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Immunology and Infection

Procédures de transplantation de moelle osseuse chez la souris pour étudier l’hématopoïèse clonale

Published: May 26, 2021 doi: 10.3791/61875
Automatic Translation
1, 4, 4, 4, 4, 4, 2, 3,4, 1,4
1Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia School of Medicine, 2Department of Cardiology, Xinqiao Hospital, Army Medical University, 3Department of Cardiology, Osaka City University Graduate School of Medicine, 4Hematovascular Biology Center, Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine

Summary

Nous décrivons trois méthodes de transplantation de moelle (BMT) : BMT avec l’irradiation de tout-corps, BMT avec l’irradiation blindée, et méthode de BMT sans le pré-conditionnement (BMT adoptif) pour l’étude de l’hématopoïèse clonale dans des modèles murins.

Abstract

L’hématopoïèse clonale est une affection associée à l’âge répandue qui résulte de l’accumulation de mutations somatiques dans les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPCs). Les mutations dans les gènes conducteurs, qui confèrent la forme physique cellulaire, peuvent conduire au développement de clones de HSPC en expansion qui donnent de plus en plus lieu à des leucocytes de descendance hébergeant la mutation somatique. Puisque l’hématopoïèse clonale a été associée aux maladies cardiaques, aux accidents vasculaires cérébraux, et à la mortalité, le développement des systèmes expérimentaux qui modélisent ces processus est essentiel pour comprendre les mécanismes qui sous-ensivent ce nouveau facteur de risque. Des procédures de transplantation de moelle impliquant le conditionnement myéloablatif chez la souris, telles que l’irradiation de corps entier (TBI), sont couramment employées pour étudier le rôle des cellules immunitaires dans les maladies cardio-vasculaires. Cependant, des dommages simultanés à la niche de moelle osseuse et à d’autres sites d’intérêt, tels que le cœur et le cerveau, sont inévitables avec ces procédures. Ainsi, notre laboratoire a développé deux méthodes alternatives pour minimiser ou éviter les effets secondaires possibles causés par TBI : 1) la transplantation de moelle avec blindage d’irradiation et 2) BMT adoptive aux souris non conditionnées. Dans les organes blindés, l’environnement local est préservé permettant l’analyse de l’hématopoïèse clonale tandis que la fonction des cellules immunitaires résidentes est intacte. En revanche, le BMT adoptif aux souris non conditionnées a l’avantage supplémentaire que les environnements locaux des organes et la niche hématopoïétique sont préservés. Ici, nous comparons trois différentes approches de reconstitution de cellules hématopoïétiques et discutons de leurs forces et limites pour des études de l’hématopoïèse clonale dans les maladies cardio-vasculaires.

Introduction

L’hématopoïèse clonale (CH) est une condition qui est fréquemment observée chez les personnes âgées et se produit à la suite d’un clone de tige et de cellule progéniteur hématopoïétique élargie (HSPC) portant une mutation génétique1. On lui a suggéré qu’à l’âge de 50, la plupart des individus auront acquis une moyenne de cinq mutations exoniques dans chaque HSPC2, mais la plupart de ces mutations auront comme conséquence peu ou pas de conséquences phénotypiques à l’individu. Cependant, si par hasard l’une de ces mutations confère un avantage concurrentiel au HSPC, par exemple en favorisant sa prolifération, son auto-renouvellement, sa survie ou une combinaison de ceux-ci, cela peut conduire à l’expansion préférentielle du clone mutant par rapport aux autres HSPCs. En conséquence, la mutation se propagera de plus en plus à travers le système hématopoïétique car le HSPC muté donne naissance à des cellules sanguines matures, conduisant à une population distincte de cellules mutées dans le sang périphérique. Alors que des mutations dans des dizaines de gènes pilotes candidats différents ont été associées à des événements clonaux dans le système hématopoïétique, parmi ceux-ci, les mutations dans l’ADN méthyltransférase 3 alpha (DNMT3A) et dix onze translocation 2 (TET2) sont les plus répandues3. Plusieurs études épidémiologiques ont révélé que les personnes porteuses de ces mutations génétiques présentent un risque significativement plus élevé de maladies cardiovasculaires (MCV), d’accidents vasculaires cérébraux et de mortalité entièrement causale3,4,5,6,7. Tandis que ces études ont identifié qu’une association existe entre le CH et la plus grande incidence de CVD et de course, nous ne savons pas si ce rapport est causal ou un épiphenomenon partagé avec le processus vieillissant. Pour obtenir une meilleure compréhension de cette association, des modèles animaux appropriés qui récapitulent correctement la condition humaine du CH sont exigés.

Plusieurs modèles animaux ch ont été établis par notre groupe et d’autres utilisant des poissons zèbres, des souris et des primates non humains8,9,10,11,12,13,14. Ces modèles utilisent souvent des méthodes de reconstitution hématopoïétique par transplantation de cellules génétiquement modifiées, parfois en utilisant la recombinaison Cre-lox ou le système CRISPR. Cette approche permet l’analyse d’une mutation génétique spécifique dans les cellules hématopoïétiques afin d’évaluer comment elle contribue au développement de la maladie. En outre, ces modèles utilisent souvent des cellules congéniques ou rapporteures pour distinguer les effets des cellules mutantes des cellules normales ou de type sauvage. Dans de nombreux cas, un régime de préconditionnement est nécessaire pour greffer avec succès les cellules souches hématopoïétiques de donneur.

