Summary
Vi beskriver en metode til at opnå primære kulturer af kegle fotoreceptorer fra nethinden af kyllingembryoner og dens anvendelse til screening med højt indhold.
Abstract
Human dagtimerne vision bygger på funktionen af kegle fotoreceptorer i midten af nethinden, fovea. Patienter, der lider af den mest udbredte form for arvelig nethinde degeneration, retinitis pigmentosa, mister nattesyn på grund af mutation drevet tab af stang fotoreceptorer, et fænomen efterfulgt af en progressiv tab af funktion og død af kegler, der fører til blindhed. Genetikere har identificeret mange gener med mutationer forårsager denne sygdom, men de første identificerede mutationer spørgsmålstegn ved mekanismerne i sekundære kegle degeneration og hvordan en dominerende mutation i rhodopsin genkodning for det visuelle pigment udelukkende udtrykt i stænger kan udløse kegle degeneration.
Dette resultat af transplantationer i en genetisk model af sygdommen førte til begrebet celleinteraktioner mellem stænger og kegler og af ikke-celle autonom degeneration af kegler i alle genetiske former for retinitis pigmentosa.
Kegler udgør 5% af alle fotoreceptorer hos mennesker og kun 3% i musen, så deres undersøgelse er vanskelig i disse arter, men kegler overtal stænger i fuglearter. Vi har tilpasset 96-brøndsplader til kultur nethindeprækursorer fra nethinden af kyllingembryoner på 29. fase af deres udvikling. I disse primære kulturer udgør kegler 80% af cellerne efter in vitro differentiering. Cellerne degenererer over en periode på en uge i mangel af serum. Her beskriver vi metoderne og dens standardisering.
Dette kegleberigede kultursystem blev brugt til at identificere den epitelbaserede kegle-levedygtighedsfaktor (EdCVF) ved screening med højt indhold af et rottehindepigmenteret epitel normaliseret cDNA-bibliotek. Rekombinant EdCVF forhindrer degeneration af keglerne.
Introduction
Nethinden af hvirveldyr arter er dobbelt, med stang fotoreceptorer for svagt lys vision og kegle fotoreceptorer til dagslys, farve og skarphed vision. Primat synsstyrke er afhængig af en region i centrum af nethinden, kaldet fovea, der er beriget med kegler, men generelt udgør kegler kun 5% af alle fotoreceptorer. Derfor er analysen af keglerne i primat nethinden og især kulturen af kegler teknisk vanskelig. Alle andre pattedyrarter har ingen fovea, og procentdelen af kegler er lav for gnavere, der oftest anvendes i nethindeforskning. Dette er ikke tilfældet for fuglearter, for hvilke kegler dominerer nethinden af disse godt at se fuglearter. Dinosaurer, som har domineret økosystemet, da pattedyrene først dukkede op under evolutionen, er på fuglens fylogenetiske oprindelse1. Som følge af en sådan konkurrence mellem dinosaurer og tidlige pattedyr er pattedyrene for det meste natlige med nethinder domineret af stænger. Først senere under evolutionen blev den daglige vision af nogle pattedyrsarter, blandt hvilke primater tilhører, en evolutionær fordel. Ikke desto mindre forbliver forfædrenes periode som en atavisme af den natlige flaskehals i udviklingen af pattedyrssyn2,3.
Mens de studerede nethindecelledifferentiering, viste Adler og Hatlee, at fotoreceptorer udgør ca. 70% af de retinale differentierede celler i kulturer afledt af kylling på den embryonale dag (ED) 6 eller fase 294. På grund af forekomsten af kegler i kyllingehinden er kulturer af nethindeceller fra ED6 kyllingembryoner blevet udviklet som kegleberigede kulturer5.
Betydningen af kegle-medieret synsstyrke for mennesker er en truism. Mennesker ramt af genetiske eller aldrende sygdomme, der ændrer kegle funktion er stærkt handicappede. Dette har fremmet en meget stor mængde undersøgelser af arvelige nethindegenerationer (IRD) med det formål at finde behandlinger for disse blændende sygdomme6,7. Den første succes, opnået ved hjælp af en rekombinant adeno-associeret vektor (AAV) til behandling af en alvorlig form for IRD Leber medfødt amaurosis (LCA), er et bevis på konceptet for genterapi8. Identifikationen af de gener, hvis mutationer udløser IRD åbner mulighed for at helbrede disse sygdomme ved hjælp af genterapi. Ikke desto mindre er disse sygdomme skyldes mutationer i mere end 200 forskellige gener9. Selv i tilfælde af autosomale recessive former for IRD, når genindførelsen af den normale kopi af morbid genet kunne genoprette visuel funktion, favoriserer de økonomiske omkostninger ved hver enkelt udvikling de mest udbredte til skade for de mindre almindelige og for dem, for hvilke den genetiske oprindelse forbliver ukendt. Denne kendsgerning fik forskere til at tænke på mere generelle behandlinger. Apoptotisk celledød optrådte som en fælles vej, og et terapeutisk mål for disse sygdomme, der skrider frem ved degeneration af fotoreceptorer, herunder for autosomale dominerende former10,11. Succeserne med en sådan tilgang mangler imidlertid. For den mest almindelige form for IRD, retinitis pigmentosa (RP), den fælles vej er det sekundære tab af funktion i sidste ende efterfulgt af degeneration af kegler12,13. Forebyggelse af tab af keglefunktion vil bevare det centrale syn af fovea uafhængigt af de forårsagende mutationer14.
