Summary
מאמר זה מציג שיטה של בקיעה ללא שימוש קליפת ביצה למחקרים טוקסיקולוגיים של מזהמי חלקיקים כגון מיקרופלסטיק.
Abstract
מיקרופלסטיק הוא סוג מזהם עולמי מתפתח המהווה איום בריאותי גדול על בעלי חיים בשל ספיגתם והעברתם ברקמות ובאיברים של בעלי חיים. השפעות אקולוגיות של מיקרופלסטיק על התפתחות עוברים ציפורים אינן ידועות. ביצת הציפור היא מערכת פיתוח ותזונה מלאה, וכל התפתחות העובר מתרחשת על קליפת הביצה. לכן, תיעוד ישיר של התפתחות העובר ציפור תחת הלחץ של מזהמים כגון מיקרופלסטיק מוגבל מאוד על ידי קליפת ביצה אטומה בקיעה המסורתית. במחקר זה, ההשפעות של מיקרופלסטיק על התפתחות עובר שליו היו מנוטרים חזותית על ידי בקיעה ללא קליפת ביצה. השלבים העיקריים כוללים ניקוי וחיטוי של ביצים מופרות, דגירה לפני החשיפה, הדגירה לטווח קצר לאחר החשיפה, ואת מיצוי המדגם. התוצאות מראות כי בהשוואה לקבוצת הביקורת, המשקל הרטוב ואורך הגוף של הקבוצה החשופה למיקרופלסטיק הראו הבדל סטטיסטי ושיעור הכבד של כל הקבוצה החשופה גדל באופן משמעותי. בנוסף, הערכנו גורמים חיצוניים המשפיעים על הדגירה: טמפרטורה, לחות, זווית סיבוב ביצה, ותנאים אחרים. שיטה ניסיונית זו מספקת מידע רב ערך על האקוטוקסיולוגיה של מיקרופלסטיק ודרך חדשנית לחקור את ההשפעות השליליות של מזהמים על התפתחות העוברים.
Introduction
ייצור פסולת הפלסטיק היה כ-6,300 הרים בשנת 2015, עשירית ממנו מוחזר, והשאר נשרף או נקבר מתחת לאדמה. ההערכה היא כי כ -12,000 הר של פסולת פלסטיק ייקבר מתחת לאדמה עד 20501. עם תשומת הלב של הקהילה הבינלאומית לפסולת פלסטיק, תומפסון הציע לראשונה את הרעיון של מיקרופלסטיק בשנת 20042. מיקרופלסטיק (MPs) מתייחס פלסטיק חלקיקים קטנים עם קוטר חלקיקים פחות מ 5 מ"מ. כיום, חוקרים זיהו את נוכחותם בכל מקום של חברי פרלמנט בקו החוף של יבשות שונות, האיים האטלנטיים, האגמים היבשתיים, הקוטב הצפוני ובתי גידול במעמקי הים3,4,5,6,7. לכן, חוקרים נוספים החלו לחקור את הסיכונים הסביבתיים של חברי פרלמנט.
אורגניזמים יכולים לבלוע חברי פרלמנט בסביבה. חברי פרלמנט נמצאו במערכת העיכול של 233 אורגניזמים ימיים ברחבי העולם (כולל 100% מיני צבים, 36% מיני כלבי ים, 59% מיני לווייתנים, 59% מיני עופות ים, 92 סוגים של דגי ים ו -6 סוגים של חסרי חוליות)8. יתר על כן, חברי פרלמנט עשויים לחסום את מערכת העיכול של האורגניזמים, לצבור ולעבור בבובות שלהם9. נמצא כי חברי פרלמנט ניתן להעביר באמצעות שרשרת המזון, ואת צריכתם שונה עם השינויים של בית הגידול, שלב הצמיחה, הרגלי האכלה, ומקורותמזון 10. כמה חוקרים דיווחו על קיומם של חברי פרלמנט גללים של עופותים 11, כלומר עופות ים לפעול כנשא של חברי פרלמנט. בנוסף, בליעה של חברי פרלמנט יכולה להשפיע על בריאותם של אורגניזמים מסוימים. לדוגמה, חברי פרלמנט יכולים להסתבך במערכת העיכול, ובכך להגדיל את התמותה של cetaceans12.
