Summary
I denne artikel beskriver vi isolering af rhesus macaque afledte fedtafledte stamceller (ADSC'er) ved hjælp af en enzymatisk vævsfordøjelsesprotokol. Dernæst beskriver vi ADSC-spredning, som omfatter celleløsning, tælling og plettering. Endelig beskrives ADSC-differentiering ved anvendelse af specifikke adipogene inducerende midler. Derudover beskriver vi farvningsteknikker for at bekræfte differentiering.
Abstract
Fedtvæv giver en rig og tilgængelig kilde til multipotente stamceller, som er i stand til selvfornyelse. Disse fedtafledte stamceller (ADSC'er) giver et konsistent ex vivo-cellulært system, der funktionelt ligner in vivo-adipocytter. Brug af ADSC'er i biomedicinsk forskning giver mulighed for cellulær undersøgelse af fedtvævets metaboliske regulering og funktion. ADSC-differentiering er nødvendig for tilstrækkelig adipocytudvidelse, og suboptimal differentiering er en vigtig mekanisme for fedtdysfunktion. Forståelse af ændringer i ADSC-differentiering er afgørende for at forstå udviklingen af metabolisk dysfunktion og sygdom. De protokoller, der er beskrevet i dette manuskript, vil, når de følges, give modne adipocytter, der kan bruges til flere in vitro funktionelle tests til vurdering af ADSC metabolisk funktion, herunder men ikke begrænset til assays, der måler glukoseoptagelse, lipolyse, lipogenese og sekretion. Rhesus macaques (Macaca mulatta) er fysiologisk, anatomisk og evolutionært ligner mennesker, og som sådan er deres væv og celler blevet brugt i vid udstrækning i biomedicinsk forskning og til udvikling af behandlinger. Her beskriver vi ADSC-isolering ved hjælp af frisk subkutant og omentalt fedtvæv opnået fra 4-9-årige rhesus macaques. Fedtvævsprøver fordøjes enzymatisk i collagenase efterfulgt af filtrering og centrifugering for at isolere ADSC'er fra den stromale vaskulære fraktion. Isolerede ADSC'er spredes i stromale medier efterfulgt af ca. 14-21 dages differentiering ved anvendelse af en cocktail af 0,5 μg / ml dexamethason, 0,5 mM isobutylmethylxanthin og 50 μM indomethacin i stromale medier. Modne adipocytter observeres ved ca. 14 dages differentiering. I dette manuskript beskriver vi protokoller for ADSC-isolering, spredning og differentiering in vitro. Selvom vi har fokuseret på ADSC'er fra rhesus macaque fedtvæv, kan disse protokoller bruges til fedtvæv opnået fra andre dyr med minimale justeringer.
Introduction
Fedtvæv består af en heterogen blanding af celler, overvejende modne adipocytter og en stromal vaskulær fraktion, herunder fibroblaster, immunceller og fedtafledte stamceller (ADSC'er)1,2,3. Primære ADSC'er kan isoleres direkte fra hvidt fedtvæv og stimuleres til at differentiere sig til adipocytter, brusk eller knogleceller4. ADSC'er udviser klassiske stamcelleegenskaber såsom opretholdelse af multipotens in vitro og selvfornyelse; og er tilhængere af plast i kultur 5,6. ADSC'er er af stor interesse for brugen i regenerativ medicin på grund af deres multipotens og evne til let at høstes i store mængder ved hjælp af ikke-invasive teknikker7. Aditogen differentiering af ADSC'er producerer celler, der funktionelt efterligner modne adipocytter, herunder lipidakkumulering, insulinstimuleret glukoseoptagelse, lipolyse og adipokinsekretion8. Deres lighed med modne adipocytter har ført til udbredt anvendelse af ADSC'er til fysiologisk undersøgelse af cellulære egenskaber og metabolisk funktion af adipocytter. Der er stigende beviser, der understøtter ideen om, at udviklingen af metabolisk dysfunktion og lidelser stammer fra celle- eller vævsniveau 9,10,11,12. Optimal ADSC-differentiering er nødvendig for tilstrækkelig fedtvævsudvidelse, korrekt adipocytfunktion og effektiv metabolisk regulering13.