Actuellement, la transplantation de moelle osseuse à des souris réceptrices peut être divisée en deux catégories principales : 1) conditionnement myéloablatif et 2) transplantation non conditionnée. Le conditionnement myéloablatif peut être réalisé par l’une des deux méthodes, à savoir l’irradiation corporelle totale (TBI) ou la chimiothérapie15. Le TBI est réalisé en soumettant le receveur à une dose létale d’irradiation gamma ou radiographique, générant des ruptures d’ADN ou des réticélisations au sein de cellules se divisant rapidement, les rendant irréparables16. Le busulfan et le cyclophosphamide sont deux agents chimiothérapeutiques couramment utilisés qui perturbent la niche hématopoïétique et causent de la même manière des dommages à l’ADN aux cellules qui se divisent rapidement. Le résultat net du préconditionnement myéloablatif est l’apoptose des cellules hématopoïétiques, qui détruit le système hématopoïétique du receveur. Cette stratégie permet non seulement l’engraftment réussi du distributeur HSPCs, mais peut également empêcher le rejet de greffe en supprimant le recipient' système immunitaire de s. Cependant, le préconditionnement myéloablatif a de graves effets secondaires tels que des dommages aux tissus et aux organes et à leurs cellules immunitaires résidentes ainsi que la destruction de la niche native de la moelle osseuse17. Par conséquent, des méthodes alternatives ont été proposées pour surmonter ces effets secondaires indésirables, en particulier en ce qui concerne les dommages aux organes d’intérêt. Ces méthodes comprennent l’irradiation blindée des souris réceptrices et l’MT adoptive sur des souris non conditionnées9,17. Le fait de protéger le thorax, la cavité abdominale, la tête ou d’autres régions de l’irradiation par l’emplacement d’une barrière de plomb protège les tissus d’intérêt des effets nocifs de l’irradiation et maintient leur population résidente de cellules immunitaires. D’autre part, le BMT adoptif des HSPCs aux souris non conditionnées a un avantage supplémentaire car il préserve la niche hématopoïétique indigène. Dans ce manuscrit, nous décrivons les protocoles et les résultats de l’engraftment de HSPC après plusieurs régimes de transplantation chez les souris, spécifiquement la livraison de HSPC aux souris de TBI, aux souris partiellement protégées de l’irradiation, et aux souris non conditionnées. L’objectif global est d’aider les chercheurs à comprendre les différents effets physiologiques de chaque méthode ainsi que la façon dont ils affectent les résultats expérimentaux dans le contexte du CH et des maladies cardiovasculaires.

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Protocol

Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Virginie.

1. Avant le préconditionnement

  1. Placer les souris réceptrices sur de l’eau supplémentée aux antibiotiques (5 mM de sulfaméthoxazole, 0,86 mM de triméthoprime) ~ 24 h avant l’irradiation. Ceci est nécessaire pour prévenir l’infection, car le système immunitaire sera supprimé après l’irradiation et maintenu pendant 2 semaines après l’irradiation. À ce stade, compléter les souris avec un gel nutritionnel / hydratation pour encourager l’alimentation et pour prévenir la perte de poids et la déshydratation après irradiation.

Figure 1
Figure 1 : Images montrant diverses configurations de préconditionnement. (A) Configuration de l’irradiation corporelle totale en cage à tarte à l’aide de rayons gamma (césium 137): Le faisceau de rayonnement provient de l’arrière de l’irradiateur dans la direction de l’axe y (rayonnement horizontal). (B) Configuration de l’irradiation corporelle totale de la cage de souris à l’aide de rayons X: La cage de la souris est placée dans la chambre réfléchissante. Le faisceau de rayonnement provient du haut de l’irradiateur en forme de cône (rayonnement vertical). La distance entre la source de rayonnement et la cage est de 530 mm.(C)Plateau réglable en irradiateur à rayons X: Cette configuration est utilisée pour l’irradiation partiellement blindée à l’aide de rayons X. Le faisceau de rayonnement provient du haut de l’irradiateur en forme de cône (rayonnement vertical). La distance entre la source de rayonnement et le plateau est de 373 mm et le rayon est de 250 mm. (D) Thorax-shielding: Les souris anesthésiées sont placées sur un plateau. Les souris sont placées l’une à l’envers les unes aux autres dans des positions couchées sur le décubitus dorsal avec les bras et les jambes complètement étendus. L’extrémité inférieure du bouclier de plomb est alignée avec l’os du xiphisternum et l’extrémité supérieure avec le thymus. (E) Blindage abdominal : Les souris anesthésiées sont placées comme dans la configuration de blindage du thorax avec l’extrémité inférieure du bouclier de plomb alignée avec l’anus et l’extrémité supérieure sous le diaphragme. (F) Configuration d’irradiation de blindage de la tête utilisant les rayons gamma (césium-137): Les pattes avant de la souris anesthésiée sont collées et la souris est placée dans un dispositif de retenue conique. Le bouclier de plomb noir (marqué) couvre la tête et les oreilles de la souris. Le faisceau de rayonnement provient de l’arrière de l’irradiateur dans la direction de l’axe Y (rayonnement horizontal). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