חברי פרלמנט לבדם יש השפעות רעילות על אורגניזמים, כמו גם השפעות רעילות משותפות על אורגניזמים עם מזהמים אחרים. בליעה של ריכוזים הקשורים לסביבה של פסולת פלסטיק עלולה להפריע לתפקוד המערכת האנדוקרינית של דגים בוגרים13. גודל המיקרופלסטיק הוא אחד הגורמים החשובים המשפיעים על ספיגתם והצטברותם על ידי אורגניזמים14,15. הפלסטיק בגודל קטן, במיוחד הפלסטיק בגודל ננו, נוטים אינטראקציה עם תאים ואורגניזמים עם רעילות גבוהה16,17,18,19. למרות ההשפעות המזיקות של מיקרופלסטיק בגודל ננו-חלקיקים על אורגניזמים עולה על רמת המחקר הנוכחית, זיהוי וכימות של מיקרופלסטיק עם גדלים פחות מכמה מיקרומטרים, במיוחד תת מיקרו מיקרומטר / ננו-פלסטיק בסביבה, הוא עדיין אתגר גדול. בנוסף, ננו-פלסטיק יש גם כמה השפעות על עוברים. פוליסטירן יכול לפגוע בהתפתחות עוברים של קיפודי ים על ידי ויסות פרופילי חלבון וגנים20.
כדי לחקור את ההשפעה הפוטנציאלית של חברי פרלמנט על אורגניזמים, ערכנו את המחקר הזה. בשל הדמיון בין עוברים ציפורים ועוברים אנושיים, הם משמשים בדרך כלל במחקר ביולוגי התפתחותי21 כולל אנגיוגנזה ו antiangiogenesis, הנדסת רקמות, שתל ביו חומרי, וגידולים במוח22,23,24. לעוברי ציפורים יש את היתרונות של עלות נמוכה, מחזור תרבות קצר ותפעול קל25,26. לכן, בחרנו עוברים שליו עם מחזור צמיחה קצר כחיה ניסיונית במחקר זה. בו זמנית, אנו יכולים לצפות ישירות בשינויים המורפולוגיים של עוברים שליו שנחשפו לחברי פרלמנט במהלך שלב ההתפתחות העוברית באמצעות טכנולוגיית בקיעה ללא קליפת ביצה. החומרים הניסיוניים בהם נעשה שימוש היו פוליפרופילן (PP) ופוליסטירן (PS). מכיוון ש- PP ו- PS27 מהווים את השיעור הגדול ביותר של סוגי פולימרים המתקבלים משקעים וגופי מים ברחבי העולם, סוגי הפולימר הנפוצים ביותר המופקים מאורגניזמים ימיים שנתפסו הם אתילן ופרופילן28. פרוטוקול ניסיוני זה מתאר את כל התהליך להערכה חזותית של השפעות טוקסיקולוגיות של חברי פרלמנט על עוברים שליו שנחשפו לחברי פרלמנט. אנו יכולים בקלות להרחיב שיטה זו כדי לבחון רעילות של מזהמים אחרים להתפתחות העובר של בעלי חיים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה לפני החשיפה
- בחר ביצי שליו מופרות שנולדו באותו יום לבדיקת החשיפה.
- בחר ביצי שליו עם משקולות דומות. כל ביצת שליו מופרית היא בערך 10-12 גרם.
- נקה לחלוטין את כל ביצי שליו מופרות מצואה חיצונית ופסולת אחרת.
- לחטא כל ביצית שליו מופרית מראש ואת הביצים לשימוש (בחר ביצים עם צורת קליפה דומה, במיוחד את קצה הביצית) עם פתרון אנטיביוטי (פניצילין וסטסטרוטומיצין, 1:1000, טמפרטורת החדר). לחטא את האינקובטור עם 75% אתנול.
- פתח את הביצים עם הקצה הקהה של מקדחה דנטלית, משאיר את קליפת הביצה בקצה לשימוש נוסף. לפני העברת הביציות המופרות, את התוכן של הביצים נשפכים החוצה. זה כדי לשמור על הלחות של קליפת הביצה. קוטר הפתיחה של הביצה היה כ -3 ס"מ.