I den tidlige fase af RP udløser tabet af stænger en reduktion i udtrykket af stangafledt keglelevedygtighedsfaktor (RdCVF), kodet af det nucleoredoxin-lignende 1 (NXNL1) gen, som afbryder det metaboliske og redox-signalering mellem stænger og kegler15. Indgift af en rekombinant AAV, der indkapsler de to produkter fra NXNL1-genet, trofisk faktoren RdCVF og thioredoxinenzymet RdCVFL, kunne teoretisk forhindre keglesynstab i alle genetiske former for RP16. Vi har vist, at NXNL1-genproduktet, RdCVFL, udtrykkes i kyllingekeglerberigede kulturer17, og hvor det spiller en beskyttende rolle18. RdCVF og NXNL1 genet blev identificeret ved højt indhold screening af en nethinde cDNA bibliotek ved hjælp af overlevelse af celler fra en kegle-beriget kultur som udlæsning19. Vi screenede hvad der svarer til 210.000 individuelle kloner af biblioteket ved hjælp af 8 parallelle tests for hver klon. Dette repræsenterer et meget stort antal test, der kræver nem adgang til det biologiske materiale, nethinden af kyllingembryoner. Vi fandt ud af, at det var relativt let at få embryonerede kyllingæg på ugentlig basis, fordi de er bredt produceret til agroindustrien til æglæggende høner og kødproducerende kyllinger. Efter omhyggelig standardisering af kegle-berigede kulturer, giver systemet en nem, robust og reproducerbar måde at teste tusindvis af molekyler for deres evne til at bevare kegle levedygtighed. Disse celler kan også bruges til genmanipulationer20 , der gavner studiet af signaltransduktion og biokemiske analyser21,22,23.
Nethindeforskere har udviklet alternative metoder som brugen af keglecellelinjen 661W24,25,26. Ikke desto mindre er identiteten af denne cellelinje stadig kontroversiel27,28. De 661W celler blev klonet fra nethinde tumorer af en transgen mus linje, der udtrykker SV40 store T antigen under kontrol af den menneskelige interphotoreceptor retinol-bindende protein promotor. SV40 store T antigen formidler cellulære transformation og udødeliggørelse. Som følge heraf skal signalvejen identificeret ved hjælp af 661W celler rapporteres ind i konteksten af en transformeret og udødeliggjort cellelinje, der på mange måder adskiller sig fra kegler på stedet. I den henseende består det kegleberigede kultursystem af primære neuroner, keglerne, der er mere fysiologisk relevante.
Selv om det er muligt at opnå en ren kultur af fotoreceptorer ved hjælp af vibratome sektion af musen nethinden, den meget lave procentdel af kegler i den ydre nethinden af gnavere gør denne tilgang uegnet til fremstilling af kegle-beriget kulturer29. Svinehinden indeholder ingen fovea, men har en region kaldet area centralis, der er meget beriget med kegler30. Den høje andel af kegler i nethinden døgn gnavere, som Arvicanthis ansorgei og Psammomys obsesus31,32, tilbyder en mulig løsning, men kræver opdræt af sådanne eksotiske arter. Voksne svineøjne, indsamlet fra lokale slagterier, kan bruges til at producere en blandet kultur af stænger og kegler, der er blevet brugt til at studere fotoreceptor overlevelse33. En elegant løsning er at forrense kegler fra grisen nethinden ved hjælp af panorering med peanut agglutinin (PNA) lectin, som selektivt binder sig til kegler34. Ikke desto mindre er denne metode vanskelig at gennemføre i stor skala på grund af dens kompleksitet.
Human induceret pluripotente stamceller (iPS) tilbyder den mest lovende tilgang til at opnå en kegle fotoreceptor cellepopulation, der kan bruges til nethindetransplantation, men som også kan tilpasses til kegleberiget kultur35,36. Da transskription faktor NRL er påkrævet for stang-fotoreceptorer37, nrl-/- musen har en nethinden domineret af korte bølge kegler (S-kegler). Inaktivering kan bruges til at fremstille S-kegleberiget præparat ved at skelne mellem mennesker og iPS38,39. En anden mulig tilgang er at fremme kegle differentiering ved hjælp af skjoldbruskkirtelhormon signalering40. Mens nye metoder til fremstilling af kegleberigede kulturer fra menneskelig iPS er ved at opstå, giver kyllingembryoner en aktuel dokumenteret metode19.
Den kegleberigede kultur var medvirkende til identifikationen af RdCVF ved at klone19. Dette system blev også brugt med succes til at påvise, at RdCVF stimulerer glukoseoptagelsen og dens metabolisme ved aerob glykolyse22. Desuden blev kegleberiget kultur brugt til at validere den beskyttende rolle, som RdCVFL, det andet produkt af NXNL1-genet 23. For nylig blev dette system brugt til at demonstrere eksistensen af beskyttelse af molekyler udskilles af retinale pigmenterede epitelceller transduceret med OTX241.
Protocol
Protokollen blev godkendt af Komitéen for Etik af Dyreforsøg ved Universitetet Pierre og Marie Curie og det franske ministerium for forskning (Permit Number: APAFIS # 1028 2015070211275177). Dyreforsøgene blev udført under følgende tilladelse: "Certificat d'autorisation d'expérimenter sur les animaux vertébrés A-75-1863. Préfecture de Police de Paris (9. november 2011 - 8. november 2016)".
