosten.
2. Geen extra stappen.
3. Ideaal voor hoge overvloedige doelen.		 1. Lagere gevoeligheid: problematisch zonder overvloedige doelen.

Tabel 1: Voor-/nadelen van IHC-technieken. Deze tabel toont de voor-/nadelen voor indirecte detectiemethoden: Peroxidasereactie met (3,3'-diaminobenzidine) DAB en fluorescentie; en signaalversterkingsmethoden: avidine-biotinecomplex (ABC), gelabeld streptavidin-biotine (LSAB), en geen aanvullende amplificatiemethode.

Een afbeelding met een hoge resolutie is van fundamenteel belang om een goede analyse uit te voeren en de resultaten te presenteren. Er zijn twee benaderingen om de resolutie te verbeteren: 1) gebruik van een beter microscoopontwerp (bijv. Confocal, multifoton) of 2) numeriek omkeren van het vervagingsproces om beelden te verbeteren met behulp van deconvolutie9. Helaas is confocale microscopie niet betaalbaar vanwege de hoge kosten van apparatuur en het onderhoud ervan10. Een wide-field epifluorescentiemicroscoop en de daaropvolgende deconvolutie van de z-stack beelden bieden een geschikt, goedkoop alternatief voor confocale microscopie 8,9. Zoals hierboven vermeld, is het doel van deconvolutie om het oorspronkelijke signaal te herstellen dat werd aangetast door het acquisitiesysteem9, door onscherpte, onscherpe waas en vervorming te verminderen die worden weergegeven in het beeld dat is verkregen door een epifluorescentie- of confocale microscoop met behulp van wiskundige verwijderingsalgoritmen10. Het verkregen wazige beeld kan wiskundig worden gemodelleerd als het resultaat van het oplossen van de waargenomen objecten met een 3D-point-spread-functie (PSF). PSF is een theoretisch diffractiepatroon van de lichtpunten die door het weefselmonster worden uitgezonden en door de microscoop worden verzameld. PSF-bestand wordt gemaakt met de specifieke omstandigheden van elk beeld, zoals de CCD-celafstand van de camera, brekingsindex van de gebruikte media, het numerieke diafragma van de objectieflens, de emissiegolflengte van de fluorofoor, beeldformaten, aantal afbeeldingen in de z-stack-verwerkingsmethode en de ruimte ertussen (zie technische specificatie in tabel 2). Met andere woorden, het PSF-bestand vat de effecten van de beeldvormingsopstelling op de microscoopwaarnemingen samen9. We gebruiken echter de diffractie PSF 3D Plugin (https://imagej.net/Diffraction_PSF_3D) om ons eigen specifieke PSF-bestand te maken voor elke z-stack-afbeelding. Z-stack-afbeeldingen zijn een reeks gedigitaliseerde optische secties van gedefinieerde diepten (z-as) op dezelfde XY-locatie van de dia. Een computer verzamelt de informatie die uit het focusvlak wordt verkregen door signalen die afkomstig zijn van objecten in andere brandpuntsvlakken opnieuw toe te wijzen. Om z-stack-afbeeldingen te maken, is het noodzakelijk om afbeeldingen te maken van verschillende gefocuste lagen van de dia's (bijvoorbeeld tien verschillende afbeeldingen van hetzelfde XY-gebied om de 1 μm diepte). Vervolgens gebruiken we microscopiesoftware van de fabrikant of Fiji om een z-stack of 3D-afbeelding te maken. Het resultaat is een afbeeldingsbestand met één stapel (bijvoorbeeld tien afbeeldingen met verschillende focuspunten). Er zijn verschillende klantspecifieke tools en softwareoplossingen, zoals open-source software voor deconvolutiemicroscopie. We zullen de uitvoer van het deconvolutieproces tonen met behulp van DeconvolutionLab29, een Fiji11-plug-in (distributie van ImageJ12). Deconvolutie zal helpen de resolutie van de uiteindelijke microfoto's te verbeteren (zie figuur 1B,C ). Voor meer informatie en instructies raden we ten zeerste aan om referentie13 te lezen.

Figure 1
Figuur 1: Representatieve afbeelding van 3D-deconvolutie voor meerdere kleurkanalen. (A) DG bij lage vergroting. (B) De originele z-stack afbeeldingen voor elk kanaal en de samengevoegde afbeelding. (C) 3D-gedeconvolueerde z-stack-afbeeldingen voor elk kanaal en de samengevoegde afbeelding. Dit brein was van de rat die deel uitmaakte van de fysieke activiteitsgroep. Er werd gebruik gemaakt van de gelabelde streptavidin-biotine (LSAB) amplificatiemethode. Het toonde Cy3 streptavidin geconjugeerd antilichaam voor het aangeven van BrdU (rood), DAPI als een counterstaining (blauw) en glial fibrillary acidic protein (GFAP) als een astrogliale marker (groen). ML = moleculaire laag; GCL = korrelige cellaag; SGZ = subgranulaire zone. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het doel van dit werk is om een gedetailleerde beschrijving te geven van de stappen om positieve en succesvolle resultaten te verkrijgen met immunostaining en om veelgebruikte stappen in BrdU-gebaseerde studies te vermelden, zonder het gebruik van een confocale microscoop. BrdU-kleuring is een techniek die verschillende stappen vereist die zorgvuldig moeten worden gevolgd om een succesvolle vlek te bereiken. Het standaardiseren van deze kleuringstechnieken duurt meestal maanden en is tijd- en middelenintensief. We verwachtten dat dit artikel informatie zou kunnen bieden aan de groepen die binnen dit veld beginnen door tijd en fouten te verminderen.

Protocol

Alle procedures volgen de National Institutes of Health-gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (NIH Publications N ° 8023, herzien in 1978) en lokale Mexicaanse wetten om het aantal gebruikte dieren en hun lijden te minimaliseren. De ethische commissie van de Universidad Iberoamericana keurde de experimentele protocollen voor het gebruik van dieren in deze studie goed.

1. Reagensvoorbereiding en -installatie

OPMERKING: De meeste oplossingen kunnen dagen voor gebruik worden bereid, tenzij anders aangegeven.