2. Préconditionnement des souris réceptrices (facultatif)

  1. Irradiation corporelle totale
    1. Placer les souris réceptrices dans une cage à tarte uniformément tranchée ou dans une cage à souris dans la chambre réfléchissante dans le rayon calculé pour recevoir la même dose d’irradiation; cependant, un maximum de 8 souris par cage à tarte et de 5 souris par cage à souris est recommandé pour assurer une irradiation uniforme (Figure 1A, B).
    2. Pour obtenir une myéloablation complète, assurez-vous que les souris réceptrices reçoivent une dose totale de rayonnement de 11 Gy dans deux fractions de 5,5 Gy séparées par un intervalle de 4 à 24 h.
      REMARQUE: Bien que la greffe optimale puisse être obtenue en mettant en œuvre un intervalle de 4 h entre les fractions, cela peut être étendu à un intervalle de 24 h, ce qui peut être utile lorsque le travail et / ou l’irradiateur n’est pas disponible.
  2. Irradiation partiellement blindée
    1. Anesthésier les souris réceptrices par injection intrapéritonéale de kétamine (80–100 mg/kg) et de xylazine (5–10 mg/kg). La limitation des mouvements de la souris est essentielle pour assurer l’irradiation uniforme et la protection efficace des organes de ciblage pendant le processus de blindage.
    2. Pour le blindage du thorax et de l’abdomen, orientez verticalement le faisceau de rayonnement de l’irradiateur à rayons X vers la souris(figure 1C).
      1. Placez les souris anesthésiées sur une plaque plate, en centrant la source de rayonnement d’en haut. Placez les souris inversées les unes par rapport aux autres en décubitus dorsal, les bras et les jambes complètement étendus(figure 1D,E).
        REMARQUE: L’installation d’irradiateur à rayons X, pour cette expérience, permet que deux souris à la fois puissent être positionnées dans le rayon effectif qui permet une irradiation uniforme. Bien que le rayon effectif soit calculé en fonction de la distance entre la source de rayonnement et le plateau, le nombre d’animaux qui peuvent être irradiés simultanément dépendra de l’irradiateur spécifique.
      2. Fixez les pattes des souris sur la plaque à l’aide de ruban adhésif pour vous assurer que les souris sont immobilisées pendant la procédure d’irradiation. Placez le blindage au plomb de manière à ce qu’il couvre les régions qui ont besoin de protection.
      3. Pour le blindage du thorax, préparez le bouclier en plomb en mesurant la longueur de l’os du xiphisternum de la souris au thymus et en calculant l’épaisseur qui fournira une protection suffisante contre la source d’irradiation. Placez le blindage en plomb de sorte que l’extrémité inférieure s’aligne avec l’os du xiphisternum. L’extrémité supérieure de la barrière de plomb s’adaptera près du thymus (Figure 1D).
      4. Pour le blindage de l’abdomen, préparez le bouclier en plomb en mesurant la longueur de l’anus de la souris au diaphragme et en calculant l’épaisseur qui fournira une protection suffisante contre la source d’irradiation. Placez le blindage en plomb de sorte que l’extrémité inférieure s’aligne sur l’anus. L’extrémité supérieure du bouclier de plomb s’adaptera sous le diaphragme(Figure 1E).
        REMARQUE : La localisation du bouclier de plomb pour qu’elle soit cohérente entre les cohortes peut réduire certaines variations en ce qui concerne la taille des souris.
    3. Pour le blindage de la tête, orientez le faisceau de rayonnement de l’irradiateur de césium horizontalement vers la souris.
      1. Collez soigneusement les pattes avant d’une souris anesthésiée sur l’abdomen. Cela garantit que les bras reçoivent une dose complète d’irradiation et ne sont pas couverts par le bouclier.
      2. Pour le blindage de la tête, placez la souris dans un dispositif de retenue conique qui tient à l’intérieur d’un bouclier en plomb. Une fois que la souris est à l’intérieur du dispositif de retenue conique, faites glisser le dispositif de retenue dans la fente à l’intérieur du bouclier de plomb(Figure 1F). Le bouclier en plomb doit couvrir complètement la tête et les oreilles de la souris (~ 3,2 cm), laissant le reste du corps de la souris exposé à l’irradiation. La position du dispositif de retenue à l’intérieur du bouclier peut être ajustée pour s’adapter aux animaux de différentes tailles en le faisant glisser plus loin à l’intérieur ou à l’extérieur du bouclier.
      3. Placez les souris à l’intérieur de l’irradiateur, perpendiculairement à la source pour l’irradiation.
    4. Exposer les souris à deux fractions d’irradiation de 5,5 Gy (dose totale de 11 Gy) séparées par un intervalle de 4 à 24 h.
    5. Après chaque fraction d’irradiation, placez les cages avec des souris anesthésiées sur des tapis chauffants ou sous des lampes chauffantes rouges pour prévenir l’hypothermie et aider à la récupération de l’anesthésie.
      REMARQUE: Attention à ne pas surchauffer la souris anesthésiée lors de l’utilisation d’une lampe car ils ne peuvent pas échapper à la chaleur. Comme décrit ci-dessus, le positionnement des animaux et l’épaisseur du bouclier en plomb peuvent différer d’une étude à l’autre en fonction des caractéristiques spécifiques de l’irradiateur (type de rayonnement/direction du faisceau, etc.). Les chercheurs devront ajuster leurs expériences en conséquence.

3. Isolement osseux

REMARQUE : Idéalement, les souris donneuses et les souris réceptrices devraient avoir un âge similaire et avoir entre 8 et 12 semaines. L’utilisation d’au moins 3 souris comme donneurs (plutôt que d’un seul donneur) est préférable pour minimiser l’hétérogénéité (même lors de l’utilisation de souris avec le même génotype). Environ 40 millions de cellules de moelle osseuse non fractionnées peuvent être obtenues à partir de six os (deux fémurs, deux tibias et deux huméris) d’une seule souris. La transplantation de 5 millions de cellules de moelle osseuse à chaque souris réceptrices assurera généralement la greffe.

  1. Euthanasier les souris donneuses par luxation cervicale sans anesthésie (méthode préférée pour éviter la contamination chimique des cellules) et placer chaque souris sur un tampon absorbant.
  2. Désinfectez la peau à l’aide d’un vaporisateur d’éthanol à 70 %.
  3. Faites une petite coupe transversale dans la peau sous la cage thoracique et maintenez la peau fermement de chaque côté de l’incision, déchirez dans des directions opposées vers la tête et les pieds. Décollez la peau de tous les membres.
  4. Couper sur les épaules et les articulations du coude, et enlever les muscles attachés et les tissus conjonctifs à l’aide d’un Kimwipe pour obtenir l’humeri.
  5. Disloquer soigneusement les articulations de la hanche entre le fémur et les os de la hanche. Utilisez des ciseaux émoussés pour couper le long de la tête du fémur et détacher les jambes. Couper sur l’articulation du genou pour séparer le fémur et le tibia, et enlever soigneusement les muscles attachés et les tissus conjonctifs à l’aide d’un Kimwipe pour récolter le fémur et le tibia.
    REMARQUE: Portez une attention particulière pour garder l’épiphyse osseuse intacte au cours de cette étape. Jetez tous les os cassés en raison de la perte de stérilité. Les os de la hanche et de la colonne vertébrale peuvent être collectés en plus du fémur, du tibia et de l’humérus. Pour recueillir les os de la colonne vertébrale, un mortier et un pilon peuvent être utilisés pour écraser les os en morceaux et récolter les cellules de la moelle osseuse.
  6. Placer les os isolés de souris du même génotype dans un tube conique correspondant de 50 mL contenant 20 mL de PBS stérile glacé, et les garder sur la glace jusqu’à une utilisation ultérieure. Portez une attention particulière pour placer correctement les os dans des tubes avec des génotypes assortis.
  7. Répétez les étapes ci-dessus pour chaque animal donneur qui change de gants entre chaque souris. En outre, nettoyez les ciseaux et autres instruments avec 70% d’éthanol entre chaque souris.

4. Isolement des cellules de moelle osseuse

REMARQUE : Effectuez les étapes suivantes dans une armoire de classe II de biosécurité.

