Summary
Vi beskriver en metode for å oppnå primære kulturer av kjegle fotoreseptorer fra netthinnen av kyllingembryoer og dens bruk for screening av høyt innhold.
Abstract
Menneskelig dagtidsyn er avhengig av funksjonen til kegle fotoreseptorer i sentrum av netthinnen, fovea. Pasienter som lider av den mest utbredte formen for arvelig retinal degenerasjon, retinitis pigmentosa, mister nattsyn på grunn av mutasjonsdrevet tap av stang fotoreseptorer, et fenomen etterfulgt av et progressivt tap av funksjon og død av kjegler som fører til blindhet. Genetikere har identifisert mange gener med mutasjoner som forårsaker denne sykdommen, men de første mutasjonene identifisert stilte spørsmål ved mekanismene for sekundær kjegledegenerering og hvordan en dominerende mutasjon i rhodopsingenkodingen for det visuelle pigmentet uttrykt utelukkende i stenger kan utløse kjegledegenerering.
Dette resultatet av transplantasjoner i en genetisk modell av sykdommen førte til begrepet celleinteraksjoner mellom stenger og kjegler og av ikke-celle autonom degenerasjon av kjegler i alle genetiske former for retinitis pigmentosa.
Kegler utgjør 5% av alle fotoreseptorer hos mennesker og bare 3% i musen, så studien deres er vanskelig i disse artene, men kjegler overgår stenger i fuglearter. Vi har tilpasset 96-brønnsplater til kultur retinal forløpere fra netthinnen av kylling embryoer på trinn 29 av deres utvikling. I disse primærkulturene representerer kjegler 80% av cellene etter in vitro differensiering. Cellene degener over en periode på en uke i fravær av serum. Her beskriver vi metodene og standardiseringen.
Dette kjegleberikede kultursystemet ble brukt til å identifisere den epitel-avledede kjegle levedyktighetsfaktoren (EdCVF) ved høy innholdsscreening av et rotte retinal pigmentert epitel normalisert cDNA-bibliotek. Rekombinant EdCVF forhindrer degenerasjon av keglene.
Introduction
Netthinnen av virveldyrarter er dobbel, med stang fotoreseptorer for svakt lyssyn og kjegle fotoreseptorer for dagslys, farge og skarphet syn. Primat synsskarphet er avhengig av en region i sentrum av netthinnen, kalt fovea, som er beriket i kjegler, men generelt representerer kjegler bare 5% av alle fotoreseptorer. Følgelig er analysen av keglene i primat netthinne og spesielt kulturen av kjegler teknisk vanskelig. Alle andre pattedyrarter har ingen fovea, og prosentandelen kegler er lav for gnagere som oftest brukes i retinal forskning. Dette er ikke tilfelle for fuglearter, for hvilke kjegler dominerer netthinnen til disse godt se fuglearter. Dinosaurer, som har dominert økosystemet da pattedyrene først dukket opp under evolusjonen, er på den fylogenetiske opprinnelsen til fugler1. Som en konsekvens av slik konkurranse mellom dinosaurer og tidlige pattedyr, er pattedyrene for det meste nattlige med netthinner dominert av stenger. Først senere under evolusjonen ble den daglige visjonen til noen pattedyrarter, blant annet primater, en evolusjonær fordel. Likevel forblir forfedrenes periode som en atavisme av nattlig flaskehals i utviklingen av pattedyrsyn2,3.
Mens de studerte retinal celledifferensiering, viste Adler og Hatlee at fotoreseptorer representerer omtrent 70% av retinal differensierte celler i kulturer avledet fra kylling på embryonal dag (ED) 6 eller trinn 294. På grunn av utbredelsen av kjegler i kylling netthinnen, har kulturer av retinalceller fra ED6 kyllingembryoer blitt utviklet som kegleberikede kulturer5.
Betydningen av kjeglemediert synsskarphet for mennesket er en truisme. Personer som er rammet av genetiske eller aldrende sykdommer som endrer kjeglefunksjon, er sterkt handikappet. Dette har fremmet en svært stor mengde studier på arvelige retinal degenerasjoner (IRD) med sikte på å finne behandlinger for disse blendende sykdommene6,7. Den første suksessen, oppnådd ved hjelp av en rekombinant adeno-assosiert vektor (AAV) for terapi av en alvorlig form for IRD Leber medfødt amaurose (LCA), er et konseptbevis for genterapi8. Identifiseringen av genene hvis mutasjoner utløser IRD åpner muligheten for å kurere disse sykdommene ved hjelp av genterapi. Likevel er disse sykdommene et resultat av mutasjoner i mer enn 200 forskjellige gener9. Selv i tilfelle av autosomale recessive former for IRD, når gjeninnføringen av den normale kopien av det sykelige genet kunne gjenopprette visuell funksjon, favoriserer de økonomiske kostnadene for hver enkelt utvikling de mest utbredte i skade for de mindre vanlige og til de som den genetiske opprinnelsen forblir ukjent for. Dette faktum fikk forskere til å tenke på mer generelle terapier. Apoptotisk celledød dukket opp som en vanlig vei, og et terapeutisk mål for disse sykdommene som utvikler seg ved degenerasjon av fotoreseptorer, inkludert for autosomale dominerende former10,11. Imidlertid mangler suksessene til en slik tilnærming. For den vanligste formen for IRD, retinitis pigmentosa (RP), er den vanlige banen sekundær tap av funksjon til slutt etterfulgt av degenerasjon av kjegler12,13. Forebygging av tap av kjeglefunksjon vil bevare sentral visjon av fovea uavhengig av de forårsakende mutasjonene14.