Protokoller beskrevet i dette manuskript er enkle teknikker, der anvender standard laboratorieudstyr og grundlæggende reagenser. Manuskriptet beskriver først protokollen for isolering af primære ADSC'er fra frisk fedtvæv ved hjælp af mekanisk og enzymatisk fordøjelse. Dernæst beskrives protokollen for spredning og passaging af ADSC'er i stromalt medium. Endelig beskrives protokollen for adipogen differentiering af ADSC'er. Efter differentiering kan disse celler bruges til undersøgelser for bedre at forstå adipocytmetabolisme og dysfunktionsmekanismer. Protokollerne til bekræftelse af adipogen differentiering og lipiddråbedetektion ved anvendelse af olierød O og bor-dipyrromether (BODIPY) farvning er også beskrevet. Detaljerne i disse protokoller fokuserede på primære ADSC'er isoleret fra frisk omental fedtvæv af rhesus macaques. Vi og andre har brugt denne protokol til med succes at isolere ADSC'er fra rhesus macaque subkutane og omentale fedtvævsdepoter14,15. For den samme mængde væv, der anvendes, har vi observeret, at subkutant fedtvæv er mere tæt, hårdere og giver mindre celler fra fordøjelsen sammenlignet med omentalt fedtvæv. Denne protokol er også blevet brugt til at isolere ADSC'er fra humane fedtprøver16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle opnåede væv og procedurer blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Louisiana State University Health Sciences Center og blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra National Institute of Health (NIH-publikation nr. 85-12, revideret 1996).
1. Fremstilling af buffere og opløsninger
- Der fremstilles steril 5-phosphatbufferet saltvandsvaskebuffer (5-PBS) opløsning ved tilsætning af 5% penicillin/streptomycin (pen/strep) og 0,25 μg/ml svampehæmmer til 1x PBS. Der fremstilles steril 2-PBS vaskebufferopløsning (2-PBS) ved tilsætning af 2% pen/strep og 0,25 μg/ml svampehæmmer i 1x PBS. Vaskebuffere kan opbevares ved 4 °C til fremtidig brug og skal anvendes inden for 4 uger.
BEMÆRK: 5-PBS buffer anvendes til opsamling af fedtvæv og indledende vask for at minimere mulig forurening, da vævsprøver opnået ved obduktion opsamles i et ikke-sterilt miljø. - Forbered steril collagenasebuffer (CB) ved at kombinere 0,075% collagenase type I (125 enheder / mg aktivitet), 2% pen / strep og 0,25 μg / ml svampehæmmer i Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS) med 1% bovin serumalbumin. CB skal anvendes inden for 1 time.
- Forbered sterilt ADSC-vækstmedium ved hjælp af α-MEM-buffer. Kombiner 100 ml føtalt bovint serum (FBS), 5 ml 200 mM L-glutaminopløsning, 500 μL 0,25 μg/ml svampehæmmer og 10 ml pen/strepopløsning i 394 ml α-MEM-buffer. ADSC-vækstmediet kan opbevares ved 4 °C og skal anvendes inden for 4 uger.
BEMÆRK: Varmeinaktivering af FBS er ikke nødvendig. - Sterilt ADSC-differentieringsmedium fremstilles ved at kombinere ADSC-vækstmedium som forberedt ovenfor og induktionsmidler for at opnå en endelig koncentration på 0,5 μg/ml dexamethason, 0,5 mM isobutylmethylxanthin og 50 μM indomethacin.
2. ADSC-isolering
- Vævsforberedelse og fordøjelse
- Pipette ~10 ml 5-PBS buffer i fire 100 mm cellekulturskåle.
- Der overføres ~50 g fedtprøve til en af de 100 mm skåle, der indeholder 5-PBS. Den indsamlede fedtvævsprøve vaskes fire gange ved at overføre den sekventielt på tværs af de fire kulturretter, der indeholder 5-PBS.
- Overfør fedtprøve til en ren 100 mm kulturskål og grundigt hakket fedtvæv ved hjælp af en saks eller to sterile skalpeller. Mincing giver mulighed for at øge overfladearealet for effektiv og komplet enzymatisk fordøjelse.