  1. BrdU oplossing
    1. Haal de BrdU-oplossing uit de vriezer van -20 °C en laat deze bij kamertemperatuur (RT) in evenwicht brengen.
    2. Bereken de massa BrdU die nodig is voor een dosis van 50 mg / kg op basis van het lichaamsgewicht van de rat. Bereken het volume van 0,9% zoutoplossing (0,9 g NaCl in 100 ml steriele H2O) die nodig is voor een werkoplossing van 20 mg/ml. Bereid een overmaat voor om ten minste 0,5 ml per rat per injectie te geven.
      OPMERKING: De dosis die aan proefdieren wordt toegediend, moet veilig zijn, met minimale bijwerkingen en effectief. Er is gemeld dat de duur van de kleuring met 100 mg/kg BrdU niet opweegt tegen de potentieel hogere toxiciteit in vergelijking met de dosis van 50 mg/kg7. Er werden geen significante verschillen gevonden in het aantal BrdU-gelabelde cellen/mm3 voor 50 en 100 mg/kg i.p. bij ratten7. Het verdient de voorkeur om een kleine dosis te injecteren om het lijden van de dieren te minimaliseren.
    3. Weeg de BrdU-oplossing af en voeg deze toe aan de zoutoplossing in een conische buis en vortex.
      OPMERKING: Verwarm de zoutoplossing voor op 45\u201250 °C in een waterbad voor volumes groter dan 1 ml.
    4. Plaats de buis in een waterbad bij 50 °C gedurende 10\u201215 min en vortex om de 2\u20123 min totdat deze volledig is opgelost. Filtreer de oplossing met een spuitfilter voor steriele injectie. Dek de tube af met tinfolie, koel hem af op kamertemperatuur en gebruik hem direct.
      LET OP: BrdU-oplossing is giftig en mogelijk kankerverwekkend. Bereid het in de zuurkast. BrdU-oplossing moet worden behandeld met de juiste beschermingsmiddelen (PBM). Het wordt aanbevolen om de oplossing onmiddellijk voor gebruik te bereiden. De oplossing is echter 24 uur stabiel onder RT. Bescherm het tegen licht.
  2. Voeg voor de bereiding van 1 L 0,1 M fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij pH 7,4 240 mg kaliumfosfaat monobasis (KH2PO4), 1,44 g natriumfosfaat dibasis (Na2HPO4), 200 mg kaliumchloride (KCl) en 8 g natriumchloride (NaCl) toe aan 800 ml dubbel gedestilleerd water (ddH2O) onder constant roeren. Stel de pH in op 7,4 en voeg dubbel gedestilleerd H2O toe tot een totaal volume van 1 l. Bewaar bij 4 °C gedurende maximaal 1 week.
  3. Voeg voor 100 ml PBS+ 3% (3 ml) normaal paardenserum en 0,3% (300 μL) Triton X-100 toe aan 0,1 M PBS (pH 7,4). Bewaren in aliquots van 20\u201250 ml bij -20 °C gedurende maximaal 3 maanden.
    OPMERKING: Als alternatief kan TBS worden gebruikt in plaats van PBS. Elk ander serum dat verschilt van de antilichamen en het experimentele weefsel van de gastheer is geschikt.
  4. Voeg voor 100 ml PBS++ 10% (10 ml) normaal paardenserum en 0,3% (300 μL) Triton X-100 toe aan 0,1 M PBS pH 7,4. Bewaren in aliquots van 20\u201250 ml bij -20 °C gedurende maximaal 3 maanden.
  5. Meng voor 1 l cryoprotectante oplossing 250 ml ethyleenglycol en 250 ml glycerol, roer voortdurend tot het gemengd is. Breng langzaam op 1 L met PBS. Filtreer met filterpapier van klasse 4 (20\u201225 μm). Bewaren bij 4 °C of RT gedurende maximaal 1 jaar.
  6. Bereid 4% paraformaldehyde in 0,1 M PBS (PFA-oplossing) als volgt. Voeg voor 1 l oplossing langzaam 40 g paraformaldehydepoeder toe aan 800 ml 60\u201265 °C 0,1 M PBS onder constant roeren. Roer totdat paraformaldehyde volledig is opgelost terwijl de temperatuur wordt geregeld (60\u201265 °C). Voeg indien nodig een paar druppels van 1 M NaOH toe om de oplossing te verduidelijken. Wanneer de oplossing kamertemperatuur bereikt, filtert u met filterpapier van graad 4 (20-25 μm).
    LET OP: Paraformaldehyde is giftig en wordt ervan verdacht kankerverwekkend te zijn, bereid in de zuurkast. Bewaren bij 4 °C voor en bij voorkeur binnen 2 dagen gebruiken. PFA kant-en-klare oplossing is in de handel verkrijgbaar.
  7. Voeg voor 1 l 10 mM natriumcitraatbuffer (SCB) bij pH 6 1,204 g natriumcitraat (dihydraat) en 1,134 g citroenzuur toe aan 800 ml dubbel gedestilleerd H2O onder constant roeren. Stel de pH in op 6,0 en voeg ddH2O toe tot 1 l. Bewaar bij 4 °C gedurende maximaal 6 maanden.
  8. Bereid 50 ml 2 N HCl door langzaam 8,25 ml 12 N HCl (geconcentreerde stamoplossing) toe te voegen aan 41,75 ml ddH2O onder constant roeren.
    LET OP: Bereid in de zuurkast. De oplossing moet onmiddellijk voor gebruik worden bereid.
    OPMERKING: 2 N HCl zal worden gebruikt voor DNA-denaturatie, een cruciale stap. Omdat BrdU in het DNA wordt opgenomen, wordt HCl gebruikt om de DNA-bindingen te openen waardoor BrdU-antilichaam toegang krijgt tot BrdU in het DNA.
  9. Bereid endogene peroxidaseblokkeringsoplossing als volgt. Bereid 100 ml 0,6% waterstofperoxide door 2 ml 30% waterstofperoxide te mengen met 98 ml ddH2O onder constant roeren.
    OPMERKING: De oplossing moet onmiddellijk voor gebruik worden bereid. Houd het in het donker, want H2O2 is lichtgevoelig. PBS of TBS kan worden gebruikt in plaats van water.
  10. Bereid avidin-biotine complex (ABC) oplossing volgens de instructies van de fabrikant. Voeg voor 5 ml ABC in 0,1 M PBS 2 druppels (≈100 μL) reagens A toe en meng vervolgens 2 druppels (≈100 μL) reagens B en meng.
    OPMERKING: De oplossing moet worden bereid en gedurende 20 minuten voor gebruik worden getrommeld.
  11. Bereid DAB (Diaminobenzidine) Peroxidase (HRP) substraat met behulp van de kit door de instructies van de fabrikant te volgen. Voeg aan 5 ml ddH2O 2 druppels (≈ 84 μL) reagens 1 toe en meng, voeg 4 druppels (≈ 100 μL) reagens 2 toe en meng, voeg vervolgens 2 druppels (≈ 80 μL) reagens 3 toe en meng. Voeg ten slotte, indien gewenst, 2 druppels (≈ 80 μL) reagens 4 (nikkel) toe en meng.
    OPMERKING: Oplossing moet onmiddellijk voor gebruik worden bereid.
    LET OP: DAB is giftig en mogelijk kankerverwekkend. Het moet met zorg worden behandeld en worden weggegooid volgens de regelgeving voor gevaarlijk afval in elke instelling. Om DAB te inactiveren, voegt u verschillende druppels bleekmiddel (natriumhypochloriet) toe; de oplossing wordt zwart.
  12. Bereid 100 ml cresylvioletoplossing door 100 mg cresylvioletacetaat en 250 μl azijnzuur toe te voegen aan 80 ml ddH2O bij 55°u201260 °C. Stel het volume in op 100 ml, filtreer en bewaar bij 4 °C in een donkergekleurd vat.
    OPMERKING: De gebruiker wordt aangemoedigd om verschillende concentraties van de cresylvioletoplossing te testen voordat deze op waardevolle weefselmonsters wordt gebruikt. Het resultaat kan donkerder zijn voor counterstaining met sommige weefselmonsters, wat het vermogen om BrdU-positieve cellen nauwkeurig te tellen kan verminderen.

2. Thymidine analoge BrdU toediening

  1. Beperk het proefdier (bijv. 90 dagen oude mannelijke Wistar-rat met een gewicht van 350 g) door de onderbuikholte te immobiliseren.
  2. Dien de BrdU-oplossing (50 mg/kg) intraperitoneaal (i.p.) toe met een naald van 23 G en een spuit van 1 ml.
    OPMERKING: Pas het injectievolume aan op basis van het gewicht van het dier. Gebruik een naald van 23\u201227 G en een spuit van 1\u20125 ml voor volwassen ratten. Het maximaal verdraagbare intraperitoneale injectievolume bij de volwassen rat is 10 ml. Verschillende routes kunnen worden gebruikt om de BrdU-oplossing14 toe te dienen. Bijvoorbeeld intraperitoneale injectie of orale toediening via drinkwater.

3. Weefselvoorbereiding

OPMERKING: Drie maanden oude ratten kregen ad libitum toegang tot fysieke activiteit (eindeloos wiel) gedurende zeven dagen. Op dag 6 werden ratten 3 keer geïnjecteerd met BrdU (stap 2) met tussenpozen van 12 uur. Voer stappen uit in rubriek 3 na 8 uur na de laatste BrdU-injectie.

