Summary
在本文中，我们描述了使用酶组织消化方案分离恒河猴衍生的脂肪来源干细胞（ADSC）。接下来，我们描述ADSC增殖，包括细胞分离，计数和电镀。最后，使用特定的成脂诱导剂描述ADSC分化。此外，我们描述了染色技术以确认差异化。
Abstract
脂肪组织提供了丰富且易于获得的多能干细胞来源，这些干细胞能够自我更新。这些脂肪来源的干细胞（ADSC）提供一致的离体细胞系统，其功能与体内脂肪细胞相似。在生物医学研究中使用ADSC可以对脂肪组织代谢调节和功能进行细胞研究。ADSC分化是充分扩增脂肪细胞所必需的，次优分化是脂肪功能障碍的主要机制。了解ADSC分化的变化对于了解代谢功能障碍和疾病的发展至关重要。遵循本手稿中描述的方案将产生成熟的脂肪细胞，可用于多种体外功能测试，以评估ADSC代谢功能，包括但不限于测量葡萄糖摄取，脂肪分解，脂肪生成和分泌的测定。恒河猴 （Macaca mulatta） 在生理学、解剖学和进化上与人类相似，因此，它们的组织和细胞已广泛用于生物医学研究和治疗开发。在这里，我们描述了使用从4-9岁恒河猴获得的新鲜皮下和网膜脂肪组织进行ADSC分离。脂肪组织样品在胶原酶中酶解，然后过滤和离心以从基质血管组分中分离ADSC。分离的ADSC在基质培养基中增殖，然后在基质培养基中使用0.5μg/mL地塞米松、0.5mM异丁基甲基黄嘌呤和50μM吲哚美辛的混合物进行约14-21天的分化。在分化约14天时观察到成熟的脂肪细胞。在这篇手稿中，我们描述了ADSC体外分离、增殖和分化的方案。虽然，我们专注于来自恒河猴脂肪组织的ADSC，但这些协议可用于从其他动物获得的脂肪组织，只需最少的调整。
Introduction
脂肪组织由细胞、主要成熟的脂肪细胞和基质血管部分（包括成纤维细胞、免疫细胞和脂肪来源的干细胞 （ADSC））的异质混合物组成1，2，3。原代ADSC可以直接从白色脂肪组织中分离出来，并刺激分化成脂肪细胞、软骨或骨细胞4。ADSCs表现出经典的干细胞特性，例如维持体外多能性和自我更新;并在文化中坚持塑料5，6。ADSCs因其多能性和使用非侵入性技术轻松大量收获的能力而对再生医学的使用具有重要意义7。ADSC的成脂分化产生功能上模仿成熟脂肪细胞的细胞，包括脂质积累，胰岛素刺激的葡萄糖摄取，脂肪分解和脂肪因子分泌8。它们与成熟脂肪细胞的相似性导致ADSC广泛用于脂肪细胞的细胞特征和代谢功能的生理研究。越来越多的证据支持代谢功能障碍和紊乱的发展起源于细胞或组织水平的观点9，10，11，12。最佳的ADSC分化是充分脂肪组织扩张，适当的脂肪细胞功能和有效代谢调节所必需的13。
本手稿中描述的方案是使用标准实验室设备和基本试剂的简单技术。手稿首先描述了使用机械和酶消化从新鲜脂肪组织中分离原代ADSC的方案。接下来，描述了ADSCs在基质培养基中的增殖和传代方案。最后，描述了ADSCs的成脂分化方案。分化后，这些细胞可用于研究，以更好地了解脂肪细胞代谢和功能障碍机制。还描述了使用油红O和硼-二吡咯甲烷（BODIPY）染色确认脂肪分化和脂滴检测的方案。这些方案的细节集中在从恒河猴的新鲜网膜脂肪组织中分离的原代ADSC。我们和其他人已经使用该协议成功地从恒河猴皮下和网膜脂肪组织库14，15中分离出ADSC。对于使用相同数量的组织，我们观察到与网膜脂肪组织相比，皮下脂肪组织更致密，更坚韧，并且从消化中产生的细胞更少。该协议还用于从人类脂肪样品中分离ADSC16。
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Protocol
所有获得的组织和程序均由路易斯安那州立大学健康科学中心的机构动物护理和使用委员会批准，并根据国家卫生研究院的指南（NIH出版物第85-12号，1996年修订）进行。
1. 缓冲液和溶液的制备
- 通过将 5% 青霉素/链霉素（笔/链球菌）和 0.25 μg/mL 真菌抑制剂添加到 1x PBS 中，制备无菌 5-磷酸缓冲盐水洗涤缓冲液 （5-PBS） 溶液。通过在 1x PBS 中加入 2% 笔/链球菌和 0.25 μg/mL 真菌抑制剂来制备无菌 2-PBS 洗涤缓冲液 （2-PBS） 溶液。洗涤缓冲液可在4°C下储存以备将来使用，并且必须在4周内使用。