  1. Préparation des ensembles de tubes : Faites un petit trou dans le fond d’un tube de microcentrifugation stérile de 0,5 mL à l’aide d’une aiguille de 18 G et placez-le dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 mL, qui contient 100 μL de PBS stérile glacé au fond.
    REMARQUE: Comme seulement six os peuvent tenir dans le tube de microcentrifuge de 0,5 mL, il est recommandé de préparer suffisamment d’ensembles de tubes pour traiter tous les os en même temps.
  2. Aspirer le PBS et transférer les os isolés sur une boîte de culture cellulaire stérile de 100 mm. En tenant chaque os à l’aide d’une pince fine, coupez soigneusement les épiphyses de chaque extrémité à l’aide de petits ciseaux qui ont été stérilisés dans un autoclave. Placez les os coupés dans les ensembles de tubes préparés.
  3. Centrifuger les tubes à 10 000 x g pendant 35 s à 4 °C.
  4. Après centrifugation, confirmer que la moelle osseuse a été retirée avec succès des os. Les os doivent apparaître blancs et translucides avec une pastille rouge relativement grande au fond du tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Jetez le tube à microcentrifugation de 0,5 mL.
    NOTA : Si l’inspection visuelle ne permet pas de détecter la moelle osseuse au bas du tube de 1,5 mL, coupez de nouveau l’os et répétez l’étape 4.3.
  5. Ressusciter la moelle osseuse dans 1 mL de PBS glacé, puis transférer la suspension cellulaire du même génotype à un tube conique assorti de 50 mL.
  6. Dissocier les cellules en les faisant passer à travers une aiguille de 18 G avec une seringue de 10 mL 10 fois.
  7. Filtrer les suspensions unicellulaires à travers une passoire cellulaire de 70 μm. Ajouter du PBS glacé supplémentaire à un volume final de 10 mL et ressusciter les cellules grâce à l’utilisation douce de pipette-aide.
  8. Centrifuger à 310 x g pendant 10 min à 4 °C.
  9. Aspirez le surnageant et ressuscitez la pastille de cellules avec 10 ml de médias RPMI sans sérum. Épargner 30 μL de ce matériau pour le comptage cellulaire.
  10. Déterminer la concentration cellulaire avec un compteur cellulaire et calculer le volume de suspension cellulaire requis pour la transplantation. Pour l’exemple d’un 100% BMT, 5 x 106 cellules de moelle osseuse sont nécessaires pour chaque souris réceptrices.
    REMARQUE: Pour un BMT compétitif, préparer un total de 5 x 106 cellules de moelle osseuse comprenant un mélange de cellules donneuses (par exemple, CD45.2+) et de cellules concurrentes (par exemple, CD45.1+). La préparation de cellules de moelle osseuse supplémentaires est fortement recommandée. Par exemple, s’il y a 10 souris réceptrices par groupe expérimental, nous préparons généralement suffisamment de cellules pour 12 souris réceptrices.
  11. Transférer le volume calculé de la suspension cellulaire dans un nouveau tube conique de 50 mL. Centrifuger à 310 x g pendant 10 min à 4 °C.
  12. Aspirer le surnageant et ressusciter les cellules en utilisant la quantité calculée de milieu RPMI sans sérum pour atteindre la densité cellulaire et le volume appropriés. Typiquement, 200 μL est le volume optimal pour une injection rétro-orbitale.

5. Transplantation de cellules de moelle osseuse à des souris irradiées

  1. Anesthésier les souris réceptrices avec 5% d’isoflurane.
  2. Pendant que les souris sont anesthésiées, injectez lentement 200 μL de cellules de moelle osseuse dans la veine rétro-orbitale à l’aide d’une aiguille de 28 à 30 G avec une seringue à insuline.
    1. Alternativement, effectuer l’administration des cellules donneuses par injection intraveineuse de la veine de la queue et injection intramédullaire fémorale, avec un volume maximal de 0,2 mL et 25 μL, respectivement.
  3. Une fois les cellules injectées, placez une goutte de gouttes oculaires contenant de la proparacaïne sur la surface de l’œil pour soulager la douleur. On peut alors laisser l’animal reprendre conscience.

6. Transplantation de cellules de moelle osseuse à des souris non conditionnées

  1. Anesthésier les souris réceptrices par inhalation d’isoflurane à 5%.
  2. Injecter 5 x 106 cellules de moelle osseuse non fractionnées de l’un ou l’autre génotype rétro-orbitalement à des souris réceptrices non irradiées avec une seringue à insuline de 28 à 30 G.
  3. Répétez les étapes 6.1 et 6.2 sur 3 jours consécutifs, de sorte que les souris réceptrices seront transplantées avec un total de 1,5 x 107 cellules de moelle osseuse.
    REMARQUE: Puisque le BMT adoptif sans procédure de préconditionnement exige la transplantation de moelle pendant 3 jours consécutifs, on devrait essayer d’alterner les yeux pour chaque injection.
  4. Après l’injection, administrer une goutte de gouttes oculaires contenant de la proparacaïne à l’œil affecté.

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Representative Results

Pour comparer l’effet de trois méthodes de BMT/pre-conditioning sur l’engraftment de distributeur de cellules, les fractions des cellules de distributeur dans le sang périphérique et le tissu de coeur ont été analysées par cytometry d’écoulement à 1 mois de poteau-BMT. Des cellules d’isolement ont été souillées pour que les marqueurs spécifiques de leucocyte identifient les différents sous-ensembles de leucocytes. Dans ces expériences, le sauvage-type(WT) C57BL/6 (CD45.2) cellules de moelle de distributeur ont été livrés à WT B6. SJL-PtprcaPrpcb/BoyJ (CD45.1) souris réceptrices pour distinguer les cellules donneuses des cellules du receveur. Les stratégies de contrôle par cytométrie de flux qui ont été utilisées sont décrites précédemment par Wang et al.9 dans la figure supplémentaire 1.

Le groupe traité par irradiation corporelle totale (TBI) a reçu 5 x 106 cellules de moelle suivant une dose mortelle totale de rayonnement de 11 GY dans deux fractions de 5,5 GY séparées par un intervalle de 4 h. Dans le sang périphérique des souris réceptrices, des monocytes, des neutrophiles, et des cellules de B ont été en grande partie ablated et remplacés par la progéniture des cellules moelle-dérivées de distributeur. De plus, la population résidente de monocytes cardiaques et de neutrophiles dans les cœurs de souris réceptrices a été presque entièrement remplacée par des cellules dérivées de donneurs(figure 2A).