  1. Injecteer pentobarbital (50 mg/kg i.p.) en wacht enkele minuten tot het dier diep verdoofd is.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat het dier volledig verdoofd is voordat u doorgaat. Knijp voorzichtig in een van de poten of de staart. Als het dier reageert op de stimulus, wacht dan nog een paar minuten. Als het dier niet reageert op de knijp, ga dan naar de volgende stap.
  2. Stel het hart bloot door de buikholtehuid onder het borstbeen te snijden, de ribben uit elkaar te halen en het middenrif door te snijden.
  3. Transcardiale perfusiefixatie
    1. Steek een naald in de linker ventrikel en maak een kleine incisie in het rechter atrium. Gebruik een pomp of zwaartekracht om (debiet 5\u20127 ml/min.) 0,1 M PBS te perfuseren totdat het volledige bloed is afgevoerd en de oplossing helder wordt.
    2. Voer met behulp van een pomp of zwaartekracht koude perfusie uit (debiet 5 \ u20127 ml / min) met PFA-oplossing om het weefsel te fixeren totdat de staart stijf wordt.
      OPMERKING: Meestal heeft een rat van 300 g ongeveer 100 \ u2012150 ml van de PFA-oplossing nodig. De weefselfixatie is optioneel. Daardoor kunnen de hersenen worden geëxtraheerd voor gebruik in verschillende processen om het gebruik van dieren in de experimenten te minimaliseren.
  4. Dissectie en postfixatie
    1. Onthoofd het dier en haal voorzichtig de hersenen uit de schedel. Dompel de hersenen onder in een conische buis met PFA-oplossing (~ 40 ml voor een rat van 250 mg) gedurende 1 \ u20122 dagen bij 4 ° C.
      OPMERKING: Niet te veel fixeren (meer dan 48 uur), omdat dit de weefselkleuring kan uitputten als gevolg van de onbeschikbaarheid van antigenen.
    2. Bereid 100 ml 30% sucrose-oplossing en voeg 30 g sucrose toe aan 70 ml 0,1 M PBS-oplossing onder constant roeren. Voeg 0,1 M PBS-oplossing toe aan 100 ml. Dompel de hersenen onder in een conische buis met een 30% sucrose-oplossing (35 ml) gedurende ongeveer 1 \ u20122 dagen bij 4 ° C totdat de hersenen naar de bodem van de buis zinken.
  5. Snijden van coronale hersensecties
    OPMERKING: Het gebruik van een cryostaat-microtoom vereist begeleiding en training. Voor gedetailleerde instructies, zie referentie15.
    1. Dompel het hele brein onder in iso-pentaan bij -80 °C en houd het gedurende 10 minuten op -80 °C. Plaats de hersenen in een inbeddingsmatrix op een cryostaat-microtoomplaat.
      OPMERKING: Onder bepaalde omstandigheden kan het snel bevriezen van de hersenen bij -80 °C een breuk of schade aan het weefsel veroorzaken. De gebruiker moet zich bewust zijn van dit probleem. Als dit het geval is, gebruik dan -20 °C iso-pentaan om de hersenen te bevriezen.
    2. Snijd met behulp van een cryostaat-microtoom (temperatuur bij -25 tot -20 °C) coronale secties van 40 μm dikte. Breng secties sequentieel over in een celkweekplaat met 24 putten met cryoprotectieoplossing volgens de gids in figuur 2. Bewaren bij -20 °C tot gebruik, tot enkele maanden.
      OPMERKING: Verwerk hierna al het weefsel in vrij zwevende seriële secties van 40 μm in 12-well platen met mesh-inzetstukken in zachte en continue agitatie (10 rpm). Het is mogelijk om hersensecties jarenlang onder de juiste omstandigheden op te slaan.

Figure 2
Figuur 2: Schematische illustratie van het sequentieel overbrengen van secties van cryostaat-microtoom naar een 24-well celkweekplaat met cryoprotectie-oplossing. Begin bij A1-put en plaats de volgende plakjes in rij A; na A6-put naar de volgende rij B, ga zo maar door. Bij aankomst op de D6 gaat u terug naar de A1 en rijdt u verder. Deze opstelling maakt Nth (bijvoorbeeld zesde voor neurogenese, equivalent aan de inhoud van één kolom) sectiekwantificering van een heel hersengebied mogelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Immunostaining

OPMERKING: Zie tabel 1 voor de samenvatting van de voor- en nadelen van elke techniek.

  1. Detectie van BrdU met behulp van peroxidasereactie met DAB
    OPMERKING: Voer de stappen 4.1.1 tot en met 4.1.5 uit op dag 1.
    1. Breng plakjes over van de cryoprotectieoplossing naar 0,1 M PBS bij kamertemperatuur. Spoel drie keer gedurende 10 minuten elk, met 0,1 M PBS.
    2. Incubeer plakjes gedurende 30 minuten in endogene peroxidaseblokkeringsoplossing om endogene peroxidase te inactiveren. Spoel 3 keer, elk 10 minuten, met 0,1 M PBS. Voer eventueel het ophalen van antigeen uit (zie rubriek 5). Incubeer plakjes gedurende 20 min met 2 N HCl bij 37 °C. Spoel in 0,1 M boraatbuffer (8,5 pH) gedurende 10 min. Spoel 3 keer gedurende 10 minuten elk, met ijskoude 0,1 M PBS.
    3. Incubeer plakjes gedurende 2 uur bij kamertemperatuur met PBS++ (blokkeeroplossing). Incubeer met anti-BrdU primair antilichaam (muisgastheer) in een concentratie van 1:250 in PBS+ 's nachts bij 4 °C.
    4. Spoel de plakjes op dag 2 3 keer gedurende 10 minuten elk met 0,1 M PBS.
    5. Incubeer met 1:250 HRP-geconjugeerd secundair antilichaam (anti-muis) in PBS+ gedurende 2\u20124 h bij kamertemperatuur. Spoel 3 keer gedurende 10 minuten elk met 0,1 M PBS.
    6. Breng plakjes over naar DAB Peroxidase (HRP) Substraatoplossing en incubeer gedurende 2\u201210 min. Wanneer plakjes donkergrijs worden, visualiseer het weefsel dan met een vergrootglas of een microscoop. Als er positieve cellen aanwezig zijn, spoel dan 3 keer (elk gedurende 15 minuten) met kraanwater (om de achtergrond te verminderen). Was 3 keer gedurende 10 minuten elk met 0,1 M PBS.
    7. Monteer plakjes voorzichtig op gelatinekleurige dia's met een zachte borstel, droog ze 's nachts aan de lucht bij kamertemperatuur. Counterstain (zie rubriek 7.1), voeg permanent montagemedium toe en plaats coverslips. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 6 maanden.
  2. Detectie van BrdU met behulp van peroxidasereactie met het avidine-biotine-peroxidasecomplex
    OPMERKING: Voer de stappen 4.2.1 tot en met 4.2.5 uit op dag 1.
    1. Breng plakjes over van de cryoprotectie-oplossing naar 0,1 M PBS om op kamertemperatuur te brengen. Spoel 3 keer gedurende 10 minuten elk met 0,1 M PBS.
    2. Incubeer gedurende 30 minuten met endogene peroxidaseblokkeringsoplossing om endogene peroxidase te inactiveren. Spoel 3 keer gedurende 10 minuten elk in 0,1 M PBS. Voer eventueel het ophalen van antigeen uit (zie rubriek 5).
    3. Incubeer gedurende 20 min met 2 N HCl bij 37 °C. Spoel in 0,1 M boraatbuffer (pH 8,5) gedurende 10 min. Was 3 keer gedurende 10 minuten elk met ijskoude 0,1 M PBS.
    4. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in PBS++ (blokkeringsoplossing).
    5. Incubeer met anti-BrdU primair antilichaam (muisgastheer) 1:250 in PBS+ 's nachts bij 4°C.
    6. Spoel op dag 2 3 keer gedurende 10 minuten elk met 0,1 M PBS.
    7. Incubeer met 1:250 gebiotinyleerd secundair antilichaam (anti-muis) in PBS+ gedurende 2\u20124 h bij kamertemperatuur. Spoel 3 keer gedurende 10 minuten elk met 0,1 M PBS.
    8. Incubeer in de ABC-oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Spoel 3 keer gedurende 10 minuten elk met 0,1 M PBS.
    9. Breng plakjes over naar DAB-peroxidase (HRP) substraatoplossing en incubeer gedurende 2 \u201210 min. Wanneer plakjes donkergrijs worden, visualiseer het weefsel dan met een vergrootglas of een microscoop. Als er positieve cellen aanwezig zijn, spoel dan 3 keer (elk 15 min) met kraanwater (om de achtergrond te verminderen), gevolgd door 3 keer met 0,1 M PBS-was gedurende 10 minuten elk.
      OPMERKING: Oplossing moet onmiddellijk voor gebruik worden bereid. Er moet voor worden gezorgd dat hersenschijfjes niet aan elkaar kleven als gevolg van onregelmatige donkere vlekken in het weefsel.
    10. Monteer plakjes voorzichtig op gelatinekleurige dia's met een zachte borstel en droog vervolgens een nacht aan de lucht bij kamertemperatuur.
    11. Verduur indien nodig (zie stap 7.1), voeg permanent montagemedium toe en plaats coverslips. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 6 maanden.
  3. Detectie van BrdU door immunofluorescentie met behulp van gelabelde Streptavidin-Biotine (LSAB) amplificatie
    OPMERKING: Voer de stappen 4.3.1 tot en met 4.3.4 uit op dag 1.
    1. Breng plakjes over van de cryoprotectieoplossing naar 0,1 M PBS bij kamertemperatuur. Spoel 3 keer gedurende 10 minuten elk met 0,1 M PBS. Voer eventueel het ophalen van antigeen uit (zie rubriek 5).
    2. Incubeer gedurende 20 min in 2 N HCl bij 37 °C. Spoel in 0,1 M boraatbuffer (8,5 pH) gedurende 10 min. Spoel 3 keer gedurende 10 minuten elk in ijskoude 0,1 M PBS.
    3. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in PBS++ (blokkeringsoplossing). Incubeer met 1:250 anti-BrdU primair antilichaam (muisgastheer) in PBS+ 's nachts bij 4 °C.
    4. Spoel op dag 2 3 keer gedurende 10 minuten elk met 0,1 M PBS.
    5. Incubeer met 1:250 gebiotinyleerd secundair antilichaam (anti-muis) in PBS+ gedurende 2\u20124 h bij kamertemperatuur. Spoel 3 keer gedurende 10 minuten elk met 0,1 M PBS. Incubeer met 1:250 fluorochroom-geconjugeerde streptavidin (Cy3) in PBS (gebruik geen serum) gedurende 1\u20122 h bij kamertemperatuur. Spoel 3 keer gedurende 10 minuten elk met 0,1 M PBS.
      OPMERKING: Serum kan biotine bevatten en mag niet worden toegevoegd aan verdunningsmiddelen. Gebruik in plaats daarvan PBS met 0,3% Triton X-100.
    6. Monteer plakjes voorzichtig op gelatinekleurige dia's met een zachte borstel, droog ze 's nachts aan de lucht bij kamertemperatuur of monteer ze onmiddellijk met een geschikt montagemedium. Counterstain (zie stap 7.2), voeg permanent montagemedium toe en plaats coverslips. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 6 maanden.
  4. Detectie van BrdU door indirecte immunofluorescentie
    OPMERKING: Voer stap 4.4.1 tot 4.4.4 uit op dag 1.
    1. Breng plakjes over van de cryoprotectieoplossing naar 0,1 M PBS totdat deze op kamertemperatuur is. Spoel 3 keer gedurende 10 minuten elk met 0,1 M PBS. Voer indien nodig antigeen ophalen uit (optioneel, zie rubriek 5).
    2. Incubeer gedurende 20 min in 2 N HCl bij 37 °C. Spoel in 0,1 M boraatbuffer (8,5 pH) gedurende 10 min. Spoel 3 keer gedurende 10 minuten elk met ijskoude 0,1 M PBS. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur met PBS++ (blokkerende oplossing). Incubeer met 1:250 anti-BrdU primair antilichaam (muisgastheer) in PBS+ 's nachts bij 4 °C.
    3. Spoel op dag 2 3 keer gedurende 10 minuten elk met 0,1 M PBS.
    4. Incubeer met 1:250 fluorochroom-geconjugeerd secundair antilichaam (anti-muis) in PBS+ gedurende 2\u20124 h bij kamertemperatuur. Spoel 3 keer gedurende 10 minuten elk met 0,1 M PBS.
    5. Monteer plakjes voorzichtig op gelatinekleurige dia's met een zachte borstel, droog ze 's nachts aan de lucht bij kamertemperatuur of monteer ze onmiddellijk met een geschikt montagemedium. Counterstain (zie stap 7.2), voeg permanent montagemedium toe en plaats coverslips. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 6 maanden.