- Overfør det hakkede fedtvæv til 50 ml plastisk konisk rør indeholdende 13 ml CB (1-3 cm sektion væv pr. 15 ml CB).
- Skyl kulturskålen med 2 ml CB og overfør mediet til det 50 ml plastiske koniske rør.
BEMÆRK: På dette tidspunkt skal der være i alt 15 ml CB med væv i et 50 ml plastisk konisk rør. - Pipetter op og ned flere gange ved hjælp af 25 ml serologisk pipette for at lette mekanisk vævsfordøjelse.
- Det 50 ml plastkoniske rør indeholdende væv i CB inkuberes på en vippe ved medium hastighed ved 37 °C i 30-60 min.
- ADSC plating til kultur
- Tilsæt 10 ml ADSC-vækstmedium til 50 ml røret indeholdende væv for at neutralisere enzymaktivitet. Pipetter op og ned flere gange ved hjælp af 25 ml serologisk pipette til at adskille eventuelle fedtvævsaggregater.
- Overfør væskedelen til et nyt sterilt 50 ml konisk rør, der efterlader de faste stoffer. Vask det originale 50 ml rør 3 gange med ~ 7 ml 2-PBS buffer og overfør væskedelen til 50 ml røret.
- Centrifuge ved 500 x g i 5 minutter for at opnå en cellepellet. Fjern forsigtigt så meget supernatant som muligt ved hjælp af en serologisk pipette uden at forstyrre cellepelleten. Dekantér ikke.
- Resuspender cellepellet i 1 ml 1x røde blodlegemer (RBC) lysisbuffer og inkuberes ved stuetemperatur i 10 min. Tilsæt 5 ml ADSC-vækstmedium til røret og centrifuger ved 500 x g i 5 minutter, fjern derefter forsigtigt og kassér supernatanten.
- Tilsæt 5 ml ADSC-vækstmedium og centrifuge ved 500 x g i 5 minutter for at vaske cellepellet. Kassér supernatanten.
- Resuspender pelleten i 2 ml ADSC-vækstmedium og filtrer gennem en 70 μm cellesi ind i et nyt sterilt 50 ml plastkonisk rør.
- Skyl cellesien med yderligere 2 ml ADSC-vækstmedium. 4 ml af suspensionen indeholdende ADSC'er overføres fra det koniske rør på 50 ml til en steril 100 mm kulturskål.
- Vask det 50 ml koniske rør 2 gange med 3 ml ADSC-vækstmedium og overfør væsken til 100 mm kulturskålen indeholdende ADSC'er i alt 10 ml medium i kulturskål.
- Se celler under et omvendt mikroskop ved 10x forstørrelse for at kontrollere, om der er flydende celler i mediet som vist i figur 1A. Celler skal opbevares i en CO 2 -inkubator ved 37 °C ved 5 % CO2 og 100 % relativ luftfugtighed.
- Efter 24 timer skal du se celler under et omvendt mikroskop for at kontrollere, om celleadhærens er fastholdt. Aspirer ADSC-vækstmediet fra pladen og udskift med 10 ml friske, varme (37 °C) medier. Fjern og udskift medier hver 48. time, indtil cellerne er 80%-90% sammenflydende (figur 1B).
BEMÆRK: Mindst 10-20 % af cellerne vil være klæbende inden 24 timer. Kontroller cellekulturen for tegn på forurening, såsom cellegranularitet, mediets turbiditet eller vækst af sporer. Når cellerne er 80% sammenflydende, kan de høstes til spredning og kryopræservering eller induceres til at differentiere. ADSC'er kan udvides til 4-6 passager, før de mister deres evne til effektivt at sprede eller differentiere.
3. Spredning af ADSC
- Celle løsrivelse
- Fjern ADSC-vækstmediet ved hjælp af en aspirator/pipette. Skyl sammenflydende ADSC'er 2 gange med 2 ml steril PBS ved stuetemperatur.
- Aspirer PBS og tilsæt 2 ml 0,25 % trypsin-EDTA pr. 100 mm dyrkningsplade. Sørg for, at hele overfladearealet er dækket af trypsin.
