Summary
Bu makalede, enzimatik doku sindirim protokolü kullanılarak rhesus makak kaynaklı adipoz kaynaklı kök hücrelerin (ADSC'ler) izolasyonu anlatılmaktadır. Daha sonra, hücre dekolmanı, saymayı ve kaplamayı içeren ADSC proliferasyonunu tanımladık. Son olarak, ADSC farklılaşması spesifik adipojenik indükleyici ajanlar kullanılarak tanımlanmıştır. Ek olarak, farklılaşmayı doğrulamak için boyama tekniklerini açıklıyoruz.
Abstract
Yağ dokusu, kendini yenileyebilen zengin ve erişilebilir bir multipotent kök hücre kaynağı sağlar. Bu adipoz türevi kök hücreler (ADSC'ler), fonksiyonel olarak in vivo adipositlerinkine benzeyen tutarlı bir ex vivo hücresel sistem sağlar. ADSC'lerin biyomedikal araştırmalarda kullanımı, yağ dokusunun metabolik regülasyonunun ve fonksiyonunun hücresel olarak araştırılmasına izin verir. ADSC farklılaşması yeterli adiposit genişlemesi için gereklidir ve suboptimal diferansiyasyon yağ disfonksiyonunun majör bir mekanizmasıdır. ADSC farklılaşmasındaki değişiklikleri anlamak, metabolik disfonksiyon ve hastalığın gelişimini anlamak için çok önemlidir. Bu makalede açıklanan protokoller, takip edildiğinde, glukoz alımı, lipoliz, lipogenez ve sekresyonu ölçen tahliller dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere, ADSC metabolik fonksiyonunu değerlendirmek için birkaç in vitro fonksiyonel test için kullanılabilecek olgun adipositler verecektir. Rhesus makakları (Macaca mulatta) fizyolojik, anatomik ve evrimsel olarak insanlara benzerdir ve bu nedenle dokuları ve hücreleri biyomedikal araştırmalarda ve tedavilerin geliştirilmesinde yaygın olarak kullanılmıştır. Burada, 4-9 yaş rhesus makaklarından elde edilen taze subkutan ve omental yağ dokusu kullanılarak ADSC izolasyonunu tanımladık. Yağ dokusu örnekleri kollajenazda enzimatik olarak sindirilir, ardından ADSC'leri stromal vasküler fraksiyondan izole etmek için filtrasyon ve santrifüjleme yapılır. İzole ADSC'ler stromal ortamda çoğaltılır ve ardından stromal ortamda 0.5 μg / mL deksametazon, 0.5 mM izobütil metilksantin ve 50 μM indometazin kokteyli kullanılarak yaklaşık 14-21 günlük farklılaşma sağlanır. Olgun adipositler yaklaşık 14 günlük farklılaşmada gözlenir. Bu yazıda, ADSC izolasyonu, proliferasyonu ve farklılaşması için protokolleri in vitro olarak açıklayacağız. Her ne kadar rhesus makak yağ dokusundan ADSC'lere odaklanmış olsak da, bu protokoller diğer hayvanlardan elde edilen yağ dokusu için minimum ayarlamalarla kullanılabilir.
Introduction
Yağ dokusu, heterojen bir hücre karışımından, ağırlıklı olarak olgun adipositlerden ve fibroblastlar, bağışıklık hücreleri ve adipoz kaynaklı kök hücreleri (ADSC'ler) içeren stromal vasküler fraksiyondan oluşur1,2,3. Primer ADSC'ler doğrudan beyaz yağ dokusundan izole edilebilir ve adipositlere, kıkırdaklara veya kemik hücrelerine farklılaşmak için uyarılabilir4. ADSC'ler, in vitro multipotensinin korunması ve kendini yenileme gibi klasik kök hücre özellikleri sergiler; ve kültürde plastiğe yapışır 5,6. ADSC'ler, multipotensiyel olmaları ve non-invaziv teknikler kullanılarak büyük miktarlarda kolayca hasat edilebilmeleri nedeniyle rejeneratif tıpta kullanım için önemli bir ilgi çekicidir7. ADSC'lerin adipojenik farklılaşması, lipid birikimi, insülin ile uyarılmış glikoz alımı, lipoliz ve adipokin sekresyonu8 dahil olmak üzere olgun adipositleri fonksiyonel olarak taklit eden hücreler üretir. Olgun adipositlere benzerlikleri, adipositlerin hücresel özelliklerinin ve metabolik fonksiyonlarının fizyolojik olarak araştırılmasında ADSC'lerin yaygın olarak kullanılmasına yol açmıştır. Metabolik disfonksiyon ve bozuklukların gelişiminin hücresel veya doku seviyesinden kaynaklandığı fikrini destekleyen kanıtlar artmaktadır 9,10,11,12. Yeterli yağ dokusu genişlemesi, uygun adiposit fonksiyonu ve etkili metabolik regülasyon için optimal ADSC farklılaşması gereklidir13.