1. Inkubation af befrugtede æg
- Indsamle ugentlige befrugtede æg (stamme I 657, rød etiket), opnået naturligt, på et industrielt rugeri.
- Bevar de befrugtede æg ved 17 °C (deres biologiske nul) i laboratoriet, efter at de er "lagt" af hønen.
- For hver kultur inkuberes syv befrugtede æg i 24 timer ved 20 °C og derefter 136 timer ved 37 °C med periodisk tilbagevenden af hældningen (en progressiv bevægelse i 2 timer fra den ene side til den modsatte, en 4-timers cyklus) af æggene i et befugtet kammer.
2. Genvinding af kyllingembryoner
- Vask overfladen af de syv æg med desinfektionsmiddel (f.eks Pursept A express).
- For at bryde æggeskallen skal du lave et hul i toppen af skallen med store lige tænger. Skær derefter skallen for at fjerne hatten fra ægget som et blødkogt æg.
- Ekstraktér forsigtigt hvert foster fra æggeskallen med buede pincet, og overfør det derefter til en petriskål, der indeholder steril fosfatbuffer saltvand (PBS), der tidligere er opvarmet til 37 °C. Fjern forsigtigt konvolutten, der omgiver embryonerne (chorion eller chorioallantoic membranen).
- Kontroller udviklingsstadiet for hvert embryon ved visuel sammenligning med Hamburger og Hamilton42.
- Udvalgte to embryoner på udviklingsstadiet29 (figur 1). Vingerne bøjer ved albuerne. Halsbåndet skiller sig synligt ud. Lovforslaget er mere fremtrædende end på 28. etape.
- Enucleate øjnene af disse udvalgte embryoner og overføre dem i CO2-uafhængigemedium (Life teknologier).
ADVARSEL: Det er meget vigtigt, at embryoet er på trin 29 og ikke på trin 28 eller 30 (figur 1); derfor er det nødvendigt at inkubere mindst 7 æg, selvom kun to endelig vil blive brugt. Chorionen er meget tynd, så svært at skelne, men den er meget tæt på embryoet, så den skal fjernes uden at røre embryoet.
3. Dissektion af nethinder
- Halshugge og beskære de udvalgte embryoner med buede pincet.
- Overfør de fire øjne til CO2-uafhængigtmedium. Dette medium indeholder 0,9 mM CaCl2 og 0,65 mM MgCl2.
- Placer øjet med hornhinden med forsiden nedad, synsnerven vender eksperimentatoren. Bor et hul i synsnerven ved hjælp af to lige pincet.
- Indsæt en gren af hver tang mellem nethinden og pigmentepitelet (Figur 2). Træk i hver tang og drej øjet for at løsne epitelet fra nethinden. Fjern hornhinden efterfulgt af linsen og glasagtige.
- Overfør de fire nethinder i en petriskål indeholdende Ringers medium ved pH 7.2.
ADVARSEL: Sørg for, at kun nethinden forbliver, og fjern eventuelle spor af glasagtige og resterende retinale pigmenterede epitel.
4. Forberedelse af nethindecelleophænget
- Skær de fire nethinder i meget små stykker ved hjælp af to lige tænger.
- Vask nethindestykkerne to gange med Ringers medium.
- Efter den anden vask med Ringers medium, lad stykkerne af nethinden falde på bunden af røret og fjern Ringers medium. Retinale stykker behandles i 20 minutter ved 37 °C med en opløsning af trypsin (0,25% w/v).
- Opløsningen spredes efter 10 minutter ved efterfølgende sugning. Afladning ved hjælp af en Pasteur pipette og kontrollere for dissociation af nethinde stykker. Stop reaktionen ved at tilføje kulturmedier suppleret med 10% inaktiveret fosterkalveserum.
- Inkuber celleaffjedringen med 0,05 mg DNase I. Dissociate celleklyngerne og DNA'et ved efterfølgende sugning og udledning ved hjælp af en Pasteur pipette umiddelbart efter tilsætning af DNase.
- Håndvask nethindecelleaffjedringen to gange med kemisk defineret dyrkningsmedium (CDCM): et tilsvarende volumen af Dulbeccos modificerede ørnemedium og M199-medier suppleret med 100 μg/mL linolsyre/BSA 0,86 μM insulin, 0,07 μM transferrin, 2,0 μM progesteron, 0,28 μM prostaglandin, 0,29 μM Na2SeO3, 182 μM putrescine, 3 mM taurin 4,7 μM cytidin 5′-diphosphocholin, 2,7 μM cytidin 5′-diphosphoethanolamin, 0,55 μM hydrocortison, 0,03 μM triiodothyronine, 1 mM natrium pyruvat og 20 μM gentamycin.
5. Nethindecellesåning
- To sorte 96-brønds kulturplader behandles med gennemsigtig bund i 2 timer ved 37 °C med poly-L-lysin ved 32,25 μg/cm2.
- Skyl disse plader to gange med M199 kultur medium. Resuspend cellepillen i 1 mL CDCM.
- Tilsæt til en aliquot på 10 μL af celleophænget trypan blå for at plette de levende celler. Cellernes affjedringsprøve til et hæmocytometer (Malassez' celletællingskammer).
