Summary
Nous décrivons une méthode pour obtenir des cultures primaires des photorécepteurs de cône de la rétine des embryons de poulet et son utilisation pour le criblage de contenu élevé.
Abstract
La vision diurne humaine repose sur la fonction des photorécepteurs cononiques au centre de la rétine, la fovéa. Les patients souffrant de la forme la plus répandue de dégénérescence rétinienne héréditaire, la rétinite pigmentaire, perdent la vision nocturne en raison de la perte de photorécepteurs à tiges induite par mutation, un phénomène suivi d’une perte progressive de fonction et de la mort des cônes conduisant à la cécité. Les généticiens ont identifié de nombreux gènes avec des mutations causant cette maladie, mais les premières mutations identifiées ont remis en question les mécanismes de la dégénérescence du cône secondaire et comment une mutation dominante dans le gène de la rhodopsine codant pour le pigment visuel exprimé exclusivement en bâtonnets peut déclencher la dégénérescence du cône.
Ce résultat des transplantations dans un modèle génétique de la maladie a conduit au concept d’interactions cellulaires entre les tiges et les cônes et de dégénérescence autonome non cellulaire des cônes dans toutes les formes génétiques de la rétinite pigmentaire.
Les cônes représentent 5% de tous les photorécepteurs chez l’homme et seulement 3% chez la souris, de sorte que leur étude est difficile chez ces espèces, mais les cônes sont plus nombreux que les tiges chez les espèces d’oiseaux. Nous avons adapté des plaques de 96 puits pour la culture de précurseurs rétiniennes de la rétine d’embryons de poulet au stade 29 de leur développement. Dans ces cultures primaires, les cônes représentent 80% des cellules après différenciation in vitro. Les cellules dégénèrent sur une période d’une semaine en l’absence de sérum. Ici, nous décrivons les méthodes et leur normalisation.
Ce système cône-enrichi de culture a été employé pour identifier le facteur épithélium-dérivé de viabilité de cône (EdCVF) par le criblage de contenu élevé d’une bibliothèque normalisée d’ADNc pigmentée pigmentée rétinienne de rat. L’EdCVF recombinant empêche la dégénérescence des cônes.
Introduction
La rétine des espèces de vertébrés est double, avec des photorécepteurs de tige pour la vision de la lumière tamisée et des photorécepteurs de cône pour la lumière du jour, la couleur et la vision de l’acuité. L’acuité visuelle des primates repose sur une région au centre de la rétine, appelée fovéa, qui est enrichie en cônes, mais dans l’ensemble, les cônes ne représentent que 5% de tous les photorécepteurs. Par conséquent, l’analyse des cônes dans la rétine des primates et en particulier la culture des cônes sont techniquement difficiles. Toutes les autres espèces de mammifères n’ont pas de fovéa et le pourcentage de cônes est faible pour les rongeurs qui sont le plus couramment utilisés dans la recherche sur la rétine. Ce n’est pas le cas pour les espèces aviaires, pour lesquelles les cônes dominent la rétine de ces espèces d’oiseaux bien voyantes. Les dinosaures, qui ont dominé l’écosystème lorsque les mammifères sont apparus pour la première fois au cours de l’évolution, sont à l’origine phylogénétique des oiseaux1. En conséquence d’une telle compétition entre les dinosaures et les premiers mammifères, les mammifères sont pour la plupart nocturnes avec des rétines dominées par des bâtonnets. Ce n’est que plus tard au cours de l’évolution que la vision diurne de certaines espèces de mammifères, parmi lesquelles appartiennent les primates, est devenue un avantage évolutif. Néanmoins, la période ancestrale reste comme un atavisme du goulot d’étranglement nocturne dans l’évolution de la vision des mammifères2,3.
En étudiant la différenciation cellulaire rétinienne, Adler et Hatlee ont montré que les photorécepteurs représentent environ 70% des cellules différenciées rétiniennes dans les cultures dérivées du poulet au jour embryonnaire (DE) 6 ou au stade 294. En raison de la prévalence des cônes dans la rétine du poulet, des cultures de cellules rétiniennes à partir d’embryons de poulet ED6 ont été développées en tant que cultures enrichies encônes 5.