Bu makalede açıklanan protokoller, standart laboratuvar ekipmanlarını ve temel reaktifleri kullanan basit tekniklerdir. Makale ilk olarak primer ADSC'lerin mekanik ve enzimatik sindirim kullanılarak taze yağ dokusundan izole edilmesine yönelik protokolü açıklamaktadır. Daha sonra, ADSC'lerin stromal ortamda proliferasyon ve pasajı için protokol açıklanmaktadır. Son olarak, ADSC'lerin adipojenik farklılaşması için protokol tanımlanmıştır. Farklılaşmayı takiben, bu hücreler adiposit metabolizmasını ve işlev bozukluğu mekanizmalarını daha iyi anlamak için çalışmalar için kullanılabilir. Yağ Kırmızı O ve bor-dipirometen (BODIPY) boyaması kullanılarak adipojenik farklılaşmanın doğrulanması ve lipit damlacığı tespiti için protokoller de tanımlanmıştır. Bu protokollerin ayrıntıları, rhesus makaklarının taze omental yağ dokusundan izole edilen primer ADSC'lere odaklanmıştır. Biz ve diğerleri bu protokolü ADSC'leri rhesus makak subkutan ve omental yağ dokuları depolarından14,15'ten başarılı bir şekilde izole etmek için kullandık. Kullanılan aynı miktarda doku için, deri altı yağ dokusunun omental yağ dokusuna kıyasla daha yoğun, daha sert ve sindirimden daha az hücre verdiğini gözlemledik. Bu protokol aynı zamanda ADSC'leri insan yağ örneklerinden izole etmek için de kullanılmıştır16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Elde edilen tüm dokular ve prosedürler, Louisiana Eyalet Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmış ve Ulusal Sağlık Enstitüsü'nün kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir (NIH yayını No. 85-12, gözden geçirilmiş 1996).
1. Tamponların ve çözeltilerin hazırlanması
- 1x PBS'ye %5 penisilin/streptomisin (kalem/strep) ve 0,25 μg/mL mantar inhibitörü ekleyerek steril 5-fosfat tamponlu tuzlu su yıkama tamponu (5-PBS) çözeltisi hazırlayın. 1x PBS'ye %2 kalem/strep ve 0,25 μg/mL mantar inhibitörü ekleyerek steril 2-PBS yıkama tamponu (2-PBS) çözeltisi hazırlayın. Yıkama tamponları ileride kullanılmak üzere 4 °C'de saklanabilir ve 4 hafta içinde kullanılmalıdır.
NOT: 5-PBS tamponu, nekropside elde edilen doku örnekleri steril olmayan bir ortamda toplandığı için olası kontaminasyonu en aza indirmek için yağ dokusu toplama ve ilk yıkama için kullanılır. - %0.075 kollajenaz Tip I (125 ünite/mg aktivite), %2 kalem/strep ve 0.25 μg/mL mantar inhibitörünü Hank'in dengeli tuz çözeltisinde (HBSS) %1 Sığır Serum Albümini birleştirerek steril kollajenaz tamponu (CB) hazırlayın. CB 1 saat içinde kullanılmalıdır.