- Under et mikroskop skal du tælle de farvede celler for fire rækker af hæmofometeret (dvs. 40 kvadrater) og derefter beregne det gennemsnitlige cellenummer for en række. Koncentrationen af celler i suspensionen beregnes ved at anvende følgende metode: Antal celler/mL suspension = gennemsnitligt antal celler i en række (10 kvadrater) x 10 det samlede antal kvadrater af hæmocytometer x fortynding med trypanblå x 1.000 (for at udtrykke resultatet som celler/mL).
- Celleaffjedringen bringes i to koncentrationer (5,6 x 104 celler/mL og 1,12 x 105 celler/mL), der svarer til de to platingtætheder (1 x 105 celler/cm2 og 2 x 105 celler/cm2) ved hjælp af CDCM.
- Frø 50 μL af de to celle suspensioner i de to forbehandlede sorte 96-brønds kultur plader. Cellerne i pladerne fordeles med en flerkanalpipette fra højre side af pladen til venstre, idet der homogeniseres mellem hver kolonne, således at cellernes fordeling er homogen.
- Tilføje 50 μL af biblioteket af molekyler (f.eks. konditioneret medie fra et cDNA bibliotek, se nedenfor), der skal screenes ved hjælp af et foruddefineret mønster (Tabel 1).
- Pladerne inkuberes i syv dage ved 37 °C under 5% CO2 uden ændring af mediet.
6. Optælling af levedygtige celler
- Til hver brønd af pladen tilsættes 2,7 μM calcein AM og 0,3 mM ethidium homodimer.
BEMÆRK: Calcein trænger ind i cellerne, der er uigennemtrængelige for store molekyler som ethidium homodimer. I cytoplasma af levende celler, calcein er hydrolyseret af endogene esteraser, bliver fluorescerende ved at udsende på 520 nm når ophidset på 485 nm. Ethidium homodimer binder sig til DNA på døde celler. Ethidium DNA-homodimer binding forårsager rød fluorescens, der skal udsendes på 635 nm efter excitation ved 520 nm. - Inkubat pladerne i 1 time ved stuetemperatur i mangel af lys.
- Fluorescensen aflæses på en automatiseret pladelæser, der består af et omvendt mikroskop udstyret med en kviksølvlampe med to excitationsfiltre ved 485 og 520 nm, to emissionsfiltre ved 520 og 635 nm, et mål (x10), et motoriseret stadium, der styres af en processor og et opladningskoblet enhedskamera (CCD). Denne tælleplatform styres af Metamorph-softwaren19. Det gør det muligt at erhverve fluorescens billeder af levende celler og døde celler samtidig i hver brønd af 96-godt plade, der starter fra brønde A1 mod godt A12, så B12 mod B1, C1 mod C12 og så videre (Tabel I).
- Beregne det gennemsnitlige område A for en enkelt celle ved hjælp af de 18 brønde i de negative kontrolelementer (tabel I).
- Tæl cellerne i hver brønd på pladen og påfør følgende empiriske formel A x 29 / 20,7 for at forhindre, at celledoubletter (gruppering af to celler) tælles. Scor keglernes beskyttende virkning af molekyler som forholdet mellem det gennemsnitlige celletal i de 4 brønde, hvor vi testede molekylet i forhold til det gennemsnitlige celletal i de 18 brønde i den negative kontrol (se tabel 1 og supplerende figur 1).
- Kombiner resultaterne af pladen seedet ved 1 x 105 celler / cm2 med den ene seedet på 2 x 105 celler / cm2 for at evaluere den potentielle beskyttelse (levedygtighedsforhold) af hvert molekyle screenet.
Representative Results
Vi beskriver her, hvordan kegleberiget kultursystem kan bruges til at identificere nye keglebeskyttelsesproteiner. Vi brugte denne protokol til at screene en normaliseret CDNA bibliotek lavet af choroid og nethinde pigmenteret epitel fra 400 øjne 8 uger gamle Long-Evans rotter43.
Dette bibliotek indeholder 6,0 x 106 uafhængige kolonier, der danner enheder (CFU'er) og har en gennemsnitlig klonet skærstørrelse på 2,1 kilobase (kb), med mere end 99% af rekombinante kloner. Puljer på 100 kloner fra dette bibliotek var forbigående forbikogte (0,1 μg plasmid DNA) i COS-1 celler og konditioneret medium (CM) af COS-1 blev høstet efter inkubation i 48 timer i DMEM uden serum. Membraner eller exosomer blev ikke fjernet ved ultracentrifugering. Halvtreds mikroliter af hver CM blev tilføjet til 4 brønde af to 96-brønds plader: en seedet ved 2 x 105 celler / cm2, den anden ved 4 x 105 celler / cm2. CM fra COS-1 celler transfected med den tomme vektor pcDNA3.1 bruges til at konstruere biblioteket blev brugt som negativ kontrol (Tabel 1). I alt 2.112 sæt af 100 kloner svarende til 211.200 individuelle kloner blev evalueret i fire kulturbrønde og for to såningsbetingelser for kegleberigede kulturer. De to betingelser svarer til to lidt forskellige vaccinationstætheder, som gør det muligt at vurdere beskyttelsesaktiviteten mere præcist for i alt 1.689.600 kulturbrønde.