Dans le groupe partiellement blindé d’irradiation, des souris réceptrices ont été irradiées avec un bouclier de thorax et transplantées avec 5 x10 6 cellules de moelle suivant une dose totale de rayonnement de 11 GY dans deux fractions de 5,5 GY séparées par un intervalle de 4 h. Contrairement au groupe TBI, la contribution des cellules données donneur-dérivées aux cellules immunitaires cardiaques était modeste, ce qui reflète probablement les effets combinés de la protection des cellules immunitaires locales dans le cœur des souris réceptrices et du repeuplement physiologique des cellules de donneur dérivées de la moelle osseuse du sang périphérique. Les cellules réceptrices de la moelle osseuse de souris dans les régions protégées sont également susceptibles d’avoir contribué à la reconstitution du sang périphérique, ce qui réduit le pourcentage de cellules dérivées du donneur dans le sang périphérique par rapport au groupe traité par TBI (Figure 2B).

Dans le groupe sans BMT préconditionnant (BMT adoptif), des souris réceptrices ont été transplantées avec 5 x 106 cellules de moelle sur 3 jours consécutifs. À 4 semaines de poteau-BMT, la partie des cellules donateur-dérivées dans le sang périphérique et le coeur était discernable. (environ 5 %) (Figure 2C).

Pour illustrer comment le modèle BMT adoptif peut être appliqué à l’étude du modèle CH, CD45.2+ cellules de moelle osseuse de donneur (WT ou Tet2-/-) ont été transplantées dans CD45.1+ souris réceptrices. Les receveurs sans conditionnement ont été transplantés avec 5 x10 6 cellules de moelle osseuse chaque jour pendant 3 jours consécutifs (pour un total de 1,5 x 107, n = 5–6 par groupe). L’analyse cytometric d’écoulement du sang périphérique a été exécutée 4, 8, 12, et 16 semaines de poteau-transplantation. Les cellules de distributeur Tet2-déficientes ont conféré un avantage concurrentiel et se sont graduellement développées au fil du temps ; WBCs, monocytes, Ly6Chi monocytes, neutrophiles, cellules T, et cellules de B ont augmenté de manière significative au fil du temps. Par rapport aux cellules donneuses déficientes en Tet2 greffées chez les souris réceptrices, les souris réceptrices greffées avec des cellules donneuses WT ont montré une expansion clonale moins significative des cellules donneuses (Figure 3). Conformément au paradigme clinique de l’hématopoïèse clonale, l’expansion des cellules déficientes en Tet2 n’a pas d’impact sur les nombres absolus des différents types de cellules sanguines9 (données non présentées).

Figure 2
Figure 2 : Analyse cytométrique en flux du sang et du cœur à l’aide de différentes méthodes de préconditionnement. L’analyse cytometric d’écoulement du sang et du coeur périphériques a été exécutée pendant 1 mois après la transplantation de moelle. Pour distinguer les cellules de donneur des cellules des destinataires, CD45.1+ souris réceptrices ont été transplantées avec cd45.2+ cellules de moelle osseuse de donneur. (A) 5 x 106 cellules de moelle ont été transplantées après deux fractions d’irradiation totale de corps (2 x 5.5 GY, intervalle de 4 h, n = 3). (B) 5 x 106 cellules de moelle ont été transplantées après deux fractions d’irradiation totale de corps avec le thorax-blindage (2 x 5.5 GY, intervalle de 4 h, n = 10). (C) Les destinataires sans conditionnement ont été transplantés avec 5 x10 6 cellules de moelle osseuse pendant 3 jours consécutifs (pour un total de 1,5 x 107, n = 4). Les données sont exprimées en moyenne ± SEM. Les WBC totaux sont définis comme CD45+; Neutrophiles comme Ly6G+; Ly6Chi monocytes comme CD115+,Ly6G- , et Ly6C+; Ly6Clo monocytes comme CD115+, Ly6G-, et Ly6C-; Cellules B comme CD45R+; Cd4+ lymphocytes T comme CD3e+ et CD4+; Cd8+ lymphocytes T comme CD3e+ et CD8+; et macrophages comme CD64+, Ly6G-, et Ly6C-. (WBC: globules blancs, Neut: neutrophiles, Mono: monocytes, Mac: macrophages). La figure 2A,C a été modifiée à partir de Wang et al.9. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Ill. 3 : Expansion clonale des cellules déficientes en Tet2 à l’aide de la BMT adoptive à des souris non conditionnées. CD45.2+ cellules de moelle osseuse de distributeur (WT ou Tet2-/-) ont été transplantées dans CD45.1+ souris réceptrices. Des destinataires sans traitement ont été transplantés avec 5 x 106 cellules de moelle chaque jour pendant 3 jours consécutifs (pour un total de 1.5 x 107,n = 5-6 par groupe). L’analyse cytometric d’écoulement du sang périphérique a été exécutée après 4, 8, 12, et 16 semaines de poteau-transplantation. La fraction de CD45,2+ cellules donneuses dans chaque population est indiquée. (A) WBC (B) Mono (C) Ly6Chi mono (D) Cellules B (E) Lymphocytes T. Les données sont exprimées en moyenne ± SEM. Les WBC sont définis comme CD45+; Neutrophiles comme Ly6G+; Ly6Chi monocytes comme CD115+,Ly6G- , et Ly6C+; Ly6Clo monocytes comme CD115+, Ly6G-, et Ly6C-; Cellules B comme CD45R+; CD4+ lymphocytes T comme CD3e+ (WT: type sauvage, WBC : globules blancs, Mono : monocytes) Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Pour des études d’hématopoïèse clonale, nous avons décrit trois méthodes de BMT : BMT avec l’irradiation de tout-corps, BMT avec l’irradiation avec le blindage partiel, et une méthode moins couramment utilisée de BMT qui n’implique aucun préconditionnement (BMT adoptif). Ces méthodes ont été utilisées pour évaluer l’impact de l’hématopoïèse clonale sur les maladies cardiovasculaires. Les chercheurs peuvent modifier ces méthodes en conséquence en fonction de l’objectif spécifique de leur étude.