- Der inkuberes pladen i ~7 minutter ved 37 °C i 5 % CO2 , indtil ADSC'erne løsnes. Fjern pladen fra inkubatoren, og løsn cellerne mekanisk ved kraftigt at pipettere trypsinopløsningen i pladen.
- Tilsæt 2 ml ADSC-vækstmedium til de løsrevne celler og pipetter forsigtigt for at blande. Overfør celler til sterilt 50 ml plastisk konisk rør. For at sikre maksimal cellegendannelse skylles kulturskålen med yderligere 2 ml ADSC-vækstmedium og overføres medium til det koniske rør, der indeholder løsrevne celler.
- Centrifuge det 50 ml koniske rør ved 500 x g i 5 minutter ved stuetemperatur for at opnå en cellepellet. Dekanterer forsigtigt supernatant uden at forstyrre cellepellet.
- Resuspender cellepellet i 5-6 ml ADSC-vækstmedium pr. 1 x 106 celler.
- Celleantal og plettering
- I et 1,5 ml mikrocentrifugerør fortyndes 10 μL celleopløsning ovenfra og 10 μL 0,04% trypanblå opløsning (0,4% trypanblå fortyndet 1:10 i PBS) og tæller celler ved hjælp af et hæmocytometer.
- Resuspender det ønskede antal ADSC'er i vækstmedium. For 100 mm kulturskål, plade ~ 3,0 x 105 celler i 10 ml ADSC-vækstmedier for at muliggøre 80% sammenløb i 72 timer eller 100% sammenløb i 96 timer.
- Se skålen under et omvendt mikroskop ved 10x forstørrelse inden inkubation for at sikre tilstedeværelse af suspenderede celler. Cellerne holdes ved 37 °C ved 5 % CO2 og 100 % relativ luftfugtighed.
- Hver 48. time opsuger vækstmediet og erstattes med varmt (37 °C) medium, indtil cellerne er 80% til 90% sammenflydende som vist i figur 1B.
- Gentag trin fra punkt 3.1 og 3.2 for et passende antal passager for at opnå det ønskede cellenummer.
BEMÆRK: Efter passage 5 til 6 ser primære celler ud til at gennemgå ældning; Sigt derfor mod at opnå ønskede cellenumre ved passage 4.
4. ADSC adipogen differentiering
- Aspirer ADSC-vækstmedium fra klæbede ADSC'er, der har nået 80% til 90% sammenløb.
- Skyl hurtigt ADSC-cellelag med steril PBS ved stuetemperatur.
- Tilføj ADSC differentieringsmedium. Til 100 mm kulturskål tilsættes 10 ml ADSC-differentieringsmedium.
- Udskift medium hver 3. dag i ca. 14-21 dage. Modne adipocytter observeres generelt efter 14 dages differentiering.
- Undersøg celler under et omvendt lysmikroskop ved 40x forstørrelse for at bekræfte tilstedeværelsen af lipiddråbe som vist i figur 2A.
5. Påvisning af adipocyt
BEMÆRK: Dette afsnit beskriver farvningsprotokoller, der anvendes til påvisning af lipiddråber i differentierede adipocytter, men immunfluorescerende farvning til CD105, en mesenkymal stamcellemarkør, kan også bruges til ADSC-bekræftelse.
- Olie Rød O farvning
- Der fremstilles 0,5% Oil Red O-stamopløsning i isopropanol. For 20 ml olie rød O-stamopløsning opløses 100 mg olie rød O i 20 ml isopropanol. Opløsningen filtreres gennem et sterilt sprøjtefilter med 0,2 μm membran.
- Opsæt forsigtigt differentieringsmediet og vask celler 2 gange ved at tilføje PBS langs siderne af brønden for ikke at forstyrre cellemonolaget.
- Opsæt forsigtigt PBS fra celler og tilsæt nok neutralt bufferet formalin (NBF, 10%) til at dække cellelag. Inkuberes ved stuetemperatur i 30-60 min.
- Under formalinfikseringstrinnet fremstilles Oil Red O-arbejdsløsningen ved at fortynde 3 dele Oil Red O-stamopløsning med 2 dele destilleret vand. Opløsningen blandes og filtreres gennem et sterilt sprøjtefilter med 0,2 μm membran. Arbejdsløsningen er stabil i op til 2 timer.