L’importance de l’acuité visuelle cône-négociée pour l’homme est un truisme. Les personnes touchées par des maladies génétiques ou vieillissantes qui modifient la fonction du cône sont grandement handicapées. Cela a favorisé un très grand nombre d’études sur les dégénérescences rétiniennes héréditaires (IRD) dans le but de trouver des traitements pour ces maladies aveuglantes6,7. Le premier succès, obtenu à l’aide d’un vecteur adéno-associé recombinant (VAA) pour le traitement d’une forme sévère d’amaurose congénitale (ACV) IRD Leber, est une preuve de concept pour la thérapiegénique 8. L’identification des gènes dont les mutations déclenchent l’IRD ouvre la possibilité de guérir ces maladies par thérapie génique. Néanmoins, ces maladies résultent de mutations dans plus de 200 gènes distincts9. Même dans le cas des formes autosomiques récessives d’IRD, lorsque la réintroduction de la copie normale du gène morbide pourrait restaurer la fonction visuelle, le coût économique de chaque développement individuel favorise les plus répandus au détriment des moins communs et de ceux dont l’origine génétique reste inconnue. Ce fait a amené les chercheurs à réfléchir à des thérapies plus générales. La mort cellulaire apoptotique est apparue comme une voie commune, et une cible thérapeutique de ces maladies qui progressent par la dégénérescence des photorécepteurs, notamment pour les formes autosomiques dominantes10,11. Cependant, les succès d’une telle approche sont absents. Pour la forme la plus courante d’IRD, la rétinite pigmentaire (RP), la voie commune est la perte secondaire de fonction finalement suivie de la dégénérescence des cônes12,13. La prévention de la perte de la fonction conique préservera la vision centrale de la fovéa indépendamment des mutations causales14.
Au stade précoce de la RP, la perte de tiges déclenche une réduction de l’expression du facteur de viabilité du cône dérivé de la tige (RdCVF), codé par le gène nucléoréo-comme 1(NXNL1),qui interrompt la signalisation métabolique et redox entre les tiges et les cônes15. L’administration d’un AAV recombinant codant pour les deux produits du gène NXNL1, le facteur trophique RdCVF et l’enzyme thiorédoxine RdCVFL, pourrait théoriquement prévenir la perte de vision conique sous toutes les formes génétiques de RP16. Nous avons montré que le produit du gène NXNL1, RdCVFL, s’exprime dans les cultures enrichies en cônes de poulet17 et où il joue un rôle protecteur18. RdCVF et le gène NXNL1 ont été identifiés par le criblage à haute teneur d’une bibliothèque rétinienne d’ADNc utilisant la survie des cellules d’une culture cône-enrichie comme lecture19. Nous avons examiné l’équivalent de 210 000 clones individuels de la bibliothèque à l’aide de 8 tests parallèles pour chaque clone. Cela représente un très grand nombre de tests nécessitant un accès facile au matériel biologique, aux rétines des embryons de poulet. Nous avons constaté qu’il était relativement facile d’obtenir des œufs de poule embryonnaires sur une base hebdomadaire parce qu’ils sont largement produits pour l’agro-industrie pour les poules pondeuses et les poulets producteurs de viande. Après une normalisation minutieuse des cultures enrichies en cônes, le système fournit un moyen facile, robuste et reproductible de tester des milliers de molécules pour leur capacité à préserver la viabilité du cône. Ces cellules se présentent également à des manipulations génétiques20 qui bénéficient à l’étude de la transduction du signal et aux analyses biochimiques21,22,23.
Les chercheurs rétiniennes ont développé des méthodes alternatives comme l’utilisation de la lignée cellulaire cononique 661W24,25,26. Néanmoins, l’identité de cette lignée cellulaire reste controversée27,28. Les cellules 661W ont été clonées des tumeurs rétiniennes d’une ligne transgénique de souris qui exprime le grand antigène SV40 de T sous le contrôle de l’promoteur rétinol-contraignant humain de protéine d’interphotoreceptor. Sv40 grand antigène de T négocie la transformation cellulaire et l’immortalisation. En conséquence, la voie de signalisation identifiée à l’aide de cellules 661W doit être rapportée dans le contexte d’une lignée cellulaire transformée et immortalisée qui est distincte à bien des égards des cônes in situ. À cet égard, le système de culture enrichi en cônes est composé de neurones primaires, les cônes qui sont plus physiologiquement pertinents.