I det tidlige stadiet av RP utløser tap av stenger en reduksjon i uttrykket av stang-avledet kjegle levedyktighetsfaktor (RdCVF), kodet av nukleoredoxin-lignende 1 (NXNL1) gen, som avbryter metabolsk og redoks signalering mellom stenger og kjegler15. Administrasjonen av en rekombinant AAV som koder de to produktene av NXNL1-genet, den trofiske faktoren RdCVF og tioredoksenzymet RdCVFL, kan teoretisk forhindre kjeglesynstap i alle genetiske former for RP16. Vi har vist at NXNL1 genprodukt, RdCVFL, uttrykkes i kyllingkegleberikede kulturer17 og hvor det spiller en beskyttende rolle18. RdCVF og NXNL1-genet ble identifisert ved høy innholdsscreening av et retinal cDNA-bibliotek ved hjelp av overlevelsen av celler fra en kjegleberiket kultur som avlesning19. Vi screenet tilsvarende 210 000 individuelle kloner i biblioteket ved hjelp av 8 parallelle tester for hver klone. Dette representerer et svært stort antall tester som krever enkel tilgang til det biologiske materialet, netthinnene til kyllingembryoer. Vi fant ut at det var relativt enkelt å skaffe embryonerte kyllingegg på ukentlig basis fordi de er bredt produsert for agroindustrien for eggleggende høner og kjøttproduserende kyllinger. Etter nøye standardisering av de kjegleberikede kulturene, gir systemet en enkel, robust og reproduserbar måte å teste tusenvis av molekyler for deres evne til å bevare kjegle levedyktighet. Disse cellene er også egnet til genetiske manipulasjoner20 som drar nytte av studiet av signaltransduksjon og til biokjemiske analyser21,22,23.
Retinal forskere har utviklet alternative metoder som bruk av kjeglecellelinjen 661W24,25,26. Likevel forblir identiteten til denne cellelinjen kontroversiell27,28. De 661W cellene ble klonet fra retinal svulster av en transgen mus linje som uttrykker SV40 store T antigen under kontroll av den menneskelige interphotoreceptor retinol-bindende protein promotor. SV40 stor T antigen formidler cellulær transformasjon og udødeliggjøring. Som konsekvens må signalvei identifisert ved hjelp av 661W celler rapporteres inn i konteksten av en transformert og udødeliggjort cellelinje som på mange måter skiller seg fra kjegler in situ. I så måte består det kegleberikede kultursystemet av primære nevroner, kjeglene som er mer fysiologisk relevante.
Mens det er mulig å oppnå en ren kultur av fotoreseptorer ved hjelp av vibratome-seksjonering av mus netthinnen, gjør den svært lave prosentandelen av kjegler i ytre netthinne av gnagere denne tilnærmingen uegnet for å produsere kegleberikede kulturer29. Gris netthinnen inneholder ingen fovea, men har en region som kalles område centralis som er svært beriket i kjegler30. Den høye andelen kjegler i netthinnen daglige gnagere, som Arvicanthis ansorgei og Psammomys obsesus31,32, tilbyr en mulig løsning, men krever avl av slike eksotiske arter. Voksne grisøyne, samlet fra lokale slakterier, kan brukes til å produsere en blandet kultur av stenger og kjegler som har blitt brukt til å studere fotoreseptoroverlevelse33. En elegant løsning er å pre-rense kjegler fra gris netthinnen ved hjelp av panorering med peanøtt agglutinin (PNA) lectin, som selektivt binder seg til kjegler34. Likevel er denne metoden vanskelig å implementere i stor skala på grunn av kompleksiteten.
Menneskeskapte pluripotente stamceller (iPS) tilbyr den mest lovende tilnærmingen for å oppnå en kegle fotoreseptorcellepopulasjon som kan brukes til retinal transplantasjon, men som også kan tilpasses kjegleberiket kultur35,36. Siden transkripsjonsfaktoren NRL er nødvendig for stang-fotoreseptorer37, har Nrl-/- musen en netthinne dominert av kortbølgekegler (S-kjegler). Inaktiveringen kan brukes til å produsere S-kegleberiket forberedelse ved differensiering av mennesker fra iPS38,39. En annen mulig tilnærming er å fremme kjegle differensiering ved hjelp av skjoldbruskhormon signalering40. Mens nye metoder for å produsere kegleberikede kulturer fra menneskelig iPS dukker opp, gir kyllingembryoer en nåværende bevist metode19.
Den kjegleberikede kulturen var medvirkende i identifiseringen av RdCVF ved å uttrykke kloning19. Dette systemet ble også brukt med hell for å demonstrere at RdCVF stimulerer glukoseopptak og metabolisme ved aerob glykolyse22. Videre ble kjegleberiket kultur brukt til å validere den beskyttende rollen til RdCVFL, det andre produktet av NXNL1-genet 23. Mer nylig ble dette systemet brukt til å demonstrere eksistensen av å beskytte molekyler utskilt av retinal pigmenterte epitelceller transdusert med OTX241.