注意：5-PBS缓冲液用于脂肪组织收集和初始洗涤，以尽量减少可能的污染，因为在尸检中获得的组织样品是在非无菌环境中收集的。 - 通过将 0.075% I 型胶原酶（125 单位/mg 活性）、2% 笔/链球菌和 0.25 μg/mL 真菌抑制剂在 Hank 平衡盐溶液 （HBSS） 中与 1% 牛血清白蛋白相结合，制备无菌胶原酶缓冲液 （CB）。CB必须在1小时内使用。
- 使用α-MEM缓冲液制备无菌ADSC生长培养基。将 100 mL 胎牛血清 （FBS）、5 mL 200 mM L-谷氨酰胺溶液、500 μL 0.25 μg/mL 真菌抑制剂和 10 mL 笔/链球菌溶液混合在 394 mL α-MEM 缓冲液中。ADSC生长培养基可以储存在4°C，必须在4周内使用。
注意：FBS不需要热灭活。 - 通过将上述制备的ADSC生长培养基与诱导剂相结合，制备无菌ADSC分化培养基，以达到0.5μg/ mL地塞米松，0.5mM异丁基甲基黄嘌呤和50μM吲哚美辛的最终浓度。
2. ADSC隔离
- 组织制备和消化
- 将 ~10 mL 的 5-PBS 缓冲液移液到四个 100 mm 细胞培养皿中。
- 将~50g脂肪样品转移到含有5-PBS的100mm培养皿之一中。通过在含有5-PBS的四个培养皿中依次转移来洗涤收集的脂肪组织样品四次。
- 将脂肪样品转移到干净的100 mm培养皿中，并使用剪刀或两把无菌手术刀彻底切碎脂肪组织。切碎可以增加表面积，以实现高效和完整的酶消化。
- 将切碎的脂肪组织转移到含有 13 mL CB（每 15 mL CB 1-3 cm 组织切片）的 50 mL 塑料锥形管中。
- 用 2 mL CB 冲洗培养皿，并将培养基转移到 50 mL 塑料锥形管中。
注意：此时，50 mL塑料锥形管中应总共有15 mL CB和组织。 - 使用 25 mL 血清移液器上下移液数次，以促进机械组织消化。
- 将含有 CB 中组织的 50 mL 塑料锥形管在摇杆上以中速在 37 °C 下孵育 30-60 分钟。
- 用于培养的ADSC镀层
- 将 10 mL ADSC 生长培养基加入含有组织的 50 mL 管中以中和酶活性。使用 25 mL 血清移液管上下移液数次，以分离任何脂肪组织聚集体。
- 将液体部分转移到新的无菌 50 mL 锥形管中，留下固体。用 ~7 mL 2-PBS 缓冲液洗涤原始 50 mL 管 3 次，并将液体部分转移到 50 mL 管中。
- 以500 ×g 离心5分钟以获得细胞沉淀。使用血清移液管小心地去除尽可能多的上清液，不要干扰细胞沉淀。不要倾析。
- 将细胞沉淀重悬于 1 mL 的 1x 红细胞 （RBC） 裂解缓冲液中，并在室温下孵育 10 分钟。向管中加入5mL ADSC生长培养基，并以500 x g 离心5分钟，然后小心地除去并丢弃上清液。
- 加入 5 mL ADSC 生长培养基，并以 500 x g 离心 5 分钟以洗涤细胞沉淀。弃去上清液。
- 将沉淀重悬于2 mL ADSC生长培养基中，并通过70 μm细胞过滤器过滤到新的无菌50 mL塑料锥形管中。
- 用另外 2 mL ADSC 生长培养基冲洗细胞过滤器。将 4 mL 含有 ADSC 的悬浮液从 50 mL 锥形管转移到无菌 100 mm 培养皿中。
- 用 3 mL ADSC 生长培养基洗涤 50 mL 锥形管 2 次，并将液体转移到含有 ADSC 的 100 mm 培养皿中，在培养皿中总共 10 mL 培养基。
- 在倒置显微镜下以10倍放大倍率观察细胞，以检查培养基中的浮动细胞，如图1A所示。细胞应保持在37°C，5%CO 2和100%相对湿度的CO2培养箱中。
- 24小时后，在倒置显微镜下观察细胞以检查细胞粘附性。从平板中吸出ADSC生长培养基，并用10mL新鲜，温暖（37°C）的培养基替换。每48小时取出并更换培养基，直到细胞汇合80%–90%（图1B）。
注意：至少10-20%的细胞将在24小时内贴壁。检查细胞培养物是否有污染迹象，例如细胞粒度、培养基浑浊度或孢子生长。一旦细胞汇合80%，就可以收获它们进行增殖和冷冻保存或诱导分化。ADSC可以在失去有效增殖或分化的能力之前扩展到4-6代。
3. ADSC增殖
- 细胞脱离
- 使用吸气器/移液器取出ADSC生长培养基。用 2 mL 无菌室温 PBS 冲洗融合的 ADSC 2 次。
- 吸出 PBS 并每 100 mm 培养板加入 2 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA。确保整个表面积被胰蛋白酶覆盖。