Modèles d’hématopoïèse clonale
L’hématopoïèse clonale est le phénomène dans lequel les cellules hématopoïétiques mutantes entrent en concurrence avec les cellules de type sauvage et obtiennent une domination clonale au fil du temps. Pour créer un modèle de cette compétition, des souris peuvent être administrées de la moelle osseuse, qui consiste en un mélange de cellules génétiquement différentes. En général, ce mélange comprendra des cellules mutantes et de type sauvage, qui ont été étiquetées avec une étiquette fluorescente ou différents marqueurs pan-leucocytaires (c.-à-d. CD45.1 et CD45.2). Par exemple, lors de la création de modèles qui imitent le CH médié par Tet2,nous effectuons une transplantation compétitive de moelle osseuse dans des receveurs irradiés mortellement qui implique généralement le mélange de 90% de cellules provenant de donneurs CD45.1 Tet2+/+ et de 10% de cellules provenant de CD45.2 Tet2-/-, Tet2+/- ou de donneurs Tet2+/+ de contrôle8. La détection par cytométrie en flux des variantes CD45 à l’aide d’anticorps monoclonaux spécifiques permet de distinguer les cellules donneuses (CD45.1-/CD45.2+) des cellules concurrentes (CD45.1+/CD45.2-) dans le sang, et d’évaluer la dynamique clonale des cellules d’essai au fil du temps. Ce faisant, nous avons pu observer une augmentation progressive du chimérisme des donneurs de cellules déficientes en Tet2, tandis que le pourcentage de cellules de type sauvage reste à environ 10%. Ce cadre expérimental imite le scénario humain des individus porteurs d’une mutation somatique TET2, puisque ces mutations sont initialement portées par un petit nombre de HSPCs, qui se développeront progressivement au fil du temps. L’utilisation de cette approche dans les modèles de maladies cardiovasculaires de l’athérosclérose et de l’insuffisance cardiaque a conduit à la documentation d’un lien de causalité potentiel entre Tet2-mediated CH et CVD8,9,10.

Lorsqu’ils utilisent ces approches, les chercheurs devraient tenir compte des effets confusionnants possibles générés par l’ICT. Bien que le TBI avant la transplantation permette un degré élevé de greffe de HSPC, ce préconditionnement entraînera plusieurs effets indésirables en dehors du système hématopoïétique. Il a été documenté que le TBI peut entraîner une inflammation, des blessures et une fibrose dans plusieurs systèmes d’organes, y compris la peau, le foie, les reins, les poumons, la moelle osseuse, le cœur, le cerveau, etc.18,19,20. Ces effets secondaires peuvent avoir un impact négatif sur les organes cardiovasculaires à l’étude, et ils modifient également la pathogenèse de la maladie21,22. Un exemple notable est l’effet de l’irradiation sur les macrophages résidents dans le cœur. L’irradiation du thorax a comme conséquence un remplacement marqué des macrophages cardiaque-résidents avec les macrophages monocyte-dérivés de circulation. Des études ont montré que les macrophages cardiaques-résidents présentent des caractéristiques distinctes par rapport aux macrophages dérivés des monocytes circulants qui se grefferont dans le cœur après une lésion radiologique. Dans les contextes de la maladie, on pense que les macrophages résidents cardiaques jouent un rôle cardioprotecteur, tandis que l’infiltration de macrophages à diffusion hématogène favorise les blessures et l’inflammation23. Par conséquent, il est concevable que le remplacement des cellules immunitaires cardiaques résidentes par des cellules à diffusion hématogène modifie les processus pathologiques à l’étude, qui contribuent aux maladiescardiovasculaires 24,25,26. De même, dans le cerveau, le TBI entraîne l’épuisement de la microglie résidente et le remplacement par des macrophages périphériques27,28. Alors que les macrophages dérivés périphériques peuvent se comporter comme des cellules microgliales, ils maintiennent une identité fonctionnelle et transcriptionnelle unique par rapport à la microglie dérivée des monocytes28. Par conséquent, il est possible que la séquelle de la maladie puisse être modifiée, en particulier lors de l’étude de maladies telles que les accidents vasculaires cérébraux ischémiques. Afin d’éviter ces effets confusionnants, le blindage du thorax et de la tête peut être recommandé. Ceci est avantageux car il fournit une protection au cœur et au cerveau, respectivement; et il maintient également leurs cellules immunitaires résidentes intactes, récapitulant mieux la condition humaine de CH. Cependant, comme indiqué précédemment, le blindage entraîne un taux de chimère inférieur à celui du préconditionnement du TBI, qui élimine essentiellement toutes les cellules hématopoïétiques de l’hôte.

Un autre obstacle important au préconditionnement est son effet délétère sur la niche de la moelle osseuse. Bien que les dommages induits par irradiation de la niche de nomenclature puissent être reconstitués dans une mesure sous-optimale, il n’est pas clair si l’hématopoïèse naïve est récupérée dans ces microenvironnements endommagés. En outre, la transplantation de HSPCs mélangés dans la nomenclature vide initie une course pour la prolifération entre les clones, plutôt que la simple « concurrence » pour une niche qui est occupée par un HSPC de type sauvage- qui est vraisemblablement ce qui se produit dans CH. Ainsi, une approche potentiellement préférable à l’étude du CH peut être la méthode adoptive de BMT, par laquelle des cellules de nomenclature sont transférées dans les souris réceptrices sans préconditionnement. Cette BMT adoptive sans méthode de préconditionnement affecte le moins du minimum l’hématopoïèse naïve en cours, récapitulant le plus fidèlement le CH observé chez l’homme29. La figure 2C montre le niveau de chimérisme à 1 mois après la transplantation sans préconditionnement. Bien que le chimère donneur soit faible à ce point de temps précoce, nous trouvons une fraction progressivement croissante de clones déficients en Tet2 au fil du temps, comme le présente la figure 3. Il convient de noter que ce modèle est plus utile lorsque les cellules mutantes ont un avantage concurrentiel sur les cellules de type sauvage dans des conditions homéostatiques telles que les cellules déficientes en Tet2. Quand des cellules de Tet2-deficient sont engrafted, il y a une expansion marquée dans de diverses populations de leucocyte telles que des neutrophiles, des monocytes, des cellules de NK, et des cellules de B. Une expansion plus lente a été notée dans les cellules de T, probablement en raison de la demi-vie plus longue de cette population.