Blandt de 42 puljer af kloner med et forhold på over 2 har puljer 0080 og 0073 levedygtighedsforhold 16 og 14 gange højere efter 7 dages kultur end den negative kontrol, pcDNA3.1(Supplerende figur 1). Denne analyse er afgørende for at identificere interessepuljerne. Hver udvalgt pulje på 100 kloner blev opdelt i 16 sæt af 10 kloner fra deres glycerol lager. Disse delpuljer blev udarbejdet og testet efter samme metode i en anden screeningsrunde (dvs. i alt 3.200 kulturbrønde). Delpuljen 0073-09 gav det stærkeste rentabilitetsforhold (supplerende figur 2A) og blev opdelt til at producere 16 individuelle kloner, der blev testet i en tredje screeningsrunde på kegleberigede kulturer. Klonen 0073-09-37-klon skiller sig klart ud fra de andre med et levedygtighedsforhold svarende til 2,5(supplerende figur 2B). Y-aksen har en anden skala, selv om såningstætheden var den samme end i supplerende figur 2A. Vi har set dette ofte, når assays gentages ugentligt i flere måneder. Efter analyse bekræfter disse resultater, at klon 0073-09-37 har en robust og reproducerbar effekt på kegle overlevelse. Testen blev gentaget uafhængigt (Figur 3A), og indsatsen på 1,8 kb blev sekventeret (Figur 3B).
En bioinformatikanalyse viste, at klonen 0073-09-37, at vi kaldte epitel-afledte kegle levedygtighed faktor (EdCVF), indeholder tre åbne læserammer (ORFs), den ene den mest opstrøms (ORF1) koder for 84 rester af C-terminal del af rotteprotein zink finger protein-180 (ZFP180, NP_653358) af 727 aminosyrer44. De to andre ORF'er (ORF2 og ORF3) er langt mindre godt bevaret hos mus og fraværende hos andre pattedyr. Når ORF1 testes uafhængigt, har den kun en beskyttende virkning på keglerne(supplerende figur 3). ORF1 blev fremstillet som et glutathion S-transferase (GST) fusionsprotein (Figur 4A). EdCVF-proteinet blev renset og GST-mærket fjernet (Figur 4B). EdCVF er i stand til at forhindre kegledegeneration i kegleberiget kultursystem(figur 4C).
Figur 1: Kyllingembryoner i fase28 th,29th og 30th af udviklingen. Pile W: vinge, C: krave og B: bill. Skalalinje 1 cm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:Dissektion af kyllingembryoners nethinde Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Epitelbaseret keglegabilitetsfaktor (EdCVF), klon 0073-09-37. A. Det er ikke så lidt. Øget levedygtighed på kegleberiget kultur. B. Sekvensen af cDNA klon 0073-09-37. Den understregede sekvens GAATTC er det EcoRI-begrænsningssted, der bruges til at konstruere biblioteket. De to codons GTG med fed er ualmindelige oversættelse indledning steder for EdCVF stammer fra vektoren. Statistisk analyse af Student's test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:Rekombinant EdCVF-aktivitet. B. Det rensede rekombinant EdCVF-protein. C. Trofisk aktivitet af GST-EdCVF på kegle i kultur. Statistisk analyse ved hjælp af Tukeys test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: Forholdet mellem det gennemsnitlige celletal for en cDNA-pulje og den negative kontrol, det konditionerede medium for COS-1-celler, der transfected med den tomme vektor PCDNA3.1 under første screeningsrunde. Klik her for at hente denne fil.
Supplerende Figur 2: Antal celler i live. A. Det er ikke så lidt. Den anden runde af screening med sub-puljer af 0073 pool. B. Den tredje screeningsrunde med isolerede kloner. CN: det konditionerede medium af COS-1 celler transfected med den tomme vektor, pcDNA3.1. Klik her for at hente denne fil.
Supplerende figur3: Trofisk aktivitet af de tre åbne læserammer for den isolerede klon 0073-09-37. Statistisk analyse ved hjælp af Dunnetts test. Klik her for at hente denne fil.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| en | 1 | 1 | 1 | 1 | 2 | Nc | 2 | 2 | 2 | 3 | 3 | Nc |
| b | Nc | 3 | 3 | 4 | 4 | 4 | Nc | 4 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| C | 6 | Nc | 6 | 6 | 6 | 7 | 7 | Nc | 7 | 7 | 8 | 8 |
| d | 8 | 8 | Nc | 9 | 9 | 9 | 9 | 10 | Nc | 10 | 10 | 10 |
| ecstasy | 11 | 11 | 11 | Nc | 11 | 12 | 12 | 12 | 12 | Nc | 13 | 13 |
| F | 13 | 13 | 14 | 14 | Nc | 14 | 14 | 15 | 15 | 15 | Nc | 15 |
| g | 16 | 16 | 16 | 16 | 17 | Nc | 17 | 17 | 17 | 18 | 18 | Nc |
| H | 18 | 18 | 19 | 19 | 19 | 19 | Nc | 20 | 20 | 20 | Nc | 20 |
| NC negative kontroller | ||||||||||||
| 1-20 positioner af puljer testet i firedoblet | ||||||||||||
Tabel 1: Plan over 96-brøndspladen til screening med højt indhold
Discussion
Blandt de mange parametre, der kan begrænse produktionen af en kegleberiget kultur fra kyllingembryoner, er det første kritiske skridt at nøjagtigt identificere udviklingsstadiet for embryonerne i de udklækkede æg. Det er blevet observeret, at dyrkning af celler fra nethinden af embryoner på ED8(34 th fase) producerer kun 35% fotoreceptorer, med de resterende 65% er lavet af andre neuroner4. Uanset hvilken logistik der anvendes til at få de udklækkede æg, er det nødvendigt at finjustere temperaturen og inkubationstiden og omhyggeligt undersøge embryonerne sammenlignet med referencebillederne af alle udviklingsstadier42,45.