5. Antigeen ophalen (optioneel)

OPMERKING: Antigen Retrieval is een optionele stap die bedoeld is om het verlies van antigeniciteit te corrigeren dat wordt veroorzaakt door fixatie die de tertiaire en quaternaire structuur van veel antigenen wijzigt, waardoor ze niet detecteerbaar zijn door antilichamen. Deze stap kan worden toegevoegd aan het oorspronkelijke protocol.

  1. Verwarm in een magnetron of waterbad 10 mM natriumcitraatbuffer (SCB) pH 6-oplossing voor tot 90 \u201295 °C (afhankelijk van de hoogte begint de oplossing rond deze temperatuur te koken). Vul 80% van een conische buis van 50 ml (40 ml) met voorverwarmd SCB. Breng plakjes over op mesh-inzetstukken in de conische buis met SCB. Bedek de buis met een schroefdop met gaten gemaakt met een naald van 18\u201220 G.
  2. Bewaar plakjes gedurende 30 minuten in SCB bij 80\u201285 °C afwisselende opwarmingscycli in de magnetron op het minimale vermogensniveau. Vul indien nodig de conische buis opnieuw met SCB. Breng de plakjes onmiddellijk daarna samen met de mesh-inzetstukken over in ijskoude 0,1 M PBS en spoel 3 keer gedurende 10 minuten elk.

6. Meerdere immunostainings (optioneel)

OPMERKING: Zie het introductiegedeelte voor de reden achter deze stap.

  1. Gelijktijdig meerdere immunostainings
    1. Bereid een cocktail met de primaire antilichamen tegen het doelwit (bijv. muis anti-BrdU en konijn anti-GFAP) in PBS +. Gebruik verschillende gastheren voor elk primair antilichaam dat wordt gebruikt. Incubeer een nacht bij 4 °C. Ga verder met dezelfde volgende stappen voor elk protocol.
    2. Bereid een cocktail met de overeenkomstige secundaire antilichamen voor elk primair antilichaam dat wordt gebruikt (bijv. Geiten-antimuis FITC, geiten-anti-konijn TRITC) in dezelfde verdunningsoplossing voor elk protocol. Ga verder met dezelfde volgende stappen voor elk protocol. Gebruik idealiter secundaire antilichamen die afkomstig zijn van dezelfde gastheren om kruisreacties te voorkomen.
  2. Sequentiële meervoudige immunostainings.
    1. Volg het protocol voor het eerste antilichaamdoel (bijv. muis anti-BrdU) en stop voordat de plakjes worden gemonteerd. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur met PBS++ (blokkerende oplossing).
    2. Incubeer het tweede primaire antilichaam (bijv. konijn anti-GFAP) in PBS+ 's nachts bij 4 °C. Volg de volgende stappen voor elk protocol, inclusief de incubatie van het tweede secundaire antilichaam (bijv. Geiten-anti-konijn TRITC). Ga door met de volgende stappen voor elk protocol tot het einde.

7. Counterstaining (optioneel)

  1. Voor protocollen die peroxidasereactie gebruiken, verwarmt u de cresylvioletoplossing voor tot 60 °C. Hydrateer de dia's met ddH2O gedurende 1 min. Incubeer de dia's in de hete cresyl violetoplossing gedurende 5\u201220 min.
    1. Spoel de dia's met ddH2O gedurende 1 min. Spoel de dia's af met 70%, 80%, 90% en 100% ethylalcohol gedurende elk 1\u20123 min. Spoel de dia's af met xyleen gedurende 1\u20123 min.
    2. Voeg permanent hydrofoob montagemedium toe en plaats coverslips.
      LET OP: Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 6 maanden. Zelfgemaakt montagemedium met PVA (Polyvinyl alcohol)-DABCO kan worden gebruikt.
  2. Voeg voor protocollen die immunofluorescentie gebruiken een klein volume (25\u201250 μL) hydrofiel montagemedium met DAPI, propidiumjodide of iets dergelijks toe. Sluit rond de omtrek af met nagellak of een plastic kit. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 6 maanden.

8. Beeldvorming en analyse

OPMERKING: Zie tabel 2 voor specificaties voor het instellen van microscoop. Meestal gebeurt het tellen van de gekleurde nieuwe cellen met behulp van de peroxidasereactie gekleurde plakjes (goedkopere methode), maar het kan ook worden uitgevoerd met behulp van immunofluorescentie.