Protocol
Protokollen ble godkjent av Komiteen for etikk for dyreforsøk ved Universitetet Pierre og Marie Curie og det franske forskningsdepartementet (Tillatelsesnummer: TFOFIS #1028 2015070211275177). Dyreforsøkene ble utført under følgende autorisasjon: "Certificat d'autorisation d'expérimenter sur les animaux vertébrés A-75-1863. Préfecture de Police de Paris (9. november 2011-8. november 2016)".
1. Inkubasjon av befruktede egg
- Samle ukentlige befruktede egg (stamme I 657, rød etikett), oppnådd naturlig, ved et industrielt klekkeri.
- Vedlikehold de befruktede eggene ved 17 °C (deres biologiske null) i laboratoriet etter at de er "lagt" av høna.
- For hver kultur, inkuber syv befruktede egg i 24 timer ved 20 °C og deretter 136 timer ved 37 °C med periodisk tilbakevending av hellingen (en progressiv bevegelse i 2 timer fra den ene siden til motsatt, en 4-timers syklus) av eggene i et fuktet kammer.
2. Gjenoppretting av kyllingembryoene
- Vask overflaten på de syv eggene med desinfeksjonsmiddel (f.eks.
- For å bryte eggeskallet, lag et hull i toppen av skallet med store rette tanger. Klipp deretter skallet for å fjerne hatten fra egget som et mykt kokt egg.
- Trekk forsiktig ut hvert embryo fra eggeskallet med buede tang, og overfør det deretter til en Petri-tallerken som inneholder steril fosfatbuffer saltvann (PBS) som tidligere ble oppvarmet til 37 °C. Fjern forsiktig konvolutten som omgir embryoene (koret eller chorioallantoic membranen).
- Bekreft utviklingsstadiet av hvert embryo ved visuell sammenligning med Hamburger og Hamilton42.
- Velg to embryoer i29. Vingene bøyer seg ved albuene. Kragen skiller seg synlig ut. Lovforslaget er mer fremtredende enn på28.-etappen.
- Enucleate øynene til disse utvalgte embryoer og overføre dem i CO2-uavhengigmedium (Life technologies).
FORSIKTIG: Det er svært viktig at embryoet er på trinn 29, og ikke på trinn 28 eller 30 (Figur 1); derfor er det nødvendig å inkubere minst 7 egg, selv om bare to endelig vil bli brukt. Koret er veldig tynt, så vanskelig å skille, men det er veldig nært fra embryoet, så det må fjernes uten å berøre embryoet.
3. Disseksjon av netthinnene
- Decapitate og enucleate de valgte embryoer med buede tang.
- Overfør de fire øynene til CO2-uavhengigmedium. Dette mediet inneholder 0,9 mM CaCl2 og 0,65 mM MgCl2.
- Plasser øyet med hornhinnen med ansiktet ned, synsnerven som vender mot eksperimentet. Bor et hull i synsnerven ved hjelp av to rette tang.
- Sett inn en gren av hver tang mellom netthinnen og pigmentepitelet (figur 2). Trekk på hver tang og roter øyet for å løsne epitelet fra netthinnen. Fjern hornhinnen etterfulgt av linsen og glasslegemet.
- Overfør de fire netthinnene i en Petri-tallerken som inneholder Ringers medium på pH 7.2.
FORSIKTIG: Pass på at bare netthinnen forblir og fjern eventuelle spor av glasslegemet og gjenværende retinal pigmentert epitel.
4. Klargjøring av retinal celle suspensjon
- Klipp de fire netthinnene i svært små biter ved hjelp av to rette tanger.
- Vask netthinnestykkene to ganger med Ringers medium.
- Etter den andre vasken med Ringers medium, la netthinnen falle på bunnen av røret og fjern Ringers medium. Behandle netthinnestykkene i 20 minutter ved 37 °C med en oppløsning av trypsin (0,25 % m/v).
- Disperger løsningen etter 10 minutter ved etterfølgende sug. Utladning ved hjelp av en Pasteur pipette og se etter dissosiasjon av netthinnestykkene. Stopp reaksjonen ved å legge til kulturmedier supplert med 10% inaktivert fosterkalvserum.
- Inkuber cellefjæringen med 0,05 mg DNase I. Fjern celleklyngene og DNA-et ved etterfølgende sug og utslipp ved hjelp av en Pasteur pipette umiddelbart etter å ha lagt til DNase.
- Vask retinal celle suspensjon to ganger med kjemisk definert kultur medium (CDCM): et likt volum av Dulbecco's Modified Eagle Medium og M199 medier supplert med 100 μg / ml linolsyre / BSA, 0,86 μM insulin, 0,07 μM transferrin, 2,0 μM progesteron, 0,28 μM prostaglandin, 0,29 μM Na2SeO3,182 μM putrescine, 3 mM taurin, 4.7 μM cytidin 5′-difosfocholin, 2,7 μM cytidin 5′-difosfoetanolamin, 0,55 μM hydrokortison, 0,03 μM triiodothyronin, 1 mM natriumpyromitt og 20 μM gentamycin.
5. Retinal celle såing
- Behandle to svarte 96-brønns kulturplater med gjennomsiktig bunn i 2 timer ved 37 °C med poly-L-lysin ved 32,25 μg/cm2.
- Skyll disse platene to ganger med M199 kulturmedium. Resuspend cellepellet i 1 ml CDCM.