- 将板在37°C下在5%CO2 中孵育~7分钟，直到ADSC分离。从培养箱中取出板，并通过用力移取板中的胰蛋白酶溶液来机械移开细胞。
- 向脱落的细胞中加入 2 mL ADSC 生长培养基，轻轻移液混合。将细胞转移到无菌 50 mL 塑料锥形管中。为确保最大细胞回收率，用另外 2 mL ADSC 生长培养基冲洗培养皿，并将培养基转移到含有分离细胞的锥形管中。
- 将50mL锥形管在室温下以500 ×g 离心5分钟以获得细胞沉淀。小心地倒出上清液，不要干扰细胞沉淀。
- 每 1 x 10 6 个细胞将细胞沉淀重悬于 5–6 mL ADSC 生长培养基中。
- 细胞计数和电镀
- 在 1.5 mL 微量离心管中，从上方稀释 10 μL 细胞溶液和 10 μL 0.04% 台盼蓝溶液（0.4% 台盼蓝在 PBS 中按 1：10 稀释），并使用血细胞计数器对细胞计数。
- 在生长培养基中重悬所需数量的ADSC。对于 100 mm 培养皿，在 10 mL ADSC 生长培养基中接种 ~3.0 x 105 个细胞，以允许 72 小时内 80% 汇合或在 96 小时内 100% 汇合。
- 孵育前在倒置显微镜下以10倍放大倍率观察培养皿，以确保存在悬浮细胞。将细胞保持在37°C，5%CO2 和100%相对湿度。
- 每48小时吸出生长培养基并用温（37°C）培养基替换，直到细胞80%至90%汇合，如图 1B所示。
- 重复第 3.1 和 3.2 节中的步骤以获得适当数量的传代以获得所需的细胞数。
注意：传代5至6代后，原代细胞似乎经历衰老;因此，旨在通过传代4获得所需的细胞数。
4. ADSC成脂分化
- 从已达到80%至90%汇合度的粘附ADSC中吸出ADSC生长培养基。
- 用无菌室温PBS快速冲洗ADSC细胞层。
- 加入ADSC分化培养基。对于 100 mm 培养皿，加入 10 mL ADSC 分化培养基。
- 每 3 天更换一次培养基，持续约 14-21 天。通常在分化 14 天后观察到成熟的脂肪细胞。
- 在倒置光学显微镜下以40倍放大倍率检查细胞，以确认脂滴的存在，如图 2A所示。
5. 脂肪细胞检测
注意：本节将描述用于分化脂肪细胞中脂滴检测的染色方案，但是，CD105（一种间充质干细胞标志物）的免疫荧光染色也可用于ADSC确认。
- 油红O染色
- 在异丙醇中制备0.5%油红O储备溶液。对于 20 mL 油红 O 储备溶液，将 100 mg 油红 O 溶解在 20 mL 异丙醇中。通过具有0.2μm膜的无菌注射器过滤器过滤溶液。
- 小心地吸出分化培养基，并通过沿孔的侧面添加PBS来洗涤细胞2次，以免干扰细胞单层。
- 小心地从细胞中吸出PBS，并添加足够的中性缓冲福尔马林（NBF，10%）以覆盖细胞层。在室温下孵育30-60分钟。
- 在福尔马林固定步骤中，通过将3份油红O储备溶液与2份蒸馏水稀释来制备油红O工作溶液。混合溶液并通过带有0.2μm膜的无菌注射器过滤器过滤。工作溶液稳定长达2小时。
- 小心吸出NBF并用蒸馏水快速洗涤（~15秒）细胞层。吸水后加入足够的60%异丙醇以覆盖细胞层，并在室温下孵育5分钟。
- 孵育5分钟后小心吸出异丙醇，并加入足够的油红O工作溶液以覆盖细胞层并在室温下孵育10-15分钟。
- 小心地吸出油红O工作溶液，并用蒸馏水洗涤细胞层几次，直到水变得清澈。
- 将PBS添加到细胞培养皿中，并在倒置显微镜下检查细胞以指示分化和脂滴的存在（图2B）。
- 胸部染色
- 通过将 1.3 g BODIPY 溶解在 1 mL DMSO 中来制备 5 mM BODIPY 储备溶液。通过在PBS中稀释储备溶液1：25，000倍来制备2μg/ mL BODIPY工作溶液。
- 小心地吸出分化培养基，并通过沿孔的侧面添加PBS来洗涤细胞2次，以免干扰细胞单层。
- 小心吸出PBS并加入足够的BODIPY工作溶液以覆盖细胞层并在37°C下孵育30分钟。
注意：从这一点开始，通过用箔纸覆盖板来保护细胞免受光照。 - 小心吸出BODIPY工作溶液，并用PBS洗涤细胞层3次。
- 通过加入4%多聚甲醛并在室温下孵育15分钟来固定细胞。
- 小心地吸出固定缓冲液并通过沿孔的侧面添加PBS来洗涤细胞2次，以免干扰细胞单层。