Bien qu’il soit possible d’obtenir une culture pure de photorécepteurs en utilisant le sectionnement vibratome de la rétine de souris, le très faible pourcentage de cônes dans la rétine externe des rongeurs rend cette approche inadaptée à la production de cultures enrichies encônes 29. La rétine porcine ne contient pas de fovéa mais a une région appelée zone centralis qui est très enrichie en cônes30. La forte proportion de cônes dans les rongeurs diurnes de la rétine, comme Arvicanthis ansorgei et Psammomys obsesus31,32, offre une solution possible mais nécessite la reproduction de telles espèces exotiques. Les yeux de porc adultes, recueillis dans les abattoirs locaux, peuvent être utilisés pour produire une culture mixte de tiges et de cônes qui ont été utilisés pour étudier la survie des photorécepteurs33. Une solution élégante consiste à pré-purifier les cônes de la rétine porcine en utilisant un panoramique avec de la lectine d’agglutinine d’arachide (PNA), qui se lie sélectivement aux cônes34. Néanmoins, cette méthode est difficile à mettre en œuvre à grande échelle en raison de sa complexité.
Les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPS) offrent l’approche la plus prometteuse pour obtenir une population de cellules photoréceptrices coniques qui peut être utilisée pour la transplantation rétinienne mais qui peut également être adaptée à la culture enrichie en cône35,36. Étant donné que le facteur de transcription NRL est requis pour les photorécepteurs à tige37,la souris Nrl-/- possède une rétine dominée par des cônes à ondes courtes (cônes S). L’inactivation pourrait être utilisée pour produire une préparation enrichie en côneS en S par différenciation de l’homme par rapport à iPS38,39. Une autre approche possible consiste à promouvoir la différenciation du cône à l’aide de la signalisation de l’hormone thyroïdienne40. Alors que de nouvelles méthodes de production de cultures enrichies en cônes à partir d’iPS humains émergent, les embryons de poulet fournissent une méthode éprouvée actuelle19.
La culture enrichie en cône a joué un rôle déterminant dans l’identification du RdCVF par clonage d’expression19. Ce système a également été utilisé avec succès pour démontrer que le RdCVF stimule l’absorption du glucose et son métabolisme par glycolyse aérobie22. En outre, une culture enrichie en cônes a été utilisée pour valider le rôle protecteur de RdCVFL, le deuxième produit du gène NXNL1 23. Plus récemment, ce système a été utilisé pour démontrer l’existence de molécules protectrices sécrétées par des cellules épithéliales pigmentées rétiniennes transduites avec OTX241.
Protocol
Le protocole a été approuvé par le Comité d’éthique de l’expérimentation animale de l’Université Pierre et Marie Curie et le ministère de la recherche Français (numéro de permis : APAFIS#1028 2015070211275177). Les expérimentations animales ont été réalisées sous l’autorisation suivante : « Certificat d’autorisation d’expérimenter sur les animaux vertébrés A-75-1863. Préfecture de Police de Paris (9 novembre 2011-8 novembre 2016) ».
1. Incubation des œufs fécondés
- Prélever chaque semaine les œufs fécondés (souche I 657, étiquette rouge), obtenus naturellement, dans une écloserie industrielle.
- Maintenir les œufs fécondés à 17 °C (leur zéro biologique) en laboratoire après qu’ils ont été « pondus » par la poule.
- Pour chaque culture, incuber sept œufs fécondés pendant 24 heures à 20 °C, puis 136 heures à 37 °C avec réversion intermittente de l’inclinaison (un mouvement progressif pendant 2 heures d’un côté à son opposé, un cycle de 4 heures) des œufs dans une chambre humidifiée.
2. Récupération des embryons de poulet
- Lavez la surface des sept œufs avec un désinfectant (p. ex. Pursept A express).
- Pour casser la coquille d’œuf, faites un trou dans le haut de la coquille avec de grandes pinces droites. Ensuite, coupez la coquille pour enlever le chapeau de l’œuf comme un œuf à la coque.
- Extraire délicatement chaque embryon de la coquille d’œuf avec une pince incurvée, puis le transférer dans une boîte de Petri contenant une solution saline tampon phosphate stérile (PBS) préalablement chauffée à 37 °C. Retirez doucement l’enveloppe qui entoure les embryons (le chorion ou la membrane chorioallantoïque).
- Vérifier le stade de développement de chaque embryon par comparaison visuelle avec Hamburger et Hamilton42.
- Sélectionnez deux embryons au 29e stade de développement (Figure 1). Les ailes se plient aux coudes. Le collier se démarque visiblement. Le projet de loi est plus important qu’à la28 e étape.
- Énucléer les yeux de ces embryons sélectionnés et les transférer dans un milieu indépendant du CO2(Life technologies).
ATTENTION : Il est très important que l’embryon soit au stade 29, et non au stade 28 ou 30(Figure 1); c’est pourquoi il est nécessaire d’incuber au moins 7 œufs, même si seulement deux seront finalement utilisés. Le chorion est très mince, si difficile à distinguer, mais il est très proche de l’embryon, il doit donc être retiré sans toucher l’embryon.