- Legg til en aliquot på 10 μL av celleopphenget trypan blå for å flekke levende celler. Tilsett cellenes suspensjonsprøve til et hemocytometer (celletellingskammeret i Malassez).
- Under et mikroskop teller du de fargede cellene for fire rader i hemocytometeret (dvs. 40 kvadrater), og deretter beregner du det gjennomsnittlige cellenummeret for en rad. Beregn konsentrasjonen av celler i suspensjonen ved å bruke følgende metode: Antall celler/ml suspensjon = gjennomsnittlig antall celler på rad (10 kvadrater) x 10 totalt antall kvadrater av hemocytometer x fortynning med trypan blå x 1000 (for å uttrykke resultatet som celler / ml).
- Bring celleopphenget til to konsentrasjoner (5,6 x 104 celler/ml og 1,12 x 105 celler/ml) som tilsvarer de to platingtetthetene (1 x 105 celler/cm2 og 2 x 105 celler/cm2) ved hjelp av CDCM.
- Frø 50 μL av de to cellesuspensjonene i de to forbehandlede svarte 96-brønns kulturplatene. Fordel cellene i platene med en flerkanals pipette fra høyre for platen til venstre, homogenisere mellom hver kolonne, slik at fordelingen av cellene er homogen.
- Tilsett 50 μL av biblioteket med molekyler (f.eks. det betingede mediet fra et cDNA-bibliotek, se nedenfor) som skal screenes ved hjelp av et forhåndsdefinert mønster (Tabell 1).
- Inkuber platene i syv dager ved 37 °C under 5 % CO2 uten medieskifte.
6. Telle levedyktige celler
- Til hver brønn av platen, tilsett 2,7 μM calcein AM og 0,3 mM ethidium homodimer.
MERK: Calcein trenger inn i cellene som er ugjennomtrengelige for store molekyler som ethidium homodimer. I cytoplasma av levende celler hydrolyseres calcein av endogene esteraser, blir fluorescerende ved å slippe ut ved 520 nm når den er spent på 485 nm. Ethidium homodimer binder seg til DNA på døde celler. Ethidium DNA-homodimerbinding fører til at rød fluorescens slippes ut ved 635 nm etter eksitasjon ved 520 nm. - Inkuber platene i 1 time ved romtemperatur i fravær av lys.
- Les fluorescensen på en automatisert plateleser som består av et invertert mikroskop utstyrt med en kvikksølvlampe med to eksitasjonsfiltre på 485 og 520 nm, to utslippsfiltre ved 520 og 635 nm, et mål (x10), et motorisert stadium kontrollert av en prosessor og et ladekoblet enhetskamera (CCD). Denne telleplattformen styres av Metamorph-programvaren19. Det gjør det mulig å skaffe fluorescensbilder av levende celler og døde celler samtidig i hver brønn av 96-brønnsplaten, fra brønn A1 mot brønn A12, deretter B12 mot B1, C1 mot C12 og så videre (Tabell I).
- Beregne gjennomsnittsområdet A for en enkelt celle ved hjelp av de 18 brønnene i de negative kontrollene (Tabell I).
- Tell cellene i hver brønn på platen og bruk følgende empiriske formel A x 29 / 20,7 for å forhindre at celledobler (gruppering av to celler) telles. Skår den beskyttende effekten av kjegler med molekyler som forholdet mellom gjennomsnittlig cellenummer i de 4 brønnene der vi testet molekylet kontra gjennomsnittlig cellenummer i de 18 brønnene i den negative kontrollen (se tabell 1 og supplerende figur 1).
- Kombiner resultatene av platefrøet ved 1 x 105 celler / cm2 med det ene frøet ved 2 x 105 celler / cm2 for å evaluere potensiell beskyttelse (levedyktighetsforhold) av hvert molekyl som vises.
Representative Results
Vi beskriver her hvordan det kegleberikede kultursystemet kan brukes til å identifisere nye kjegler som beskytter proteiner. Vi brukte denne protokollen til å screene et normalisert cDNA-bibliotek laget av choroid og retinal pigmentert epitel fra 400 øyne på 8 uker gamle Long-Evans rotter43.
Dette biblioteket inneholder 6,0 x 106 uavhengige kolonier som danner enheter (CFUer) og har en gjennomsnittlig klonet innsatsstørrelse på 2,1 kilobase (kb), med mer enn 99% av rekombinante kloner. Bassenger på 100 kloner fra biblioteket ble forbigående transfektert (0,1 μg plasmid DNA) til COS-1 celler og det betingede mediet (CM) av COS-1 ble høstet etter inkubasjon i 48 timer i DMEM uten serum. Membraner eller eksosomer ble ikke fjernet ved ultracentrifugation. Femti mikroliter av hver CM ble tilsatt til 4 brønner av to 96-brønnsplater: ett frø ved 2 x 105 celler / cm2, den andre ved 4 x 105 celler / cm2. CM fra COS-1 celler transfektert med den tomme vektoren pcDNA3.1 som brukes til å konstruere biblioteket ble brukt som negativ kontroll (Tabell 1). Totalt ble 2.112 sett med 100 kloner tilsvarende 211.200 individuelle kloner evaluert i fire kulturbrønner og for to såingsforhold for kjegleberikede kulturer. De to forholdene tilsvarer to litt forskjellige inokulasjonstettheter som gjør det mulig å vurdere beskyttelsesaktiviteten mer presist, for totalt 1.689.600 kulturbrønner.