- Opsug forsigtigt NBF og vask hurtigt (~ 15 s) cellelaget med destilleret vand. Tilsæt nok 60% isopropanol til at dække cellelaget efter opsugning af vand og inkuber ved stuetemperatur i 5 min.
- Opsæt forsigtigt isopropanol efter 5 minutters inkubation og tilsæt nok Oil Red O-arbejdsløsning til at dække cellelaget og inkuberes ved stuetemperatur i 10-15 min.
- Opsug forsigtigt olierød O-arbejdsløsningen, og vask cellelaget flere gange med destilleret vand, indtil vandet bliver klart.
- Tilsæt PBS til cellekulturskålen og undersøg celler under et omvendt mikroskop for indikation af differentiering og tilstedeværelse af lipiddråber (figur 2B).
- BODIPY farvning
- Der fremstilles 5 mM BODIPY stamopløsning ved at opløse 1,3 g BODIPY i 1 ml DMSO. Der fremstilles 2 μg/ml BODIPY-arbejdsopløsning ved at fortynde stamopløsningen 1:25.000 gange i PBS.
- Opsæt forsigtigt differentieringsmediet og vask celler 2 gange ved at tilføje PBS langs siderne af brønden for ikke at forstyrre cellemonolaget.
- Opsug forsigtigt PBS, og tilsæt nok BODIPY-arbejdsløsning til at dække cellelaget og inkuberes ved 37 °C i 30 minutter.
BEMÆRK: Fra dette punkt skal du beskytte celler mod lys ved at dække pladen med folie. - Opsug forsigtigt BODIPY-arbejdsløsningen og vask cellelaget 3 gange med PBS.
- Fix celler ved at tilsætte 4% paraformaldehyd og inkubere ved stuetemperatur i 15 min.
- Opsug forsigtigt fikseringsbufferen og vask celler 2 gange ved at tilføje PBS langs siderne af brønden for ikke at forstyrre cellemonolaget.
- Tilsæt PBS til cellekulturskålen og undersøg celler under et omvendt fluorescerende mikroskop for tegn på differentiering og tilstedeværelse af lipiddråbe (figur 2C). Billedceller ved hjælp af et FITC/EGFP/Bodipy Fl/Fluo3/DiO Chroma-filtersæt. Excitationsbølgelængde er ved 480 nm med en båndbredde på 40 nm og emissionsbølgelængde er ved 535 nm med en båndbredde på 50 nm. Et lignende eller passende filtersæt og mikroskop kan bruges.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ADSC'erne isoleret fra rhesus macaque fedtvævsprøver blev podet på dyrkningsplader og er vist i figur 1. På platingdagen er celler ikke-klæbende og flyder i kulturskålen som vist i figur 1A. Inden for 72 timer bliver ADSC'er 80% sammenflydende og er klar til adipocytdifferentiering (figur 1B). ADSC'er udviser stærke adipogene egenskaber efter kemisk induktion. Efter 14 dages differentiering kan modne adipocytter observeres via lysmikroskopi (figur 2A). For at bekræfte ADSC adipogenic differentiering kan forskellige pletter bruges til at visualisere lipiddråber af de differentierede modne adipocytter. På dag 14 af differentiering blev celler farvet og fastgjort med Oil Red O (figur 2B) og BODIPY (figur 2C) til lipiddråbevisualisering. Den sorte pil repræsenterer en differentieret adipocyt (figur 2B). Disse data indikerer, at ADSC'er efter denne protokol blev genereret fra rhesus macaque fedtvæv og differentieret til modne adipocytter.