  1. Om cellen te kwantificeren, identificeert u eerst de gyrus dentate correct met de 4x vergrotingslens (voor verdere instructies over DG anatomische details, zie Amaral et al.16).
    1. Zoek in de korrelige cellaag van de gyrus dentate naar kernen die zijn gelabeld met BrdU (met behulp van de 40x vergrotingslens). Voer celonderzoek uitputtend uit langs de z-as, omdat nieuwe cellen in verschillende lagen kunnen worden verdeeld (zie Video 1).
    2. Selecteer een intervalsectie voor celonderzoek over de gyrus dentate (bijvoorbeeld elke 6e sectie van weefsel, gelijk aan elke 240 μm).
    3. Tel alle BrdU-positieve cellen. De morfologie van de gelabelde kern kan veranderen afhankelijk van hoeveel BrdU de cel heeft opgenomen (zie figuur 3 als leidraad). Beweeg langzaam over de z-as om alle verschillende kernen te kwantificeren die een cluster integreren (zie Video 2).
    4. Vermenigvuldig het totale aantal getelde cellen met de intervalsectie geselecteerd (bijv. 6) om het totale aantal brdu-gelabelde nieuwe cellen te schatten.
    5. Idealiter tel je in een regulier experiment minstens tien secties per dier en minstens vijf dieren per groep.
  2. Deconvolutie van afbeeldingen (optioneel)
    OPMERKING: Raadpleeg het introductiegedeelte voor belangrijke informatie over deze stap. Deze procedure vereist monochrome afbeeldingen (grijswaarden). Transformeer kleurenafbeeldingen in grijswaarden. Als de afbeeldingen een RGB-samenstelling zijn, splitst u eerst de kanalen en voegt u ze samen als één afbeelding (niet samengesteld) en transformeert u vervolgens naar 8-bits grijswaarden.
    1. Maak een z-stack bestand van micrografieën.
    2. Maak een PSF-bestand (Point Spread Function) dat de Diffraction PSF 3D-plug-in (https://imagej.net/Diffraction_PSF_3D) opent vanuit het menu Plug-ins . Vul alle vereiste gegevens in (zie tabel 2). Druk op OK en sla het bestand op.
    3. Open de DeconvolutionLab29 plugin vanuit het optie Plugins menu (http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/). Sleep de overeenkomende z-stack-afbeelding en het PDF-bestand naar de bijbehorende venstersleuf.
    4. Selecteer het deconvolutiealgoritme (bijvoorbeeld Richardson-Lucy) en het aantal iteraties (bijvoorbeeld 20). Druk op RUN.
    5. Combineer de opgeloste afbeeldingen tot één z-stack-afbeelding door Stapels te selecteren in het menu Afbeelding bovenaan. Klik vervolgens op Z Project. Selecteer Maximale intensiteit in het vervolgkeuzemenu Projectietype , druk op OK en sla het bestand op.
    6. Maak een RGB-afbeelding met behulp van het enkele z-stack-afbeeldingsbestand dat in de bovenstaande stap is gemaakt met de gewenste pseudokleur door Kleur te selecteren in het menu Afbeelding bovenaan. Klik vervolgens op Kanalen samenvoegen. Stel de bijbehorende afbeelding in op het gewenste kleurkanaal in het vervolgkeuzemenu. Verwijder het vinkje uit het selectievakje Samengesteld maken, druk op OK en sla het bestand op (zie Afbeelding 4).
    7. Als er meer dan één kanaalafbeelding is, herhaalt u de stappen 8.2.1\u20128.2.5. Maak een RGB-afbeeldingsbestand volgens stap 8.2.6, open ten minste twee afbeeldingsbestanden en selecteer verschillende kleurkanalen voor elk afbeeldingsbestand (zie afbeelding 4).

Representative Results

De hierboven beschreven methoden werden toegepast om pasgeboren cellen in volwassen rat hippocampus te kwantificeren na vrijwillige fysieke activiteit, in tegenstelling tot een controlegroep zonder extra fysieke activiteit. We gebruikten de postnatale hippocampus van de rat als een positieve controle. Mannelijke ratten van 3 maanden oud waren zeven dagen lang onder een vrijwillig fysiek activiteitsprotocol (eindeloos wiel). Op dag 6 werden ratten geïnjecteerd met BrdU (rubriek 2) en elke 12 uur daarna tot drie volledige injecties. Om drie celcyclusdelingen te voltooien, werden de dieren transcardiaal geïnfundeerd (rubriek 3) 8 uur na de laatste BrdU-injectie. Dezelfde procedure werd gebruikt bij drie maanden oude ratten die geen fysieke activiteit ondergingen om als vergelijkende controle te worden gebruikt. Als positieve controle werden rattenpups van één dag oud (postnatale dag 1) één keer geïnjecteerd met BrdU, zoals beschreven in rubriek 2 hierboven. Een dag na de injectie (postnatale dag 2) werden pups geëuthanaseerd en werden hun hoofden ondergedompeld in PFA-oplossing, zoals beschreven in stap 3.4. Volwassen ratten werden diep verdoofd (stap 3.1), transcardiaal geïnfundeerd, zoals beschreven in stap 3.2. Hersenen werden ontleed en post-gefixeerd (stap 3.4). Hersenen werden gesneden in coronale secties van 40 μm (stap 3.5). Secties werden verwerkt voor BrdU immunohistochemie, zoals beschreven in stap 4.

We gebruikten mierikswortelperoxidasereactie met DAB IHC voor kleuring (stap 4.1) en het tellen van BrdU-positieve cellen in DG. Figuur 5 toont een DG-sectie met BrdU-gelabelde cellen. Figuur 5C,D toont een representatief deel van het DG-gedeelte bij hogere vergroting. Gelabelde cellen vertoonden intense donkere vlekken, die werden gemarkeerd met pijlen. De inzet toont het gemiddelde aantal gelabelde cellen in de experimentele en controlegroepen (getelde positieve cellen vermenigvuldigd met zes zoals beschreven in stap 8.1). De t-test van een student onthulde significantieverschillen tussen de aantallen BrdU-positieve cellen (t(10) = 2,704, p = 0,0222). De controlegroep die geen fysieke activiteit onderging, vertoonde 2.040 ± 314 cellen (n = 6 ratten). Ter vergelijking: de fysieke activiteitsgroep vertoonde gemiddeld 3.606 ± 486 (n = 6 ratten) BrdU-positieve cellen. Zoals waargenomen, verhoogt blootstelling aan fysieke activiteit BrdU-positieve cellen. Daarom zijn deze resultaten consistent met andere gerapporteerde resultaten die aantonen dat fysieke activiteit de cellulaire proliferatie in de volwassen gyrus dentate verhoogde17.

Figure 3
Figuur 3: Voorbeelden van verschillende morfologie van BrdU-gelabelde celkern. BrdU is een DNA-synthesemarker die de kern labelt. In het hippocampusgebied hadden de BrdU-positieve kernen een semi-ovale vorm in de subkorrelige zone van gyrus dentate. Omdat BrdU wordt opgenomen door concurrentie, zal de hoeveelheid die voor elke cel wordt opgenomen een variatie hebben die later zal worden weerspiegeld in hoe de kern zal worden gevisualiseerd. (A) Immunofluorescentiebeeld. (B) Er wordt een afbeelding gepresenteerd met behulp van een peroxidasereactie zonder aanvullende amplificatiemethode. Gele pijlen tonen artefacten en niet-specifieke signalen. Zwarte of witte pijlen tonen BrdU+-cellen. 1 – Volledig gevijlde kern, semi-ovale kernen sterk gekleurd. 2 – Kernen met stippen, de rand van de kernen is gemarkeerd en heeft binnenkant verschillende stippen. 3 – Kernen met weinig stippen, de rand van de kernen zijn gemarkeerd en hebben een klein aantal stippen binnenin. 4 – Kleine kern is mogelijk cellen in een ander differentiatiestadium, maar nog steeds onderdeel van de niche. 5 – Clusters zijn voorlopercellen onder deling, daarom kunnen meerdere cellen samen in gecondenseerde groepen worden waargenomen. Binnen deze groepen moet het tellen bijzonder zorgvuldig worden gedaan om te voorkomen dat positieve cellen verkeerd worden gelabeld. Rode pijlen tonen de kern onder deling die kan worden verward met een enkele cel. Elke cel is ingesloten in een vak en kan in realtime worden onderscheiden in een Z-asvlak. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Representatieve RGB-afbeelding voor enkele en samengevoegde kanalen. De bovenste afbeelding toont de oorspronkelijke z-stack-afbeelding en de onderste afbeelding toont de 3D-gedeconvolueerde z-stack-afbeelding. (A) Lage vergroting van het DG. (B) RGB-afbeelding voor elk kanaal en (C) RGB samengevoegde afbeelding. Dit was een brein uit de controlegroep. Immunofluorescentie werd gebruikt zonder een aanvullende amplificatiemethode. BrdU (rood), DAPI als counterstaining (blauw) en GFAP (glial fibrillary acidic protein) als astrogliale marker (groen). ML = moleculaire laag; GCL = korrelige cellaag; SGZ = subgranulaire zone. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Representatieve DG-sectie met BrdU-gelabelde cellen (intens donker) voor elke experimentele groep. De peroxidasereactie werd gebruikt met de avidine-biotine-peroxidase complexe amplificatiemethode. (A, B) Een lage vergroting van de DG weergeven en (C, D) het vakgebied weergeven bij een hogere vergroting. Panelen A en C zijn weefsels uit de fysieke activiteitsgroep, panelen B en D zijn van de controlegroep. De inzet toont het gemiddelde aantal gelabelde cellen in de fysieke activiteits- en controlegroepen (getelde positieve cellen vermenigvuldigd met zes zoals beschreven in stap 8.1). ML = moleculaire laag; GCL = korrelige cellaag; SGZ = subgranulaire zone; pijlen geven BrdU+-cellen aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Video 1: Video met een andere focus van positieve cellen langs de z-as verdeeld over verschillende lagen. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 2: Video met een andere focus van positieve celclusters langs de z-as verdeeld over verschillende lagen. Beweeg langzaam over de z-as om alle verschillende kernen te kwantificeren die een cluster integreren. Klik hier om deze video te downloaden.