Blant de 42 klonene med et forhold som er større enn 2, har bassengene 0080 og 0073 levedyktighetsforhold 16 og 14 ganger høyere etter 7 dager med kultur enn den negative kontrollen, pcDNA3.1 (Supplerende figur 1). Denne analysen er avgjørende for å identifisere interessepuljer. Hvert utvalg av 100 kloner ble delt inn i 16 sett med 10 kloner fra glyserolbestanden. Disse underbassengene ble utarbeidet og testet i henhold til samme metode i en andre runde med screening (dvs. totalt 3200 kulturbrønner). Underutvalget 0073-09 ga det sterkeste levedyktighetsforholdet (Supplementary Figure 2A) og ble delt inn for å produsere 16 individuelle kloner som ble testet i en tredje runde med screening på kjegleberikede kulturer. Klonen 0073-09-37 klone skiller seg tydelig ut fra de andre med et levedyktighetsforhold lik 2,5 (Supplerende figur 2B). Y-aksen har en annen skala selv om såddtettheten var den samme enn i supplerende figur 2A. Vi har sett dette ofte når analysene gjentas ukentlig i flere måneder. Etter analyse bekrefter disse resultatene at klone 0073-09-37 har en robust og reproduserbar effekt på kjegleoverlevelse. Testen ble gjentatt uavhengig (figur 3A), og innsatsen på 1,8 kb ble sekvensert (figur 3B).
En bioinformatisk analyse viste at klonen 0073-09-37, som vi kalte epitel-avledet kjegle levedyktighetsfaktor (EdCVF), inneholder tre åpne leserammer (ORF), den som er mest oppstrøms (ORF1) koder for 84 rester av C-terminaldelen av rotteproteinet sinkfingerprotein-180 (ZFP180, NP_653358) på 727 aminosyrer44. De to andre ORF-ene (ORF2 og ORF3) er mye mindre godt bevart hos mus og fraværende hos andre pattedyr. Når ORF1 testes uavhengig, har den en beskyttende effekt på kjeglene (Tilleggs figur 3). ORF1 ble produsert som et glutathione S-transferase (GST) fusjonsprotein (figur 4A). EdCVF-proteinet ble renset og GST-koden fjernet (Figur 4B). EdCVF er i stand til å forhindre kjegle degenerasjon i det kegleberikede kultursystemet (Figur 4C).
Figur 1: Kyllingembryoer i trinn 28th, 29th og 30th av utviklingen. Piler W: vinge, C: krage og B: regning. Skalalinje 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Disseksjon av netthinnen i kyllingembryoet Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Epithelium-avledet kjegle levedyktighetsfaktor (EdCVF), klone 0073-09-37. A. Økt levedyktighet på kjegleberiket kultur. B. Sekvensen av cDNA-klonen 0073-09-37. Den understrekede sekvensen GAATTC er EcoRI-begrensningsområdet som brukes til å konstruere biblioteket. De to codons GTG i fet skrift er uvanlige oversettelse initiering nettsteder for EdCVF stammer fra vektoren. Statistisk analyse etter Studentens prøve. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Rekombinant EdCVF-aktivitet. A. Sekvens av EdCVF i fusjonen med glutathione S-transferase (GST). B. Det rensede rekombinante EdCVF-proteinet. C. Trofisk aktivitet av GST-EdCVF på kjegle i kultur. Statistisk analyse ved hjelp av Tukeys test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Forholdet mellom gjennomsnittlig cellenummer for et cDNA-basseng og den negative kontrollen, det betingede mediet av COS-1-celler transfektert med den tomme vektoren pcDNA3.1 i løpet av første runde av screening. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende Figur 2: Antall aktive celler. A. Den andre runden med screening med underpuljer på 0073 basseng. B. Den tredje runden med screening med isolerte kloner. CN: det betingede mediet av COS-1 celler transfektert med den tomme vektoren, pcDNA3.1. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 3: Trofisk aktivitet av de tre åpne leserammene til den isolerte klonen 0073-09-37. Statistisk analyse ved hjelp av Dunnetts test. Klikk her for å laste ned denne filen.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| en | 1 | 1 | 1 | 1 | 2 | Nc | 2 | 2 | 2 | 3 | 3 | Nc |
| B | Nc | 3 | 3 | 4 | 4 | 4 | Nc | 4 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| C | 6 | Nc | 6 | 6 | 6 | 7 | 7 | Nc | 7 | 7 | 8 | 8 |
| D | 8 | 8 | Nc | 9 | 9 | 9 | 9 | 10 | Nc | 10 | 10 | 10 |
| E | 11 | 11 | 11 | Nc | 11 | 12 | 12 | 12 | 12 | Nc | 13 | 13 |
| F | 13 | 13 | 14 | 14 | Nc | 14 | 14 | 15 | 15 | 15 | Nc | 15 |
| G | 16 | 16 | 16 | 16 | 17 | Nc | 17 | 17 | 17 | 18 | 18 | Nc |
| H | 18 | 18 | 19 | 19 | 19 | 19 | Nc | 20 | 20 | 20 | Nc | 20 |
| NC-negative kontroller | ||||||||||||
| 1-20 posisjoner av bassengene testet i firedoblet | ||||||||||||
Tabell 1: Plan for 96-brønnsplaten for screening av høyt innhold
Discussion
Blant de mange parametrene som kan begrense produksjonen av en kegleberiket kultur fra kyllingembryoer, er det første kritiske trinnet å nøyaktig identifisere utviklingsstadiet av embryoene i de klekkede eggene. Det har blitt observert at kultur av celler fra netthinner av embryoer i ED8 (34. trinn) produserer bare 35% fotoreseptorer, med de resterende 65% er laget av andre nevroner4. Uansett hvilken logistisk som brukes for å få de klekkede eggene, er det nødvendig å finjustere temperaturen og inkubasjonstiden, og å undersøke forsiktig embryoene sammenlignet med referansebildene i alle utviklingsstadier42,45.