Figur 1: Lette mikrografer af ADSC'er på platingdagen og ved 80% cellesammenløb. (A) Repræsentativ lysmikrograf af stromale vaskulære celler på platingdagen efter ADSC-isolering fra frisk rhesus macaque fedtvæv (10x forstørrelse). (B) Repræsentativ lysmikrograf af ADSC'er ved 80% sammenløb (20x forstørrelse). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Mikrografer af ADSC'er på dag 14 af differentiering. (A) Repræsentativ lysmikrograf opnået på dag 14 af ADSC-differentiering (40x forstørrelse). (B) Repræsentativ mikrograf af Oil Red O-farvning på dag 14 af ADSC-differentiering (20x forstørrelse). (C) Repræsentativ mikrograf af bor-dipyrromethen (BODIPY) farvning på dag 14 af ADSC-differentiering (20x forstørrelse). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ADSC-isolations-, sprednings- og differentieringsprotokoller er ligetil og reproducerbare, men de kræver omhyggelig teknik for at sikre tilstrækkelig isolation, sund ekspansion og effektiv differentiering. Et sterilt arbejdsmiljø er afgørende for alle cellekultureksperimenter. Bakterier eller svampe kan indføres i cellekulturer gennem forurenede værktøjer, medier eller arbejdsmiljø. Svampeforurening er indikeret ved sporevækst i kulturen, mens bakteriel forurening indikeres ved tilstedeværelsen af turbiditet af medierne. Vi foreslår, at biosikkerhedsskabet og alle pipetter, flasker og værktøj desinficeres inden brug, at den laminære luftstrøm tændes mindst 15 minutter før brug af biosikkerhedsskabet, og at kabinettet og alle pipetter desinficeres efter brug for at reducere risikoen for kontaminering. Vi foreslår også autoklavering af ikke-filterpipettespidser til vakuumaspiration og skylning af aspiratoren med sterilt vand efterfulgt af 70% ethanol efter brug. En kulturret kun med medier kan anbringes i den befugtede inkubator ved 37 °C og 5 % CO2 i et par dage for at kontrollere mediernes sterilitet. Forurenede kulturer skal bleges i 30 minutter og kasseres. Cellekulturinkubatoren skal også desinficeres.
En stor forskel mellem protokollerne i dette manuskript og dem, der tidligere er offentliggjort, er brugen af BSA i vores ADSC-collagenasefordøjelsesbuffer, som muliggør isolering af modne adipocytter og ADSC'er. Derudover bruger vores protokol ADSC-vækstmedium suppleret med 20% FBS sammenlignet med 10% FBS som foreslået af de fleste protokoller. Vi har bemærket, at rhesus macaque primære ADSC'er spredes og differentieres bedre med 20% FBS. ADSC-differentiering in vitro induceres af afstamningsspecifikke induktionsmidler. De induktionsmidler, der anvendes i denne protokol, er bredt accepteret til in vitro adipogen differentiering af ADSC'er. I modsætning til mange tidligere offentliggjorte protokoller inkluderer den adipogene differentieringscocktail imidlertid ikke insulin- eller PPARγ-agonister. Vi og andre har brugt denne protokol til med succes at differentiere både rhesus macaque og humane ADSC'er14,15,16.
I denne protokol bekræftes ADSC adipogen differentiering ved påvisning af lipiddråber ved hjælp af Oil Red O og BODIPY farvningsteknikker. Selvom disse pletter er velkendte i marken, er der andre metoder, der almindeligvis anvendes, herunder flowcytometri til påvisning af CD105 til identifikation af ADSC'er eller markører for endotel- og immunceller for at etablere renhed af ADSC'er17.