- α-MEM tamponu kullanarak steril ADSC büyüme ortamı hazırlayın. 100 mL fetal sığır serumu (FBS), 5 mL 200 mM L-glutamin çözeltisi, 500 μL 0.25 μg/mL mantar inhibitörü ve 10 mL kalem/strep solüsyonunu 394 mL α-MEM tamponunda birleştirin. ADSC büyüme ortamı 4 ° C'de saklanabilir ve 4 hafta içinde kullanılmalıdır.
NOT: FBS'nin ısı ile inaktivasyonu gerekli değildir. - Yukarıda hazırlandığı gibi ADSC büyüme ortamını ve 0.5 μg / mL deksametazon, 0.5 mM izobütil metilksantin ve 50 μM indometasinin nihai konsantrasyonunu elde etmek için indüksiyon ajanlarını birleştirerek steril ADSC farklılaşma ortamı hazırlayın.
2. ADSC izolasyonu
- Doku hazırlama ve sindirim
- Pipet, dört adet 100 mm'lik hücre kültürü kabına ~10 mL 5-PBS tampon içerir.
- ~50 g yağ örneğini 5-PBS içeren 100 mm'lik tabaklardan birine aktarın. Toplanan yağ dokusu örneğini, 5-PBS içeren dört kültür kabı boyunca sırayla aktararak dört kez yıkayın.
- Yağ örneğini temiz bir 100 mm kültür kabına aktarın ve makas veya iki steril neşter kullanarak yağ dokusunu iyice kesin. Kıyma, verimli ve eksiksiz enzimatik sindirim için yüzey alanının arttırılmasını sağlar.
- Kıyılmış yağ dokusunu 13 mL CB içeren 50 mL plastik konik tüpe aktarın (15 mL CB başına 1-3 cm'lik doku kesiti).
- Kültür kabını 2 mL CB ile durulayın ve ortamı 50 mL plastik konik tüpe aktarın.
NOT: Bu noktada, 50 mL'lik plastik konik tüp içinde doku ile birlikte toplam 15 mL CB bulunmalıdır. - Mekanik doku sindirimini kolaylaştırmak için 25 mL serolojik pipet kullanarak birkaç kez yukarı ve aşağı pipet kullanın.
- CB'de doku içeren 50 mL plastik konik tüpü 30-60 dakika boyunca 37 ° C'de orta hızda bir rocker üzerinde inkübe edin.
- Kültür için ADSC kaplama
- Enzim aktivitesini nötralize etmek için doku içeren 50 mL tüpe 10 mL ADSC büyüme ortamı ekleyin. Herhangi bir yağ dokusu agregasını ayırmak için 25 mL serolojik pipet kullanarak birkaç kez yukarı ve aşağı pipet kullanın.
- Sıvı kısmı, katıları geride bırakarak yeni bir steril 50 mL konik tüpe aktarın. Orijinal 50 mL tüpü ~7 mL 2-PBS tampon ile 3 kez yıkayın ve sıvı kısmı 50 mL tüpe aktarın.
- Bir hücre peleti elde etmek için 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın. Hücre peletini rahatsız etmeden serolojik bir pipet kullanarak mümkün olduğunca fazla süpernatantı dikkatlice çıkarın. Dekantasyon yapmayın.
- Hücre peletini 1 mL 1x kırmızı kan hücresi (RBC) lizis tamponunda yeniden askıya alın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Tüpe 5 mL ADSC büyüme ortamı ekleyin ve 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın, ardından süpernatanı dikkatlice çıkarın ve atın.
- 5 mL ADSC büyüme ortamı ekleyin ve hücre peletini yıkamak için 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın. Süper natantı atın.
- Peleti 2 mL ADSC büyüme ortamında yeniden askıya alın ve 70 μm'lik bir hücre süzgecinden yeni bir steril 50 mL plastik konik tüpe filtreleyin.
- Hücre süzgecini ilave 2 mL ADSC büyüme ortamı ile durulayın. ADSC'ler içeren süspansiyonun 4 mL'sini 50 mL konik tüpten steril 100 mm'lik bir kültür kabına aktarın.