Opprinnelig ble det kegleberikede kultursystemet utviklet ved hjelp av White Leghorn-stammen4. Den hvite fargen på eggene av den stammen er ikke spesielt verdsatt i Frankrike, så vi brukte en kyllingstamme som produserer brune egg. Vi brukte I 657-stammen, som er laget ved å krysse I 66 roosters med JA57 høner5. Vi var i stand til å reprodusere egenskapene til de opprinnelige kulturene. Dette viser at kyllingens genetiske bakgrunn ikke er kritisk for å oppnå kegleberikede kulturer.
Vi har ikke testet effekten av individuell fjerning av kosttilskuddene i kulturmediet, men har observert at insulin spiller en kritisk rolle i samsvar med effekten av insulin på overlevelse av kjegler i rd1-musen, en modell av autosomal recessiv RP46. Triiodothyronin (T3) kan også delta i differensiering av retinal forløperceller av kyllingembryo i kjegler i henhold til rollen som skjoldbruskhormonreseptor i retinal celle skjebne under utvikling40. Følgelig kan det kegleberikede kultursystemet ikke brukes til å identifisere insulin ved ekspresjonskloning46.
Det kegleberikede kultursystemet er avhengig av kulturen til primære nevroner og er mye mer hensiktsmessige tha-metoder som er avhengige av bruk av udødelige celler som cellelinje 661W24,25,26.
Metoden beskrevet her kan endres ved å utføre en tidligere elektroporasjon med plasmid DNA20. Før du forbereder retinal celle suspensjon, er hele netthinnen plassert i kammeret til en skreddersydd elektroporator med 120 μL 0,5 μg / μL plasmid DNA i 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA. Fem pulser på 15 V i 50 ms hver påføres atskilt med 950 ms intervall22. Forsøk på å levere forstyrrende RNA (RNAi) ved hjelp av replikasjon kompetent fuglespleise (RCAS) retrovirus i kjegleberikede kulturer mislyktes47. Dette skyldes absolutt det faktum at i fravær av serum og i kulturer med lav tetthet, er retinal forløperceller ikke replikerende, en nødvendig for forplantning av retrovirus.
Vi utviklet det kjegleberikede kultursystemet for å identifisere trofiske faktorer som fremmer kjegleoverlevelse ved hjelp av uttrykkskloning19. For å gjøre det mulig, utførte vi et første skritt med screening av høyt innhold ved hjelp av betinget medium fra bassenger på 100 kloner. Selv om cDA-ene fra biblioteket uttrykkes under kontroll av en sterk CMV-promotor etter transfeksjon av COS-1-celler, gir det ikke en garanti for at alle proteinene som er kodet av individuelle CDA-er, når en konsentrasjon som er tilstrekkelig til å bli scoret positivt av levedyktighetsanalysen. Dette er en stor begrensning. I den forstand er enhver screening egentlig ikke uttømmende. I tillegg, selv om membranøse proteiner ikke ble fjernet fra det betingede mediet, er konfigurasjonen av analysen ugunstig for identifisering av ikke-diffusive faktorer. Et alternativ ville være å screene individuelle kloner etter å ha fått sekvensen av cDNAene for å unngå dupliseringer i analyse mange ganger samme kandidatprotein. Dette ble initiert ved å sekvensere retinal cDNA biblioteker vi brukte43. Selv om den er rasjonell, har denne tilnærmingen også sine begrensninger. Den bioinformatiske analysen av cDNA-sekvensene vil uimotståelig pålegge, ved siden av reduksjonen av redundansen, prioriteringen av screening av visse kloner basert på kunnskap. Dette vil ikke være skadelig hvis endelig, hele biblioteket vil bli screenet selv om tiden som kreves for å gjøre det vil bli betydelig forlenget. Men alltid vil identiteten til sekvensen påvirke vår måte å se på resultatene på. Dette vil ikke være nøytralt siden tolkningen av sekvensen naturligvis vil være i konkurranse med eksperimentelle data.
Identifiseringen av EdCVF viser også at screening av høyt innhold medfører tekniske begrensninger. Fra første runde med screening identifiserte vi to bassenger med høy aktivitet (Supplerende figur 1). Utvalget 0073 førte til vellykket identifisering av EdCVF, mens utvalg 0080 ikke utførte slike funn. Vi har ikke løst problemet som kan skyldes tap av den aktive klonen under utarbeidelsen av underbassenger. Alternativt er det ikke utelukket, selv om det ikke er statistisk gunstig, at blant cDNAene i pool 0080 handlet to proteiner synergistisk og deres aktivitet kunne ikke observeres som individuelle kloner.