Microscoop Type: Epifluorescentie Microscoop Olympus BX53
Licht: Hogedruk kwikbooglamp van 130 W (U-HGLGPS)
Acquisitie Software: CellSens Standaard
Filtersets: Catalogusnummer Excitatie bereik Dichromatische spiegel Onderdrukkingsbereik
U-FUW 340 - 490 nm 410 NM 420 NM
U-FBW 460 - 495 nm 505 NM 510 NM
U-FGW 530 - 550 nm 570 NM 575 NM
Fototoestel: Model: CCD-camera UC50
Spectraal bereik: 290 – 1000 nm
CCD chip grootte: 2/3 in, 2588 (Breedte *7) X 1960 (Hoogte *8) pixels
Pixelgrootte: 3,4 x 3,4 μm
Fluorochroom: Naam Excitatie Golflengte (nm) Emissie *3 Golflengte (nm) Emissie Kleur
4, 6-diamidino-2-fenyl-indool HCI (DAPI) 345 455 Blauw
Tetramethylrhodamine-isothyocyanaat (TRITC) 541 572 Rood
Fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) 494 519 Groen
Cy3 552 565 Rood
Montagemedium en dompelolie: Naam Brekingsindex van het medium *1
Lucht (niets tussen de dia en de lens) 1.00029
Antifade montagemedium met DAPI 1.45
Montagemedium voor permontatie 1.519
Lage autofluorescentie-onderdompelingsolie (MOIL-30 Type F) 1.518
Vergroting Lens (Plan Fluoriet) Vergroting Numeriek diafragma (NA) *2 Resolutie (μm) Pixelafstand afbeelding (nm) *5 Segmentafstand Z-as (nm) *6
4x 0.13 2.12 850 3000
10x 0.3 0.92 340 3000
20x 0.5 0.55 170 2000
40x 0.75 0.37 85 1000
100x 1.3 0.21 34 1000

Tabel 2: Specificaties voor het instellen van microscoop en vereisten voor het maken van PSF-bestanden (Point Spread Function). Er zijn 11 slots in het diffractie PSF 3D plugin venster om het PSF bestand te maken. Elke sleuf wordt als volgt beschreven: *1 - Brekingsindex van het medium: brekingsindex voor het medium tussen de dia en de lens (bijv. Lucht = 1,00029). *2 - Numeriek diafragma: NA van de gebruikte lens (deze moet worden gecorrigeerd wanneer een ander onderdompelingsmedium wordt gebruikt en de lens is toegewezen). *3 - Golflengte: Fluorochrome maximale emissiegolflengte (nm). *4 - Longitudinale sferische aberratie: 0,00. *5 - Beeldpixelafstand: CCD-pixelgrootte (nm)/vergroting (bijv. 3,4 μm en 100X lens, 3400/100 = 34 nm). *6 - Afstand tussen afbeeldingen Z-as. *7 - Breedte: Voer de breedte in van de afbeelding die in pixels moet worden gedeconcentreerd. *8 - Hoogte: Voer de hoogte in van de afbeelding die in pixels moet worden gedeconcentreerd. *9 - Diepte, segmenten: het aantal afbeeldingen in de z-stack. *10 - Normalisatie: Som van pixelwaarden = 1. *11 - Titel: Gewenste naam voor het PSF-bestand. Het bestand moet overeenkomen met de unieke gegeven z-stack-afbeelding.

Discussion

Volwassen neurogenese is een proces dat het vaakst voorkomt in niches van volwassen neurale voorlopercellen die het potentieel hebben om nieuwe neuronen te genereren gedurende hun hele levensduur. Bromodeoxyuridine (BrdU) labeling wordt veel gebruikt in de immunologie om het aantal nieuw gegenereerde cellen in een volwassen brein te karakteriseren. BrdU zal voornamelijk worden opgenomen in cellen van discrete hersengebieden (neurogene zones). Deze cellen bevinden zich in de subventrikelzone (SVZ), de gyrus dentate van de hippocampus - tussen de hilus en granulaire cellen die bekend staan als subgranulaire zone (SGZ)1,2,18. Bovendien zijn er verschillende hersengebieden die worden gekenmerkt door een lagere proliferatieve capaciteit op volwassen leeftijd, waaronder de hypothalamus, striatum, neocortex en amygdala19. Zoals eerder vermeld, is BrdU-kleuring de veelgebruikte methode voor onderzoek naar neurogenese bij volwassenen om celproliferatie te detecteren. Het gebruik van BrdU als marker heeft echter beperkingen en valkuilen. De eerste is dat BrdU een celcyclusmarker is. Daarom moet dubbele of drievoudige kleuring worden uitgevoerd om het lot van de cel te identificeren en celmarkers bevatten om het specifieke ontwikkelingsstadium van de gelabelde cellen te detecteren. Nog een zorg over BrdU is dat het een toxische en mutagene oplossing is die de DNA-stabiliteit wijzigt en de cellulaire functie en celcycli kan veranderen. Rekening moet worden gehouden met de eerdere informatie bij het besluit om een toedieningsprotocol en toedieningsdoses (50 \u2012600 mg / kg) te volgen. Een ander cruciaal kenmerk is dat BrdU een DNA-synthesemarker is, geen celproliferatiemarker14. Daarom is het relevant om celproliferatie te onderscheiden van andere gebeurtenissen zoals een DNA-reparatie, abortieve celcyclusherinvoering en genduplicatie. Onderzoekers moeten passende controles volgen om het juiste gebruik van BrdU te garanderen. Voor een meer gedetailleerde discussie over deze problemen en beperkingen, raden we aan het werk van Taupinte bekijken 14. Het standaardisatieproces van een immunohistochemisch protocol kan traag en uitdagend zijn. In dit werk hebben we alle algemene stappen gepresenteerd om een succesvol IHC-protocol te beheren. We raden echter aan dat elke onderzoeksgroep weefsel, antilichamen en aandoeningen van tevoren test en evalueert. Tests en evaluaties moeten worden uitgevoerd met ten minste drie verschillende niveaus van incubaties, wasstappen en sterktes voor elk getest antilichaam en weefsel. We raden onderzoekers ook aan om aanvullende protocollen te bekijken om de beste te kunnen kiezen die voldoet aan specifieke behoeften en vereisten 20,21,22,23,24,25.