- 50 mL konik tüpü 3 mL ADSC büyüme ortamı ile 2 kez yıkayın ve sıvıyı ADSC'ler içeren 100 mm kültür kabına kültür kabında toplam 10 mL ortam için aktarın.
- Şekil 1A'da gösterildiği gibi ortamdaki yüzen hücreleri kontrol etmek için ters çevrilmiş mikroskop altındaki hücreleri 10x büyütmede görüntüleyin. Hücreler bir CO 2 inkübatöründe 37 °C'de %5 CO2 ve %100 bağıl nemde tutulmalıdır.
- 24 saat sonra, hücre yapışmasını kontrol etmek için hücreleri ters çevrilmiş bir mikroskop altında görüntüleyin. ADSC büyüme ortamını plakadan aspire edin ve 10 mL taze, ılık (37 ° C) ortam ile değiştirin. Hücreler %80-%90 oranında kaynaşana kadar her 48 saatte bir ortamları çıkarın ve değiştirin (Şekil 1B).
NOT: Hücrelerin en az% 10-20'si 24 saat boyunca yapışacaktır. Hücre granülerliği, ortamın bulanıklığı veya sporların büyümesi gibi kontaminasyon belirtileri için hücre kültürünü kontrol edin. Hücreler% 80 birleştiğinde, çoğalma ve kriyoprezervasyon için toplanabilir veya farklılaşmaya teşvik edilebilirler. ADSC'ler, verimli bir şekilde çoğalma veya farklılaşma yeteneklerini kaybetmeden önce 4-6 pasaja genişletilebilir.
3. ADSC proliferasyonu
- Hücre ayrılması
- ADSC büyüme ortamını aspiratör/pipet kullanarak çıkarın. Akıcı ADSC'leri 2 mL steril, oda sıcaklığında PBS ile 2 kez durulayın.
- PBS'yi aspire edin ve 100 mm kültür plakası başına 2 mL % 0.25 tripsin-EDTA ekleyin. Tüm yüzey alanının tripsin ile kaplandığından emin olun.
- ADSC'ler ayrılana kadar plakayı 37 ° C'de% 5 CO2'de ~ 7 dakika boyunca inkübe edin. Plakayı inkübatörden çıkarın ve tripsin çözeltisini plakadaki zorla pipetleyerek hücreleri mekanik olarak yerinden çıkarın.
- Yerinden çıkmış hücrelere 2 mL ADSC büyüme ortamı ekleyin ve karıştırmak için hafifçe pipet ekleyin. Hücreleri steril 50 mL plastik konik tüpe aktarın. Maksimum hücre iyileşmesini sağlamak için, kültür kabını başka bir 2 mL ADSC büyüme ortamı ile durulayın ve ortamı müstakil hücreler içeren konik tüpe aktarın.
- Bir hücre peleti elde etmek için 50 mL konik tüpü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın. Hücre peletini rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice dekantlayın.
- Hücre peletini 1 x 10 6 hücre başına 5-6 mL ADSC büyüme ortamındayeniden askıya alın.
- Hücre sayımı ve kaplama
- 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde, yukarıdan 10 μL hücre çözeltisini ve 10 μL% 0.04 tripan mavisi çözeltisini (PBS'de 1:10 seyreltilmiş %0.4 tripan mavisi) seyreltin ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
- Büyüme ortamında istenen ADSC sayısını yeniden askıya alın. 100 mm kültür çanağı için, 72 saatte %80 birleşmeye veya 96 saatte %100 akıcılığa izin vermek için 10 mL ADSC büyüme ortamında ~3,0 x 105 hücre tabaklayın.
- Asılı hücrelerin varlığından emin olmak için çanağı inkübasyondan önce 10x büyütmede ters çevrilmiş bir mikroskop altında görüntüleyin. Hücreleri 37 °C'de %5 CO2 ve %100 bağıl nemde tutun.
- Her 48 saatte bir büyüme ortamını aspire eder ve Şekil 1B'de gösterildiği gibi hücreler% 80 ila% 90 oranında kaynayana kadar ılık (37 ° C) ortamla değiştirilir.
- İstenen hücre numarasını elde etmek üzere uygun sayıda pasaj için bölüm 3.1 ve 3.2'deki adımları yineleyin.