Oprindeligt blev kegleberiget kultursystem udviklet ved hjælp af White Leghorn stamme4. Den hvide farve af æggene af denne stamme er ikke særlig værdsat i Frankrig, så vi brugte en stamme af kylling, der producerer brune æg. Vi udnyttede I 657-stammen, som foretages ved at krydse I 66 roosters med JA57 høns5. Vi var i stand til at reproducere de oprindelige kulturers egenskaber. Dette viser, at kyllingens genetiske baggrund ikke er kritisk for at opnå kegleberigede kulturer.
Vi har ikke testet effekten af individuel fjernelse af kosttilskud i kulturmediet, men har observeret, at insulin spiller en kritisk rolle i overensstemmelse med insulinets virkning på overlevelsen af kegler i rd1-musen, en model af autosomal recessiv RP46. Triiodothyronine (T3) kan også deltage i differentieringen af retinale prækursorceller af kyllingembryoet i kegler i henhold til skjoldbruskkirtelhormonreceptorens rolle i nethindecelle skæbne under udvikling40. Derfor kan det kegleberigede dyrkningssystem ikke bruges til at identificere insulin ved at udtrykke kloning46.
Kegle-beriget kultur system er afhængig af kulturen i primære neuroner og er langt mere passende tha metoder afhængige af brugen af udødeliggjorte celler som celle linje 661W24,25,26.
Den her beskrevne metode kan ændres ved at udføre en tidligere elektroporation med plasmid DNA20. Før nethindecelleaffjedringen forberedes, anbringes hele nethinden i kammeret på en specialfremstillet elektroporator med 120 μL på 0,5 μg/μL plasmid-DNA i 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA. Fem impulser på 15 V for 50 ms hver påføres adskilt af 950 ms interval22. Forsøg på at levere forstyrrende RNA (RNAi) ved hjælp af replikation kompetente aviær splejsning (RCAS) retrovirus i kegle-beriget kulturer mislykkedes47. Dette skyldes helt sikkert, at i mangel af serum og i kulturer med lav densitet er nethindeprækursorceller ikke repliktive, en forudsætning for spredning af retrovirus.
Vi udviklede kegle-beriget kultur system til at identificere trofiske faktorer, der fremmer kegle overlevelse ved hjælp af udtryk kloning19. For at gøre det muligt udførte vi et første trin i screening med højt indhold ved hjælp af konditioneret medium fra puljer på 100 kloner. Selv om cDA'erne fra biblioteket udtrykkes under kontrol af en stærk CMV-promotor efter transinfektion af COS-1-celler, giver det ikke garanti for, at alle proteiner, der er kodet af individuelle cDA'er, når en koncentration, der er tilstrækkelig til at blive scoret positiv af rentabilitetsanalysen. Dette er en stor begrænsning. I den forstand er enhver screening ikke rigtig udtømmende. Hertil kommer, at selv om membranholdige proteiner ikke blev fjernet fra det betingede medium, er analysens konfiguration ugunstig for identifikationen af ikke-diffusive faktorer. Et alternativ ville være at screene individuelle kloner efter at have opnået rækkefølgen af cDA'erne for at undgå dobbeltarbejde i assaying mange gange det samme kandidatprotein. Dette blev indledt ved sekventering af nethinde cDNA biblioteker vi brugte43. Selv om denne tilgang er rationel, har den også sine begrænsninger. Den bioinformatiske analyse af cDNA-sekvenserne vil u uimodståeligt ud over reduktionen af redundansen pålægge prioriteringen af screening af visse kloner baseret på viden. Dette vil ikke være skadeligt, hvis endelig ville hele biblioteket blive screenet, selvom den tid, der kræves for at gøre det, vil blive væsentligt forlænget. Men uvægerligt vil sekvensens identitet påvirke vores måde at se på resultaterne på. Dette vil ikke være neutralt, da fortolkningen af sekvensen naturligvis vil være i konkurrence med forsøgsdataene.
Identifikationen af EdCVF viser også, at screening med højt indhold indebærer tekniske begrænsninger. Fra første screeningsrunde identificerede vi to puljer med høj aktivitet(supplerende figur 1). Puljen 0073 førte til en vellykket identifikation af EdCVF, mens pool 0080 ikke førte til en sådan konstatering. Vi har ikke løst det problem, der kan opstå som følge af tabet af den aktive klon under forberedelsen af underpuljer. Alternativt er det ikke udelukket, selv om det ikke er statistisk gunstigt, at der blandt CDA'erne for pulje 0080 handlede to proteiner synergistisk, og deres aktivitet kunne ikke observeres som individuelle kloner.
Identifikationen af molekyler, der beskytter kegler ved at screene små molekyler, er en fremtidig anvendelse af det kegleberigede kultursystem. Sådanne molekyler vil være uvurderlige til behandling af nethindepatologier, for hvilke genterapi ikke er den mest hensigtsmæssige tilgang som aldersrelateret makuladegeneration.