הערה: כדי להפחית את הנזק לעובר שליו, השתמש מקדחה דנטלית כדי לפתוח את הקצה הקהה של הביצה ולהפוך את הסדק חלק ככל האפשר. - לאחר העיקור, מניחים את ביצי השליו מופרות באינקובטור 38 מעלות צלזיוס עם 60% לחות ל-24-48 שעות. ודא כי הקצה הקהה של ביצת שליו פונה למעלה.
- במהלך הדגירה של ביצי שליו מופרות, לעקר את הכלים הדרושים בניסויים הבאים בסיר עיקור. כלים אלה כוללים ניילון נצמד,, מים סטריליים, טיפים פיפטה, מספריים ישרים כירורגיים, פינצטה, וכפית.
הערה: השתמש בסרט עם סובלנות טמפרטורה גבוהה מספיק כדי למנוע בעיות עם עיקור בטמפרטורה גבוהה.
2. בוקעים את ביצת שליו ללא קליפה
- מעבירים את ביצי שליו המופריות מראש מהאינקובטור לספסל נקי ומניחים אותן שטוחות על המיכל כדי לייצב אותן במשך כ 1-2 דקות.
- השתמש במספריים (12.5 ס"מ מספריים ישרים כירורגיים) כדי לתקוע חור קטן (קוטר 3 מ"מ) בציר המרכזי של ביצי שליו מופרות מראש ולחתוך 1-2 ס"מ פתח קטן. מעבירים בזהירות את הביצית הלבנה והחלמון של ביצי שליו מופרות לקליפת הביצית החתכה.
הערה: בעת חיתוך פתח קטן עם מספריים, להימנע מגע של חלמון של ביצי שליו. - הוסף את פתרון הבקרה (ללא חברי פרלמנט) ואת הפתרון החשוף של מסות שונות (0.1, 0.2 ו-0.3 מ"ג) של מיקרופלסטיק עם שלושה גדלי חלקיקים (100, 200 ו- 500 ננומטר) לתכולת הביצה באמצעות פיפטה. יחד עם זאת, להוסיף 1 טיפה של פניצילין 1 טיפה של סטרפטומיצין עם מזרק 1 מ"ל.
- מכסים את פתיחת קליפת הביצה בסרט המעוקר (שלב 1.6).
- על פי שלב 2.1-2.4, לטפל בכל ביצי שליו מופרות.
- מניחים את עוברי השליו המועברים לתוך אינקובטור 38 °C עם 60% לחות לתקופה הדרושה. בניסוי זה, השתמש בזווית סיבוב ביצה של ±30°. להפוך את הביצים פעם בשעה.
הערה: ההעברה צריכה להיות מהירה ככל האפשר, מה שדורש יותר תרגול בשלב המוקדם.
3. איסוף דוגמאות
- לאחר שבעה ימים של תרבות, להסיר עוברים מפותחים שנצפו בעין בלתי מן החלמון לשטוף עם פתרון חוצץ פוספט (PBS).
- יבשו את התמיסה העודפת מחוץ לעובר המנוקה בנייר סופג ושקלו צלחת פטרי נקייה.
- פתחו את כל חלל החזה, הפרידו את הכבד והלב מהפנים עם צבת מחט-האף, והכניסו לצינורות צנטריפוגות בגודל 1.5 מ"ל מיד לאחר הניקוי.
- תעד במהירות את המשקל על איזון אלקטרוני וחשב את האינדקס הפטוסומטי (HIS = משקל כבד / משקל גוף x 100). למדוד את אורך החזה והגוף.
- בהתבסס על האינדיקטורים לעיל, להעריך את ההשפעה של חברי פרלמנט על התפתחות עוברית.
הערה: איכות העובר כאן מתייחסת לאיכות הסרת החלמון.
4. ניתוח נתונים
- דווח על הנתונים הניסיוניים בצורה של שגיאת תקן ± ממוצעת (SEM).