3. Dissection des rétines
- Décapiter et énucléer les embryons sélectionnés avec une pince incurvée.
- Transférer les quatre yeux dans un milieu indépendant du CO2. Ce milieu contient 0,9 mM deCaCl2 et 0,65 mM deMgCl2.
- Positionnez l’œil avec la cornée face vers le bas, le nerf optique face à l’expérimentateur. Percez un trou dans le nerf optique à l’aide de deux pinces droites.
- Insérer une branche de chaque pince entre la rétine et l’épithélium pigmentaire (Figure 2). Tirez sur chaque pince et faites pivoter l’œil pour détacher l’épithélium de la rétine. Retirer la cornée suivie du cristallin et du vitré.
- Transférer les quatre rétines dans une boîte de Petri contenant le milieu de Ringer à un pH de 7,2.
ATTENTION: Assurez-vous qu’il ne reste que la rétine et éliminez toute trace d’épithélium pigmenté de la rétine vitreuse et restante.
4. Préparation de la suspension des cellules rétiniennes
- Coupez les quatre rétines en très petits morceaux à l’aide de deux pinces droites.
- Lavez les morceaux rétiniennes deux fois avec le milieu de Ringer.
- Après le deuxième lavage avec le milieu de Ringer, laissez les morceaux de rétine tomber sur le fond du tube et retirez le milieu de la sonnerie. Traiter les morceaux rétiniennes pendant 20 minutes à 37 °C avec une solution de trypsine (0,25 % p/v).
- Disperser la solution après 10 minutes par aspiration successive. Décharger à l’aide d’une pipette Pasteur et vérifier la dissociation des morceaux rétiniennes. Arrêtez la réaction en ajoutant des milieux de culture complétés par 10% de sérum de veau fœtal inactivé.
- Incuber la suspension cellulaire avec 0,05 mg de DNase I. Dissocier les amas cellulaires et l’ADN par aspiration et décharge successives à l’aide d’une pipette pasteur immédiatement après l’ajout de la DNase.
- Laver la suspension cellulaire rétinienne deux fois avec un milieu de culture chimique défini (CPCM) : un volume égal de milieu Eagle modifié de Dulbecco et de milieu M199 complété par de l’acide linoléique 100 μg/mL/BSA, de l’insuline 0,86 μM, de la transferrine 0,07 μM, de la progestérone 2,0 μM, de la prostaglandine 0,28 μM, de la na2SeO3μM, de la putrescine 182 μM, de la taurine 3 mM, de la cytidine 5′-diphosphocholine 4,7 μM, de la cytidine 5′-diphosphocholine 2,7 μM, de l’hydrocortisone 0,55 μM, de la triiodothyronine 0,03 μM, du pyruvate de sodium 1 mM et de la géntamycine 20 μM.
5. Ensemencement des cellules rétiniennes
- Traiter deux plaques de culture noires à 96 puits avec fond transparent pendant 2 heures à 37 °C avec de la poly-L-lysine à 32,25 μg/cm2.
- Rincer ces plaques deux fois avec le milieu de culture M199. Ressusciter la pastille cellulaire dans 1 mL de CDCM.
- Ajouter à une partie aliquote de 10 μL de la suspension cellulaire du bleu trypan pour tacher les cellules vivantes. Ajouter l’échantillon de suspension de cellules à un hémocytomètre (chambre de comptage cellulaire de Malassez).
- Au microscope, comptez les cellules colorées pour quatre rangées de l’hémocytomètre (c.-à-d. 40 carrés), puis calculez le nombre moyen de cellules pour une rangée. Calculer la concentration de cellules de la suspension en appliquant la méthode suivante : Nombre de cellules/mL de suspension = nombre moyen de cellules dans une rangée (10 carrés) x 10 le nombre total de carrés de l’hémocytomètre x dilution avec trypan bleu x 1 000 (pour exprimer le résultat en cellules/mL).
- Porter la suspension cellulaire à deux concentrations (5,6 x 104 cellules/mL et 1,12 x 105 cellules/mL) correspondant aux deux densités de placage (1 x 105 cellules/cm2 et 2 x 105 cellules/cm2) à l’aide du CDCM.
- Ensemencez 50 μL des deux suspensions cellulaires dans les deux plaques de culture noires prétraitées à 96 puits. Distribuez les cellules dans les plaques avec une pipette multicanal de la droite de la plaque vers la gauche, en homogénéisant entre chaque colonne, de sorte que la distribution des cellules soit homogène.