Identifisering av molekyler som beskytter kjegler ved å screene små molekyler er en fremtidig anvendelse av det kegleberikede kultursystemet. Slike molekyler vil være uvurderlige for behandling av retinal patologier som genterapi ikke er den mest hensiktsmessige tilnærmingen som aldersrelatert makuladegenerasjon.
Disclosures
TL, J-AS og VF har patent på bruk av EdCVF for å behandle retinal degenerasjoner [WO2009071659 (A1). 12. juni 2007].
Acknowledgments
Forfatterne takker Jacques Bellalou, Lorelei Fournier, Emmanuelle Clérin, Frédéric Blond og den entreprise agricole à responsabilité limitée (EARL Morizeau Dangers, Frankrike) for deres uvurderlige hjelp. Dette arbeidet ble støttet av Inserm, Sorbonne University, Agence Nationale pour la Recherche (ANR, Labex Lifesenses), Foundation Fighting Blindness (USA) og IHU FOReSIGHT [ANR-18-IAHU-0001] støttet av franske statlige midler administrert av ANR i Investissements d'Avenir-programmet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 black plates (Clear Button with lid Tissue culture treated) | Corning | 3603 | |
| Calcein AM | Thermo-Fisher scientific | C1430 | |
| CCD Camera | Photometrics | CoolSnap FX HQ | |
| CDPC (Cytidine 5′-diphosphocholine sodium salt dihydrate) | Sigma-Aldrich | C0256 | |
| CO2 Independant | Thermo-Fisher scientific | 18045-054 | |
| Curved forceps | Dutscher | 005093 | |
| DMEM Media | Thermo-Fisher scientific | 41966-029 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | D4263 | |
| Eggs incubator | FarmLine | M08 01 3100 | |
| Ethidium Homodimer | Thermo-Fisher scientific | E1169 | |
| Fœtal bovine serum | Thermo-Fisher scientific | 10270-098 | |
| Gentamycin | Thermo-Fisher scientific | 15710-049 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0880 | |
| ITS (insulin Transferine selenium) | Sigma-Aldrich | I1884 | |
| large straight pliers | Dutscher | 005074 | |
| Linoleic acid | Sigma-Aldrich | L8384 | |
| M199 medium | Thermo-Fisher scientific | 31150-022 | |
| Metamorph software | Metamorph | ||
| Microscope | NIKON | Eclipse TE2000 | |
| Motorized stage | Martzauzer | Mutlicontrol 2000 | |
| Optical filter switch | Shutter Instrument company | Lambda 10-2 | |
| PBS 1X | Thermo-Fisher scientific | 14190-086 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P7556 | |
| Pursept A express | Fisher scientific | 11814110 | |
| Putriscine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| straight forceps | Dutscher | 005092 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T6397 | |
| Trypan blue | Thermo-Fisher scientific | 15250-061 | |
| Trypsine 0.25 % | Thermo-Fisher scientific | 25200-056 |
References
- Brownstein, C. D. The Implicit Mind. , Oxford University Press. (2019).
- Heesy, C. P., Hall, M. I. The nocturnal bottleneck and the evolution of mammalian vision. Brain, Behavior and Evolution. 75 (3), 195-203 (2010).
- Borges, R., et al. Adaptive genomic evolution of opsins reveals that early mammals flourished in nocturnal environments. BMC Genomics. 19 (1), 121 (2018).
- Adler, R., Hatlee, M. Plasticity and differentiation of embryonic retinal cells after terminal mitosis. Science. 243 (4889), 391-393 (1989).
- Fintz, A. C., et al. Partial characterization of retina-derived cone neuroprotection in two culture models of photoreceptor degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (2), 818-825 (2003).
- Roska, B., Sahel, J. A.
- Duncan, J. L., et al. Inherited Retinal Degenerations: Current Landscape and Knowledge Gaps. Translational Vision Science & Technology. 7 (4), 6 (2018).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
- RetNet. Retinal Information Network. , (2020).
- Doonan, F., Donovan, M., Cotter, T. G. Activation of multiple pathways during photoreceptor apoptosis in the rd mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (10), 3530-3538 (2005).
- Comitato, A., et al. Dominant and recessive mutations in rhodopsin activate different cell death pathways. Human Molecular Genetics. 25 (13), 2801-2812 (2016).
- Cronin, T., Leveillard, T., Sahel, J. A. Retinal degenerations: from cell signaling to cell therapy; pre-clinical and clinical issues. Current Gene Therapy. 7 (2), 121-129 (2007).
- Baumgartner, W. A., Baumgartner, A. M. Accounting for disagreements on average cone loss rates in retinitis pigmentosa with a new kinetic model: Its relevance for clinical trials. Medical Hypotheses. 89, 107-114 (2016).
- Leveillard, T., Sahel, J. A. Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling. Science Translational Medicine. 2 (26), (2010).
- Leveillard, T., Sahel, J. A. Metabolic and redox signaling in the retina. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (20), 3649-3665 (2017).
- Clerin, E., Marussig, M., Sahel, J. A., Leveillard, T. Metabolic and Redox Signaling of the Nucleoredoxin-Like-1 Gene for the Treatment of Genetic Retinal Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), (2020).
- Fridlich, R., et al. The Thioredoxin-like Protein Rod-derived Cone Viability Factor (RdCVFL) Interacts with TAU and Inhibits Its Phosphorylation in the Retina. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (6), 1206-1218 (2009).