- השתמש בניתוח חד-גורם של שונות כדי להשוות את האמצעים של קבוצות מרובות של דגימות. ערך ההפרש המשמעותי היה α = 0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לניתוח נתונים ניסיוניים השווינו משקל רטוב, אורך גוף, אורך רכי החזה ושינוי מדד הפטוסומטי בין קבוצת הביקורת לבין 6 קבוצות הניסוי, תוך מדידה והשתקפות של הצמיחה וההתפתחות של עוברים שליו מנקודת מבט מאקרו. זיהינו שישה עוברים שליו רגילים בכל קבוצה. כל עובר הגיע לשלב ההמבורגר והמילטון (HH) הנדרשים.
באיור 1העברנו את תכולת ביצית שליו המופרית מראש לתוך קליפות הביציות בחצי הכדור ושמנו אותן באינקובטור. ואז תיעדנו את התפתחות העוברים באמצע הדגירה במשך שלושה ימים. כפי שמוצג באיור 2, A-A2 היא קבוצת הביקורת, ו-B-B2 היא קבוצת טיפול אחת. מנקודת המבט של התפתחות העוברים המקרוסקופיים, העוברים התפתחו כרגיל ללא ההשפעות השליליות של מיקרופלסטיק.
טבלה 1 וטבלה 2 הן ה- SEM ± הממוצע של משקל רטוב, אורך הגוף ואורך החזה של עובר שליו לאחר חשיפה של שבוע. הטבלאות מראות כי המשקל הרטוב ואורך הגוף משתנים באופן משמעותי בקבוצות חשיפה שונות. המשקל ואורך הגוף של הקבוצות שטופלו עם 0.1 מ"ג, 0.3 מ"ג, 100 ננומטר, ו 500 ננומטר חברי פרלמנט ירד מעט. משקל הגוף ואורך הגוף של 0.2 מ"ג של 200 ננומטר קבוצות שטופלו מיקרופלסטית גדלו מעט (P < 0.05).
מדד הפטוסומטי (HIS) מראה את שיעור הכבד בעובר שליו, שהוא סימן חשוב לשפוט את מידת התפתחות הכבד. יתר על כן, HSI ממלא תפקיד חשוב בפתוגנזה של פגיעה בקרום תאי הכבד וחדירה דלקתית. כפי שניתן לראות באיור 3 ובאיור 4, בהשוואה לקבוצת הביקורת, שיעור הכבד בכל קבוצת הטיפול גדל משמעותית לאחר חשיפה למיקרופלסטיק. עם זאת, לא היה הבדל משמעותי בין 0.2 מ"ג ו 0.3 מ"ג של 100 ננומטר קבוצות טיפול MPs וקבוצת הביקורת.
איור 1: ביצי שליו בוקעות ללא קליפה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: התפתחות העובר של שליו ביום השישי, השביעי והשמונה בשלב האמצעי של הבקיעה ללא קליפת ביצה. החץ הירוק מצביע על העיניים; החץ הכחול מצביע על הגפיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מדד הפטוסומטי של עוברים שליו לאחר חשיפה לחברי פרלמנט (nm) למשך 7 ימים. הבדלים משמעותיים בין קבוצות בקרה וטיפול מסומנים על ידי * P < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מדד הפטוסומטי של עוברים שליו לאחר חשיפה לחברי פרלמנט (μm) למשך 7 ימים. הבדלים משמעותיים בין קבוצות בקרה וטיפול מסומנים על ידי * P < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| טיפול חברי פרלמנט | משקל (ז) | אורך (ס"מ) | אורך שטר כף החזה |
| לשלוט | 2.509±0.324 | 5.425±0.477 | 1.025±0.094 |
| 100 ננומטר | 1.812±0.155* | 4.632±0.315* | 0.950±0.152 |
| 200 ננומטר | 2.272±0.368 | 5.297±0.268 | 1.025±0.076 |
| 500 ננומטר | 1.785±0.127* | 4.892±0.154* | 1.017±0.082 |
טבלה 1: משקל רטוב, אורך הגוף ואורך החזה של עוברים שליו לאחר חשיפה לחברי פרלמנט (nm) במשך 7 ימים
| טיפול | משקל (ז) | אורך (ס"מ) | אורך שטר כף החזה |
| לשלוט | 2.161±0.166 | 5.23±0.26 | 1.10±0.04 |
| 0.1 מ"ג | 1.960±0.338* | 4.82±0.75* | 1.04±0.04 |
| 0.2 מ"ג | 2.410±0.366* | 5.25±0.26 | 1.07±0.10 |
| 0.3 מ"ג | 1.901±0.759 | 4.95±0.15* | 1.02±0.09 |
טבלה 2: משקל רטוב, אורך גוף ואורך עד החזה של עוברים שליו לאחר חשיפה לחברי פרלמנט (מיקרומטר) למשך 7 ימים. בהשוואה לקבוצת הביקורת, * מציין P < 0.05, ** מציין P < 0.01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מספק תוכנית ניסיונית יעילה להערכת התפתחות העובר שליו על ידי זיהוי מדדי הפיתוח הבסיסיים. עם זאת, יש עדיין כמה מגבלות לניסוי זה.