L’expansion des cellules déficientes en Tet2 a été observée non seulement dans le sang périphérique, mais aussi dans plusieurs autres tissus, y compris la moelle osseuse, le foie et les reins, avec différentes dynamiques de reconstitution des cellules hématopoïétiques9. Par exemple, l’article publié précédemment par notre laboratoire décrivait le chimérisme des cellules de moelle osseuse des cellules donneuses déficientes en WT et en Tet2 greffées chez des souris réceptrices CD45.1 8 mois après l’adoption de la BMT9. Les cellules donneuses déficientes en Tet2 transplantées sur des souris réceptrices CD45.1 ont montré un avantage concurrentiel par rapport à la lignée immature–cellules Sca1+c-Kit+ (LSK), cellules HSC à court terme et à long terme et progéniteurs multipotents (MPPs) par rapport à celle des cellules donneuses WT transplantées dans les souris réceptrices CD45.1. En outre, comme Tet2-deficient cellule donneuse greffée souris réceptrices, ils développent un phénotype relatif à l’âge de cardiomyopathie sans facteurs exogènes causant le dysfonctionnement cardiaque, récapitulant ainsi l’effet de l’hématopoïèse clonale d’une manière similaire à celle des humains vieillissants. Cette observation a été accompagnée du plus grand degré de chimerism dans les neutrophiles cardiaques et les monocytesde salut de Ly6C. Collectivement, ce régime adoptif de BMT peut être appliqué aux études futures qui pourraient élargir notre compréhension de l’association entre le développement de maladies cardio-vasculaires et l’hématopoïèse clonale à un niveau plus avancé.

En résumé, nous avons décrit trois méthodes BMT et discuté de leur application dans la génération de modèles ch. Le CH est associé à des pronostics plus sombres dans les maladies cardiovasculaires telles que l’athérosclérose et l’insuffisance cardiaque. Bien que des progrès considérables aient été réalisés, l’étude des liens de causalité entre le CH et les MCV en est encore à ses balbutiements, et d’autres investigations sont nécessaires grâce à l’utilisation de modèles animaux optimisés. Nous espérons que ces protocoles permettront aux chercheurs de choisir une méthode plus physiologiquement appropriée de BMT, qui minimalise les effets confusionnants potentiels sur le système cardio-vasculaire, produisant finalement des études qui élargissent notre compréhension de la façon dont ch contribue aux maladies cardio-vasculaires.

Conception du blindage en plomb
L’épaisseur du bouclier en plomb sera dictée par le type d’irradiation utilisé pour induire la myéloablation. Les types de rayons X ou gamma sont fréquemment utilisés pour la myéloablation expérimentale, mais diffèrent en termes de fréquence, de longueur d’onde et d’énergie des photons. En ce qui concerne le blindage, l’énergie des photons, qui décrit l’énergie ou la vitesse à laquelle les rayons voyagent, est le paramètre le plus important. Typiquement, les rayons X de source de rayonnement ont une énergie de 160 kVp tandis que les sources de césium-137, qui émettent des rayons gamma, ont une énergie de 662 KeV. L’énergie émise par ces sources de rayonnement équivaut à leur pouvoir de pénétration, les énergies plus élevées ayant un plus grand pouvoir de pénétration. Par conséquent, une plus grande épaisseur de blindage en plomb est requise lors de l’utilisation d’irradiateurs à base de sources de césium par rapport à l’utilisation d’irradiateurs à base de rayons X. L’irradiation à base de rayons X, que nous utilisons lorsque nous effectuons un blindage du thorax et des abdominaux, nécessite un bouclier en plomb de 7 mm d’épaisseur pour fournir une protection suffisante. Cependant, pour les sources de césium 137, que nous utilisons lorsque nous effectuons le blindage de la tête, les écrans en plomb doivent avoir une épaisseur d’au moins 1 pouce pour fournir une protection suffisante.

Les écrans en plomb destinés à être utilisés dans les irradiateurs à rayons X peuvent être achetés auprès de fournisseurs commerciaux. Alternativement, les feuilles de plomb peuvent être coupées à la taille pour s’adapter autour du corps de l’animal ou pour s’adapter autour d’un dispositif de retenue (voir la figure 1). Lors de l’utilisation d’un irradiateur à base de césium, des briques en plomb, qui sont considérablement plus épaisses, doivent être utilisées et peuvent être fabriquées sur mesure par des entreprises spécialisées dans la fabrication de ces types de boucliers. Par exemple, pour le pare-tête, nous avons conçu sur mesure une brique de plomb pour contenir un dispositif de retenue à tube conique de 50 mL (voir figure 1F). L’animal est capable de s’adapter à l’intérieur du dispositif de retenue, qui est ensuite inséré dans un trou fait dans la brique, pour fournir une protection de 1,5 pouce contre l’irradiation. Il est important de noter que tous les écrans en plomb doivent être recouverts de peinture ou de ruban adhésif pour prévenir l’exposition à la poussière de plomb, qui peut être toxique.

En fonction de l’équipement et de ses paramètres, les chercheurs peuvent concevoir leurs propres boucliers en plomb pour leurs sites d’intérêt. Ici, nous avons introduit le thorax, l’abdominaux, et le blindage principal ; cependant, d’autres sites tels que le membre ou le flanc peuvent également être envisagés pour le blindage. De plus, alors que les deux sources de rayonnement (césium 137 et rayons X) conviennent à l’ablation de la moelle osseuse et à la greffe réussie, une variabilité dans la reconstitution des populations de cellules lymphoïdes et myéloïdes a été observée entre les sources d’irradiation au césium 137 et aux rayons X30. Ainsi, les chercheurs devraient tenir compte des réponses physiologiques disparates à la source de rayonnement pour les utiliser dans les études.

Intervalles de dosage
Les intervalles de dosage et de dosage peuvent affecter l’efficacité de l’engraftment de cellules de distributeur et des taux de survie. Dans les patients humains, l’irradiation de haut-dose peut causer la pneumonie interstitielle idiopathique, les dommages gastro-intestinaux, et la formation de cataracte. Dans les modèles murins, l’irradiation unique à forte dose suivie d’une greffe de moelle osseuse peut produire des résultats similaires et peut également affecter les taux de survie31. Par conséquent, l’irradiation fractionnée est fortement recommandée pour les études de BMT de souris. De plus, les intervalles de dosage des fractions peuvent avoir un impact sur le taux de survie et le taux de reconstitution de la souris, conduisant à différentes fractions de chimère des cellules donneuses dans les organes hématologiques ainsi que dans d’autres tissus31. Ainsi, les chercheurs devraient être prudents en concevant un programme fractionné de dosage d’irradiation pour des études de BMT.