Disclosures
TL, J-AS og VF har et patent på brugen af EdCVF til behandling af nethinde degenerationer [WO2009071659 (A1). 12. juni 2007].
Acknowledgments
Forfatterne takker Jacques Bellalou, Lorelei Fournier, Emmanuelle Clérin, Frédéric Blond og entreprise agricole à responsabilité limitée (EARL Morizeau Dangers, Frankrig) for deres uvurderlige hjælp. Dette arbejde blev støttet af Inserm, Sorbonne University, Agence Nationale pour la Recherche (ANR, Labex Lifesenses), Foundation Fighting Blindness (USA) og IHU FOReSIGHT [ANR-18-IAHU-0001] støttet af franske statslige midler, der forvaltes af ANR inden for Investissements d'Avenir-programmet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 black plates (Clear Button with lid Tissue culture treated) | Corning | 3603 | |
| Calcein AM | Thermo-Fisher scientific | C1430 | |
| CCD Camera | Photometrics | CoolSnap FX HQ | |
| CDPC (Cytidine 5′-diphosphocholine sodium salt dihydrate) | Sigma-Aldrich | C0256 | |
| CO2 Independant | Thermo-Fisher scientific | 18045-054 | |
| Curved forceps | Dutscher | 005093 | |
| DMEM Media | Thermo-Fisher scientific | 41966-029 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | D4263 | |
| Eggs incubator | FarmLine | M08 01 3100 | |
| Ethidium Homodimer | Thermo-Fisher scientific | E1169 | |
| Fœtal bovine serum | Thermo-Fisher scientific | 10270-098 | |
| Gentamycin | Thermo-Fisher scientific | 15710-049 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0880 | |
| ITS (insulin Transferine selenium) | Sigma-Aldrich | I1884 | |
| large straight pliers | Dutscher | 005074 | |
| Linoleic acid | Sigma-Aldrich | L8384 | |
| M199 medium | Thermo-Fisher scientific | 31150-022 | |
| Metamorph software | Metamorph | ||
| Microscope | NIKON | Eclipse TE2000 | |
| Motorized stage | Martzauzer | Mutlicontrol 2000 | |
| Optical filter switch | Shutter Instrument company | Lambda 10-2 | |
| PBS 1X | Thermo-Fisher scientific | 14190-086 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P7556 | |
| Pursept A express | Fisher scientific | 11814110 | |
| Putriscine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| straight forceps | Dutscher | 005092 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T6397 | |
| Trypan blue | Thermo-Fisher scientific | 15250-061 | |
| Trypsine 0.25 % | Thermo-Fisher scientific | 25200-056 |
References
- Brownstein, C. D. The Implicit Mind. , Oxford University Press. (2019).
- Heesy, C. P., Hall, M. I. The nocturnal bottleneck and the evolution of mammalian vision. Brain, Behavior and Evolution. 75 (3), 195-203 (2010).
- Borges, R., et al. Adaptive genomic evolution of opsins reveals that early mammals flourished in nocturnal environments. BMC Genomics. 19 (1), 121 (2018).
- Adler, R., Hatlee, M. Plasticity and differentiation of embryonic retinal cells after terminal mitosis. Science. 243 (4889), 391-393 (1989).
- Fintz, A. C., et al. Partial characterization of retina-derived cone neuroprotection in two culture models of photoreceptor degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (2), 818-825 (2003).
- Roska, B., Sahel, J. A.
- Duncan, J. L., et al. Inherited Retinal Degenerations: Current Landscape and Knowledge Gaps. Translational Vision Science & Technology. 7 (4), 6 (2018).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
- RetNet. Retinal Information Network. , (2020).
- Doonan, F., Donovan, M., Cotter, T. G. Activation of multiple pathways during photoreceptor apoptosis in the rd mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (10), 3530-3538 (2005).
- Comitato, A., et al. Dominant and recessive mutations in rhodopsin activate different cell death pathways. Human Molecular Genetics. 25 (13), 2801-2812 (2016).
- Cronin, T., Leveillard, T., Sahel, J. A. Retinal degenerations: from cell signaling to cell therapy; pre-clinical and clinical issues. Current Gene Therapy. 7 (2), 121-129 (2007).
- Baumgartner, W. A., Baumgartner, A. M. Accounting for disagreements on average cone loss rates in retinitis pigmentosa with a new kinetic model: Its relevance for clinical trials. Medical Hypotheses. 89, 107-114 (2016).
- Leveillard, T., Sahel, J. A. Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling. Science Translational Medicine. 2 (26), (2010).
- Leveillard, T., Sahel, J. A. Metabolic and redox signaling in the retina. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (20), 3649-3665 (2017).
- Clerin, E., Marussig, M., Sahel, J. A., Leveillard, T. Metabolic and Redox Signaling of the Nucleoredoxin-Like-1 Gene for the Treatment of Genetic Retinal Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), (2020).
- Fridlich, R., et al. The Thioredoxin-like Protein Rod-derived Cone Viability Factor (RdCVFL) Interacts with TAU and Inhibits Its Phosphorylation in the Retina. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (6), 1206-1218 (2009).
- Mei, X., et al. The Thioredoxin Encoded by the Rod-Derived Cone Viability Factor Gene Protects Cone Photoreceptors Against Oxidative Stress. Antioxidants, Redox Signaling. 24 (16), 909-923 (2016).