ראשית, התמותה של עוברים שליו בשלב מאוחר יותר של הבקיעה גבוהה יותר בגלל הבקיעה ללא קליפה. ישנם גורמים בלתי נשלטים באופן מלאכותי כגון הרס של יחס חלבון נורמלי בתהליך הניסוי. הגבלתנו את זמן החשיפה של העוברים כדי להבטיח את דיוק הניסוי. המחקר של עובר יכול להתרחש רק בשלבים המוקדמים והאמצעיים של התפתחות העובר. שנית, המחקר של חברי פרלמנט על התפתחות עובר שליו מתרחש רק ברמת הניתוח המורפולוגי הבסיסי. לפיכך, המסקנות פשוטות יחסית ופגמים עשויים להתקיים. יחד עם זאת, הדרישות לתנאי ניסוי ותפעול גבוהות יחסית בתהליך הניסוי הזה. לכן, כמה נקודות ראויות לציון מפורטות כדלקמן:
חשוב מאוד לחטא ולחטא ביצי שליו מופרות בעבודת ההכנה בשל מיקרואורגניזמים פתוגניים מזיקים על פני השטח של ביצי שליו מופרות. אם הם מחוטאים, החיידקים עלולים להפריע לביציות שליו מופרות במהלך הדגירה, וכתוצאה מכך למותם של עוברים שליו. גם אם ההעברה תצליח, שיעור התמותה יהיה גבוה יותר. לכן, עבודה טובה צריכה להיעשות בחיטוי ועיקור כדי להפחית את התמותה הניסיונית.
כאשר ציפורים בוקעות ביצים, לעתים קרובות הן משנות את מיקום הביצים ושומרות על זרימת האוויר כדי לשמור על טמפרטורה קבועה לביצים ועל המיקום הנכון לעובר. הניסוי הזה השתמש בסרט כדי לאטום את קליפת הביצה. אם זווית סיבוב הביצים גדולה מדי, אז לבן הביצה יזרום החוצה. אם הוא קטן מדי, אז הידבקות בין סרט העובר לבין סרט קליפת הביצה עלולה להתרחש, וכתוצאה מכך עוברים מתים. לכן, הגדר את זווית הסיבוב בהתאם למצב בפועל.
במהלך העברת עוברים שליו, ביצי שליו מופרות מראש ממוקמות אופקית ולאחר מכן לחתוך באמצע קליפת הביצה. בדרך זו, חלק קטן של חלבון ביצה זורם בקלות החוצה, אשר הורס את הפרופורציה הרגילה ואת ההפצה של לבן ביצה עבה ודק. זה גורם לחלמון, שהיה צריך להיות למעלה, להישען לצד אחד, גורם לעובר למות. לכן, הקפד להפוך את כל הביצה לבן לזרום לתוך קליפת ביצה חצי הכדור החדש כדי להבטיח את הפרופורציה הרגילה ואת ההפצה במהלך ההעברה.
לאחר ההעברה המוצלחת, הנסיין חייב להיזהר לא להפיל את הנוזל ישירות. הנוזל צריך להסתמך על קיר קליפת הביצה כדי לגרום לו לזרום לאט במהלך תוספת של מזהמים ואנטיביוטיקה.