Dans le contexte du taux de survie et de la reconstitution des cellules immunitaires, notre petite étude a montré qu’un groupe de souris recevant une irradiation corporelle totale avec une dose de rayonnement létale de 11 Gy dans deux fractions de 5,5 Gy séparées par un groupe d’intervalle de 24 h n’avait pas de résultats significativement différents de ceux du groupe qui recevait le même dosage de TBI à un intervalle de 4 h (voir tableau 1). Cependant, avec le thorax-blindage BMT, le groupe d’intervalle de 24 h a semblé montrer moins d’efficacité de chimerism de distributeur de cellules en comparaison du groupe d’intervalle de 4 h. Une explication possible de ce résultat est que l’irradiation avec l’intervalle de 24 h n’a peut-être pas été suffisante pour enlever les cellules immunocompetentes du destinataire parce que les intervalles prolongés ont donné aux souris réceptrices suffisamment de temps pour réparer les cellules endommagées. De plus, le thorax protège les os partiels de la colonne vertébrale qui contiennent également les CSH du receveur. Ainsi, les cellules réceptives immunocompetentes restantes et récupérées ont pu avoir attaqué les cellules donateur-dérivées et ont induit des résultats qui ont montré l’efficacité inférieure d’engraftment.

   

WBC (%) Cellule B (%) Lymphocyte T (%) Mono (%) Ly6Chi mono (%) Ly6Clo mono (%) Neutrophile (%)
TBI-BMT Intervalle de 4h 97,4 ± 1,0 100 ± 0 59.1 ± 18.7 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0
Intervalle de 24h 97,2 ± 2,2 100 ± 0 79,0 ± 8,1 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0
thorax-blindage BMT Intervalle de 4h 56,2 ± 4,0 54.2 ± 6.2 0,5 ± 0,1 66,7 ± 6,1 63,8 ± 6,3 70,8 ± 5,7 82,0 ± 3,8
Intervalle de 24h 34,4 ± 3.1 34,8 ± 3,1 2.9 ± 1.7 45,0 ± 3,2 34.2 ± 3.6 56,2 ± 4,9 56 ± 10,0

Tableau 1 : Efficacité de la greffe de cellules donneuses à l’aide de différents intervalles de dosage. L’analyse cytometric d’écoulement du sang périphérique a été exécutée pendant 1 mois après la transplantation de moelle. Wt CD45.2+ cellules de moelle osseuse de distributeur ont été transplantées dans CD45.1+ souris réceptrices. 5 x 106 cellules de moelle ont été transplantées après deux fractions d’irradiation corporelle totale (2 x 5.5 GY) avec ou sans thorax-blindage séparé par un intervalle de 4 h ou un intervalle de 24 h. (n = 3–4 par groupe).

Soins aux animaux
Plusieurs étapes impliquant des souris sont nécessaires pour le succès de cette expérience. Ainsi, une attention particulière est requise aux points suivants: Premièrement, la livraison de cellules donneuses viables est cruciale pour une greffe réussie. Il faut être correctement entraîné à la collecte de cellules BM intactes et à leur injection dans les souris réceptrices. Les conséquences d’une mauvaise livraison des cellules comprennent l’échec du donneur HSPCs à reconstituer la moelle osseuse réceptrice menant à la mortalité. Deuxièmement, le soin doit être pris après la transplantation pour éviter l’infection, en particulier après thérapie myeloablative. Le contact avec des agents pathogènes peut être fatal, car les souris deviennent transitoirement immunodéficientes après irradiation. Comme indiqué ci-dessus, compléter l’eau potable avec des antibiotiques peut réduire le risque d’infection mortelle. De plus, fournir aux animaux receveurs du gel nutritionnel/hydratation peut minimiser la déshydratation et les carences nutritionnelles qui peuvent survenir après l’irradiation, car l’irradiation peut perturber l’épithélium intestinal conduisant à la diarrhée32. Les cages doivent également être remplacées fréquemment pour réduire le risque de contamination par les bactéries fécales, les animaux doivent être manipulés dans une station de transfert d’animaux appropriée et les souris réceptrices doivent être surveillées attentivement pour détecter toute perte de poids et tout signe de détresse ou de douleur.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health des États-Unis à K. Walsh (HL131006, HL138014 et HL132564), à S. Sano (HL152174), une subvention de l’American Heart Association à M. A. Evans (20POST35210098) et une subvention de la Japan Heart Foundation à H. Ogawa.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5ml microcentrifuge Fisher Scientific 05-408-121 general supply
1.5ml microcentrifuge Fisher Scientific 05-408-129 general supply
1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE EXELINT 26028 general supply
Absolute Ethanol (200 prfof) Fisher chemical 200559 general supply
BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle Becton Dickinson 309626 general supply
BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm) Becton Dickinson 395195 general supply
Cesium-137 Irradiator J. L. Shepherd  Mark IV equipment
DietGel 76A Clear H2O 70-01-5022 general supply
Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish Life Sciences 353003 general supply
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 352098 general supply
Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm Fisher Scientific 22363548 general supply
Graefe Forceps Fine Science Tools 11051-10 general supply
Hardened Fine Scissors Fine Science Tools 14090-09 general supply
Isothesia (Isoflurane) solution Henry Schein 29404 Solution
Ketamine Zoetis 043-304 injection
Kimwipes Delicate Task Wipers Kimtech Science KCC34155 general supply
PBS pH7.4 (1X) Gibco 10010023 Solution
RadDisk – Rodent Irradiator Disk Braintree Scientific IRD-P M general supply
RPMI Medium 1640 (1X) Gibco 11875-093 Medium
Sulfamethoxazole and Trimethoprim TEVA 0703-9526-01 injection
Xylazine Akorn 139-236 injection
X-ray irradiator Rad source RS-2000 equipment

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Immunologie et infection numéro 171 hématopoïèse clonale préconditionnement myéloablatif conditionnement non myéloablatif reconstitution de cellules hématopoïétiques greffe de moelle osseuse transfert adoptif
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