- Ajouter 50 μL de la bibliothèque de molécules (p. ex., les milieux conditionnés d’une bibliothèque d’ADNc, voir ci-dessous) à examiner à l’aide d’un motif prédéfini(tableau 1).
- Incuber les plaques pendant sept jours à 37 °C sous 5 % deCO2 sans changement de support.
6. Comptage des cellules viables
- À chaque puits de la plaque, ajouter 2,7 μM de calcéine AM et 0,3 mM d’éthidium homodimer.
REMARQUE: La calcine pénètre dans les cellules qui sont imperméables aux grandes molécules comme l’éthidium homodimer. Dans le cytoplasme des cellules vivantes, la calcéine est hydrolysée par des estérases endogènes, devient fluorescente en émettant à 520 nm lorsqu’elle est excitée à 485 nm. Ethidium homodimer se lie à l’ADN sur les cellules mortes. La liaison ADN-homodimère d’Ethidium provoque l’émissation de la fluorescence rouge à 635 nm après excitation à 520 nm. - Incuber les plaques pendant 1 heure à température ambiante en l’absence de lumière.
- Lire la fluorescence sur un lecteur de plaque automatisé composé d’un microscope inversé équipé d’une lampe à mercure avec deux filtres d’excitation à 485 et 520 nm, deux filtres d’émission à 520 et 635 nm, un objectif (x10), un étage motorisé commandé par un processeur et une caméra à dispositif couplé à la charge (CCD). Cette plateforme de comptage est contrôlée par le logiciel Metamorph19. Il permet d’acquérir des images de fluorescence de cellules vivantes et de cellules mortes simultanément dans chaque puits de la plaque de 96 puits, en commençant par les puits A1 vers le puits A12, puis B12 vers B1, C1 vers C12 et ainsi de suite(tableau I).
- Calculer la surface moyenne A d’une seule cellule à l’aide des 18 puits des témoins négatifs(tableau I).
- Comptez les cellules dans chaque puits de la plaque et appliquez la formule empirique suivante A x 29 / 20,7 pour éviter que les doublets cellulaires (regroupement de deux cellules) ne soient comptés. Noter l’effet protecteur des cônes par molécules comme le rapport entre le nombre moyen de cellules dans les 4 puits où nous avons testé la molécule par rapport au nombre de cellules moyen dans les 18 puits du témoin négatif (voir le tableau 1 et la figure supplémentaire 1).
- Combiner les résultats de la plaque ensemencée à 1 x 105 cellules/cm2 avec celle ensemencée à 2 x 105 cellules/cm2 pour évaluer le potentiel de protection (rapport de viabilité) par chaque molécule criblée.
Representative Results
Nous décrivons ici comment le système de culture enrichi en cônes peut être utilisé pour identifier de nouvelles protéines protectrices de cônes. Nous avons employé ce protocole pour examiner une bibliothèque normalisée d’ADNc faite de l’épithélium pigmenté choroïde et rétinien de 400 yeux de 8 mois de vieux rats de Long-Evans43.
Cette bibliothèque contient 6,0 x 106 unités formant des colonies indépendantes (UFC) et a une taille moyenne d’insert cloné de 2,1 kilobase (kb), avec plus de 99% de clones recombinants. Des pools de 100 clones de cette bibliothèque ont été transfectés transitoirement (0,1 μg d’ADN plasmidique) en cellules COS-1 et le milieu conditionné (CM) de COS-1 a été récolté après incubation pendant 48 heures dans du DMEM sans sérum. Les membranes ou les exosomes n’ont pas été enlevés par ultracentrifugation. Cinquante microlitres de chaque CM ont été ajoutés à 4 puits de deux plaques de 96 puits : l’un ensemencé à 2 x10 5 cellules/cm2, l’autre à 4 x 105 cellules/cm2. Cm à partir de cellules COS-1 transfectées avec le vecteur vide pcDNA3.1 utilisé pour construire la bibliothèque a été utilisé comme contrôle négatif (Tableau 1). Au total, 2 112 ensembles de 100 clones correspondant à 211 200 clones individuels ont été évalués dans quatre puits de culture et pour deux conditions d’ensemencement de cultures enrichies en cônes. Les deux conditions correspondent à deux densités d’inoculation légèrement différentes qui permettent d’évaluer plus précisément l’activité protectrice, pour un total de 1 689 600 puits de culture.