- 将PBS添加到细胞培养皿中，并在倒置荧光显微镜下检查细胞，寻找分化和脂滴存在的证据（图2C）。使用 FITC/EGFP/Bodipy Fl/Fluo3/DiO 色度滤镜组对细胞进行成像。激发波长为480 nm，带宽为40 nm，发射波长为535 nm，带宽为50 nm。可以使用类似或适当的滤光片组和显微镜。
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Representative Results
将从恒河猴脂肪组织样品中分离的ADSC接种在培养板上，如图 1所示。在接种当天，细胞不贴壁并漂浮在培养皿中，如图 1A所示。在72小时内，ADSC将变得80%汇合并准备好进行脂肪细胞分化（图1B）。ADSCs在化学诱导后表现出很强的脂肪生成特性。分化14天后，可以通过光学显微镜观察成熟的脂肪细胞（图2A）。为了确认ADSC成脂分化，可以使用各种染色剂来观察分化的成熟脂肪细胞的脂滴。在分化的第14天，对细胞进行染色并用油红O（图2B）和BODIPY（图2C）固定以进行脂滴可视化。黑色箭头代表分化的脂肪细胞（图2B）。这些数据表明，按照该协议，ADSCs由恒河猴脂肪组织产生并分化为成熟的脂肪细胞。
图1：电镀当天ADSC的光显微照片和80%细胞汇合度。 （A）从新鲜恒河猴脂肪组织中分离ADSC后电镀当天基质血管细胞的代表性光学显微照片（10倍放大）。（B）80%汇合度（20倍放大倍率）的ADSC的代表性光学显微照片。 请点击此处查看此图的大图。
图2：分化第14天ADSC的显微照片。 （A）在ADSC分化的第14天获得的代表性光学显微照片（40倍放大）。（B）ADSC分化第14天油红O染色的代表性显微照片（20倍放大）。（C）ADSC分化第14天（20倍放大）时硼-二吡咯甲烷（BODIPY）染色的代表性显微照片。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
ADSC分离、增殖和分化方案简单易用且可重现，但需要谨慎的技术来确保充分分离、健康扩增和高效分化。无菌的工作环境对于所有细胞培养实验都至关重要。细菌或真菌可能通过受污染的工具、培养基或工作环境引入细胞培养物中。真菌污染由培养物中的孢子生长指示，而细菌污染由培养基浑浊的存在表示。我们建议在使用前对生物安全柜和所有移液器、瓶子和工具进行消毒，在使用生物安全柜前至少 15 分钟打开层流气流，并在使用后对柜子和所有移液器进行消毒，以降低污染风险。此外，我们建议高压灭菌非过滤式移液器吸头进行真空抽吸，并在使用后用无菌水冲洗抽吸器，然后用70%乙醇冲洗。可以将仅带有培养基的培养皿置于37°C和5%CO2 的加湿培养箱中几天，以检查培养基的无菌性。受污染的培养物应漂白30分钟并丢弃。细胞培养箱也应进行消毒。
本手稿中的方案与先前发表的方案之间的主要区别是在我们的ADSC胶原酶消化缓冲液中使用BSA，这允许分离成熟的脂肪细胞和ADSC。此外，我们的方案使用补充有20%FBS的ADSC生长培养基，而大多数方案建议使用10%FBS。我们注意到恒河猴原代ADSCs在20%FBS下增殖和分化得更好。体外ADSC分化由谱系特异性诱导剂诱导。该方案中使用的诱导剂被广泛接受用于ADSC的体外成脂分化。然而，与许多先前发表的方案不同，脂肪分化鸡尾酒不包括胰岛素或PPARγ激动剂。我们和其他人已经使用该协议成功地区分了恒河猴和人类ADSCs14，15，16。
在该协议中，通过使用油红O和BODIPY染色技术的脂滴检测来确认ADSC成脂分化。尽管这些染色剂在该领域已得到广泛认可，但还有其他常用的方法，包括用于检测CD105以鉴定ADSC的流式细胞术，或用于确定ADSCs纯度的内皮细胞和免疫细胞标志物17。
ADSC的使用为再生医学和代谢研究提供了有价值的工具。ADSC分离和增殖产生大量干细胞，可用于多种下游应用和实验技术，包括但不限于本协议中描述的那些。该方案中分化脂肪细胞的主要预期用途包括使用代谢测定，例如胰岛素刺激的葡萄糖摄取，脂肪生成和刺激的脂肪分解18。此外，ADSC可以分为成骨谱系和成软骨谱系，并用于下游分析，包括组织工程7。
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Disclosures
没有。
Acknowledgments