Zoals eerder vermeld, omvat de procedure verschillende stappen en methodologische overwegingen die vaak worden gebruikt en genoemd in wetenschappelijke artikelen, die later zullen worden besproken. We raden onderzoekers aan om de antilichamen zorgvuldig en correct te kiezen in termen van techniek, budget, apparatuur, opstelling en hoofddoel van het onderzoek. Antilichamen moeten worden getest met hetzelfde type weefsel dat later in het experiment zal worden getest. We raden ook het gebruik aan van een antilichaam dat voor hetzelfde doel (IHC) is getest (d.w.z. niet alleen in western blot- of flowcytometrietechnieken) om de compatibiliteit met de fixatietechniek te testen. Verschillende routes kunnen worden gebruikt om de BrdU-kleuring toe te dienen, zoals intraperitoneale injectie, intraperitoneale infusie, orale inname of intraventriculaire infusie (voor een meer gedetailleerde beschrijving van elke techniek, zie referentie26). Als de intraperitoneale injectie is geselecteerd, zorg er dan voor dat BrdU wordt toegediend in de peritoneale holte en vermijd het darmgebied. Omdat de darm verschillende cellen in duplicatie heeft die de BrdU kunnen uitputten voordat deze in de hersenen komt, wat het aantal gelabelde cellen zal beïnvloeden. Het is cruciaal om dunne secties te verkrijgen, omdat ze een betere penetratie van oplossingen mogelijk maken. Coronale plakjes van 40 μm dik werden rostro-caudally gesneden en werden overgebracht naar een 24-well celkweekplaat, volgens de stereologische procedure voorgesteld door Kempermann et al.27. De immunohistochemie kan worden uitgevoerd met weefsel gemonteerd op dia's of als vrij zwevende secties. Omdat BrdU zich diep in celkernen bevindt, maakt het de penetratie van oplossingen in vrij zwevende secties mogelijk, wat betere resultaten en betere toegang tot het interessegebied oplevert. Het is belangrijk om DNA-bindingen (DNA-denaturatie) te openen om de primaire anti-BrdU-antilichaamtoegang mogelijk te maken. In dit werk hebben we deze specifieke procedures uitgevoerd met behulp van HCI-incubatie. Aan de andere kant maakte het proces van het blokkeren van niet-specifieke epitopen een nauwkeurigere identificatie van het celsignaal mogelijk.

De goede membraanpermeabilisatie zorgt ervoor dat de antilichamen goed door het interessegebied kunnen dringen. Het toevoegen van een permeabilizer zoals Triton X-100 aan PBS++ en PBS+ oplossingen verbetert de membraanpermeabilisatie. Zowel PBS- als Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) reagentia kunnen in dit protocol worden gebruikt. Qua budget zou de TBS relativiteit goedkoper kunnen zijn dan de PBS. PBS kan echter interfereren met antifosfaatantistoffen en alkalische fosfatase-geconjugeerde antilichamen remmen, dus vermijd het gebruik van PBS als het doelwit posttranslationeel wordt gewijzigd door fosforylering (d.w.z. gefosforyleerd). We gebruikten de PBS voor dit werk en we kwamen erachter dat weefselwasstappen een specifieker signaal gaven. We raden onderzoekers ook aan om ten minste drie wascycli uit te voeren met behulp van TBS of PBS. De oplossingen moeten vers worden bereid. Antigeen retrieval (AR) is een methode die bedoeld is om het verlies van antigeniciteit te verminderen dat wordt veroorzaakt door de fixatie die de structuur van de tertiaire en quaternaire antigenen wijzigt. Deze reductie maakt antigenen niet detecteerbaar door antilichamen28,29. De warmte-geïnduceerde epitoop retrieval (HIER) die in dit protocol wordt gebruikt, probeerde de chemische reacties tussen formaldehyde en eiwitten om te keren door hoge temperatuur of sterke alkalische hydrolyse (met andere bufferoplossingen als EDTA pH 8,5 of Tris pH 9,5). Het is essentieel om nieuwe antilichamen met verschillende AR-protocollen te testen om de resultaten te vergelijken en de beste voor het protocol te kiezen. Deze laatste stap kan optioneel zijn in een regulier protocol; we hebben echter weefsels behandeld met een antigeen ophaalprotocol om betere resultaten voor dit protocol te bieden.

Het is cruciaal om de juiste uiteindelijke contrasterende kleur en de counterstain-techniek te selecteren met inachtneming van de primaire kleuringskleur en methode die wordt gebruikt om een niet-vlekkende structuur zichtbaar te maken en te voorkomen dat de primaire kleur van de immuunreactie wordt gemaskeerd. Voor de fluorescentiemicroscopie is de DAPI (4', 6-diamidino-2-fenylalandool) een zeer populaire nucleaire en chromosoomtellerstain die blauwe fluorescentie (absorptie: 360 nm, emissie: 460 nm) uitzendt bij binding aan AT-gebieden van DNA. DAPI-bevattend montagemedium is beschikbaar en is gemakkelijk te gebruiken; dit biedt uitstekende signaalretentie voor beeldacquisitie. Voor de peroxidereactie was IHC verkrijgbaar in verschillende opties, zoals cresylviolet, hematoxyline, neutrale rode of methylgroene kleuring. Voor meerdere immunostainingtechnieken is het cruciaal om een compatibel antilichaam te kiezen met de fixatietechniek die wordt gebruikt om kruisreactiviteit te voorkomen30. Wanneer problemen en complicaties met een enkele kleuring zijn opgelost, dient u een andere kleurkleuring toe als dit nodig wordt geacht. Het is cruciaal om de niet-specifieke binding tussen de secundaire antilichamen te controleren. Dit kan worden gedaan door de primaire antilichamen te verzadigen voordat een secundair antilichaam wordt gebruikt dat wordt geproduceerd in dezelfde gastheersoort van de primaire antilichamen. Bijvoorbeeld, bij het gebruik van anti-muis geproduceerd in konijn en anti-konijn geproduceerd in geiten secundaire antilichamen, moet het anti-konijn geproduceerd in geitenantilichaam worden gebruikt voordat de anti-muis geproduceerd in konijn antilichaam. Wanneer de sequentiële methode volledig wordt gedomineerd, kan het gelijktijdige immunostainingproces worden gestart. Bij deze methode is het essentieel om secundaire antilichamen op de juiste manier te kiezen. Idealiter moeten al die antilichamen afkomstig zijn van hetzelfde gastheerdier om kruisreactiviteit te voorkomen. We raden aan om een positieve controle uit te voeren om te bevestigen dat de kleuringsmethode nauwkeurig werkt in postnatale hippocampusweefsel (overvloedige neurogenese rond deze leeftijd). Als het positieve controleweefsel kleuringsproblemen vertoont, bekijk en doorloop de procedure, breng correcties en aanpassingen aan en herhaal totdat een goede kleuring wordt geproduceerd. Voer vervolgens een negatieve controle uit om te testen of het antilichaam correct werkt door een bepaald primair antilichaam weg te laten of te vervangen door normaal serum (dezelfde soort als het primaire antilichaam). Zoals vermeld in de inleiding, is beelddeconvolutie een krachtig hulpmiddel en biedt het een alternatief wanneer een confocale microscoop niet beschikbaar is. Het kan de beelddeconvolutie toepassen op alle beelden die zijn verkregen met behulp van doorgelaten licht helder veld, breedveldfluorescentie en confocale fluorescentiemicroscopie. Het uiteindelijke doel van beelddeconvolutie is om het oorspronkelijke signaal te reconstrueren dat het acquisitiesysteem verslechtert10.