Parmi les 42 pools de clones ayant un rapport supérieur à 2, les pools 0080 et 0073 présentent un taux de viabilité 16 et 14 fois plus élevé après 7 jours de culture que le témoin négatif, pcDNA3.1(Figure supplémentaire 1). Cette analyse est essentielle pour identifier les bassins d’intérêt. Chaque pool sélectionné de 100 clones a été subdivisé en 16 ensembles de 10 clones de leur stock de glycérol. Ces sous-bassins ont été préparés et testés selon la même méthode lors d’une deuxième série de criblage (c.-à-d. un total de 3 200 puits de culture). Le sous-pool 0073-09 a donné le ratio de viabilité le plus élevé (figure supplémentaire 2A) et a été subdivisé pour produire 16 clones individuels qui ont été testés lors d’une troisième série de criblage sur des cultures enrichies en cônes. Le clone 0073-09-37 se distingue nettement des autres avec un rapport de viabilité égal à 2,5(Figure supplémentaire 2B). L’axe des y a une échelle différente même si la densité d’ensemencement était la même que dans la figure supplémentaire 2A. Nous l’avons vu couramment lorsque les tests sont répétés chaque semaine pendant des mois. Après analyse, ces résultats confirment que le clone 0073-09-37 a un effet robuste et reproductible sur la survie du cône. L’essai a été répété indépendamment(figure 3A),et l’insert de 1,8 kb a été séquencé(figure 3B).
Une analyse bioinformatique a révélé que le clone 0073-09-37, que nous avons nommé facteur de viabilité du cône dérivé de l’épithélium (EdCVF), contient trois cadres de lecture ouverts (ORF), celui que le plus en amont (ORF1) code pour 84 résidus de la partie C-terminale de la protéine de rat zinc finger protein-180 (ZFP180, NP_653358) de 727 acides aminés44. Les deux autres ORF (ORF2 et ORF3) sont beaucoup moins bien conservés chez la souris et absents chez d’autres mammifères. Lorsqu’il est testé indépendamment, seul ORF1 exerce un effet protecteur sur les cônes(figure supplémentaire 3). ORF1 a été produit sous forme de protéine de fusion de la glutathion S-transférase (GST)(figure 4A). La protéine EdCVF a été purifiée et l’étiquette GST retirée(figure 4B). EdCVF est capable d’empêcher la dégénérescence des cônes dans le système de culture enrichi en cônes (Figure 4C).
Figure 1: Embryons de poulet aux stades28e, 29e et 30e du développement. Flèches W: aile, C: collier et B: bec. Barre d’échelle 1 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Dissection de la rétine de l’embryon de poulet Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Facteur de viabilité du cône dérivé de l’épithélium (EdCVF), clone 0073-09-37. A. Viabilité accrue sur la culture enrichie en cônes. B. Séquence du clone de l’ADNc 0073-09-37. La séquence soulignée GAATTC est le site de restriction EcoRI utilisé pour construire la bibliothèque. Les deux codons GTG en gras sont des sites d’initiation de traduction rares pour EdCVF provenant du vecteur. Analyse statistique par test de l’étudiant. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Activité recombinante de l’EdCVF. A. Séquence de l’EdCVF dans la fusion avec la glutathion S-transférase (GST). B. La protéine EdCVF recombinante purifiée. C. Activité trophique de GST-EdCVF sur le cône en culture. Analyse statistique à l’aide du test de Tukey. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Rapport entre le nombre moyen de cellules pour un pool d’ADNc et le témoin négatif, le milieu conditionné des cellules COS-1 transfecté avec le vecteur vide pcDNA3.1 au cours de la première série de dépistage. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Suppléments Figure 2 : Nombre de cellules vivantes. A. La deuxième ronde de dépistage avec des sous-piscines de piscine 0073. B. La troisième série de dépistage avec des clones isolés. CN : milieu conditionné des cellules COS-1 transfecté avec le vecteur vide, pcDNA3.1. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 3: Activité trophique des trois cadres de lecture ouverts du clone isolé 0073-09-37. Analyse statistique à l’aide du test de Dunnett. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| un | 1 | 1 | 1 | 1 | 2 | Nc | 2 | 2 | 2 | 3 | 3 | Nc |
| B | Nc | 3 | 3 | 4 | 4 | 4 | Nc | 4 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| C | 6 | Nc | 6 | 6 | 6 | 7 | 7 | Nc | 7 | 7 | 8 | 8 |
| D | 8 | 8 | Nc | 9 | 9 | 9 | 9 | 10 | Nc | 10 | 10 | 10 |
| e | 11 | 11 | 11 | Nc | 11 | 12 | 12 | 12 | 12 | Nc | 13 | 13 |
| F | 13 | 13 | 14 | 14 | Nc | 14 | 14 | 15 | 15 | 15 | Nc | 15 |
| g | 16 | 16 | 16 | 16 | 17 | Nc | 17 | 17 | 17 | 18 | 18 | Nc |
| h | 18 | 18 | 19 | 19 | 19 | 19 | Nc | 20 | 20 | 20 | Nc | 20 |
| Contrôles négatifs NC | ||||||||||||
| 1 à 20 positions des piscines testées en quadruplicate | ||||||||||||
Tableau 1 : Plan de la plaque de 96 puits pour le criblage à haute teneur
Discussion
Parmi les nombreux paramètres qui pourraient limiter la production d’une culture enrichie en cônes à partir d’embryons de poulet, la première étape critique consiste à identifier avec précision le stade de développement des embryons dans les œufs éclos. Il a été observé que la culture de cellules à partir des rétines d’embryons à ED8 (34e stade) ne produit que 35% de photorécepteurs, les 65% restants provenant d’autres neurones4. Quelle que soit la logistique appliquée pour obtenir les œufs éclos, il est nécessaire d’affiner la température et le temps d’incubation, et d’examiner attentivement les embryons par rapport aux images de référence de tous les stades de développement42,45.
À l’origine, le système de culture enrichi en cônes a été développé en utilisant la souche White Leghorn4. La couleur blanche des œufs de cette souche n’est pas particulièrement appréciée en France, nous avons donc utilisé une souche de poulet qui produit des œufs bruns. Nous avons utilisé la souche I 657, qui est faite en croisant I 66 coqs avec des poules JA575. Nous avons pu reproduire les caractéristiques des cultures originales. Cela montre que le fond génétique du poulet n’est pas essentiel pour obtenir des cultures enrichies en cônes.
Nous n’avons pas testé l’effet de l’élimination individuelle des suppléments dans le milieu de culture, mais avons observé que l’insuline joue un rôle critique conformément à l’effet de l’insuline sur la survie des cônes chez la souris rd1, un modèle de RP récessif autosomal46. La triiodothyronine (T3) peut également participer à la différenciation des cellules précurseurs rétiniennes de l’embryon de poulet en cônes en fonction du rôle du récepteur de l’hormone thyroïdienne dans le devenir des cellules rétiniennes au cours du développement40. Par conséquent, le système de culture enrichi en cône ne peut pas être utilisé pour identifier l’insuline par clonage d’expression46.
Le système de culture enrichi en cônes repose sur la culture de neurones primaires et est beaucoup plus approprié tha méthodes s’appuyant sur l’utilisation de cellules immortalisées comme la lignée cellulaire 661W24,25,26.
Le procédé décrit ici peut être modifié en effectuant une électroporation préalable avec de l’ADN plasmidique20. Avant de préparer la suspension cellulaire rétinienne, toute la rétine est placée dans la chambre d’un électroporateur sur mesure avec 120 μL de 0,5 μg/μL d’ADN plasmidique dans 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM d’EDTA. Cinq impulsions de 15 V pour 50 ms chacune sont appliquées séparées par un intervalle de 950 ms22. Les tentatives d’administration d’ARN interférent (ARNi) à l’aide des rétrovirus d’épissage aviaire (RCAS) compétents en réplication dans des cultures enrichies en cônes ont été infructueuses47. Cela est certainement dû au fait qu’en l’absence de sérum et dans les cultures de faible densité, les cellules précurseurs rétiniennes ne sont pas réplicatives, une condition préalable à la propagation des rétrovirus.