NOT: 5 ila 6 arasındaki pasajlardan sonra, birincil hücrelerin yaşlanmaya uğradığı görülmektedir; bu nedenle, 4. geçit ile istenen hücre sayılarını elde etmeyi hedefleyin.
4. ADSC adipojenik farklılaşması
- ADSC büyüme ortamını% 80 ila% 90 birleşime ulaşmış yapışmış ADSC'lerden aspire edin.
- ADSC hücre tabakasını steril, oda sıcaklığında PBS ile hızlı bir şekilde durulayın.
- ADSC farklılaştırma ortamı ekleyin. 100 mm kültür kabı için, 10 mL ADSC farklılaşma ortamı ekleyin.
- Yaklaşık 14-21 gün boyunca her 3 günde bir ortamı değiştirin. Olgun adipositler genellikle 14 günlük farklılaşmadan sonra gözlenir.
- Şekil 2A'da gösterildiği gibi lipit damlacığının varlığını doğrulamak için ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu altındaki hücreleri 40x büyütmede inceleyin.
5. Adiposit tespiti
NOT: Bu bölüm, farklılaşmış adipositlerde lipid damlacığı tespiti için kullanılan boyama protokollerini açıklayacaktır, ancak mezenkimal bir kök hücre belirteci olan CD105 için immünofloresan boyama da ADSC onayı için kullanılabilir.
- Yağ Kırmızı O boyama
- İzopropanol% 0.5 Yağ Kırmızı O stok çözeltisi hazırlayın. 20 mL Yağ Kırmızı O stok çözeltisi için, 20 mL izopropanol içinde 100 mg Yağ Kırmızı O çözün. Çözeltiyi 0,2 μm membranlı steril bir şırınga filtresinden süzün.
- Farklılaşma ortamını dikkatlice aspire edin ve hücre tek katmanını rahatsız etmemek için kuyunun kenarlarına PBS ekleyerek hücreleri 2 kez yıkayın.
- PBS'yi hücrelerden dikkatlice aspire edin ve hücre tabakasını örtmek için yeterli nötr tamponlanmış formalin (NBF, % 10) ekleyin. Oda sıcaklığında 30-60 dakika boyunca inkübe edin.
- Formalin fiksasyon adımı sırasında, 3 parça Yağ Kırmızı O stok çözeltisini 2 parça damıtılmış su ile seyrelterek Yağ Kırmızı O çalışma çözeltisini hazırlayın. Çözeltiyi karıştırın ve 0,2 μm membranlı steril bir şırınga filtresinden süzün. Çalışma çözümü 2 saate kadar kararlıdır.
- NBF'yi dikkatlice aspire edin ve hücre tabakasını damıtılmış suyla hızlı bir şekilde yıkayın (~ 15 s). Su aspire ettikten sonra hücre tabakasını örtmek için yeterli% 60 izopropanol ekleyin ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- 5 dakikalık inkübasyondan sonra izopropanolü dikkatlice aspire edin ve hücre tabakasını örtmek için yeterli Yağ Kırmızı O çalışma çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 10-15 dakika inkübe edin.
- Yağ Kırmızı O çalışma çözeltisini dikkatlice aspire edin ve su berraklaşana kadar hücre tabakasını damıtılmış suyla birkaç kez yıkayın.
- PBS'yi hücre kültürü kabına ekleyin ve lipid damlacıklarının farklılaşmasının ve varlığının göstergesi için ters çevrilmiş bir mikroskop altında hücreleri inceleyin (Şekil 2B).
- BODIPY Boyama
- 1 mL DMSO'da 1,3 g BODIPY'yi çözerek 5 mM BODIPY stok çözeltisi hazırlayın. PBS'de stok çözeltisini 1:25.000 kez seyrelterek 2 μg/mL BODIPY çalışma çözeltisi hazırlayın.
- Farklılaşma ortamını dikkatlice aspire edin ve hücre tek katmanını rahatsız etmemek için kuyunun kenarlarına PBS ekleyerek hücreleri 2 kez yıkayın.
- PBS'yi dikkatlice aspire edin ve hücre tabakasını örtmek için yeterli BODIPY çalışma çözeltisi ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
NOT: Bu noktadan itibaren, plakayı folyo ile kaplayarak hücreleri ışıktan koruyun. - BODIPY çalışma solüsyonunu dikkatlice aspire edin ve hücre tabakasını PBS ile 3 kez yıkayın.
- % 4 paraformaldehit ekleyerek ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe ederek hücreleri sabitleyin.
- Fiksasyon tamponunu dikkatlice aspire edin ve hücre monotabakasını rahatsız etmemek için kuyunun kenarları boyunca PBS ekleyerek hücreleri 2 kez yıkayın.
- PBS'yi hücre kültürü kabına ekleyin ve farklılaşma ve lipit damlacığının varlığının kanıtı için ters çevrilmiş bir floresan mikroskop altında hücreleri inceleyin (Şekil 2C). FITC/EGFP/Bodipy Fl/Fluo3/DiO Chroma filtre seti kullanan görüntü hücreleri. Uyarma dalga boyu 40 nm bant genişliği ile 480 nm'de ve emisyon dalga boyu 50 nm bant genişliği ile 535 nm'dir. Benzer veya uygun bir filtre seti ve mikroskop kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rhesus makak yağ dokusu örneklerinden izole edilen ADSC'ler kültür plakalarına tohumlandı ve Şekil 1'de gösterilmiştir. Kaplama gününde, hücreler yapışmaz ve Şekil 1A'da gösterildiği gibi kültür kabında yüzer. 72 saat içinde, ADSC'ler% 80 oranında akıcı hale gelecek ve adiposit farklılaşmasına hazır olacaktır (Şekil 1B). ADSC'ler kimyasal indüksiyondan sonra güçlü adipojenik özellikler sergiler. 14 günlük farklılaşmadan sonra, olgun adipositler ışık mikroskobu ile gözlemlenebilir (Şekil 2A). ADSC adipojenik farklılaşmasını doğrulamak için, farklılaşmış olgun adipositlerin lipit damlacıklarını görselleştirmek için çeşitli lekeler kullanılabilir. Farklılaşmanın 14. gününde, hücreler lipit damlacığı görselleştirmesi için Yağ Kırmızı O (Şekil 2B) ve BODIPY (Şekil 2C) ile boyandı ve sabitlendi. Siyah ok, farklılaşmış bir adipositi temsil eder (Şekil 2B). Bu veriler, bu protokolü takiben, ADSC'lerin rhesus makak yağ dokusundan üretildiğini ve olgun adipositlere farklılaştığını göstermektedir.
Şekil 1: ADSC'lerin kaplama gününde ve% 80 hücre akıcılığında ışık mikrografları. (A) Taze rhesus makak yağ dokusundan ADSC izolasyonunu takiben kaplama gününde stromal vasküler hücrelerin temsili ışık mikrografisi (10x büyütme). (B) ADSC'lerin %80 akıcılıkta temsili ışık mikrografisi (20x büyütme). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Farklılaşmanın 14. gününde ADSC'lerin mikrografları. (A) ADSC farklılaşmasının 14. gününde elde edilen temsili ışık mikrografı (40x büyütme). (B) ADSC farklılaşmasının 14. gününde Kırmızı Yağ O boyamasının temsili mikrografisi (20x büyütme). (C) ADSC farklılaşmasının 14. gününde bor-dipirometen (BODIPY) boyamasının temsili mikrografisi (20x büyütme). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ADSC izolasyonu, proliferasyon ve farklılaşma protokolleri basit ve tekrarlanabilirdir, ancak yeterli izolasyon, sağlıklı genişleme ve verimli farklılaşmayı sağlamak için dikkatli bir teknik gerektirirler. Steril bir çalışma ortamı, tüm hücre kültürü deneyleri için kritik öneme sahiptir. Bakteriler veya mantarlar, kontamine aletler, ortamlar veya çalışma ortamı yoluyla hücre kültürlerine sokulabilir. Mantar kontaminasyonu, kültürdeki spor büyümesi ile belirtilirken, bakteriyel kontaminasyon, ortamın bulanıklığının varlığı ile gösterilir. Biyogüvenlik kabininin ve tüm pipetlerin, şişelerin ve aletlerin kullanımdan önce dezenfekte edilmesini, biyogüvenlik kabinini kullanmadan en az 15 dakika önce laminer hava akışının açılmasını ve kontaminasyon riskini azaltmak için kabinin ve tüm pipetlerin kullanımdan sonra dezenfekte edilmesini öneririz. Ayrıca, vakum aspirasyonu için filtresiz pipet uçlarının otoklavlanmasını ve aspiratörün steril suyla yıkanmasını ve ardından kullanımdan sonra %70 etanol kullanılmasını öneriyoruz. Ortamın sterilitesini kontrol etmek için nemlendirilmiş inkübatöre sadece 37 °C ve % 5 CO2'de birkaç gün boyunca ortam içeren bir kültür kabı yerleştirilebilir. Kirlenmiş kültürler 30 dakika boyunca ağartılmalı ve atılmalıdır. Hücre kültürü inkübatörü de dezenfekte edilmelidir.
Bu makaledeki protokoller ile daha önce yayınlanmış olanlar arasındaki en büyük fark, olgun adipositlerin ve ADSC'lerin izolasyonuna izin veren ADSC kollajenaz sindirim tamponumuzda BSA'nın kullanılmasıdır. Ek olarak, protokolümüz, çoğu protokol tarafından önerildiği gibi% 10 FBS'ye kıyasla% 20 FBS ile desteklenmiş ADSC büyüme ortamını kullanır. Rhesus makak primer ADSC'lerin çoğaldığını ve %20 FBS ile daha iyi farklılaştığını fark ettik. ADSC farklılaşması in vitro olarak soya özgü indüksiyon ajanları tarafından indüklenir. Bu protokolde kullanılan indüksiyon ajanları, ADSC'lerin in vitro adipojenik farklılaşması için yaygın olarak kabul görmektedir. Bununla birlikte, daha önce yayınlanmış birçok protokolün aksine, adipojenik farklılaşma kokteyli insülin veya PPARγ agonistlerini içermez. Biz ve diğerleri bu protokolü hem rhesus makak hem de insan ADSC'leri14,15,16'yı başarılı bir şekilde ayırt etmek için kullandık.
Bu protokolde, ADSC adipojenik farklılaşması, Oil Red O ve BODIPY boyama teknikleri kullanılarak lipit damlacığı tespiti ile doğrulanır. Bu lekeler alanda iyi tanınmasına rağmen, ADSC'leri tanımlamak için CD105'in tespiti için akış sitometrisi veya ADSC'lerin17'sinin saflığını sağlamak için endotel ve immün hücrelerin belirteçleri de dahil olmak üzere yaygın olarak kullanılan başka yöntemler de vardır.
ADSC'lerin kullanımı rejeneratif tıp ve metabolik araştırmalar için değerli bir araç sağlar. ADSC izolasyonu ve proliferasyonu, bu protokolde açıklananlar dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çeşitli aşağı akış uygulamaları ve deneysel teknikler için kullanılabilecek çok sayıda kök hücre üretir. Bu protokolde farklılaşmış adipositler için başlıca amaçlanan kullanım, insülin ile uyarılmış glikoz alımı, lipogenez ve uyarılmış lipoliz18 gibi metabolik testlerin kullanımını içerir. Ek olarak, ADSC'ler osteojenik ve kondrojenik soya ayırt edilebilir ve doku mühendisliği7 dahil olmak üzere aşağı akış analizi için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiç kimse.
Acknowledgments
Yazarlar Curtis Vande Stouwe'ye teknik yardımları için teşekkür eder. Protokollerin geliştirilmesinin altında yatan araştırma, Ulusal Alkol İstismarı ve Alkolizm Enstitüsü'nden (5P60AA009803-25, 5T32AA007577-20 ve 1F31AA028459-01) gelen hibelerle desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4 % trypan blue | Thermo-Fisher | 15250061 | |
| 1.5-ml microcentrifuge tube | Dot Scientific | 707-FTG | |
| 100 % isopropanol | Sigma-Aldrich | PX1838-P | |
| 100-mm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 50-mL plastic conical tube | Fisher Scientific | 50-465-232 | |
| 70-µm cell strainer | Corning | CLS431751 | |
| a-MEM | Thermo-Fisher | 12561056 | |
| Aluminum foil | Reynolds Wrap | ||
| BODIPY | Thermo-Fisher | D3922 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 05470 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Collagenase, Type I | Thermo-Fisher | 17100017 | |
| Dexamethasone-Water Soluble | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Distilled water | Thermo-Fisher | 15230162 | |
| Fetal Bovine Serum, USDA-approved | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fungizone/Amphotericin B (250 ug/mL) | Thermo-Fisher | 15290018 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14175095 | |
| Hemacytometer with cover slip | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Inverted light microscope | Nikon | DIAPHOT-TMD | |
| L-glutamine (200 mM) | Thermo-Fisher | 25030081 | |
| Laboratory rocker, 0.5 to 1.0 Hz | Reliable Scientific | Model 55 Rocking | |
| Neutral buffered formalin (10 %) | Pharmco | 8BUFF-FORM | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Paraformeldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo-Fisher | 10010023 | |
| Red blood cell (RBC) lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Serological pipettes, 2 to 25 mL | Costar Stripettes | ||
| Standard humidified cell culture incubator, 37 °C, 5 % CO2 | Sanyo | MCO-17AIC | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo-Fisher | 25200056 |
References
- Fain, J. N. Release of interleukins and other inflammatory cytokines by human adipose tissue is enhanced in obesity and primarily due to the nonfat cells. Vitamins and Hormones. 74, 443-477 (2006).
- Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obesity Reviews. 11 (1), 11-18 (2010).
- Wang, P., Mariman, E., Renes, J., Keijer, J. The secretory function of adipocytes in the physiology of white adipose tissue. Journal of Cellular Physiology. 216 (1), 3-13 (2008).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
- Via, A. G., Frizziero, A., Oliva, F. Biological properties of mesenchymal Stem Cells from different sources. Muscles, Ligaments and Tendons Journal. 2 (3), 154-162 (2012).
- Horwitz, E. M., et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 7 (5), 393-395 (2005).
- Zuk, P. Adipose-derived stem cells in tissue regeneration: A Review. International Scholarly Research Notices Stem Cells. 2013, 713959 (2013).
- Smith, U., Kahn, B. B. Adipose tissue regulates insulin sensitivity: role of adipogenesis, de novo lipogenesis and novel lipids. Journal of Internal Medicine. 280 (5), 465-475 (2016).
- Laclaustra, M., Corella, D., Ordovas, J. M. Metabolic syndrome pathophysiology: the role of adipose tissue. Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Disease. 17 (2), 125-139 (2007).
- Grundy, S. M. Adipose tissue and metabolic syndrome: too much, too little or neither. European Journal of Clinical Investigation. 45 (11), 1209-1217 (2015).
- Neeland, I. J., et al. Dysfunctional adiposity and the risk of prediabetes and type 2 diabetes in obese adults. Journal of the American Medical Association. 308 (11), 1150-1159 (2012).
- Kahn, C. R., Wang, G., Lee, K. Y. Altered adipose tissue and adipocyte function in the pathogenesis of metabolic syndrome. Journal of Clinical Investigation. 129 (10), 3990-4000 (2019).
- Sarjeant, K., Stephens, J. M.
- Ford, S. M., et al. Differential contribution of chronic binge alcohol and antiretroviral therapy to metabolic dysregulation in SIV-infected male macaques. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 315 (5), 892-903 (2018).
- Gagliardi, C., Bunnell, B. A. Isolation and culture of rhesus adipose-derived stem cells. Methods in Molecular Biology. 702, 3-16 (2011).
- Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
- Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
- Wang, Q. A., Scherer, P. E., Gupta, R. K. Improved methodologies for the study of adipose biology: insights gained and opportunities ahead. Journal of Lipid Research. 55 (4), 605-624 (2014).