בנוסף לארבע הנקודות שהוזכרו לעיל, שלטו בקפדנות בתנאי הדגירה. תאם את מאזן הטמפרטורה, הלחות והאוורור. שמור על מעבדת הדגירה שקטה וחשוכה כדי להשיג את סביבת הדגירה הטובה ביותר.
לסיכום, ניסוי זה מספק פרוטוקול בסיסי לחקר ההשפעות של מזהמים סביבתיים על התפתחות עוברים שליו. ישנם גם סוגים אחרים של אינדיקטורים בחקר הצמיחה וההתפתחות העוברית, כולל התפתחות כלי הדם, עקה חמצונית ונזק לתאים. הניסוי לעיל הוא רק הערכה מקרוסקופית פשוטה של התפתחות עוברית מההיבט המורפולוגי. לבסוף, רעיון המחקר המשופר והפרוטוקול בעתיד יכול לספק שיטה חדשה למחקר טוקסיקולוגי של צמיחה והתפתחות העובר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף. כל המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים ידועים או יחסים אישיים שיכולים היו להיראות כמשפיעים על עבודתו של מאמר זה.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי פרויקטים מרכזיים של מחקר ופיתוח באזור האוטונומי שינג'יאנג אויגור (2017B03014, 2017B03014-1, 2017B03014-2, 2017B03014-3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi sample tissue grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | Tissuelyser-24 | Grind large-sized plastics into small-sized ones at low temperature |
| Electronic balance | OHAUS corporation | PR Series Precision | Used for weighing |
| Fertilized quail eggs | Guangzhou Cangmu Agricultural Development Co., Ltd. | Quail eggs for hatching without shell | |
| Fluorescent polypropylene particles | Foshan Juliang Optical Material Co., Ltd. | Types of plastics selected for the experiment | |
| Incubator | Shandong, Bangda Incubation Equipment Co., Ltd. | 264 pc | Provide a place for embryo growth and development |
| Nanometer-scale polystyrene microspheres | Xi’an Ruixi Biological Technology Co., Ltd. | 100 nm, 200 nm, 500 nm | Types of plastics selected for the experiment |
| Steel ruler | Deli Group | 20 cm | Used to measure length |
| Vertical heating pressure steam sterilizer | Shanghai Shenan Medical Instrument Factory | LDZM-80KCS-II | Sterilize the experimental articles |
References
- Geyer, R., Jambeck, J. R., Law, K. L. Production, use, and fate of all plastics ever made. Science Advances. 3 (7), 5 (2017).
- Thompson, R. C., et al. Lost at sea: Where is all the plastic. Science. 304 (5672), 838-838 (2004).
- Barletta, M., Lima, A. R. A., Costa, M. F. Distribution, sources and consequences of nutrients, persistent organic pollutants, metals and microplastics in South American estuaries. Science of the Total Environment. 651, 1199-1218 (2019).
- Eriksson, C., Burton, H., Fitch, S., Schulz, M., vanden Hoff, J. Daily accumulation rates of marine debris on sub-Antarctic island beaches. Marine Pollution Bulletin. 66 (1-2), 199-208 (2013).
- Zhang, C. F., et al. Microplastics in offshore sediment in the Yellow Sea and East China Sea, China. Environmental Pollution. 244, 827-833 (2019).
- Obbard, R. W., et al. Global warming releases microplastic legacy frozen in Arctic Sea ice. Earths Future. 2 (6), 315-320 (2014).
- Van Cauwenberghe, L., Vanreusel, A., Mees, J., Janssen, C. R.
- Wilcox, C., Van Sebille, E., Hardesty, B. D. Threat of plastic pollution to seabirds is global, pervasive, and increasing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11899-11904 (2015).
- Wright, S. L., Thompson, R. C., Galloway, T. S. The physical impacts of microplastics on marine organisms: A review. Environmental Pollution. 178, 483-492 (2013).
- Ferreira, G. V. B., Barletta, M., Lima, A. R. A. Use of estuarine resources by top predator fishes. How do ecological patterns affect rates of contamination by microplastics. Science of the Total Environment. 655, 292-304 (2019).