Nous avons développé le système de culture enrichi en cônes pour identifier les facteurs trophiques qui favorisent la survie du cône à l’aide du clonage d’expression19. Afin de le rendre possible, nous avons effectué une première étape de criblage à haute teneur en utilisant un milieu conditionné provenant de pools de 100 clones. Même si les ADNc de la bibliothèque sont exprimés sous le contrôle d’un promoteur cmv fort après transfection des cellules COS-1, il n’offre pas une garantie que toutes les protéines codées par les ADNc individuels atteignent une concentration suffisante pour être marqué positif par le test de viabilité. Il s’agit d’une limitation majeure. En ce sens, tout dépistage n’est pas vraiment exhaustif. De plus, même si les protéines membraneuses n’ont pas été retirées du milieu conditionné, la configuration du dosage est défavorable à l’identification de facteurs non diffusifs. Une alternative serait de cribler les clones individuels après avoir obtenu la séquence des ADNc afin d’éviter les duplications dans le dosage plusieurs fois la même protéine candidate. Ceci a été initié par le séquençage des bibliothèques d’ADNc rétiniennes que nous avons utilisées43. Bien que rationnelle, cette approche a aussi ses limites. L’analyse bioinformatique des séquences d’ADNc imposera irrésistiblement, outre la réduction de la redondance, la priorisation du criblage de certains clones sur la base des connaissances. Cela ne nuira pas si finalement, toute la bibliothèque serait projetée même si le temps nécessaire pour le faire sera considérablement allongé. Mais invariablement, l’identité de la séquence influencera notre façon de voir les résultats. Cela ne sera pas neutre puisque l’interprétation de la séquence sera naturellement en concurrence avec les données expérimentales.
L’identification de l’EdCVF montre également que le dépistage à haut contenu implique des limitations techniques. Dès la première ronde de dépistage, nous avons identifié deux bassins à forte activité(figure supplémentaire 1). Le pool 0073 a permis d’identifier avec succès l’EdCVF, tandis que le pool 0080 n’a pas abouti à une telle constatation. Nous n’avons pas résolu le problème qui pourrait résulter de la perte du clone actif lors de la préparation des sous-pools. Alternativement, il n’est pas exclu, même si ce n’est pas statistiquement favorable, que parmi les ADNc du pool 0080, deux protéines agissaient en synergie et leur activité n’a pas pu être observée en tant que clones individuels.
L’identification de molécules protégeant les cônes en criblant les petites molécules est une application future du système de culture enrichi en cônes. De telles molécules seront inestimables pour le traitement des pathologies rétiniennes pour lesquelles la thérapie génique n’est pas l’approche la plus appropriée en tant que dégénérescence maculaire liée à l’âge.
Disclosures
TL, J-AS et VF détiennent un brevet sur l’utilisation de l’EdCVF pour traiter les dégénérescences rétiniennes [WO2009071659 (A1). 12 juin 2007].
Acknowledgments
Les auteurs remercient Jacques Bellalou, Lorelei Fournier, Emmanuelle Clérin, Frédéric Blond et l’entreprise agricole à responsabilité limitée (EARL Morizeau Dangers, France) pour leur aide précieuse. Ces travaux ont été soutenus par l’Inserm, l’Université de la Sorbonne, l’Agence Nationale pour la Recherche (ANR, Labex Lifesenses), la Fondation Fighting Blindness (USA) et l’IHU FOReSIGHT [ANR-18-IAHU-0001] soutenus par Français fonds publics gérés par l’ANR dans le cadre du programme Investissements d’Avenir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 black plates (Clear Button with lid Tissue culture treated) | Corning | 3603 | |
| Calcein AM | Thermo-Fisher scientific | C1430 | |
| CCD Camera | Photometrics | CoolSnap FX HQ | |
| CDPC (Cytidine 5′-diphosphocholine sodium salt dihydrate) | Sigma-Aldrich | C0256 | |
| CO2 Independant | Thermo-Fisher scientific | 18045-054 | |
| Curved forceps | Dutscher | 005093 | |
| DMEM Media | Thermo-Fisher scientific | 41966-029 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | D4263 | |
| Eggs incubator | FarmLine | M08 01 3100 | |
| Ethidium Homodimer | Thermo-Fisher scientific | E1169 | |
| Fœtal bovine serum | Thermo-Fisher scientific | 10270-098 | |
| Gentamycin | Thermo-Fisher scientific | 15710-049 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0880 | |
| ITS (insulin Transferine selenium) | Sigma-Aldrich | I1884 | |
| large straight pliers | Dutscher | 005074 | |
| Linoleic acid | Sigma-Aldrich | L8384 | |
| M199 medium | Thermo-Fisher scientific | 31150-022 | |
| Metamorph software | Metamorph | ||
| Microscope | NIKON | Eclipse TE2000 | |
| Motorized stage | Martzauzer | Mutlicontrol 2000 | |
| Optical filter switch | Shutter Instrument company | Lambda 10-2 | |
| PBS 1X | Thermo-Fisher scientific | 14190-086 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P7556 | |
| Pursept A express | Fisher scientific | 11814110 | |
| Putriscine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| straight forceps | Dutscher | 005092 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T6397 | |
| Trypan blue | Thermo-Fisher scientific | 15250-061 | |
| Trypsine 0.25 % | Thermo-Fisher scientific | 25200-056 |
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