Brug af ADSC'er giver et værdifuldt værktøj til regenerativ medicin og metabolisk forskning. ADSC-isolering og -spredning producerer et stort antal stamceller, der kan bruges til flere downstream-applikationer og eksperimentelle teknikker, herunder, men ikke begrænset til, dem, der er beskrevet i denne protokol. En vigtig tilsigtet anvendelse til differentierede adipocytter i denne protokol inkluderer brugen af metaboliske assays såsom insulinstimuleret glukoseoptagelse, lipogenese og stimuleret lipolyse18. Derudover kan ADSC'er differentieres til osteogen og kondrogen afstamning og anvendes til downstream-analyse, herunder til vævsteknik7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Curtis Vande Stouwe for hans tekniske bistand. Den forskning, der ligger til grund for udviklingen af protokollerne, blev støttet af tilskud fra National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (5P60AA009803-25, 5T32AA007577-20 og 1F31AA028459-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4 % trypan blue | Thermo-Fisher | 15250061 | |
| 1.5-ml microcentrifuge tube | Dot Scientific | 707-FTG | |
| 100 % isopropanol | Sigma-Aldrich | PX1838-P | |
| 100-mm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 50-mL plastic conical tube | Fisher Scientific | 50-465-232 | |
| 70-µm cell strainer | Corning | CLS431751 | |
| a-MEM | Thermo-Fisher | 12561056 | |
| Aluminum foil | Reynolds Wrap | ||
| BODIPY | Thermo-Fisher | D3922 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 05470 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Collagenase, Type I | Thermo-Fisher | 17100017 | |
| Dexamethasone-Water Soluble | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Distilled water | Thermo-Fisher | 15230162 | |
| Fetal Bovine Serum, USDA-approved | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fungizone/Amphotericin B (250 ug/mL) | Thermo-Fisher | 15290018 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14175095 | |
| Hemacytometer with cover slip | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Inverted light microscope | Nikon | DIAPHOT-TMD | |
| L-glutamine (200 mM) | Thermo-Fisher | 25030081 | |
| Laboratory rocker, 0.5 to 1.0 Hz | Reliable Scientific | Model 55 Rocking | |
| Neutral buffered formalin (10 %) | Pharmco | 8BUFF-FORM | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Paraformeldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo-Fisher | 10010023 | |
| Red blood cell (RBC) lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Serological pipettes, 2 to 25 mL | Costar Stripettes | ||
| Standard humidified cell culture incubator, 37 °C, 5 % CO2 | Sanyo | MCO-17AIC | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo-Fisher | 25200056 |
References
- Fain, J. N. Release of interleukins and other inflammatory cytokines by human adipose tissue is enhanced in obesity and primarily due to the nonfat cells. Vitamins and Hormones. 74, 443-477 (2006).
- Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obesity Reviews. 11 (1), 11-18 (2010).
- Wang, P., Mariman, E., Renes, J., Keijer, J. The secretory function of adipocytes in the physiology of white adipose tissue. Journal of Cellular Physiology. 216 (1), 3-13 (2008).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
- Via, A. G., Frizziero, A., Oliva, F. Biological properties of mesenchymal Stem Cells from different sources. Muscles, Ligaments and Tendons Journal. 2 (3), 154-162 (2012).
- Horwitz, E. M., et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 7 (5), 393-395 (2005).
- Zuk, P. Adipose-derived stem cells in tissue regeneration: A Review. International Scholarly Research Notices Stem Cells. 2013, 713959 (2013).
- Smith, U., Kahn, B. B. Adipose tissue regulates insulin sensitivity: role of adipogenesis, de novo lipogenesis and novel lipids. Journal of Internal Medicine. 280 (5), 465-475 (2016).
- Laclaustra, M., Corella, D., Ordovas, J. M. Metabolic syndrome pathophysiology: the role of adipose tissue. Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Disease. 17 (2), 125-139 (2007).
- Grundy, S. M. Adipose tissue and metabolic syndrome: too much, too little or neither. European Journal of Clinical Investigation. 45 (11), 1209-1217 (2015).
- Neeland, I. J., et al. Dysfunctional adiposity and the risk of prediabetes and type 2 diabetes in obese adults. Journal of the American Medical Association. 308 (11), 1150-1159 (2012).
- Kahn, C. R., Wang, G., Lee, K. Y. Altered adipose tissue and adipocyte function in the pathogenesis of metabolic syndrome. Journal of Clinical Investigation. 129 (10), 3990-4000 (2019).
- Sarjeant, K., Stephens, J. M.
- Ford, S. M., et al. Differential contribution of chronic binge alcohol and antiretroviral therapy to metabolic dysregulation in SIV-infected male macaques. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 315 (5), 892-903 (2018).
- Gagliardi, C., Bunnell, B. A. Isolation and culture of rhesus adipose-derived stem cells. Methods in Molecular Biology. 702, 3-16 (2011).
- Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
- Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
- Wang, Q. A., Scherer, P. E., Gupta, R. K. Improved methodologies for the study of adipose biology: insights gained and opportunities ahead. Journal of Lipid Research. 55 (4), 605-624 (2014).