- Mei, X., et al. The Thioredoxin Encoded by the Rod-Derived Cone Viability Factor Gene Protects Cone Photoreceptors Against Oxidative Stress. Antioxidants, Redox Signaling. 24 (16), 909-923 (2016).
- Leveillard, T., et al. Identification and characterization of rod-derived cone viability factor. Nature Genetics. 36 (7), 755-759 (2004).
- Vergara, M. N., Gutierrez, C., Canto-Soler, M. V. Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach. Journal of Visualized Experiments. (105), e52002 (2015).
- Fridlich, R., et al. The thioredoxin-like protein rod-derived cone viability factor (RdCVFL) interacts with TAU and inhibits its phosphorylation in the retina. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (6), 1206-1218 (2009).
- Ait-Ali, N., et al. Rod-derived cone viability factor promotes cone survival by stimulating aerobic glycolysis. Cell. 161 (4), 817-832 (2015).
- Mei, X., et al. The Thioredoxin Encoded by the Rod-Derived Cone Viability Factor Gene Protects Cone Photoreceptors Against Oxidative Stress. Antioxidants & Redox Signaling. 24 (16), 909-923 (2016).
- Tan, E., et al. Expression of cone-photoreceptor-specific antigens in a cell line derived from retinal tumors in transgenic mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (3), 764-768 (2004).
- Wang, X. W., Tan, B. Z., Sun, M., Ho, B., Ding, J. L. Thioredoxin-like 6 protects retinal cell line from photooxidative damage by upregulating NF-kappaB activity. Free Radical Biology and Medicine. 45 (3), 336-344 (2008).
- Perron, N. R., Beeson, C., Rohrer, B. Early alterations in mitochondrial reserve capacity; a means to predict subsequent photoreceptor cell death. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 45 (1-2), 101-109 (2013).
- Krishnamoorthy, R. R., Clark, A. F., Daudt, D., Vishwanatha, J. K., Yorio, T. A forensic path to RGC-5 cell line identification: lessons learned. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5712-5719 (2013).
- Al-Ubaidi, M. R. RGC-5: are they really 661W? The saga continues. Experimental Eye Research. 119, 115 (2014).
- Clerin, E., et al. Vibratome sectioning mouse retina to prepare photoreceptor cultures. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Hendrickson, A., Hicks, D. Distribution and density of medium- and short-wavelength selective cones in the domestic pig retina. Experimental Eye Research. 74 (4), 435-444 (2002).
- Bobu, C., Craft, C. M., Masson-Pevet, M., Hicks, D. Photoreceptor organization and rhythmic phagocytosis in the nile rat Arvicanthis ansorgei: a novel diurnal rodent model for the study of cone pathophysiology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 3109-3118 (2006).
- Saidi, T., Mbarek, S., Chaouacha-Chekir, R. B., Hicks, D. Diurnal rodents as animal models of human central vision: characterisation of the retina of the sand rat Psammomys obsesus. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 249 (7), 1029-1037 (2011).
- Traverso, V., Kinkl, N., Grimm, L., Sahel, J., Hicks, D. Basic fibroblast and epidermal growth factors stimulate survival in adult porcine photoreceptor cell cultures. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (10), 4550-4558 (2003).
- Balse, E., et al. Purification of mammalian cone photoreceptors by lectin panning and the enhancement of their survival in glia-conditioned medium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (1), 367-374 (2005).
- Gagliardi, G., et al. Characterization and Transplantation of CD73-Positive Photoreceptors Isolated from Human iPSC-Derived Retinal Organoids. Stem Cell Reports. 11 (3), 665-680 (2018).
- Gagliardi, G., Ben M'Barek, K., Goureau, O. Photoreceptor cell replacement in macular degeneration and retinitis pigmentosa: A pluripotent stem cell-based approach. Progress in Retinal and Eye Research. 71, 1-25 (2019).
- Mears, A. J., et al. Nrl is required for rod photoreceptor development. Nature Genetics. 29 (4), 447-452 (2001).
- Swaroop, A., Kim, D., Forrest, D. Transcriptional regulation of photoreceptor development and homeostasis in the mammalian retina. Nature Reviews Neuroscience. 11 (8), 563-576 (2010).
- Kallman, A., et al. Investigating cone photoreceptor development using patient-derived NRL null retinal organoids. Nature Communications. 3 (1), 82 (2020).
- Eldred, K. C., et al. Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids. Science. 362 (6411), (2018).
- Kole, C., et al. Otx2-Genetically Modified Retinal Pigment Epithelial Cells Rescue Photoreceptors after Transplantation. Molecular Therapy. 26 (1), 219-237 (2018).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Kole, C., et al. Identification of an Alternative Splicing Product of the Otx2 Gene Expressed in the Neural Retina and Retinal Pigmented Epithelial Cells. PLoS One. 11 (3), 0150758 (2016).
- Shannon, M., Hamilton, A. T., Gordon, L., Branscomb, E., Stubbs, L. Differential expansion of zinc-finger transcription factor loci in homologous human and mouse gene clusters. Genome Research. 13 (6), 1097-1110 (2003).
- Stern, C. D., Holland, P. W. Essential developmental biology: a practical approach. , (1993).
- Punzo, C., Kornacker, K., Cepko, C. L. Stimulation of the insulin/mTOR pathway delays cone death in a mouse model of retinitis pigmentosa. Nature Neuroscience. 12 (1), 44-52 (2009).
- Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Developmental Biology. 6, 2 (2006).