- Provencher, J. F., Vermaire, J. C., Avery-Gomm, S., Braune, B. M., Mallory, M. L. Garbage in guano? Microplastic debris found in faecal precursors of seabirds known to ingest plastics. Science of the Total Environment. 644, 1477-1484 (2018).
- Baulch, S., Perry, C. Evaluating the impacts of marine debris on cetaceans. Marine Pollution Bulletin. 80 (1-2), 210-221 (2014).
- Rochman, C. M., Kurobe, T., Flores, I., Teh, S. J. Early warning signs of endocrine disruption in adult fish from the ingestion of polyethylene with and without sorbed chemical pollutants from the marine environment. Science of the Total Environment. 493, 656-661 (2014).
- Mattsson, K., et al. Brain damage and behavioural disorders in fish induced by plastic nanoparticles delivered through the food chain. Scientific Reports. 7, 7 (2017).
- Brown, D. M., Wilson, M. R., MacNee, W., Stone, V., Donaldson, K. Size-dependent proinflammatory effects of ultrafine polystyrene particles: A role for surface area and oxidative stress in the enhanced activity of ultrafines. Toxicology and Applied Pharmacology. 175 (3), 191-199 (2001).
- Salvati, A., et al. Experimental and theoretical comparison of intracellular import of polymeric nanoparticles and small molecules: toward models of uptake kinetics. Nanomedicine-Nanotechnology Biology and Medicine. 7 (6), 818-826 (2011).
- Frohlich, E., et al. Action of polystyrene nanoparticles of different sizes on lysosomal function and integrity. Particle and Fibre Toxicology. 9, 13 (2012).
- Bexiga, M. G., Kelly, C., Dawson, K. A., Simpson, J. C. RNAi-mediated inhibition of apoptosis fails to prevent cationic nanoparticle-induced cell death in cultured cells. Nanomedicine. 9 (11), 1651-1664 (2014).
- Lehner, R., Weder, C., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B. Emergence of Nanoplastic in the Environment and Possible Impact on Human Health. Environmental Science, Technology. 53 (4), 1748-1765 (2019).
- Pinsino, A., et al. Amino-modified polystyrene nanoparticles affect signalling pathways of the sea urchin (Paracentrotus lividus) embryos. Nanotoxicology. 11 (2), 201-209 (2017).
- El-Ghali, N., Rabadi, M., Ezin, A. M., De Bellard, M. E. New Methods for Chicken Embryo Manipulations. Microscopy Research and Technique. 73 (1), 58-66 (2010).
- Rashidi, H., Sottile, V. The chick embryo: hatching a model for contemporary biomedical research. Bioessays. 31 (4), 459-465 (2009).
- Faez, T., Skachkov, I., Versluis, M., Kooiman, K., de Jong, N. In vivo characterization of ultrasound contrast agents: microbubble spectroscopy in a chicken embryo. Ultrasound in Medicine and Biology. 38 (9), 1608-1617 (2012).
- Yamamoto, F. Y., Neto, F. F., Freitas, P. F., Ribeiro, C. A. O., Ortolani-Machado, C. F. Cadmium effects on early development of chick embryos. Environmental Toxicology and Pharmacology. 34 (2), 548-555 (2012).
- Li, X. D., et al. Caffeine interferes embryonic development through over-stimulating serotonergic system in chicken embryo. Food and Chemical Toxicology. 50 (6), 1848-1853 (2012).
- Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an In Vivo Model to Study the Effect of Newly Identified Molecules on Ovarian Cancer Invasion and Metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (8), 9959-9970 (2012).
- Burns, E. E., Boxall, A. B. A. Microplastics in the aquatic environment: Evidence for or against adverse impacts and major knowledge gaps. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (11), 2776-2796 (2018).
- Alejo-Plata, M. D., Herrera-Galindo, E., Cruz-Gonzalez, D. G. Description of buoyant fibers adhering to Argonauta nouryi (Cephalopoda: Argonautidae) collected from the stomach contents of three top predators in the Mexican South Pacific. Marine Pollution Bulletin. 142, 504-509 (2019).