作者要感谢Curtis Vande Stouwe的技术援助。协议开发的基础研究得到了国家酒精滥用和酒精中毒研究所（5P60AA009803-25，5T32AA007577-20和1F31AA028459-01）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4 % trypan blue | Thermo-Fisher | 15250061 | |
| 1.5-ml microcentrifuge tube | Dot Scientific | 707-FTG | |
| 100 % isopropanol | Sigma-Aldrich | PX1838-P | |
| 100-mm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 50-mL plastic conical tube | Fisher Scientific | 50-465-232 | |
| 70-µm cell strainer | Corning | CLS431751 | |
| a-MEM | Thermo-Fisher | 12561056 | |
| Aluminum foil | Reynolds Wrap | ||
| BODIPY | Thermo-Fisher | D3922 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 05470 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Collagenase, Type I | Thermo-Fisher | 17100017 | |
| Dexamethasone-Water Soluble | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Distilled water | Thermo-Fisher | 15230162 | |
| Fetal Bovine Serum, USDA-approved | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fungizone/Amphotericin B (250 ug/mL) | Thermo-Fisher | 15290018 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14175095 | |
| Hemacytometer with cover slip | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Inverted light microscope | Nikon | DIAPHOT-TMD | |
| L-glutamine (200 mM) | Thermo-Fisher | 25030081 | |
| Laboratory rocker, 0.5 to 1.0 Hz | Reliable Scientific | Model 55 Rocking | |
| Neutral buffered formalin (10 %) | Pharmco | 8BUFF-FORM | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Paraformeldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo-Fisher | 10010023 | |
| Red blood cell (RBC) lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Serological pipettes, 2 to 25 mL | Costar Stripettes | ||
| Standard humidified cell culture incubator, 37 °C, 5 % CO2 | Sanyo | MCO-17AIC | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo-Fisher | 25200056 |
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