- Leveillard, T., et al. Identification and characterization of rod-derived cone viability factor. Nature Genetics. 36 (7), 755-759 (2004).
- Vergara, M. N., Gutierrez, C., Canto-Soler, M. V. Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach. Journal of Visualized Experiments. (105), e52002 (2015).
- Fridlich, R., et al. The thioredoxin-like protein rod-derived cone viability factor (RdCVFL) interacts with TAU and inhibits its phosphorylation in the retina. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (6), 1206-1218 (2009).
- Ait-Ali, N., et al. Rod-derived cone viability factor promotes cone survival by stimulating aerobic glycolysis. Cell. 161 (4), 817-832 (2015).
- Mei, X., et al. The Thioredoxin Encoded by the Rod-Derived Cone Viability Factor Gene Protects Cone Photoreceptors Against Oxidative Stress. Antioxidants & Redox Signaling. 24 (16), 909-923 (2016).
- Tan, E., et al. Expression of cone-photoreceptor-specific antigens in a cell line derived from retinal tumors in transgenic mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (3), 764-768 (2004).
- Wang, X. W., Tan, B. Z., Sun, M., Ho, B., Ding, J. L. Thioredoxin-like 6 protects retinal cell line from photooxidative damage by upregulating NF-kappaB activity. Free Radical Biology and Medicine. 45 (3), 336-344 (2008).
- Perron, N. R., Beeson, C., Rohrer, B. Early alterations in mitochondrial reserve capacity; a means to predict subsequent photoreceptor cell death. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 45 (1-2), 101-109 (2013).
- Krishnamoorthy, R. R., Clark, A. F., Daudt, D., Vishwanatha, J. K., Yorio, T. A forensic path to RGC-5 cell line identification: lessons learned. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5712-5719 (2013).
- Al-Ubaidi, M. R. RGC-5: are they really 661W? The saga continues. Experimental Eye Research. 119, 115 (2014).
- Clerin, E., et al. Vibratome sectioning mouse retina to prepare photoreceptor cultures. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Hendrickson, A., Hicks, D. Distribution and density of medium- and short-wavelength selective cones in the domestic pig retina. Experimental Eye Research. 74 (4), 435-444 (2002).
- Bobu, C., Craft, C. M., Masson-Pevet, M., Hicks, D. Photoreceptor organization and rhythmic phagocytosis in the nile rat Arvicanthis ansorgei: a novel diurnal rodent model for the study of cone pathophysiology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 3109-3118 (2006).
- Saidi, T., Mbarek, S., Chaouacha-Chekir, R. B., Hicks, D. Diurnal rodents as animal models of human central vision: characterisation of the retina of the sand rat Psammomys obsesus. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 249 (7), 1029-1037 (2011).
- Traverso, V., Kinkl, N., Grimm, L., Sahel, J., Hicks, D. Basic fibroblast and epidermal growth factors stimulate survival in adult porcine photoreceptor cell cultures. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (10), 4550-4558 (2003).
- Balse, E., et al. Purification of mammalian cone photoreceptors by lectin panning and the enhancement of their survival in glia-conditioned medium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (1), 367-374 (2005).
- Gagliardi, G., et al. Characterization and Transplantation of CD73-Positive Photoreceptors Isolated from Human iPSC-Derived Retinal Organoids. Stem Cell Reports. 11 (3), 665-680 (2018).
- Gagliardi, G., Ben M'Barek, K., Goureau, O. Photoreceptor cell replacement in macular degeneration and retinitis pigmentosa: A pluripotent stem cell-based approach. Progress in Retinal and Eye Research. 71, 1-25 (2019).
- Mears, A. J., et al. Nrl is required for rod photoreceptor development. Nature Genetics. 29 (4), 447-452 (2001).
- Swaroop, A., Kim, D., Forrest, D. Transcriptional regulation of photoreceptor development and homeostasis in the mammalian retina. Nature Reviews Neuroscience. 11 (8), 563-576 (2010).
- Kallman, A., et al. Investigating cone photoreceptor development using patient-derived NRL null retinal organoids. Nature Communications. 3 (1), 82 (2020).
- Eldred, K. C., et al. Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids. Science. 362 (6411), (2018).
- Kole, C., et al. Otx2-Genetically Modified Retinal Pigment Epithelial Cells Rescue Photoreceptors after Transplantation. Molecular Therapy. 26 (1), 219-237 (2018).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Kole, C., et al. Identification of an Alternative Splicing Product of the Otx2 Gene Expressed in the Neural Retina and Retinal Pigmented Epithelial Cells. PLoS One. 11 (3), 0150758 (2016).
- Shannon, M., Hamilton, A. T., Gordon, L., Branscomb, E., Stubbs, L. Differential expansion of zinc-finger transcription factor loci in homologous human and mouse gene clusters. Genome Research. 13 (6), 1097-1110 (2003).
- Stern, C. D., Holland, P. W. Essential developmental biology: a practical approach. , (1993).
- Punzo, C., Kornacker, K., Cepko, C. L. Stimulation of the insulin/mTOR pathway delays cone death in a mouse model of retinitis pigmentosa. Nature Neuroscience. 12 (1), 44-52 (2009).
- Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Developmental Biology. 6, 2 (2006).