Samenvattend is de identificatie van de nieuw gegenereerde cellen gevisualiseerd door de immunodetectie van thymidine-analoog BrdU een gecompliceerde maar krachtige techniek. Dit werk is een poging om wetenschappers te helpen, met name op het gebied van volwassen hippocampale neurogenese, om nieuwe cellen nauwkeuriger te kwantificeren. We hopen dat deze inspanning nuttig is geweest voor de wetenschappelijke gemeenschap en het gemakkelijker maakt om de studie van celproliferatie te verfijnen met behulp van de immunohistochemische techniek.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We willen de heer Miguel Burgos en Gustavo Lago bedanken voor het verlenen van technische assistentie. We willen ook Dr. Clorinda Arias, Dr. Karla Hernandez en Dr. Oscar Galicia bedanken voor hun vriendelijke steun bij het leveren van reagentia en materiaal. We bedanken ook División de Investigación y Posgrado van de Universidad Iberoamericana Ciudad de México voor het verstrekken van financiering voor de uitvoering van dit werk en voor het dekken van videoproductiekosten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENT PREPARATION AND SETUP
Donor Horse Serum BioWest S0900 Blocking and incubation solutions in PBS
Paraformaldehyde reagent grade, crystalline (PFA) Sigma-Aldrich P6148 toxic, flammable
Potassium Chloride Sigma-Aldrich 746436-500G
Potassium Phosphate, monobasic J.T Bker 3246-01
Sacarose J.T Baker 4072-01
Sodium Chloride Meyer 2365-500G
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S5881-500G Corrisive, to calibrate pH
Sodium Phophate Dibasic Sigma-Aldrich S9763-5KG
Triton-x 100 Sigma-Aldrich T8787
THYMIDINE ANALOGUE BRDU ADMINISTRATION
5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU Sigma-Aldrich B9285 toxic (mutagenic, teratogenic)
23–27G hypodermic needle BD PrecisionGlide
Saline solution PiSA 30130032
Syringes 1 mL NIPRO
TISSUE PREPARATION
15-ml polypropylene conical tube Thermo Scientific 339650
50-ml polypropylene conical tube Thermo Scientific 339652
Dissecting tools
Guillotine Stoelting
Microtome Cryostat MICROM HM525
Netwell 15 mm polyester mesh membrane inserts Corning 3477 pre-loaded in 12-well culture plates
Netwell plastic 12-well carrier kit Corning 3520 for 15 mm polyester mesh membrane inserts
Netwell plastic 6-well carrier kit Corning 3521
Perfusion pump Cole-Parmer 7553-70
Shaker IKA ROKCER 3D Digital
IMMUNOSTAINING
Cresyl violet Sigma-Aldrich C5042 1%, Light sensitive
DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit (with Nickel), 3,3’-diaminobenzidine Vector Laboratories SK-4100 carcinogenic, light sensitive
Hydochloric Acid J.T.Baker 9535-05 Corrosive, to calibrate pH
Hydrogen Peroxide, 50% Meyer 5375-1L Toxic, oxidative
Permount Mounting Medium Fisher Chemical SP15-500
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200 Light sensitive
VECTASTAIN® Elite® ABC Kit Peroxidase (HRP) Vector Laboratories PK-6100 enzymatic, avidin/biotin based amplification system
Primary antibodies
Anti-GFAP antibody produced in rabbit Sigma-Aldrich HPA056030 1:500
Monoclonal Anti-BrdU antibody produced in Mouse Sigma-Aldrich B2531 1:250
Secondary antibodies
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 715-065-151 1:250
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP Invitrogen G-21040 1:1000
Goat Anti-Mouse IgG (whole molecule), TRITC Sigma-Aldrich T5393 1:250
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed, FITC Invitrogen F-2765 1:250
Streptavidin, Cy3 Vector Laboratories SA-1300 1:250
IMAGING AND ANALYSIS
Computer Dell Computer Company T8P8T-7G8MR-4YPQV-96C2F-7THHB For controlling and monitoring protocols’ processes
CCD-camera Olympus UC50
CellSens Standard software Olympus cellSens Standard Edition Acquisition Software
Epifluorescent microscope Olympus BX53
High-pressure 130 W mercury arc lamp Olympus U-HGLGPS
low autofluorescence immersion oil Olympus MOIL-30 Type F
Micro cover-glasses (VWR, cat no 48404 454; 24  60 mm)
Microscope slides (VWR, cat no 48323-185; 76  26 mm)
U-FBW filter cube Olympus U-FBW excitation 460 - 495 nm, dichroic mirror 505 nm, suppression 510 nm
U-FGW filter cube Olympus U-FGW excitation 530 - 550 nm, dichroic mirror 570 nm, suppression 575 nm
U-FUW filter cube Olympus U-FUW excitation 340 - 490 nm, dichroic mirror 410 nm, suppression 420 nm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Altman, J. Are new neurons formed in the brains of adult mammals. Science. 135 (3509), 1127-1128 (1962).
  2. Altman, J., Das, G. D. Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats. The Journal of Comparative Neurology. 124 (3), 319-335 (1965).
  3. Miller, M. W., Nowakowski, R. S. Use of bromodeoxyuridine-immunohistochemistry to examine the proliferation, migration and time of origin of cells in the central nervous system. Brain Research. 457 (1), 44-52 (1988).
  4. Eriksson, P. S., et al. Neurogenesis in the adult human hippocampus. Nature Medicine. 4 (11), 1313-1317 (1998).
  5. Filippov, V., et al. Subpopulation of nestin-expressing progenitor cells in the adult murine hippocampus shows electrophysiological and morphological characteristics of astrocytes. Molecular and Cellular Neuroscience. 23 (3), 373-382 (2003).
  6. Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends in Neurosciences. 27 (8), 447-452 (2004).
  7. Matiašová, A., et al. Flow cytometric determination of 5-bromo-2'-deoxyuridine pharmacokinetics in blood serum after intraperitoneal administration to rats and mice. Histochemistry and Cell Biology. 142 (6), 703-712 (2014).
  8. Von Bohlen Und Halbach, O. Immunohistological markers for proliferative events, gliogenesis, and neurogenesis within the adult hippocampus. Cell and Tissue Research. 345 (1), 1-19 (2011).
  9. Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
  10. Manz, W., Arp, G., Schumann-Kindel, G., Szewzyk, U., Reitner, J. Widefield deconvolution epifluorescence microscopy combined with fluorescence in situ hybridization reveals the spatial arrangement of bacteria in sponge tissue. Journal of Microbiological Methods. 40 (2), 125-134 (2000).
  11. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  12. Abràmoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with imageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-41 (2004).
  13. Giannini, A., Giannini, J. 2D and 3D Fluorescence Deconvolution Manual. , Available from: https://pages.stolaf.edu/wp-content/uploads/sites/803/2016/12/Giannini_Giannini_Deconvolution_Manual_20161215.p (2016).
  14. Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
  15. Revilla, V., Jones, A. Cryostat sectioning of brains. International Review of Neurobiology. 47, 61-70 (2002).
  16. Amaral, D. G., Scharfman, H. E., Lavenex, P. The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies). Progress in brain research. 163, 3-22 (2007).
  17. Eadie, B. D., Redila, V. A., Christie, B. R. Voluntary exercise alters the cytoarchitecture of the adult dentate gyrus by increasing cellular proliferation, dendritic complexity, and spine density. Journal of Comparative Neurology. 486 (1), 39-47 (2005).
  18. Leal-Galicia, P., Romo-Parra, H., Rodríguez-Serrano, L. M., Buenrostro-Jáuregui, M. Regulation of adult hippocampal neurogenesis exerted by sexual, cognitive and physical activity: An update. Journal of Chemical Neuroanatomy. 101, 101667 (2019).
  19. Gould, E. How widespread is adult neurogenesis in mammals. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 481-488 (2007).
  20. Ngwenya, L. B., Peters, A., Rosene, D. L. Light and electron microscopic immunohistochemical detection of bromodeoxyuridine-labeled cells in the brain: Different fixation and processing protocols. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (7), 821-832 (2005).
  21. Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), e52551 (2015).
  22. Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. Journal of Visualized Experiments. (46), e2166 (2010).
  23. Tischler, A. S. Triple immunohistochemical staining for bromodeoxyuridine and catecholamine biosynthetic enzymes using microwave antigen retrieval. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 1-4 (1995).
  24. Taupin, P. Protocols for studying adult neurogenesis: Insights and recent developments. Regenerative Medicine. 2 (1), 51-62 (2007).
  25. Leuner, B., Glasper, E. R., Gould, E. Thymidine analog methods for studies of adult neurogenesis are not equally sensitive. Biosystems. 517 (2), 123-133 (2010).
  26. Magavi, S. S., MacKlis, J. D. Identification of newborn cells by BrdU labeling and immunocytochemistry in vivo. Methods in Molecular Biology. 438, 335-343 (2008).
  27. Kempermann, G., Gast, D., Kronenberg, G., Yamaguchi, M., Gage, F. H. Early determination and long-term persistence of adult-generated new neurons in the hippocampus of mice. Development. , 391-399 (2003).
  28. Ramos-Vara, J. A., Beissenherz, M. E. Optimization of immunohistochemical methods using two different antigen retrieval methods on formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: Experience with 63 markers. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 12 (4), 307-311 (2000).
  29. Ramos-Vara, J. A. Principles and methods of immunohistochemistry. Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).
  30. Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).

Tags

Biologie BrdU hippocampus gyrus dentate neurogenese antigeen retrieval detectiemethoden fixatie immunohistochemie immunofluorescentie standaardisatie probleemoplossing image deconvolutie
Immunohistochemische technieken om cellulaire proliferatie en neurogenese bij ratten te analyseren met behulp van de Thymidine Analog BrdU
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Buenrostro-Jauregui, M.,… More

Buenrostro-Jauregui, M., Tapia-de-Jesús, A., Mata, J., Rodríguez-Serrano, L. M., Chávez-Hernández, M. E., Mata, F., Monroy-Plasencia, M., Alonso-Flores, A. C., Leal-Galicia, P. Immunohistochemistry Techniques to Analyze Cellular Proliferation and Neurogenesis in Rats Using the Thymidine Analog BrdU. J. Vis. Exp. (163), e61483, doi:10.3791/61483 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter